Identifikasi Keragaman Gen Lecithin Cholesterol Acyltransferase Dan Lipoprotein Lipase Serta Hubungannya Dengan Kualitas Marbling Daging Domba

IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN
CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE DAN LIPOPROTEIN
LIPASE SERTA HUBUNGANNYA DENGAN KUALITAS
MARBLING DAGING DOMBA

HIDAYATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul “Identifikasi
Keragaman Gen Lecithin Cholesterol Acyltransferase dan Lipoprotein Lipase
serta Hubungannya dengan Kualitas Marbling Daging Domba” adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2015

Hidayati
NRP D161100011

RINGKASAN
HIDAYATI. Identifikasi Keragaman Gen Lecithin Cholesterol Acyltransferase
dan Lipoprotein Lipase serta Hubungannya dengan Kualitas Marbling Daging
Domba. Dibawah bimbingan CECE SUMANTRI, RONNY RAHMAN NOOR
dan RUDY PRIYANTO
Indonesia memiliki beberapa rumpun domba lokal yang memiliki
keragaman fenotip dan genetik yang tersebar di beberapa wilayah. Keragaman
genetik yang dimiliki oleh masing-masing individu atau masing-masing rumpun
merupakan sumber daya genetik yang dapat digunakan dalam peningkatan dan
pengembangan domba lokal di masa yang akan datang. Direktorat Jenderal
Peternakan telah melaporkan peningkatan populasi domba secara Nasional selama
5 tahun terakhir (2011-2014) yaitu 10.725.000 ekor; 11.791.000 ekor; 13.420.000

ekor; 14.926.000 ekor dan 15.716.000 ekor secara berturut-turut. Peningkatan
populasi domba ini merupakan suatu potensi untuk memenuhi permintaan daging
merah yang terus meningkat dari tahun ke tahun. Namun konsumsi daging domba
dan kambing di Indonesia masih rendah yaitu baru sekitar 5% dari total kebutuhan
daging atau setara dengan 0.24 g/kapita/tahun. Masih rendahnya konsumsi daging
kambing dan domba karena harga daging kambing yang relatif tinggi, persepsi
masyarakat bahwa daging domba tidak sehat karena memiliki kandungan
kolesterol dan lemak jenuh yang tinggi dan adanya bau khas yang sulit
dihilangkan. Keberadaan lemak pada bagian intramuskuler atau dikenal dengan
marbling merupakan lemak yang memiliki arti penting dalam penilaian terhadap
daging masak karena berpengaruh terhadap keempukan, juiciness dan flavour
terutama dalam pembuatan steak serta lemak pada bagian ini tidak dapat
dipisahkan langsung karena merupakan bagian dari otot berbeda dengan lemak
pada bagian lainya. Keragaman gen-gen fungsional yang berasosiasi dengan
kualitas marbling merupakan suatu hal penting dalam mengembangkan domba
yang aman untuk dikonsumsi diantaranya dengan eksplorasi keragaman gen
LCAT dan gen LPL melalui metode sekuensing dan selanjutnya keragaman yang
muncul dihubungkan dengan kualitas marbling untuk menemukan penanda
genetik yang dapat digunakan dalam seleksi (Marker Assisted Selection) dalam
pengembangan domba lokal di masa yang akan datang

Hasil penelitian pertama menemukan 3 SNPs baru gen LCAT ekson 6 pada
domba lokal Indonesia yaitu pada posisi basa c.742 C>T; c.770 T >A dan c.882
C>T. Kombinasi 3 SNPs membentuk sembilan diplotipe. Mutasi transisi sitosina
menjadi timina c.742 merupakan synonymous mutation (Ala>Ala); mutasi
transversi timina menjadi adenina c.770 dan mutasi transisi sitosina menjadi
timina c.882 merupakan non-synonymous mutation mengakibatkan perubahan
asam amino phenylalanina>isoleusina dan valina>alanina. Ketiga SNPs yang
ditemukan merupakan SNPs baru yang belum dilaporkan pada populasi domba
lainnya. Keragaman gen LCAT ekson 6 ditemukan pada rumpun domba ekor tipis
sumatera, domba ekor tipis jawa, domba ekor gemuk jawa, domba garut, domba
lembah palu dan domba pulau rote dan tidak ditemukan pada rumpun domba
kissar dan domba sumbawa.
Hasil penelitian kedua menemukan 3 SNPs baru gen LPL bagian 5’UTR
dan ekson 1 yaitu insersi pada posisi basa g.26>C/G, g.27>G dan mutasi pada

c.192T>C. Insersi g.26>C/G dan insersi g.27>G merupakan frameshift mutation
dengan frekuensi munculnya SNPs pada kedua titik mutasi ini relatif rendah pada
domba garut dan domba ekor tipis sumatera. Mutasi transisi pada posisi basa
c.192 T>C merupakan non synonymous mutation karena perubahan basa
mengakibatkan perubahan asam amino valina>alanina (Val>Ala). Mutasi pada

c.192 bersifat polimorfik pada domba garut dan monomorfik pada domba ekor
tipis sumatera.
Penelitian tahap tiga bertujuan untuk mengasosiasikan keragaman gen LPL
c.192 dengan kualitas marbling domba garut. Asosiasi keragaman genotipe gen
LPL dan kualitas marbling dianalisis menggunakan analisis sidik ragama satu
arah dan uji beda nyata terkecil untuk uji lanjut. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa perbedaan genotipe gen LPL mempengaruhi asam lemak heneikosanoat,
dimana genotipe TT (0.04%) memiliki kandungan heneikosanoat lebih tinggi
dibandingkan genotipe CC (0.03%) dan genotipe CT (0.02%). Asam lemak
heneikosanoat merupakan asam lemak minor di alam, namun keberadaan asam
lemak heneikosanoat harus diwaspadai karena keberadaan asam lemak jenuh
rantai panjang dengan atom karbon ganjil ini mengindikasikan terjadinya
akumulasi propionat pada ternak ruminansia. Propionat merupakan asam lemak
terbang hasil fermentasi rumen pada ternak ruminansia yang diberi pakan
konsentrat tinggi dan mengindikasikan terjadinya defisiensi biotin. Biotin
dibutuhkan oleh ternak ruminansia dalam proses konversi propionat menjadi
methyl malonyl CoA yang dibutuhkan dalam proses perpanjangan asam lemak
dengan menyumbangkan dua atom karbon. Defisiensi biotin dapat menghambat
pembentukan methyl malonyl CoA mengakibatkan munculnya asam lemak rantai
panjang dengan atom karbon ganjil. Selain itu keberadaan asam lemak

henekosanoat dapat mengoksidasi asam lemak omega, namun mekanisme
pastinya belum diketahui.
Rasio asam lemak tidak jenuh ganda (ALTJG): asam lemak jenuh (ALJ),
kandungan kolesterol, nilai desirable fatty acid (DFA), nilai indeks atherogenicity
dan rasio (stearat + oleat): palmitat marbling, merupakan indikator bagi daging
domba yang sehat dikonsumsi. Hasil analisis menunjukkan bahwa daging domba
garut relatif masih aman dan sehat dikonsumsi karena kandungan kolesterol
rendah (6.10%-8.91%), nilai indeks atherogenicity berkisar 0.965-1.180, rasio
(stearat + oleat): palmitat berkisar 1.984 – 2.330, nilai desirable fatty acid 42.360
– 47.720 kecuali rasio ALTJG : ALJ lebih rendah (0.062-0.065) dari rekomendasi
0.40.
Kata kunci: asam lemak, domba, gen LCAT, gen LPL, SNPs.

SUMMARY
HIDAYATI. Identification of polymorphisms of Lecithin Cholesterol
Acyltransferase gene and Lipoprotein Lipase gene and its association with
marbling lamb quality on Indonesian local sheep. Supervised by CECE
SUMANTRI, RONNY RAHMAN NOOR and RUDY PRIYANTO.
Indonesia local sheep breeds was scattered in several provinces and its own
phenotypic and genetic characteristic and variation. The existing genetic variation

within and among groups can be utilized to improve their productivity.
Directorate general of animal husbandry has reported increasing of sheep
population last five years (2010-2014) i.e. 10.725.000 heads; 11.791.000 heads;
13.420.000 heads; 14.926.000 heads and 15.716.000 heads respectively.
However, sheep and goat meat consumption in Indonesia was still low, only about
5% of the total demand for meat, equivalent to 0.24 g/capita/ year. The low
consumption of lamb is caused relatively by high cholesterol and saturated fatty
acid of lamb. The consumers are concerned about health factors, due to strong
statements from the medical profession that lamb may contain too much saturated
fatty acid and trans monounsaturated fatty acid. Marbling is important on the
assessment meat because effected the tenderness, juiciness and flavor, especially
in steak. This fat could be separated from muscle. The genes exploration of
Lecithin Cholesterol Acyltransferase and Lipoprotein Lipase polymorphisms by
sequencing method and its association with marbling quality is an important to
Marker Assisted Selection (MAS) can be utilized to development and enhanced
the genetic quality of Indonesian local sheep.
The results of the first study show three novel SNPs of LCAT gene exon 6
in Indonesian local sheep, at base c.742 C>T; c.770 T>A and c.882 C>T. The
combination of three SNPs was formed nine diplotypes. The transition mutation
of cytosine into thymine is synonymous mutation c.742 (Ala>Ala); the

transversion mutation of adenine to thymine at c.770 and transition mutation
thymine to cytosine c.882 were a non-synonymous mutations and resulted of
changed phenylalanine>isoleucine and valine>alanine. So far there is no
published studies describing three novel SNPs. Polymorphisms of LCAT gene
exon 6 were found in sumatran thin tail ed sheep, javanese thin tail ed sheep,
javanese fat tail ed sheep, garut sheep, lembah palu sheep and rote island sheep
and neither in kissar sheep and sumbawa sheep.
The results of the second study were showed three novel SNPs of LPL gene
i.e. the insertion at base g.26>C/G, g.27>G and transition mutation at base
c.192T>C. Insertion g.26.C/G and g.27>G were a frameshift mutation with
appearance frequency relatively low in both sumatran thin tail ed sheep and garut
sheep. Mutations in the base c.192 T>C was non synonymous mutation and
changed of valine>alanine (Val> Ala). This mutation is monomorphic on sumtran
thin tail and polymorphic on garut sheep.
The third study showed the polymorphisms of LPL gene at c.192T>C on
garut sheep was associated with heneicosanoic acid, whereas TT genotype (0.04)
had higher than CC (0.03) and CT (0.02). Heneicosanoic is a minor fatty acid in
nature, but the presence of heneicosanoic (21:0) affect the meat quality. The
presence of odd long-chain saturated fatty acids indicates accumulation of

propionic acid and biotin deficiency. Propionate is one of the volatile fatty acids
of rumen fermentation. Conversion propionate into methyl malonyl CoA requires
biotin. The methyl malonyl CoA was required for elongated fatty acid process by
providing two carbon atoms. Biotin deficiency could inhibit the formation of
methyl malonyl CoA and caused odd long-chain fatty acids. In addition, the
presence of fatty acids heneicosanoic acid could oxidize omega fatty acids, but the
exact mechanism is still unknown.
The results indicate that the lamb of garut sheep is relatively safe and
healthy to be consumed because the cholesterol content still low (6.10%-8.91%),
atherogenicity index of fatty acid was 0.965 -1.180, the ratio of (stearic + oleic):
palmitic was 1.984 - 2.330, and index of desirible fatty acid is 42.360 - 47.720.
They were still within the recommended range, except for PUFA: SFA ratio was
lower (0.062-0.065) than recomended 0.40.
Key words: Fatty acids, LCAT gene, LPL gene, sheep, SNPs.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN
CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE DAN LIPOPROTEIN
LIPASE SERTA HUBUNGANNYA DENGAN KUALITAS
MARBLING DAGING DOMBA

HIDAYATI

Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Ilmu dan Teknologi Peternakan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2015

Penguji pada Ujian Tertutup: 1. Dr Ir Dedi Duryadi Solihin, DEA
Staf Pengajar FMIPA IPB
2. Dr Tuti Suryati, SPt MSi
Staf Pengajar Fakultas Peternakan IPB

Penguji pada Ujian Terbuka : 1. Dr Ir Dedi Rahmat, MSi
Staf Pengajar Fakultas Peternakan UNPAD
2. Prof (R) Dr Ir Ismeth Inounu
Peneliti Utama Puslitbangnak
Kementerian Pertanian RI

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga disertasi ini dapat diselesaikan. Topik kajian yang
diteliti dalam penelitian yang dilaksanakan dari bulan Oktober 2012 sampai
dengan Agustus 2014 adalah “Identifikasi Keragaman Gen Lecithin Cholesterol
Acyltransferase dan Lipoprotein Lipase serta Hubungannya dengan Kualitas

Marbling Daging Domba”. Kedua gen ini memiliki peranan dalam transportasi
lemak dan deposisi lemak di dalam tubuh. Karya ilmiah ini disusun sebagai salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada program studi Ilmu dan
Teknologi Peternakan, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan disertasi ini tidak akan
terlaksana dengan baik tanpa bantuan dan dukungan dari banyak pihak. Oleh
karena itu ucapan terima kasih penulis haturkan kepada komisi pembimbing
Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc selaku ketua, Bapak Prof Dr Ir Ronny
Rahman Noor, MRurSc dan Bapak Dr Ir Rudy Priyanto selaku anggota yang telah
banyak meluangkan waktu, bimbingan, dorongan semangat dan masukan, dalam
penelitian maupun penulisan disertasi ini. Ucapan terima kasih juga penulis
haturkan kepada Kepala Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Bapak Prof Dr
Ir Muladno, MSA berserta staf (Eryk Andreas, SPt MSi, Isyana, S Pt dan Selvi)
yang telah memberikan izin dan kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan
penelitian di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Ucapan yang sama juga
penulis haturkan kepada Kepala Laboratorium Terpadu IPB Baranang Siang dan
staf (Bu Ani dan Mbak Rita). Kepada Dr Ir Salundik, MSi selaku ketua Program
Studi ITP serta staf (Bu Ade dan Mbak Okta) terima kasih atas pelayanan
administrasi yang ramah selama penulis menempuh studi.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal
Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan Nasional atas Beasiswa BPPS 20102013 dan Bantuan Biaya Pendidikan tahun 2014 dari Direktorat Pendidikan
Tinggi Islam, Kementerian Agama RI. Terlaksananya penelitian ini juga tidak
terlepas dari bantuan biaya penelitian dari Lembaga Penelitian dan Pengembangan
Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau melalui SK Rektor Nomor:
988/R/2013 untuk itu penulis haturkan banyak terima kasih kepada mantan
Rektor UIN Suska Riau Prof Dr HM Nazir dan mantan Kepala LPPM UIN Suska
Riau Bapak Drs Husni Thamrin MS. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan
kepada mantan Dekan Fakultas Pertanian dan Peternakan UIN Suska Riau Ibu Ir
Eniza Saleh, MSi yang telah memberikan bantuan biaya publikasi melalui DIPA
Fakultas Pertanian dan Peternakan UIN Suska Riau tahun 2014.
Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Isnandar Putra, SPt dan drh
Hanif dari Dinas Peternakan Provinsi Sumatera Barat yang telah banyak
membantu dalam pengambilan sampel domba ekor tipis sumatera begitu juga
kepada Holfinaldi, SPt atas luangan waktu untuk survey lokasi penelitian. Berikut
kepada Bapak Saharudin dan peternak domba di Kecamatan Koto Tangah Padang
juga diucapkan terima kasih. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada
Bapak Dr Ir Agus Susanto, MSc beserta istri atas persaudaraan dan diskusi
molekulernya selama ini. Kepada ibu Ir Sri Rahayu, MS juga diucapkan terima
kasih atas bantuan materi penelitian domba garut. Semoga Allah SWT membalas
segala kebaikan yang telah Bapak dan Ibu berikan selama ini.

Ungkapan terima kasih yang tulus penulis haturkan kepada yang tercinta
Ayahnda H Heldi Syair dan Ibunda Hj Wasni Nawas, kakak/abang, abang/kakak
ipar serta seluruh keluarga besar atas segala doa, kasih sayang, dukungan baik
moril maupun materil serta motivasi yang diberikan sehingga disertasi ini dapat
diselesaikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada suami Edwin
Perwira, ST MSc M Eng dan kedua putriku Raisha Adiva Khalila dan Naira
Aliya Rafifa, terima kasih atas izin kuliah, doa, pengertian, kasih sayang dan
dukungan yang diberikan selama ini. Berikut ucapan terima kasih juga penulis
tujukan kepada semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat penulis
sebutkan satu per satu, untuk itu penulis memohon maaf yang sebesar-besarnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2015

Hidayati

xvii

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
2 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL
ACYLTRANSFERASE PADA DOMBA LOKAL INDONESIA
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
3 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LIPOPROTEIN LIPASE PADA
DOMBA EKOR TIPIS SUMATERA DAN DOMBA GARUT
Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan
4 ASOSIASI KERAGAMAN GEN LIPOPROTEIN LIPASE c.192
DENGAN KUALITAS MARBLING DAGING DOMBA GARUT

1
1
2
3
3
4

5
6
8
11
19
20
21
25
27
32
33

Pendahuluan
Bahan dan Metode
Hasil dan Pembahasan
Simpulan

34
35
38
46

5 PEMBAHASAN UMUM

47

6 SIMPULAN DAN SARAN

50

DAFTAR PUSTAKA

51

LAMPIRAN

58

xviii

DAFTAR TABEL
2.1 Diplotipe gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia
2.2 Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan nilai
chi kuadrat gen LCAT pada posisi basa c.742 domba lokal Indonesia
2.3 Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan nilai
chi kuadrat gen LCAT pada posisi basa c.770 domba lokal Indonesia
2.4 Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan nilai
chi kuadrat gen LCAT pada posisi basa c.882 domba lokal Indonesia
3.1 Diplotipe sekuens bagian dari 5’UTR dan ekson 1 gen LPL domba
ekor tipis sumatera dan domba garut
3.2 Frekuensi genotipe dan frekuensi gen LPL domba ekor tipis sumatera
dan domba garut
3.3 Nilai heterosigositas dan nilai chi kuadrat gen LPL domba ekor tipis
sumatera dan domba garut
4.1 Kandungan lemak, kolesterol dan komposisi asam lemak domba garut
pada genotipe gen LPL yang berbeda
4.2 Kandungan lemak dan kolestrol beberapa breed domba
4.3 Kandungan ALJ, ALTJT, ALTJG dan rasio ALTJG:ALJ beberapa breed
domba
4.4 Profil asam lemak marbling domba garut berdasarkan genotipe gen LPL
yang berbeda (%)
4.5 Kandungan lemak, kolesterol dan profil asam lemak marbling domba
garut berdasarkan genotipe gen LPL yang berbeda (mg/100g)
4.6 Profil asam lemak pada breed domba lainnya

12
17
17
18
30
31
32
38
39
40
42
43
44

DAFTAR GAMBAR
1.1 Alur kerangka berpikir penelitian
3
2.1 Peranan LPL dan LCAT dalam transport lemak dan kolesterol dalam tubuh
ternak
7
2.2 Struktur gen LCAT, terdiri atas 6 ekson (I, II, III, IV, V dan VI) dan
5 intron
7
2.3 Sekuen amplikon gen LCAT (gen bank GQ.150556.1)
10
2.4 Hasil amplifikasi PCR gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia
12
2.5 Aligment sekuens gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia
13
2.6 Potongan sekuens gen LCAT ekson 6 yang menunjukkan terjadinya
14
mutasi pada posisi basa c.742, c.770 dan c.882
3.1 Transpor lemak ke jaringan pada ternak ruminansia dan non ruminansia 23
3.2 Mekanisme aktivasi gen LPL pada otot
24
3.3 Struktur gen LPL, terdiri atas 10 ekson (1,2, 3…10) dan 9 intron
25
3.4 Amplikon sekuen gen LPL (gen bank X.68308.1)
24

xix

3.5 Hasil amplifikasi PCR gen LPL daerah 5’UTR dan bagian ekson 1
3.6 Aligmnet gen lipoprotein lipase domba garut dan domba ekor tipis
sumatera dengan gen bank nomor akses X.68308.1
3.7 Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan insersi pada posisi basa
c.26 dan c.27
3.8 Aligment sekuens protein gen LPL domba garut dan domba ekor tipis
sumatera
3.9 Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan adanya mutasi pada posisi
c.192 T>C pada domba garut
4.1 Otot longissimus dorsi
4.2 Nilai desirable fatty acid (DFA), atherogenicity index dan rasio
(stearat+oleat): palmitat marbling domba garut

27
28
29
30
31
36
41

DAFTAR LAMPIRAN
1
2

Ovis aries lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT) gene, exons 2, 3, 6
dan partial cds gen bank: GQ150556.1
58
O.ovis mRNA for lipoprotein lipase gen bank: X.68308.1
59

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Peningkatan konsumsi daging di Indonesia diikuti dengan permintaan
masyarakat akan penyediaan daging ASUH (Aman, Sehat, Utuh dan Halal),
ramah lingkungan dan dijamin keberlanjutannya yang memiliki daya saing dan
sesuai dengan kebutuhan pasar domestik. Konsumsi daging domba dan kambing
di Indonesia masih sangat rendah, yaitu sekitar 5% dari total kebutuhan daging
atau setara dengan 0.24 g/kapita/tahun (Inounu 2011). Direktorat Jenderal
Peternakan telah melaporkan peningkatan populasi domba secara Nasional selama
5 tahun terakhir (2011-2014) yaitu 10.725.000 ekor; 11.791.000 ekor; 13.420.000
ekor; 14.926.000 ekor dan 15.716.000 ekor secara berturut-turut. Peningkatan
populasi domba ini merupakan suatu potensi untuk memenuhi permintaan daging
merah yang terus meningkat dari tahun ke tahun. Masih rendahnya konsumsi
daging kambing dan domba karena harga daging yang relatif tinggi dan
berkembang persepsi pada masyarakat bahwa daging kambing dan domba
memiliki kandungan kolesterol tinggi, kandungan asam lemak jenuh tinggi dan
bau khas yang sulit dihilangkan.
Lemak di dalam tubuh ternak ditemukan pada jaringan adipose, hati,
plasma, sel darah merah, otot rangka serta otak dan jaringan syaraf (Leat 1983).
Jaringan adipose ditemukan dalam bentuk lemak visceral, lemak subkutan, lemak
intermuskular dan lemak intramuskuler (marbling) (Kauffman dan Breidenstein
1994). Lemak intramuskuler merupakan butiran-butiran lemak yang ditemukan di
dalam otot (Aberle et al. 2001). Lemak intramuskuler memberikan pengaruh
terhadap penilaian konsumen terhadap daging karena dapat mempengaruhi
keempukan, juiciness dan flavor (Miller 1994). Disisi lain keberadaan lemak di
dalam makanan juga merupakan poin penting dalam memilih jenis makanan yang
akan dikonsumsi terutama bagi penderita penyakit-penyakit tertentu.
Konsumsi daging yang mengandung asam lemak jenuh (ALJ) tinggi
terutama laurat dan miristat dapat mengakibatkan otot rentan terhadap resistensi
insulin sehingga timbul hiperinsulinemia atau meningkatkan produksi kolesterol
oleh hati (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Begitu juga mengkonsumsi daging
dengan kandungan kolesterol tinggi berdampak timbulnya atherosclerosis atau
penebalan pembuluh darah ke jantung. Rasio asam lemak tak jenuh ganda
(ALTJG): ALJ yang tinggi dan kandungan kolesterol rendah pada daging domba
dibutuhkan sebagai pangan fungsional bagi penderita penyakit-penyakit tertentu.
Deposisi lemak pada jaringan ditentukan oleh keseimbangan proses-proses
yang berlangsung di dalam tubuh meliputi lipogenic, lipolitic, transpor asam
lemak dan jumlah asam lemak yang digunakan. Keseimbangan proses-proses
tersebut ditentukan oleh jumlah lemak yang dimakan, sintesis de novo asam
lemak, sintesis triasilgliserol, degradasi lipid dan proses transpor asam lemak
(Zhao et al. 2010).
Distribusi lemak, komposisi asam lemak dan tipe serabut otot, sekitar 35%
dipengaruhi oleh genetik (Williams 2008). Karamichou et al. (2006) menyatakan
bahwa nilai heritabilitas komposisi asam lemak marbling domba scottish
blackface berkisar sedang sampai tinggi, mengindikasikan bahwa seleksi pada
tetua dapat meningkatkan performans asam lemak pada turunannya.

2

Seleksi terhadap kualitas marbling menggunakan metode konvensional
sangat sulit dan relatif mahal sehingga dalam program seleksi berdasarkan
fenotipe, kualitas marbling tidak umum dilakukan. Alternatif yang dapat
dilakukan adalah melalui seleksi genom. Seleksi genom diawali dengan penemuan
kandidat gen yang berasosiasi dengan sifat-sifat yang diinginkan. Salah satunya
melalui eksplorasi single nucleotide polymorphisms (SNPs) untuk mengetahui
genotipe ternak dan selanjutnya dihubungkan dengan sifat-sifat yang dijadikan
sebagai kriteria seleksi. SNP merupakan variasi sekuen DNA yang muncul ketika
satu nukleotida (A, T, C atau G) berbeda dari sekuen pada umumnya.
Guo et al. (2014) melaporkan bahwa kualitas marbling sapi dan domba
ditentukan oleh poligen dan ekspresinya dipengaruhi oleh faktor lingkungan
seperti penyakit dan pakan. Keberadaan dan aktivitas enzim dalam tubuh ternak
disandikan oleh gen. Diantara enzim yang berperan terhadap kandungan
kolesterol dan profil asam lemak adalah lecithin cholesterol acyltransferase
(LCAT) dan lipoprotein lipase (LPL).
Lecithin cholesterol acyltransferase adalah soluble enzyme yang mampu
mengonversi kolesterol dan lecitin menjadi ester kolesterol dan lisolecitin pada
permukaan high density lipoprotein (HDL) dan berperan penting dalam
metabolisme lipoprotein, terutama dalam proses reverse cholesterol transport.
Enzim ini disintesis di hati tapi sirkulasinya pada plasma darah sebagai komplek
komponen HDL. Ketiadaan enzim ini menyebabkan akumulasi kolesterol bebas
pada jaringan daging dan darah.
Lipoprotein lipase adalah enzim kunci yang berperan utama pada
metabolisme dan transpor lipoprotein serta memberikan pengaruh penting pada
level trigliserida darah, mengontrol partisi trigliserida pada jaringan adipose dan
otot sehingga meningkatkan penyimpanan lemak atau menyediakan energi dalam
bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot (Ren et al. 2002; Dunner et al. 2013).
Identifikasi keragaman gen LCAT dan LPL diperlukan dalam rangka
mencari penanda genetik (genetic marker) yang dapat digunakan sebagai Marker
Assisted Selection (MAS) untuk menghasilkan dan mengembangkan dombadomba lokal yang mampu menghasilkan daging yang aman dan sehat untuk
dikonsumsi.
Perumusan Masalah
Kualitas lemak daging mempengaruhi penilaian konsumen terhadap daging
masak. Pada umumnya lemak mengandung gliserol ester, kolesterol, phospholipid
dan asam lemak. Lemak disusun atas rangkaian asam lemak yang dikelompokkan
ke dalam 3 kategori berdasarkan ikatan rangkap yang dimilikinya yaitu asam
lemak jenuh (ALJ), asam lemak tak jenuh tunggal (ALTJT) dan asam lemak tak
jenuh ganda (ALTJG). Timbunan lemak pada otot ditentukan oleh keseimbangan
dari proses yang berlangsung dalam tubuh. Keseimbangan proses ini juga
dipengaruhi oleh jumlah lemak yang dimakan.
Proses pembentukan lemak dan deposisi lemak di dalam tubuh dipengaruhi
oleh peran serangkaian enzim yang saling bekerja sama di dalam tubuh. Enzim
disandikan oleh gen penyandi. Setiap mutasi yang muncul pada suatu gen dapat
mempengaruhi fungsi dari protein yang disandikan dan atau tidak dapat
menghasilkan protein yang disandikan. Keaneka ragaman rumpun domba lokal
Indonesia berpotensi memiliki gen-gen potensial yang perlu dieksplorasi lebih

3

lanjut. Eksplorasi keragaman gen-gen potensial yang berpengaruh terhadap
kualitas marbling sapi ciamis dan sapi PO telah dilaporkan Hilmia (2013) melalui
keragaman gen steoryl CoA desaturase, namun keragaman gen belum
mempengaruhi profil asam lemak. Eksplorasi terhadap keragaman gen-gen
potensial terhadap kualitas marbling domba lokal Indonesia belum pernah
dilaporkan selama ini. Diantara gen yang diduga berhubungan dengan kualitas
marbling adalah LCAT dan LPL. Alur kerangka berpikir penelitian disajikan
pada Gambar 1.1.

Gambar 1.1 Alur kerangka berpikir penelitian
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah:
1. Mengidentifikasi keragaman gen LCAT pada domba lokal Indonesia
2. Mengidentifikasi keragaman gen LPL pada domba ekor tipis sumatera dan
domba garut
3. Menganalisis hubungan perbedaan genotipe gen LPL terhadap kualitas
marbling otot longissimus dorsi domba garut.
Manfaat Penelitian
Keluaran dari penelitian ini adalah;
1. Menginformasikan keragaman gen LCAT dan gen LPL pada domba lokal
Indonesia sebagai salah satu upaya dalam mengeksplorasi sumber daya genetik
domba lokal Indonesia yang dapat dijadikan sebagai data base dalam
pengembangan domba lokal Indonesia di masa yang akan datang.
2. Ditemukannya penanda genetik penentu kualitas lemak intramuskuler daging
domba yang dapat dijadikan sebagai Marker Assisted Selection (MAS) dalam
menghasilkan ternak domba dengan kualitas lemak intramuskuler yang baik.

4

3. Dalam jangka panjang dapat membentuk breed domba lokal yang
menghasilkan daging yang menyehatkan.
Hipotesis
Hipotesis dalam penelitian ini adalah:
1. Adanya keragaman genotipe gen LCAT dan gen LPL pada domba lokal
Indonesia.
2. Keragaman genotipe gen LCAT dan gen LPL akan memberikan pengaruh yang
berbeda terhadap kandungan lemak total, kolesterol dan profil asam lemak otot
longissimus dorsi domba garut.

5

2 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL
ACYLTRANSFERASE PADA DOMBA LOKAL INDONESIA
Abstrak
Lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) adalah soluble enzyme yang mampu
mengonversi kolesterol dan lesitin menjadi ester kolesterol dan lisolesitin pada
permukaan high density lipoprotein dan berperan dalam metabolisme lipoprotein.
Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi single nucleotide polymorphisms
(SNPs) gen LCAT pada domba lokal Indonesia. Total 118 DNA genom domba
lokal Indonesia, terdiri dari domba ekor tipis sumatera (43 ekor); domba garut (19
ekor); domba ekor tipis jawa (17 ekor); domba ekor gemuk jawa (6 ekor), domba
pulau rote (7 ekor); domba kissar (7 ekor); domba sumbawa (10 ekor) dan domba
lembah palu (9 ekor) digunakan dalam penelitian ini. Amplifikasi DNA genome
menggunakan Polymerase Chain Reaction pada fragment ekson 6 gen LCAT
menghasilkan amplikon dengan panjang 250 bp dan metode direct sequencing
digunakan untuk mengidentifikasi keragaman sekuens. Hasil sekuens dianalisis
menggunakan software Bioedit dan MEGA 5.2. Kemudian sekuens disejajarkan
dengan metode Clustal W dan selanjutnya diBLAST dengan gene bank nomor
akses GQ.150556.1. Hasil penelitian menunjukkan ditemukan tiga SNPs baru
yaitu pada posisi basa c.742 C>T, c.770 T>A dan c.882 C>T. Substitusi sitosina
menjadi timina c.742 merupakan synonymous mutation; timina menjadi adenina
c.770 dan sitosina menjadi timina c.883 merupakan non synonymous mutation.
Kata kunci: Domba, gen LCAT, PCR, sekuens, SNPs
Abstract
Lecithin Cholesterol Acyltransferase (LCAT) was a soluble enzyme that
converted cholesterol and lecithin to cholesteryl esters and lysolecithins on the
surface of high density lipoprotein and played in lipoprotein metabolism. The
research was aimed to explore single nucleotide polymorphisms (SNPs) of LCAT
gene in Indonesian local sheeps. A total of 118 genomic DNA of Indonesian local
sheeps used in this study, consisted of sumatran thin tail ed sheep (43 heads);
garut sheep (19 heads); javanese thin tail ed sheep (17 heads); javanese fat tail ed
sheep (6 heads), rote island sheep (7 heads); kissar sheep (7 heads); sumbawa
sheep (10 heads) and lembah palu sheep (9 heads). Polymerase chain reaction
was used to amplify genomic DNA for exon 6 (250 bp) and direct sequencing
method was used to identify polymorphism sequences. The results of sequence
were analyzed with BioEdit and MEGA 5.2 software. The sequences were aligned
with Clustal W method and BLAST sequence obtained from Gene Bank with
accession number GQ 150556.1. The results were showed three novel SNPs, i.e.
c.742C>T, c.770 T>A dan c.882 C>T. Substitution cytosine to thymine c.742 is a
synonymous mutation; thymine to adenine c.770 and cytosine to thymine c.882
are non synonymous mutation.
Key words: LCAT gene, PCR, sequences, sheeps, SNPs

6

Pendahuluan
Domba merupakan salah satu ternak potong yang memiliki nilai penting
bagi masyarakat Indonesia terutama dalam menyediakan daging segar, hewan
kurban (Inounu 2011), sosial, budaya dan sumber gen yang digunakan dalam
memperbaiki mutu ternak lokal melalui persilangan diantara ternak lokal atau
dengan bangsa eksotik lainnya (Sumantri et al. 2007). Menurut FAO (2002),
ternak lokal penting dilindungi karena telah beradaptasi dengan lingkungan
setempat, dapat bertahan pada kondisi pakan seadanya dan lebih tahan terhadap
penyakit dan parasit.
Domba lokal Indonesia memiliki keragaman yang tinggi berdasarkan
karakter morfometrik (Sumantri et al. 2007), keragaman DNA mikrosatelit
(Sumantri et al. 2008a dan Jakaria et al. 2012). Domba merupakan salah satu
ternak potong di Indonesia. Berkembangnya persepsi di masyarakat bahwa daging
domba mengandung kolesterol dan kandungan asam lemak jenuh (ALJ) tinggi,
harga yang relatif mahal, bau daging yang kurang diminati dan sulit untuk
dihilangkan merupakan faktor-faktor yang diduga sebagai penyebab rendahnya
konsumsi daging domba secara Nasional yaitu sekitar 5% atau setara dengan 0.24
g/kapita/tahun. Konsumsi makanan dengan kandungan kolesterol dan asam lemak
jenuh tinggi ditenggarai sebagai pemicu penyakit jantung. Kromhout et al. (1995),
telah melaporkan bahwa konsumsi makanan mengandung asam lemak jenuh dan
kolesterol yang tinggi merupakan faktor penting penentu angka penderita penyakit
jantung pada 9 negara.
Kandungan lemak tubuh ternak meningkat di antara awal pertumbuhan
sampai saat dipotong dan proporsi asam lemak juga turut berubah (Wood et al.
2008). Kandungan ALJ dan asam lemak tak jenuh tunggal (ALTJT) meningkat
sangat cepat seiring dengan peningkatan lemak, berbeda dengan asam lemak tak
jenuh ganda (ALTJG) cenderung menurun sehingga rasio ALTJG:ALJ juga akan
menurun (Smeet et al. 2004). Berbeda dengan daging dengan kandungan lemak
sedikit (lean), proporsi ALTJG mayor lebih tinggi (Wood et al. 2008). Beberapa
penelitian menunjukkan bahwa kandungan kolesterol dan asam lemak diatur oleh
gen-gen fungsional.
Lecithin Cholesterol Acyltransferase (LCAT) adalah enzim kunci yang
berperan dalam katabolisme ekstra seluler dari lipoprotein darah, disintesis di hati
dan disekresikan ke dalam plasma darah. Enzim ini bekerja mengonversi
kolesterol dan lesitin menjadi ester kolesterol dan lisolesitin pada permukaan high
density lipoprotein (HDL), terutama dalam proses reverse cholesterol transport
(Kaplanova et al. 2010; Crisa et al. 2010; Qiao et al. 2010). Defisiensi enzim ini
ditenggarai dapat mengakibatkan akumulasi kolesterol bebas di dalam darah dan
jaringan (Klein et al. 1993; Kaplanova, et al. 2010; Qiao et al. 2010).
Metabolisme Kolesterol dan Peran Lecithin Cholesterol Acyl Transferase
Kolesterol di dalam tubuh berasal dari pakan dan sintesis de novo pada hati
dan jaringan lainnya. Kolesterol ditemukan dalam bentuk kolesterol bebas atau
kombinasi kolesterol dengan asam lemak rantai panjang (long chain fatty acid)
dalam bentuk kolesterol ester. Lipoprotein memiliki peranan utama dalam
metabolisme kolesterol (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Reaksi LCAT terhadap
lipoprotein melewati beberapa tahapan yaitu dimulai dengan pengikatan enzim

7

terhadap permukaan lipid, diikuti dengan aktivasi LCAT oleh apolipoprotein,
pengikatan substrat lipid dan tahapan katalitik yang mengakibatkan peningkatan
produk lipid (Jonas 2000). Kolesterol masuk ke jaringan melalui low density
lipoprotein (LDL) dan dipindahkan dari jaringan oleh HDL melalui mekanisme
reverse cholesterol transport dengan bantuan enzim LCAT (Cheeke dan
Dierenfeld 2010). Saat HDL menerima kolesterol dari membran sel, kolesterol
bebas mengalami esterifikasi oleh LCAT. Terdapat dua mekanisme yaitu HDL
memindahkan kolesterol bebas dan ester kolesterol ke hati dan kolesterol bebas
dan ester kolesterol dibentuk menjadi very low density lipoprotein (VLDL)
melalui CETP (Cholesterol Ester Transfer Protein). VLDL yang mengalami
hidrolisis dengan perantaraan LPL menjadi LDL. Kolesterol LDL dibuang dari
darah melalui interaksi dengan reseptor LDL. Kejadian ini memungkinkan
kolesterol masuk ke dalam sel jaringan (Cheeke dan Dierenfeld 2010).
Mekanisme peranan LPL dan LCAT dalam transpor lemak dan kolesterol dalam
tubuh ternak dijelaskan pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Peranan LPL dan LCAT dalam transpor lemak dan kolesterol dalam
tubuh ternak (Sumber: http://lipidlibrary.aocs.org/lipids/ lipoprot/
index.htm)
Struktur, Letak dan Fungsi Gen LCAT
Enzim LCAT dikodekan oleh gen LCAT, pada domba terletak pada
kromosom ke 14 (www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb). Gen LCAT terdiri
atas 6 ekson dan 5 intron. Struktur gen LCAT disajikan pada Gambar 2.2. Ekson
enam merupakan ekson yang paling panjang yaitu 559 bp (Gene Bank nomor
akses GQ.150556.1).

Gambar 2.2 Struktur gen LCAT, terdiri atas 6 ekson (I, II,III, IV, V dan VI) dan
5 intron

8

Beberapa penelitian telah melaporkan adanya keragaman gen LCAT pada
ternak yang berhubungan dengan sifat-sifat produksi yaitu pada babi (Kaplanova
et al. 2010; Qiao et al. 2010); domba (Crisa et al. 2010; Moioli et al. 2012). Crisa
et al. (2010) menemukan adanya satu SNP pada intron 2 g.181 T>C dan 2 SNPs
pada exon 6 c.806 G>A dan c.1075 T>C. Mutasi ini berhubungan negatif dengan
asam lemak jenuh ganda C18:2 (asam lemak linoleat) dan berhubungan positif
dengan produksi dan kandungan asam lemak jenuh stearat pada susu domba
(Crisa et al. 2010; Moioli et al. 2012). Qiao et al. (2010) melaporkan satu SNP
pada posisi intron 1 g.266 C>G berhubungan sangat nyata dengan beberapa
karakteristik karkas pada babi.
Single nucleotide polymorphism merupakan variasi yang muncul pada
sekuen DNA ketika satu nukleotida (A, T, C atau G) berbeda dari sekuen pada
umumnya. SNP digunakan untuk mengetahui keragaman suatu gen dan frekuensi
genotipe yang muncul pada suatu populasi ternak. Asosiasi keragaman SNP
dengan sifat-sifat yang memiliki nilai ekonomis dan memiliki arti penting untuk
menemukan penanda genetik (genetic marker) yang dapat digunakan dalam
seleksi genom.
Seleksi genom digunakan untuk memprediksi nilai pemuliaan (breeding
value) untuk sifat-sifat kuantitatif pada ukuran populasi yang kecil dan akurasi
terhadap Estimated Breeding Value (EBV) rendah. Seleksi genom dapat
ditingkatkan melalui eksplorasi SNPs pada kandidat lokus dan memperkirakan
pengaruh SNPs pada populasi yang berbeda (Dunner et al. 2013).
Langkah awal yang dapat dilakukan adalah melakukan eksplorasi dan
identifikasi keragaman gen-gen potensial yang diasumsikan berhubungan dengan
sifat-sifat yang diinginkan. Eksplorasi keragaman gen LCAT pada domba lokal
Indonesia merupakan upaya untuk menemukan Marker Assisted Selection (MAS)
untuk memproduksi dan mengembangkan domba lokal Indonesia di masa yang
akan datang.
Bahan dan Metode
Tempat dan Waktu
Pengambilan sampel darah domba ekor tipis sumatera dilakukan di
Kecamatan Koto Tangah Kota Padang, Sumatera Barat pada bulan Oktober 2012
dan pengambilan sampel darah domba garut dilakukan di Kandang B Fakultas
Peternakan IPB Bogor pada bulan Juni 2013. Ekstraksi dan amplifikasi PCR
dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB
dari bulan Oktober 2012 s/d Juni 2013. Identifikasi keragaman segmen gen
LCAT ekson 6 dilakukan dengan metode direct sequencing dengan mengirimkan
sampel ke First Base Laboratory Juni s/d Agustus 2013.
Materi
Sampel darah domba lokal Indonesia sebanyak 57 sampel darah terdiri dari
43 sampel domba ekor tipis sumatera berasal dari Kecamatan Koto Tangah
Padang, Sumatera Barat dan 14 sampel domba garut (Jawa Barat) diambil pada
bagian vena jugularis menggunakan venojact. Darah disimpan dalam tabung 5
ml dan ditambahkan ethanol absolut. Selain itu juga digunakan 61 koleksi DNA
domba Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB terdiri
dari domba garut, Jawa Barat (garut-margawati tipe pedaging 5); ekor tipis jawa-

9

Jawa Barat (Jonggol, 7; MT Farm Bogor, 10); ekor gemuk jawa-Jawa Timur
(Situbundo, 6); Pulau Rote (7); Kissar (7); Sumbawa-Nusa Tenggara Barat (10)
dan Lembah Palu (9). Total DNA yang diuji dalam penelitian ini adalah 118
sampel domba lokal Indonesia.
Ekstraksi DNA
Ektraksi DNA menggunakan metode Phenol-chloroform technique
(Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 200 µL sampel darah
dipindahkan ke dalam tabung 1.5 mL lalu ditambahkan 1000 µL delution water,
divortex dan didiamkan selama ± 20 menit pada suhu ruang. Selajutnya proses
presipitasi dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm selama 5 menit.
Larutan supernatan yang terbentuk dibuang dan ditambahkan 200 µl 1 x sodium
tris EDTA (1 x STE), 40 µl sodium dosesil sulfate (SDS) 10% dan 20 µl
Proteinase K (5 mg/ml). Larutan selanjutnya dikocok perlahan pada suhu 550C
selama 2 jam. Kemudian ditambahkan larutan phenol 400 µl, 400 µl
chloroform:isoamyl alcohol = 24:1 (CIAA) dan 40 µL NaCl 5 M. Tabung
selanjutnya dikocok pada suhu ruang selama 1 jam dan disentrifugasi selama 5
menit. Larutan bening selanjutnya dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru dan
ditambahkan 800 µl ethanol absolute, 40 µL NaCl 5 M, dan disimpan pada suhu 20oC selama semalam. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada kecepatan 12.000
rpm selama 5 menit, supernatan yang terbentuk dibuang lalu tabung didiamkan
dalam keadaan terbuka sampai alkohol yang ada pada tabung hilang. Selanjutnya
ditambahkan 100 µL TE (Tris EDTA) 80% pada tabung tersebut dan disimpan
pada suhu -200C.
Amplifikasi Gen LCAT Ekson 6 dengan Polymerase Chain Reaction
Sampel DNA diamplikasi menggunakan mesin PCR GeneAmp PCR sistem
9700 dan Master Cycler Personal 22331 Eppendorf, menggunakan primer yang
dirancang sendiri menggunakan program Primer Blast dari NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools.primer-blast)
dengan
referensi
yang
digunakan adalah gen bank nomor akses GQ.150556.1. Primer forward yang
digunakan adalah F’5- GAGCAGCGCATGACGACAACG-γ’ dan primer reverse
F’5- AGGTGCTAGGAGTGGGCAGGC-γ’. Posisi primer forward dan primer
reverse pada sekuens GenBank GQ.150556.1 mengapit pada fragment ekson 6
gen LCAT pada posisi basa ke 701 sampai 950 dengan panjang product 250 bp
(Gambar 2.3).
Setiap reaksi PCR terdiri dari 50 ng (2 – 3 µl) DNA template, 0.25 µM
primer forward and reverse, 12.5 µL Dream Tag Green Master Mix dari Thermo
Scientific #K1081 ditambah dengan dH2O hingga 25 µL. Kondisi mesin PCR
diatur dengan suhu denaturasi awal pada 950C selama 5 menit dan diikuti dengan
35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 950C selama 30 detik, annealing
pada suhu 620C selama 45 detik dan ekstensi pada suhu 720C selama satu menit.
Ekstensi akhir dilakukan pada suhu 720C selama 5 menit.
Hasil dari PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose (1.5%
agarose/0.5x TBE) menggunakan 200 ng/mL ethidhium bromide (EtBr).
Penentuan panjang produk menggunakan ladder marker 100 bp. Elektroforesis
berlangsung pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Selanjutnya visualisasi gel
menggunakan UV transilluminator untuk mengetahui berhasil atau tidaknya

10

proses amplifikasi primer pada gen target. Selanjutnya produk PCR dikirim ke
First Base Laboratory Singapore untuk analisis direct sequencing menggunakan
Dideoxy Sequencing ABI 3730 XL Automated DNA Sequencer.

Gambar 2.3 Amplikon gen LCAT (gen bank nomor akses GQ.150556.1) dengan
panjang 250 bp mengapit sekuens gen LCAT c.701-c.950 merupakan
bagian dari ekson 6. Primer ditandai dengan garis bawah, bold dan
italic.
Analisis Data
Hasil sekuens fragmen gen LCAT ekson 6 dianalisis menggunakan BioEdit
(Hall 2011) dan MEGA versi 5.2 (Kumar et al. 2004) menggunakan metode
Clustal W. Selanjutnya hasil sekuens disejajarkan menggunakan BLAST (Basic
Local Aligmnet Search Tool) dengan sekuens Gene Bank nomor akses
GQ.150556. POP GENE ver.1.31 (Yeh et al. 1999) software untuk menghitung
frekuensi gen, frekuensi genotipe, uji chi kuadrat dan nilai heterosigositas pada
setiap titik mutasi.
Rumus untuk menghitung frekuensi gen dan frekuensi genotipe menurut
Nei dan Kumar (2000) yaitu;
;
Keterangan:
xi =
xj =
=
=
N =

Frekuensi gen ke-i
Frekuensi gen ke-j
Jumlah sampel dengan genotipe ii
Jumlah sampel dengan genotipe ij
Jumlah sampel

Frekuensi genotipe dihitung menggunakan rumus:
;
Keterangan:
= Frekuensi genotipe ke-ii
= Frekuensi genotipe ke-jj
= Frekuensi genotipe ke-ij

11

Penyimpangan frekuensi genotipe yang muncul dari keseimbangan HardyWeinberg dianalisis menggunakan chi square test (
) berdasarkan rumus
Nei dan Kumar (2000);
∑
Keterangan:
= chi square test
O = Frekuensi genotipe sampel yang diamati
E = Frekuensi genotipe harapan
Nilai heterosigositas pengamatan (Ho) dan harapan (He) dihitung
menggunakan POPGENE 32 versi 1.31 software (Yeh et al. 1999):

Keterangan:
=
=
=
=

∑

∑

∑

∑

Heterosigositas observasi
Heterosigositas harapan
Ukuran populasi efektif
Frekuensi genotipe AiAj, populasi ke-k

Hasil dan Pembahasan
Single Nucleotide Polymorphisms Gen LCAT Ekson 6 Pada Domba Lokal
Indonesia
Hasil amplifikasi DNA pada fragmen gen LCAT (Gambar 2.4),
menghasilkan amplikon dengan panjang 250 bp, yang mengapit sekuens gen
LCAT pada posisi basa ke 701 sampai 950 bp merupakan sebagian dari ekson 6
(Lampiran 1). Hasil aligment 118 sekuens gen LCAT domba lokal Indonesia
dengan sekuens gen bank nomor akses GQ.150556.1 (Lampiran 1), menunjukkan
3 titik mutasi baru yaitu pada posisi basa c.742 C>T, c.770 T>A dan c.882 C>T.
Tiga SNPs ini membentuk 9 diplotipe (Gambar 2.5) dan tersebar pada 8 rumpun
domba lokal Indonesia. Tiga diplotipe dengan frekuensi yang tinggi adalah
diplotipe H1H1 (66.10%), H1H3 (16.10%) dan H1H5 (5.08%) (Tabel 2.1). Tiga
SNPs yang ditemukan dalam penelitian ini merupakan SNPs baru yang belum
pernah dilaporkan oleh peneliti lain. Keragaman gen LCAT pada domba lokal
Indonesia bersifat polimorfik pada 6 rumpun yaitu domba ekor tipis sumatera,
domba ekor tipis jawa, domba ekor gemuk jawa, domba lembah palu dan domba
pulau rote dan monomorfik pada rumpun domba kissar dan domba sumbawa.
Mutasi transisi pada posisi basa c.742, substitusi sitosina menjadi timina
merupakan synonymous mutation, tidak merubah asam amino alanina (Ala>Ala)
(Gambar 2.6). Mutasi ini ditemukan pada diplotipe H2H2 (4 ekor) dan H4H10 (1
ekor), yang tersebar pada domba ekor tipis sumatera (2 ekor); domba garut (2
ekor) dan domba lembah palu (1 ekor). Genotipe heterozigot (CT) ditemukan

12

pada H1H2 dan H1H4 pada domba ekor tipis sumatera (1 ekor) dan domba ekor
tipis jawa (4 ekor). Menurut Komar (2007), secara alami, munculnya silent SNP
bisa menyandikan sintesis protein dengan sekuens asam amino yang sama, namun
dapat mengakibatkan struktur dan fungsi protein yang disandikan berbeda.
Mutasi transversi yang muncul pada posisi basa c.770 yaitu subsitusi timina
menjadi adenina dan mutasi transisi pada posisi basa c.882 yaitu subsitusi sitosina
menjadi timina (Gambar 7) merupakan non-synonymous mutation, dimana
perubahan basa mengakibatkan perubahan penilalanina menjadi isoleusina
(Phe>Ile) dan alanina menjadi valina (Ala>Val). Non-synonymous SNPs
(nsSNPs), dapat merubah susunan asam amino yang berdampak pada perubahan
protein yang terbentuk, pada manusia umumnya berhubungan dengan penyakit
keturunan (Bao dan Cui 2005).
01 02 03 04 05 06 07 08 M 09 10 11 12 13 14 15 16

250 bp

Gambar 2.4 Hasil amplifikasi PCR gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia
dengan panjang produk 250 bp; M= DNA ladder 100 bp;
01,0β…..16 = kode sampel domba ekor tipis sumatera
Tabel 2.1 Diplotipe gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia
Posisi Mutasi

Diplotipe
H1H1
H1H2
H1H3
H1H4
H1H5
H2H2
H3H5
H4H10
H5H6

c.742
CC
CT
CC
CT
CC
TT
CC
TT
CC

c.770
TT
TT
AT
AT
TT
TT
AT
AT
AT

c.882
CC
CC
CC
CC
CT
CC
CT
CT
TT
Total

Jumlah
individu

Frekuensi
(%)

78
3
19
2
6
4
4
1
1
118

66,10
2,54
16,10
1,69
5,08
3,39
3,39
0,85
0,85
100

SNP pada posisi c.770, tidak ditemukan domba dengan genotipe AA.
Heterozigot AT ditemukan pada 5 diplotipe yaitu; H1H3; H3H5; H5H6; H1H4
dan H4H10, tersebar pada rumpun domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis

13

jawa, domba lembah palu, domba ekor gemuk jawa dan domba garut. Genotipe
TT ditemukan pada empat diplotipe yaitu H1H1, H1H2, H1H5 dan H2H2.
SNP pada posisi basa c.882 membentuk 3 genotipe (CC, CT dan TT).
Genotip CC ditemukan pada 106 individu dengan 5 diplotipe yaitu H1H1,
H1H2, H1H3, H1H4 dan H2H2. Genotipe CT ditemukan pada 3 diplotipe yaitu.
H1H5, H3H5 dan H4H10, dimana genotipe TT hanya ditemukan pada satu
diplotipe H5H6. Potensi munculnya variasi sekuens nukleotida menghasilkan
synonymous mutation dan nonsynonymous mutation bervariasi antara satu gen
dengan gen lainnya (Nei dan Kumar 2000).

Gambar 2.5 Aligment sekuens gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia
Hasil penelitian menunjukkan bahwa penyebaran SNPs gen LCAT pada
domba lokal Indonesia ditemukan pada 6 sub populasi, kecuali Kissar dan
Sumbawa yang menujukkan monomorfik. Keragaman gen yang tinggi ditemukan

14

pada kelompok domba ekor tipis (domba ekor tipis sumatera dan domba ekor tipis
jawa), diikuti domba garut dan domba ekor gemuk jawa. Crissa et al. (2010)
melaporkan 3 SNPs pada gen LCAT pada 3 bangsa domba (altamurana, gentile di
puglia dan sarda) yaitu pada posisi basa g.181 T>C, c.806 G>A dan c.1075 T>C,
dengan keragaman gen yang relatif rendah.

Keterangan: SNP pada posisi basa c.742 C>T merupakan synonymous mutation
(Ala>Ala)

Keterangan: SNP pada posisi basa c.770 T>A merupakan non synonymous
mutation (Phe>Ile)

Keterangan: SNP pada posisi basa c.882 C>T merupakan non synonymous
mutation (Ala>Val)
Gambar 2.6 Potongan sekuens gen LCAT ekson yang menunjukkan terjadinya
mutasi pada posisi basa c.742, c.770 dan c.882
Setiap mutasi yang muncul berpengaruh terhadap satu atau lebih peranan
protein yang disandikan. Peranan protein yang mungkin dipengaruhi oleh mutasi
yang timbul adalah stabilitas atau folding protein, ligand binding protein,
katalisis, regulasi dengan allosteric dan mekanisme lainnya serta modifikasi post
translational protein (Wang dan Moult 2001; Teng et al. 2008). Namun, peranan
3 titik mutasi gen LCAT ekson 6 pada domba lokal Indonesia belum diketahui.
Crissa et al. (2010) menemukan 2 titik mutasi pada ekson 6 yaitu pada posisi basa
c.806 (G>A) dan c.1075 (T>C). Mutasi pada posisi basa c.806 merupakan nonsynonymous mutation (Asp>Asn), yang berpengaruh terhadap rasio asam lemak
tak jenuh C18:2 (linoleat) dan C18:3 (linolenat) pada susu domba (Crissa et al. 2010)

15

dan menurunkan produksi susu dan berpengaruh terhadap kandungan asam lemak
stearat dan oleat (Moili et al. 2012). Mutasi pada bagian intron 1 gen LCAT c.266
G>C pada babi berhubungan dengan peningkatan kandungan kolesterol darah
babi (Kaplanova et al. 2010).
Menurut Uchida et al. (1995) bahwa penurunan ak