Penurunan Kolesterol Secara In Vitro Oleh Isolat Bakteri Asam Laktat Dengan Keberadaan Oligosakarida.

(1)

PENURUNAN KOLESTEROL SECARA

IN VITRO

OLEH

ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT DENGAN KEBERADAAN

OLIGOSAKARIDA

YATI MARYATI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

(2)

(3)

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Penurunan Kolesterol secara in vitro oleh Isolat Bakteri Asam Laktat dengan Keberadaan Oligosakarida adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, November 2015

Yati Maryati NIM F251120311

(4)

(5)

RINGKASAN

YATI MARYATI.Penurunan Kolesterol secara in vitro oleh Isolat Bakteri Asam Laktat dengan Keberadaan Oligosakarida. Di bimbing oleh LILIS NURAIDA, dan RATIH DEWANTI-HARIYADI.

Pengembangan pangan fungsional berbasis probiotik dan prebiotik dengan fungsi menurunkan hiperkolesterolemia terus menerus diteliti. Hiperkolesterolemia adalah suatu kondisi dimana meningkatnya kadar kolesterol didalam darah yang melebihi kadar normal, sehingga dapat meningkatkan risiko penyakit jantung koroner (kardiosvaskular). Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa genus dan spesies bakteri asam laktat (BAL) mempunyai potensi untuk digunakan sebagai probiotik dalam mereduksi kolesterol baik secara in vitro maupun in vivo. Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang menguntungkan karena memberikan manfaat kesehatan bagi inangnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang cukup. Sementara prebiotik didefinisikan sebagai bahan pangan yang tidak dapat dicerna (indigestible) yang secara selektif merangsang pertumbuhan dan aktivitas mikroflora dalam saluran pencernaan, sehingga meningkatkan kesehatan inangnya.

Untuk meningkatkan fungsi probiotik, dikembangkan produk sinbiotik yaitu produk yang mengandung probiotik dan prebiotik. Inulin, fruktooligosakarida (FOS) dan galaktooligosakarida (GOS) merupakan jenis prebiotik yang banyak digunakan dalam industri pangan. Penelitian mengenai isolat BAL sebagai kandidat probiotik telah banyak diteliti, namun tambahan fungsi spesifik dalam menurunkan kolesterol masih perlu diteliti lebih lanjut. Selain itu pengaruh prebiotik dalam peningkatan aktivitas penurunan kolesterol oleh probiotik belum banyak diteliti.

Penelitian yang dilakukan terdiri dari 3 (tiga) tahapan. Tahap pertama adalah evaluasi lima isolat bakteri asam laktat (BAL) dari sumber yang berbeda, yaitu Lactobacillus fermentum S21209 dan Lactobacillus plantarum 1-S27202 dari tempe, Lactobacillus rhamnosus R23 dan Pediococcus pentosaceus 1-A38 dari ASI dan isolat komersial Lactobacillus acidophilus FNCC 0051 dari saluran percernaan manusia dalam kemampuannya menurunkan kolesterol secara in vitro. Tahap kedua adalah evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk memetabolisme senyawa oligosakarida (inulin, hidrolisat inulin, FOS serta GOS) dengan parameter pengujian pertumbuhan BAL yang diukur absorbansinya pada λ620 nm, pH (derajat keasaman), total gula yang dikonsumsi serta asam organik termasuk SCFA (short chain fatty acid) asam laktat, asam asetat, asam propionat, dan asam butirat. Pada tahap ketiga dilakukan evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida pada media berbasis MRS dengan oligosakarida tunggal (5% GOS, 5% FOS, 5% inulin dan 5% hidrolisat inulin (b.k)) dan kombinasinya (5% FOS+5% GOS, 5% FOS+5% inulin, 5% FOS+5% bk. hidrolisat inulin, 5% GOS+5% inulin, 5% GOS+5% hidrolisat inulin (b.k), 5% inulin+5% hidrolisat inulin (b.k)). Sebagai kontrol digunakan media berbasis MRS tanpa gula dan dengan glukosa. Analisis dilakukan terhadap kadar kolesterol, profil asam organik (asam laktat) dan SCFA (asam asetat, butirat dan propionat), total gula yang dikonsumsi serta yield total asam.

(6)

Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua isolat mampu menurunkan kolesterol, dan penurunan kolesterol tertinggi ditunjukkan oleh dua isolat yaitu L. acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23. Penurunan kolesterol diduga terjadi melalui dua cara yang berbeda pada medium yang mengandung glukosa. Mekanisme penurunan kolesterol oleh isolat P. pentosaceus 1-A38 melibatkan asimilasi kolesterol, sedangkan pada keempat isolat lainnya kemungkinan melibatkan pengikatan kolesterol pada permukaan sel. Selain itu, isolat BAL juga memiliki kemampuan yang berbeda dalam memanfaatkan oligosakarida prebiotik, terlihat pada penurunan total gula dalam medium. Isolat L. fermentum, L. plantarum dan L. acidophilus lebih memanfaatkan FOS untuk pertumbuhannya, dan GOS lebih dimanfaatkan oleh L. rhamnosus, sedangkan hidrolisat inulin oleh P. pentosaceus. Metabolisme senyawa oligosakarida oleh L. acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 menghasilkan beberapa asam organik termasuk SCFA dengan proporsi terbesar asam laktat diikuti oleh asam asetat. Selain itu, proporsi asam propionat dan butirat dipengaruhi oleh jenis isolat dan sumber karbon. L. acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 mampu menurunkan kolesterol dalam media berbasis MRS dengan sumber karbon oligosakarida. Kemampuan penurunan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida tunggal dan kombinasi juga melibatkan mekanisme baik asimilasi dan pengikatan kolesterol pada permukaan sel. Mekanisme penurunan kolesterol kemungkinan dipengaruhi oleh sumber karbon yang tersedia di dalam medium.

Kata kunci: bakteri asam laktat (BAL), oligosakarida, sinbiotik, penurunan kolesterol, prebiotik

(7)

SUMMARY

YATI MARYATI. In vitro cholesterol lowering ability of lactic acid bacteria (LAB) isolates in the presence of oligosaccharides.Under supervision of LILIS NURAIDA and RATIH DEWANTI-HARIYADI.

The development of functional food based on probiotics and prebiotics to lower hypercholesterolemia has been continuously studied. Hypercholesterolemia, an excess of cholesterol in the bloodstream, increases the risk of coronary heart disease (cardiovascular disease). Several studies show that lactic acid bacteria (LAB) have the potential to be used as probiotics in reducing cholesterol in vitro and in vivo. Probiotics are defined as useful alive microorganisms since they provide health benefits to their host when they are consumed in sufficient quantities. Meanwhile, prebiotics are indigestible foods that selectively stimulate the growth and activity of microflora in the digestive tract, thus improve the health of its host.

To improve the function of probiotics, synbiotic products, containing both probiotics and prebiotics, have been developed. Inulin, fructooligosaccharides (FOS) and galactooligosaccharides (GOS) are types of prebiotics widely used in food industries. Although the use of LAB isolates as probiotic candidates has been widely reported, its additional functions in reducing cholesterol need to be investigated further. In addition, the effects of prebiotics in improving the activity of cholesterol reduction by probiotics have not been widely studied.

The research was conducted in three stages. The first was to evaluate the ability of five different isolates of LAB, including Lactobacillus fermentum S21209 and Lactobacillus plantarum 1-S27202 from tempe, Lactobacillus rhamnosus R23 and Pediococcus pentosaceus 1-A38 from breast milk, commercially available Lactobacillus acidophilus FNCC 0051 from human digestion, to reduce cholesterol in vitro. The second stage was to evaluate the ability of selected LAB isolates to metabolize oligosaccharide compounds (inulin, inulin hydrolysates, FOS, and GOS). The parameter assayed include LAB growth measured asabsorbance at λ 620nm, pH (acidity), total sugar consumed, as well as organic acids, short chain fatty acids (SCFA), including lactic acid, acetic acid, propionic acid, and butyric acid. The third stage was to evaluate the ability of a selected LAB isolate to reduce cholesterol in MRS-based media containing single oligosaccharides (5% GOS, 5% FOS, 5% inulin, and 5% inulin hydrolysate (dry basis)) and its combinations (5% FOS + 5% GOS, 5% FOS + 5% inulin, 5% FOS + 5% inulin hydrolysate (dry basis), 5% GOS + 5% inulin, 5% GOS + 5% inulin hydrolysate (dry basis), 5% inulin + 5% inulin hydrolysate (dry basis)). MRS-based media without sugar and glucose were used as controls. Analysis was performed on cholesterol levels, profiles of organic acids (lactic acid), and SCFA (acetic, butyric and propionic acid), total sugar consumed and total yield of acid.

The results showed that all isolates were able to reduce cholesterol, and the highest cholesterol reduction was shown by L. acidophilus FNCC 0051 and L. rhamnosus R23. Cholesterol reduction is thought to occur by two different mechanisms in glucose-containing media. Cholesterol reduction by P. pentosaceus 1-A38 involves cholesterol assimilation, while that by the other isolates may involve cholesterol binding on the cell surface. Furthermore, LAB

(8)

isolates also have different abilities to utilize oligosaccharides prebiotic, as seen in the total reduction of sugar in the medium. To support its growth, L. fermentum, L. plantarum, and L. acidophilus utilized FOS, L. rhamnosus utilized GOS, and P. pentosaceus utilized inulin hydrolysate. Oligosaccharide metabolism by L. acidophilus FNCC 0051 and L. rhamnosus R23 produces several organic acids, including SCFA, with lactic acid as the largest portion followed by acetic acid. The proportion of propionic and butyric acids was influenced by the type of isolates and carbon source. L. acidophilus FNCC0051 and L. rhamnosus R23 were able to reduce cholesterol in MRS-based media with carbon source of oligosaccharide. Cholesterol reduction ability of the LAB in the presence of single and combined oligosaccharides involves both assimilation and cholesterol binding mechanisms on the cell surface. Cholesterol reduction mechanism can be affected by the carbon source existing in the medium.

Keywords: lactic acid bacteria (LAB), oligosaccharides, synbiotic, cholesterol reduction, prebiotics

(9)

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB.

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.

(10)

(11)

PENURUNAN KOLESTEROL SECARA

IN VITRO

OLEH

ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT DENGAN KEBERADAAN

OLIGOSAKARIDA

YATI MARYATI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains

pada

Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

(12)

(13)

(14)

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tesis dengan judul

“Penurunan Kolesterol secara in vitro oleh Isolat Bakteri Asam Laktat dengan

Keberadaan Oligosakarida” ini dilaksanakan pada bulan Mei 2014 hingga Oktober

2014.

Dalam kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada Prof Dr Ir Lilis Nuraida, MSc selaku ketua komisi pembimbing dan Prof Dr Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc selaku anggota komisi pembimbing atas bantuannya memberikan bimbingan arahan dan masukan ilmu serta motivasi pada penulis dengan penuh kesabaran selama penulis mengikuti pendidikan, penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian, pembuatan naskah jurnal hingga penyusunan tesis. Penulis menghaturkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Didah Nur Faridah STP, MSi sebagai penguji atas masukan dan sarannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KNRT) yang telah memberikan kesempatan beasiswa yang diberikan kepada penulis melalui program Beasiswa KNRT 2012 serta bantuan dana penelitian kepada penulis. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga kepada Pusat Penelitian Kimia, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah memberikan izin tugas belajar bagi penulis serta membantu dana dan fasilitas penelitian, dan terima kasih saya haturkan kepada alm. Prof Dr Broto S Kardono Msc yang telah memberikan rekomendasi untuk mengikuti program beasiswa Kemenristek dan sempat menjadi Co-promotor (anggota komisi pembimbing) bagi penulis.

Penulis menyampaikan terima kasih kepada teman-teman peneliti keltian pangan PP-Kimia LIPI Ibu Agustine Susilowati, Ir MM, Ibu Yetti Mulyati Iskandar, Ir MSc dan Hakiki Melanie, M Food Sci yang telah memberikan dorongan moril dan doanya demi kelancaran penelitian.

Di samping itu, terima kasih penulis sampaikan kepada mbak Ari dari SEAFAST IPB dan Kartika ITP yang telah membantu memberikan isolat BAL untuk digunakan dalam penelitian ini, serta teman-teman seperjuangan di program studi Ilmu Pangan, mbak Ira, mbak Ino, mbak Nur, mbak Ida dan Rina Ningtyas serta seluruh rekan-rekan yang telah membantu selama proses penelitian ini Ungkapan terima kasih yang tak terhingga juga penulis ucapkan kepada kedua orang tua penulis ibunda Neneng Neni dan ayahanda Sutib Utmadjaja dan juga suami tercinta Adid Adep Dwiatmoko dan anak tersayang Sarah Adyaputri yang telah sabar mendoakan dan memberi kasih sayangnya yang telah diberikan kepada penulis.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan.

Bogor, November 2015 Yati Maryati

(15)

(16)

DAFTAR ISI

Halaman PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Manfaat Hipotesis TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik

Mekanisme penurunan kolesterol oleh probiotik Prebiotik

Inulin

Fruktooligosakarida (FOS) Galaktooligosakarida (GOS) Sinbiotik

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Bahan

Alat

Metode Penelitian Prosedur Penelitian

Evaluasi isolat BAL dalam menurunkan kolesterol secara in vitro

Evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk tumbuh pada oligosakarida

Evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida

Prosedur Analisis

Total gula metode fenol-sulfat Total BAL metode SPC Analisis kadar kolesterol

Analisis asam organik dan SCFA (Short Chain Fatty Acid) HASIL DAN PEMBAHASAN

Evaluasi isolat BAL dalam menurunkan kolesterol secara in vitro

Evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk tumbuh pada oligosakarida

Evaluasi kemampuan L. acidophilus FNCC0051 dan L. rhamnosus R23 untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida

Profil asam organik SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan Saran 1 1 3 3 4 4 5 5 6 9 10 11 13 14 16 16 16 16 16 18 18 18 18 19 19 19 19 20 22 22 23 26 29 33 33 33

(17)

DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

RIWAYAT HIDUP

34 40 55

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Mekanisme peranan bakteri asam laktat (BAL) dalam penurunan kolesterol

2. Struktur kimia inulin

3. Struktur kimia FOS komersial

4. Reaksi galaktooligosakarida (GOS) dari laktosa menggunakan β -galaktosidase

5. Tahapan alur penelitian

7 11 12 14 17

DAFTAR TABEL

Halaman 1. Kombinasi efektif prebiotik terhadap isolat probiotik untuk

menurunkan kolesterol secara in vitro

2. Penurunan kolesterol (µg/mL)oleh isolat BAL dalam media MRS dan sel pelet dengan dan tanpa gula (glukosa)

3. Perubahan (△) nilai OD620 setelah inkubasi pada suhu 37oC

selama 24 jam pada medium yang mengandung oligosakarida 4. Nilai pH oleh BAL setelah inkubasi pada suhu 37oC selama 24

jam pada medium yang mengandung oligosakarida

5. Total gula yang dikonsumsi oleh BAL setelah inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam pada medium yang mengandung oligosakarida

6. Komposisi asam organik dan SCFA yang dihasilkan oleh (L.acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 dalam memetabolisme oligosakarida

7. Penurunan kolesterol pada medium, pengikatan kolesterol pada sel pelet aktivitas L. acidophilus FNCC0051 dan L. rhamnosus R23 di dalam media berbasis MRS dengan keberadaan oligosakarida tunggal

8. Penurunan kolesterol pada medium, pengikatan kolesterol pada sel pelet aktivitas L. acidophilus FNCC0051 dan L. rhamnosus R23 di dalam media berbasis MRS dengan keberadaan kombinasi oligosakarida

9. Penurunan nilai pH dan pertumbuhan BAL oleh aktivitas L. acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 dari oligosakarida tunggal dalam medium yang mengandung kolesterol.

10.Penurunan nilai pH dan pertumbuhan BAL oleh aktivitas L.

15 22 23 24 25

(18)

acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 dari kombinasi oligosakarida dalam medium yang mengandung kolesterol

11.Asam organik dan SCFA yang dihasilkan oleh isolat L. acidophilus FNCC0051 dan L. rhamnosus R23 dari oligosakarida tunggal dalam medium yang mengandung kolesterol

12.Asam organik dan SCFA yang dihasilkan oleh isolat L. acidophilus FNCC0051 dan L. rhamnosus R23 dari kombinasi oligosakarida dalam medium yang mengandung kolesterol

13.Konsentrasi total gula yang dikonsumsi dan yield asam organik yang dihasilkan oleh isolat L. acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 dari oligosakarida tunggal dalam medium yang mengandung kolesterol.

14.Konsentrasi total gula yang dikonsumsi dan yield asam organik yang dihasilkan oleh isolat L. acidophilus FNCC 0051 dan L. rhamnosus R23 dari kombinasi oligosakarida dalam medium yang mengandung kolesterol.

30 30 32 32

LAMPIRAN

Halaman 1. Kurva standar kolesterol

2. Kurva standar total gula

3. Kurva standar asam organik dan SCFA.

4. Hasil analisis statistik perhitungan penurunan kolesterol (µg/mL) oleh isolat BAL dalam media MRS

5. Hasil analisis statistik perhitungan pengikatan kolesterol (µg/mL) pada sel pelet isolat BAL.

6. Hasil analisis statistik perhitungan total BAL (log cfu/ml) pada kemampuan isolat BAL menurunkan kolesterol.

7. Hasil analisis statistik perubahan nilai (△) OD620 pada

kemampuan isolat BAL untuk tumbuh pada senyawa oligosakarida.

8. Hasil analisis statistik nilai derajat keasaman (pH) pada kemampuan isolat BAL untuk tumbuh pada senyawa oligosakarida.

9. Hasil analisis statistik penurunan kolesterol pada medium, pengikatan kolesterol pada sel pelet aktivitas L. acidophilus FNCC0051 di dalam media berbasis MRS dengan keberadaan oligosakarida tunggal dan kombinasi.

10.Hasil perhitungan statistik total asam organik termasuk SCFA oleh aktivitas L. acidophilus FNCC 0051 dari oligosakarida tunggal dan kombinasi dalam medium yang mengandung kolesterol.

11.Hasil analisis statistik yield asam organik yang dihasilkan oleh isolat L. acidophilus FNCC 0051 dari berbagai oligosakarida dalam medium yang mengandung kolesterol.

12.Hasil analisis statistik penurunan kolesterol pada medium, pengikatan kolesterol pada sel pelet aktivitas L. rhamnosus R23

40 40 41 43 43 44 44 45 45 48 49 50

(19)

di dalam media berbasis MRS dengan keberadaan oligosakarida tunggal dan kombinasi.

13.Hasil perhitungan statistik total asam organik termasuk SCFA oleh aktivitas L. rhamnosus R23 dari oligosakarida tunggal dan kombinasi dalam medium yang mengandung kolesterol.

14.Hasil analisis statistik yield asam organik yang dihasilkan oleh isolat L. rhamnosus R23 dari oligosakarida tunggal dan kombinasi dalam medium yang mengandung kolesterol

(20)

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Saat ini pengembangan pangan fungsional berbasis probiotik dan prebiotik dengan fungsi hipokolesterolemik terus dikembangkan. Kondisi hiper-kolesterolemia dapat meningkatkan risiko terhadap penyakit jantung koroner (kardiosvaskular). WHO (2011) memperkirakan bahwa pada tahun 2030, penyakit kardiosvaskular mempengaruhi sekitar 23,6 juta orang di seluruh dunia. Hal ini terjadi sebagai akibat pola dan gaya hidup masyarakat modern melalui perubahan konsumsi makanan sehari-hari tanpa pengaturan pola makan dan mengontrol asupan zat gizi secara seimbang sesuai dengan kebutuhan. Penelitian telah menunjukkan bahwa dengan berkurangnya 1% kolesterol dalam darah dapat mengurangi risiko penyakit jantung koroner sebesar 2-3% (Manson et al. 1992). Bakteri probiotik memiliki pengaruh positif terhadap kesehatan, salah satunya adalah dalam menurunkan kolesterol (Sudha et al. 2009; Liong dan Shah 2005a; Zhuang et al.2012). Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa beberapa mekanisme probiotik dalam memberikan efek hipokolesterolemia meliputi dekonjugasi enzimatik asam empedu oleh aktivitas hidrolase garam empedu (bile salt hydrolase) probiotik, asimilasi kolesterol probiotik, ko-presipitasi kolesterol dengan dekojugasi empedu, pengikatan kolesterol kedalam dinding sel probiotik, penggabungan (inkorporasi) kolesterol ke dalam membran sel probiotik selama pertumbuhan, konversi kolesterol menjadi coprostanol, dan produksi asam lemak rantai pendek (SCFA) dari hasil fermentasi oleh probiotik dengan keberadaan prebiotik (Ooi dan Liong 2010). Kemampuan bakteri probiotik untuk mendekonyugasi garam empedu merupakan aspek penting bagi BAL untuk dapat bertahan terhadap garam empedu dalam saluran pencernaan. Jenis bakteri probiotik pada umumnya adalah bakteri asam laktat (BAL).

Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup menguntungkan karena memberikan manfaat kesehatan bagi inangnya setelah dikonsumsi dalam jumlah yang cukup, terutama dengan meningkatkan proliferasi mikroflora asli pencernaan (FAO/WHO 2006). Probiotik secara umum digunakan sebagai adjuvan makanan dan memberikan sejumlah manfaat bagi kesehatan, antara lain: dapat mencegah diare (Yan et al. 2006), mencegah konstipasi (Chmielewska et al. 2010), menstimulasi peningkatan sistem imun (Galdeano et al. 2007), mengatasi laktosa intoleransi (Lie et al. 2012), mencegah resiko kanker kolon (Ucello et al. 2012), mereduksi gejala alergi (Iwasaki et al. 2004), memfasilitasi penyerapan mineral (Scholz-Ahrens et al. 2007), serta menurunkan kadar kolesterol (Liong dan Shah 2005a; Zhuang et al. 2012). Sifat tersebut telah banyak ditemukan dari berbagai mikroorganisme, terutama dari bakteri asam laktat. Secara umum bakteri asam laktat (BAL) sebagai suatu kelompok bakteri yang memproduksi asam laktat sebagai produk akhir metabolik utama selama fermentasi karbohidrat. BAL dikelompokkan ke dalam beberapa genus antara lain Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, dan Pediococcus.

Beberapa isolat BAL lokal seperti Pediocococcus pentosaceus 1-A38 (Nuraida et al. 2011), L. plantarum sa28k, L. acidophillus FNCC116, L. casei FNCC 262 (Kusumawati et al. 2003), Lactobacillus acidophillus FNCC 0051

(21)

(Sriharti 2008) telah dilaporkan berpotensi sebagai probiotik dan mampu mereduksi kolesterol.

Kusumawati et al. (2003) melaporkan bahwa tiga galur BAL, yaitu L. plantarum sa28k, L. acidophilus FNCC116 dan L. acidophilus casei FNCC262 menunjukkan kemampuan yang besar untuk mengasimilasi koleseterol, dan diuji lebih lanjut pengaruh hiperkolesterolemiknya pada tikus Sprague Dawley menunjukkan kadar kolesterol serum darah yang secara nyata lebih rendah (p>0.05) dibandingkan tikus kontrol.

Produk pangan fungsional probiotik dapat ditingkatkan fungsinya dengan penambahan prebiotik menjadi produk sinbiotik. Prebiotik mendukung pertumbuhan bakteri probiotik sehingga mampu menurunkan kolesterol melalui berbagai jalur mekanisme yang berbeda (Ooi dan Liong 2010). Prebiotik akan dimanfaatkan oleh bakteri probiotik di dalam kolon karena prebiotik dapat dihidrolisis oleh enzim ekstraselluler bakteri-bakteri usus dalam sistem pencernaan menghasilkan produk akhir metabolisme berupa SCFA sehingga memberikan manfaat bagi kesehatan dalam mengurangi kadar kolesterol di dalam serum darah. Penelitian Hernandez et al. (2012) menunjukkan bahwa prebiotik dapat meningkatkan kelangsungan hidup bakteri menguntungkan selama terpapar kondisi lambung. Prebiotik merupakan senyawa nutrisi yang dikelompokkan berdasarkan pada kemampuan untuk mendorong pertumbuhan bakteri usus tertentu yang menguntungkan (probiotik). Menurut Roberfroid (2007) definisi prebiotik adalah bahan pangan yang tidak dapat dicerna (indigestible) yang secara selektif merangsang pertumbuhan, dan aktivitas mikroflora dalam saluran pencernaan sehingga meningkatkan kesehatan dan kesejahteraan inangnya. Serat makanan, khususnya serat larut, menunjukkan beberapa aktivitas prebiotik. Kelompok prebiotik antara lain : prebiotik berjenis inulin seperti FOS (fruktooligosakarida) dan galaktooligosakarida (GOS) (Roberfroid 2007; Kelly 2009). Selain itu karbohidrat lainnya yang berpotensi sebagai prebiotik adalah laktulosa,laktosukrosa, oligosakarida kedelai, isomaltooligosakarida, palatinosa, xylooligosakarida, dan glukooligosakarida (Manning dan Gibson 2004).

Inulin dan fruktooligosakarida (FOS) serta galaktooligosakarida (GOS) merupakan jenis prebiotik yang banyak digunakan dalam industri pangan, dengan tujuan sebagai sumber prebiotik dan untuk meningkatkan kandungan serat. Inulin sebagai serat pangan terlarut (soluble dietary fiber) memiliki efek fisologis yaitu dapat menurunkan kadar kolesterol darah. FOS dapat diperoleh melalui hidrolisis inulin baik oleh asam maupun enzim. Hidrolisis inulin dengan asam memotong bagian ikatan yang tidak spesifik menjadi fruktooligosakarida sehingga banyak hasil samping yang dihasilkannya. Oleh karenanya digunakan enzim inulinase karena bersifat spesifik dalam melakukan pemotongan inulin, yaitu hanya pada

ikatan β-2,1 fruktofuransida sehingga diperoleh hidrolisat inulin dengan DP yang lebih rendah.

FOS secara komersial dapat diproduksi melalui dua metoda berbeda, sehingga menghasilkan produk akhir yang berbeda pula. FOS secara komersial

dapat disintesa dari sukrosa (disakarida) menggunakan transfruktosilasi β -fruktofuranosidase dari Aspergillus niger. FOS juga dapat diproduksi dengan hidrolisis enzimatik terkontrol dari inulin yang diekstrak dari chicory, dengan menggunakan endoinulinase. Campuran FOS yang dihasilkan biasa dinamakan

(22)

transfruktosilasi kecuali banyaknya oligosakaridanya yang tidak memiliki terminal glukosa (Singh et al. 2010).

Inulinase dapat berasal dari kapang, khamir maupun bakteri. Susilowati et al. (2013) berhasil menghidrolisis inulin dengan enzim inulinase dari kapang Acremonium sp. CBS3 yang diisolasi dari kulit umbi dahlia merah, dimana kapang

tersebut menghasilkan aktivitas enzim inulinase dalam jumlah yang tinggi. Hidrolisis inulin yang dihasilkan menunjukkan BM 540-900 yang diidentifikasi sebagai FOS. Hidrolisat inulin ini belum diuji sifat fungsionalnya terutama dalam menurunkan kolesterol dan potensinya sebagai prebiotik.

Galaktooligosakarida (GOS) dapat disintesis dari laktosa dimana gula bertindak sebagai akseptor dengan reaksi transgalaktosilasi yang dikatalisis oleh

β-galaktosidase. Serat pangan terlarut dapat mereduksi kolesterol melalui kemampuan serat terlarut mengikat asam empedu sehingga tidak dapat diabsorbsi dan disirkulasikan kembali, kemudian masuk ke usus besar untuk didegradasi dan diekskresikan. Selain itu, serat mampu mengalihkan pool (timbunan) asam empedu dari asam kolat menjadi chenodeoxycholic acid yang dapat menghambat enzim HMG CoA reduktase yang berperan dalam biosintesis kolesterol. Mikroorganisme pendegradasi serat dalam usus juga mampu menghasilkan propionat atau asam lemak rantai pendek lainnya yang dapat menghambat sintesis asam lemak dan/atau kolesterol sehingga kadarnya dalam tubuh berkurang (Slavin 2013).

Beberapa studi telah dilakukan untuk menentukan penggunaan berbagai sinbiotik dalam menurunkan kolesterol secara in vitro. Liong dan Shah (2005c) melaporkan bahwa L. casei ASCC 292 secara in vitro dapat mereduksi jumlah kolesterol yang tinggi dengan keberadaan fruktooligosakarida (FOS) dan maltodekstrin. Pada penelitian lainnya Zhang et al. (2007) menyeleksi dan mengoptimasi kombinasi sinbiotik dalam upaya menurunkan kolesterol secara in vitro melalui metode respon surface, dengan menggunakan L. plantarum LS12 sebagai probiotik, dan galaktooligosakarida (GOS) dan manitol sebagai prebiotik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi L. plantarum LS12 dengan campuran 4.5% GOS dan 5.20% manitol dapat mengurangi 75,9% kolesterol dibanding kontrol (medium ditambah glukosa).

Perumusan Masalah

BAL sebagai kandidat probiotik telah banyak diisolasi. Sebagian telah diteliti kemampuannya dalam menurunkan kolesterol dan kemampuannya dalam memetabolisme prebiotik. Namun kemampuan dalam menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida yang berperan sebagai prebiotik belum banyak dilakukan. Kemampuan BAL dalam memetabolisme prebiotik penting untuk diketahui sehingga dapat menjadi dasar pengembangan sinbiotik.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Memperoleh isolat bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi probiotik dan memiliki kemampuan mereduksi kolesterol.

(23)

2. Memperoleh isolat BAL yang mampu memetabolisme oligosakarida

3. Memperoleh informasi mengenai kemampuan isolat BAL secara in vitro dalam menurunkan kolesterol dengan keberadaan senyawa prebiotik.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini akan memberikan informasi mengenai pemanfaatan isolat BAL dengan senyawa prebiotik maupun fruktooligosakarida yang dapat diproduksi oleh enzim kapang lokal dalam bentuk hidrolisat inulin untuk pengembangan pangan fungsional, khususnya pangan sinbiotik dengan fungsi spesifik menurunkan kolesterol, serta memberikan informasi bahwa penelitian sinbiotik secara in vitro sebagai dasar untuk memperjelas interaksi yang terjadi dan penentuan kombinasi efektif antara prebiotik dan probiotik dalam memberikan efek penurun kolesterol.

Hipotesis

Isolat BAL yang digunakan dalam penelitian ini memiliki potensi dalam menurunkan kolesterol dan mampu memetabolisme senyawa prebiotik menghasilkan senyawa asam organik termasuk asam lemak rantai pendek. Kombinasi kandidat probiotik dan prebiotik akan meningkatkan fungsi kandidat probiotik sebagai penurun kolesterol.

(24)

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik

Secara umum bakteri asam laktat (BAL) adalah kelompok bakteri yang memproduksi asam laktat sebagai hasil metabolisme utamanya selama fermentasi karbohidrat. BAL dikelompokkan ke dalam beberapa genus antara lain Lactobacillus, Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, dan Pediococcus.

BAL dan bifidobakteria termasuk dalam kelompok bakteri yang menguntungkan bagi manusia karena pada umumnya termasuk kedalam status GRAS (Generally Recognized as Safe), yang dianggap aman bagi manusia. Kelompok bakteri ini tidak membusukkan bahan yang mengandung protein serta dapat memetabolisme berbagai jenis karbohidrat secara fermentatif menjadi asam laktat sehingga disebut dengan bakteri asam laktat. BAL banyak digunakan dalam produksi makanan fermentasi, seperti Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus dan Streptococcus thermophilus yang digunakan sebagai starter untuk fermentasi susu dalam produksi yoghurt. L. delbrueckii subsp.bulgaricus, selain memberikan kontribusi untuk peningkatan asam laktat dalam yoghurt juga memberikan flavor dan karakteristik tekstur (Curry et al. 2003), beberapa probiotik lain yang digunakan untuk tujuan lain, diantaranya adalah L. rhamnosus, L. acidophilus, L. johnsonii dan Bifidobacterium, karena kemampuannya untuk tumbuh dalam susu sehingga memberikan sifat fungsional dan manfaat bagi kesehatan (Vasiljevic et al. 2008; Oliveira 2012).

Secara umum bakteri probiotik sebagai bakteri non patogen yang secara normal terdapat dalam saluran cerna manusia dan bakteri probiotik memberikan proteksi terhadap usus dari bakteri patogen. Pangan probiotik berarti makanan atau minuman yang berisi mikroorganisme hidup yang diharapkan didalam tubuh akan dapat berguna dan meningkatkan kesehatan tubuh. Contoh pangan probiotik adalah yogurt, keju, mentega, sari buah dan susu formula yang difortifikasi dengan BAL probiotik. Probiotik secara umum digunakan sebagai adjuvan makanan dan sejumlah senyawa hasil metabolisme bakteri probiotik memberikan manfaat bagi kesehatan, antara lain :

(1) dapat mencegah diare dengan memberikan perlindungan terhadap sel epitel usus dan fungsi barrier, serta pencegahan enterotoksin dalam mengikat sel epitel usus, dan pengaturan lingkungan hidup mikroba usus (Yan et al. 2006),

(25)

(2) mencegah konstipasi melalui mekanisme penurunan pH didalam usus besar yang diproduksi oleh bakteri probiotik dalam bentuk asam lemak rantai pendek seperti asam butirat, asam propionat, dan asam laktat. pH rendah juga dapat meningkatkan peristaltik didalam usus besar dan kemudian dapat menurunkan waktu transit kolon (Chmielewska et al. 2010),

(3) menstimulasi peningkatan sistem imun melalui 3 (tiga) mekanisme, yaitu probiotik mengalami kontak secara langsung dengan sel-sel epitel saluran pencernaan (IEC), yang mensekresikan berbagai sitokinin seperti Interleukin-6 (IL-6) dan menginisiasi komunikasi dengan sel-sel imun di sekitarnya. Mekanisme yang kedua melalui sel-sel epitel terspesialisasi yaitu sel-sel M (MC) yang ada di sepanjang saluran pencernaan. Makrofag (MQ) atau sel-sel dendritik (DC) adalah sel-sel pertama di bawah sel-sel M yang secara langsung mengalami kontak dengan probiotik atau fragmen-fragmen antigennya dan menghasilkan sitokinin. Mekanisme ketiga yaitu DC pada lamina propria saluran pencernaan dapat memanjangkan dendrit mereka di antara IEC dan mungkin dapat secara langsung mengambil dan memproses probiotik pada lumen saluran pencernaan (Galdeano et al. 2007),

(4) mengatasi laktosa intoleransi dimana probiotik memproduksi enzim laktase menghidrolisis laktosa sehingga intoleransi laktosa dapat dikurangi dengan teratur

mengkonsumsi produk susu fermentasi karena adanya produksi enzim β -galaktosidase oleh bakteri asam laktat (Lie et al. 2012),

(5) mencegah risiko kanker kolon dengan cara mencegah perubahan mikroflora usus, inaktivasi senyawa kansinogenik, bersaing dengan bakteri patogen, meningkatkan respon imun inang, memberi efek anti-proliferasi melalui regulasi apoptosis dan diferensiasi sel, memfermentasi makanan tidak tercerna, menghambat sinyal jalur tirosin kinase (Ucello et al. 2012),

(6) mereduksi gejala alergi, dimana probiotik berperan sebagai aktivator yang kuat untuk sistem imun innate (Iwasaki et al. 2004),

(7) memfasilitasi penyerapan mineral melalui mekanisme peningkatan kelarutan mineral karena peningkatan produksi senyawa antibakteri berupa asam lemak rantai pendek (Scholz-Ahrens et al. 2007),

(8) menurunkan kadar kolesterol (Ziarno et al. 2007).

Mekanisme probiotik dalam menurunkan kolesterol

Beberapa mekanisme probiotik dalam menurunkan kolesterol, meliputi dekonjugasi enzimatik asam empedu oleh aktivitas hidrolase garam empedu (bile salt hydrolase) probiotik, asimilasi kolesterol probiotik, ko-presipitasi kolesterol dengan dekonjugasi empedu, pengikatan kolesterol kedalam dinding sel probiotik, penggabungan (inkorporasi) kolesterol ke dalam membran sel probiotik selama pertumbuhan, konversi kolesterol menjadi koprostanol, dan produksi asam lemak rantai pendek (SCFA) dari hasil fermentasi prebiotik oleh probiotik (Ooi dan Liong 2010).

Mekanisme penghambatan penyerapan kolesterol di usus kecil baik secara in vivo ataupun in vitro terkait dengan 2 proses yaitu pengikatan dan penggabungan kolesterol melalui sel bakteri dan menekan reabsorbsi asam empedu yang diperantarai oleh BSH (bile salt hydrolase) dari bakteri. Beberapa senyawa yang

(26)

terlibat dalam metabolisme kolesterol, seperti protein NPC1L1, HMGCoA

reduktase dan 7α-,27α-hydroxylase, yang mungkin juga terlibat dalam mengatur konsumsi strain probiotik (Zhuang et al. 2012).

Beberapa strain Lactobacillus mampu mensekresi bile salt hydrolase (BSH), yang dapat mengkatalisis hidrolisis glisin dan taurin atau memutuskan ikatan C-24 N-acyl amida yang terbentuk di antara asam empedu dan asam amino pada garam empedu terkonjugasi (Liong dan Shah 2005b). Proses dari dekonjugasi menghasilkan garam empedu terdekonjugasi (unconjugated bile salt) dalam bentuk asam kolat bebas yang kurang diserap oleh usus halus dibandingkan asam empedu terkonjugasi, akibatnya asam empedu yang akan kembali ke hati semakin berkurang selama sirkulasi enterohepatik, dan garam empedu yang tidak terikat ini (dekonjugasi) akan lebih mudah terbuang melalui saluran pencernaan (feses). Oleh karena itu banyak kolesterol yang dibutuhkan untuk mensintesa garam empedu lagi, dan kadar kolesterol akhirnya menurun (Shi et al. 2009). Dekonjugasi asam empedu akan menurunkan kolesterol serum dengan meningkatkan pembentukan asam empedu baru untuk menggantikan asam empedu yang hilang dalam siklus enterohepatik. Adapun mekanisme penurunan kolesterol oleh bakteri asam laktat (BAL) dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Mekanisme peranan bakteri asam laktat (BAL) dalam menurunkan kolesterol.

Empedu dengan unsur utama asam empedu, kolesterol, fosfolipid, dan pigmen biliverdin disintesis de novo dalam hati, disimpan dan terkonsentrasi di kantong empedu dan disekresi ke dalam duodenum melalui saluran empedu. Garam empedu baik glisin dan taurin terkonjugasi asam empedu dan bertindak sebagai deterjen ionik alami. Dalam usus, garam empedu memainkan peran penting dalam mengemulsi lipid dan melarutkan lipid yang memungkinkan lipolisis intra-luminal dan penyerapan produk lipolitik oleh enterosit. Asam kolat, secara umum merupakan salah satu asam empedu bebas dalam usus, diproduksi sebagian besar oleh dekonjugasi garam empedu (Kurdi et al. 2003). Jones et al.

(27)

(2004) mengevaluasi peran hidrolase garam empedu sebagai penurun kolesterol menggunakan Lactobacillus plantarum80 (pCBH1).

Mekanisme mikroorganisme probiotik dalam menghilangkan kolesterol dari media laboratorium tidak sepenuhnya jelas. Sebagian besar hipotesis hingga saat ini dalam mengevaluasi mekanisme dari potensi BAL sebagai hipokolesterolemik didasarkan pada penelitian secara in vitro. Mekanisme lain dalam penurunan kolesterol adalah dengan inkorporasi molekul kolesterol pada membran sel bakteri sehingga akan menghambat/ mengurangi penyerapan kolesterol oleh mukosa saluran pencernaan ke dalam aliran darah. Gilliland et al. (1985) menunjukkan bahwa strain Lactobacillus acidophilus tertentu dapat mengasimilasi kolesterol dalam media pertumbuhan, sehingga tidak tersedia untuk penyerapan dari usus ke dalam darah, selain itu L. acidophilus dapat mengintegrasikan beberapa kolesterol dikeluarkan dari media ke dalam membran selularnya selama pertumbuhan sehingga kolesterol yang dimasukkan ke dalam atau menempel pada sel-sel bakteri akan cenderung kurang tersedia untuk penyerapan dari usus ke dalam darah (Noh et al. 1997).

Usman dan Hosono (1999) melaporkan sebelumnya bahwa strain Lactobacillus gasseri bisa menghilangkan kolesterol dari media laboratorium melalui pengikatan ke permukaan sel. Kemampuan mengikat kolesterol berkaitan dengan pertumbuhan dan strain yang spesifik. Kimoto et al. (2002) menyatakan ada dua mekanisme yang mungkin mendasari kemampuan Lactococcus untuk menghilangkan kolesterol dari media, salah satunya adalah pelekatan kolesterol ke permukaan sel, yang merupakan fenomena fisik dan berhubungan dengan dinding sel, dan mekanisme lain yang mungkin adalah asimilasi kolesterol oleh sel-sel. Penelitian Tok et al. (2010) menunjukkan sel yang dipanaskan dan mati masih dapat menghilangkan kolesterol dari media, dengan cara mengikat kolesterol pada sel.

Liong et al. (2005) mengevaluasi strain bifidobakteria melalui dekonjugasi garam empedu dan aktivitas BSH dalam kopresipitasi kolesterol. Penelitian Klaver dan van der Meer (1993) mengindikasikan bahwa berkurangnya kolesterol pada media pertumbuhan L. acidophilus yaitu media cair MRSB dengan sejumlah garam empedu dan kolesterol, adalah karena terjadinya kopresipitasi kolesterol dengan garam empedu dalam kondisi asam pada pH lebih rendah dari 5.5.

Lye et al. (2010) mengevaluasi konversi kolesterol menjadi coprostanol oleh strain lactobacilli seperti Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus dan L. casei ATCC 393 melalui tes fluorometric, dimana semua strain probiotik menunjukkan adanya konversi baik intraseluler dan reduktase kolesterol ekstraseluler menjadi coprostanol. Konsentrasi kolesterol dalam medium juga mengalami penurunan pada fermentasi oleh probiotik disertai dengan peningkatan konsentrasi coprostanol.

Produk fermentasi probiotik antara lain SCFA (Short Chain Fatty Acid) yang dapat memberikan efek hipokolesterolemia. Hasil penelitian Trautwein et al. (1998) menunjukkan bahwa propionat mampu menghambat sintesis asam lemak. Pereira et al. (2003)menunjukkan bahwa strain L. fermentum KC5b memberikan efek menurunkan kolesterol menghasilkan SCFA khususnya proporsi molar propionat dan dekonjugasi garam empedu.

Penelitian mengenai BAL lokal dari berbagai sumber sebagai probiotik juga telah banyak dilakukan. Pediococcus pentosaceus 1-A38 yang diisolasi dari ASI

(28)

merupakan isolat yang paling potensial untuk digunakan pada pengembangan produk probiotik dengan sifat fungsional spesifik untuk menurunkan kolesterol, dengan mekanisme asimilasi dan dekonjugasi garam empedu (Nuraida et al. 2011). Beberapa BAL hasil isolasi dari makanan fermentasi Indonesia, yaitu L. plantarum sa28k, L. acidophillus FNCC116, L.casei FNCC 262 menunjukkan ketahanan yang baik pada lingkungan asam dan garam empedu, dan hasil pengujian secara in vivo terhadap efek hipokolesterolemik menunjukkan penurunan kadar kolesterol pada serum darah tikus (Kusumawati et al. 2003). Melalui kajian efek sinergistik sinbiotik secara in vitro dan in vivo bakteri asam laktat Lactobacillus acidophilus FNCC 0051 dari sistem pencernaan manusia telah diteliti dalam kemampuannya menurunkan kolesterol (Sriharti 2008). Ngatirah et al (2002) telah mengisolasi 36 isolat BAL lokal dari berbagai macam sumber (dadih, sosis, feses bayi, gatot, sawi asin (chinese leaf pickle), growol, dan yoghurt), dan 3 isolat terpilih yaitu Lactobacillus sp Dad 13, L. acidophilus D2 dan L. plantarum Mut 7, menunjukkan kemampuannya dalam mengasimilasi kolesterol, mengkonjugasi garam empedu, ketahanan terhadap asam empedu dan ketahanan terhadap pH rendah.

Tempe merupakan makanan fermentasi mengandung BAL dalam jumlah yang tinggi (Efriwati et al. 2013). Evaluasi potensi BAL yang diisolasi dari tempe sebagai probiotik atau sebagai penurun kolesterol belum pernah dilakukan. Namun demikian, mungkin diantara BAL yang ada pada tempe dapat berfungsi sebagai probotik.

Prebiotik

Prebiotik merupakan bahan selektif terfermentasi yang menghasilkan perubahan tertentu dalam komposisi dan/ atau aktivitas mikrobiota saluran cerna, sehingga memberikan manfaat pada kesehatan inangnya (Gibson et al. 2010). Efek prebiotik mengacu pada efek patologis dan fisiologis baik dalam eksperimental maupun studi intervensi pada manusia secara khusus terkait dan berkorelasi dengan perubahan selektif dalam komposisi mikrobiota usus (Roberfroid et al. 2010). Prebiotik harus memenuhi kriteria sebagai berikut : 1) tidak dihidrolisis atau diabsorbsi oleh sistem pencernaan bagian atas, 2) difermentasi pada usus besar hanya oleh bakteri yang bermanfaat bagi kesehatan, 3) mampu mengatur komposisi mikroflora pada usus besar menuju komposisi yang ideal bagi kesehatan, dengan cara meningkatkan jumlah bakteri yang menguntungkan dan mereduksi jumlah bakteri patogen (Kolida 2007). Peningkatan jumlah bakteri menguntungkan dalam kolon memerlukan suatu sumber karbohidrat yang tidak dapat tercerna, sehingga dapat dijadikan substrat untuk pertumbuhan bakteri probiotik dalam kolon. Prebiotik sebagian besar adalah serat makanan, seperti oligosakarida, namun tidak seluruh serat makanan merupakan prebiotik.

Oligosakarida merupakan komponen utama dari berbagai produk makanan (misalnya sel tanaman, susu) dan sejak tahun 1980, penggunaannya dalam makanan fungsional telah semakin diteliti (Roberfroid 2002). Oligosakarida sebagai ingredien makanan fungsional memiliki potensi besar untuk meningkatkan kualitas berbagai makanan, seperti memberikan modifikasi

(29)

makanan dan aplikasi flavor serta karakteristik fisikokimia dari berbagai gula yang bermanfaat bagi kesehatan. Berbagai penelitian telah menyelidiki produksi oligosakarida sebagai bahan makanan yang meningkatkan kondisi kesejahteraan, dan kesehatan konsumen. Dalam hal ini, perhatian khusus berhubungan dengan jenis tertentu dari serat pangan, yaitu sebagai tidak karsinogenik, oligosakarida tidak tercerna (non-digestible oligosaccharides) dan senyawa rendah kalori yang merangsang pertumbuhan dan perkembangan mikrobiota saluran cerna (Mussamatto et al. 2007).

Serat pangan khususnya serat larut air, menunjukkan beberapa aktivitas prebiotik. Senyawa ini antara lain jenis prebiotik seperti inulin, fruktooligo-sakarida dan galaktooligofruktooligo-sakarida (GOS) (Roberfroid 2007; Kelly 2009), laktulosa, laktosukrosa, oligosakarida kedelai, isomaltooligosakarida, palatinosa, xylooligosakarida, dan glukooligosakarida (Manning dan Gibson 2004).

Fruktooligosakarida, inulin, oligofruktosa, laktulosa, dan galaktooligo-sakarida telah diidentifikasi sebagai prebiotik karena karakteristik seperti tahan terhadap keasaman lambung, hidrolisis oleh enzim mamalia dan difermentasi oleh mikroflora saluran cerna untuk lebih selektif merangsang pertumbuhan dan/ atau aktivitas bakteri usus yang menguntungkan (Gibson 1999).

Prebiotik seperti inulin, FOS dan GOS berkontribusi terhadap hipo-kolesterolemia melalui dua mekanisme: penurunan penyerapan kolesterol disertai dengan peningkatan ekskresi kolesterol melalui feses, dan produksi asam lemak rantai pendek (SCFA) pada fermentasi selektif oleh mikroflora bakteri pada usus (Arjmandi 1992).

Keberadaan serat makanan (prebiotik) diperlukan didalam usus, jika tidak tersedia maka bakteri anaerob akan menarik energi dari fermentasi protein. Metabolisme ini menyebabkan produksi senyawa beracun dan berpotensi karsinogenik (seperti amoniak atau senyawa fenolik). Pada fermentasi karbohidrat (oligosakarida) prebiotik yang difermentasi dalam usus besar oleh bakteri usus besar, menghasilkan asam lemak rantai pendek seperti butirat, asetat dan propionat. Fermentasi prebiotik melibatkan berbagai proses metabolisme oleh mikroba anaerobik menjadi pemecahan senyawa organik, menghasilkan energi untuk pertumbuhan mikroba dan produksi SCFA dengan hasil samping selain SCFA akibat fermentasi bakteri diantaranya methana(CH4), hidrogen (H2), dan

karbon dioksida (CO2) (Slavin 2013). Rossi et al. (2005) menemukan bahwa

butirat merupakan produk fermentasi utama dari inulin, sedangkan asetat diproduksi dari fruktooligosakarida. Efek hipokolesterolemik dari prebiotik terutama disebabkan SCFA. Butirat diketahui menghambat sintesis kolesterol hati dan menyediakan sumber energi bagi sel-sel epitel usus manusia, sedangkan propionat dapat menghambat sintesis asam lemak dalam hati, sehingga menurunkan tingkat sekresi triasilgliserol. Propionat yang juga terlibat dalam pengendalian sintesis kolesterol di hati dan mengurangi laju sintesis kolesterol yang dapat menyebabkan penurunan kadar kolesterol (Trautwein et al. 1998).

Inulin

Inulin merupakan polidispersi β-(2-1) fruktan yang tercampur dengan oligo- dan polisakarida, dimana semua rantai linier fruktosa ini memiliki struktur GFn

(30)

(G=unit glukosil, F=unit fruktosil dan n=nomor unit fruktosil yang terhubung dengan fruktosil yang lain). Fruktan juga dapat dideskripsikan oleh derajat polimerisasi (DP). DP mengacu pada jumlah unit berulang dalam rantai oligomer atau polimer, sehingga DP sebuah fruktan individu terdiri dari sejumlah unit fruktosa berulang dan identik dengan n seperti ditunjukkan pada Gambar 2.

Gambar 2. Struktur kimia inulin (Ueno et al. 2011)

Inulin secara alami banyak terdapat dalam akar tanaman dan sayuran. Sumber sangat kaya akan inulin diantaranya adalah umbi Helianthus tuberosus (Yerusalem artichoke), Cichorium intybus (sawi putih), Dahlia pinnata (dahlia) dan Polymnia sonchifolia (yacon) (Oliveira et al. 2011). Inulin memiliki rantai gabungan 2-100 unit fruktosa, dengan panjang, komposisi dan polidispersitas tergantung pada spesies tanaman, fase dalam siklus hidupnya, tanggal panen dan ekstraksi dan pasca-prosedur ekstraksi (Barclay et al. 2010).

Sebagian besar inulin yang dihasilkan dari akar chicory memiliki panjang rantai berkisar 2-60, dengan rata-rata DP 10-12. Oligofruktosa dibuat dari 2 sampai 8 molekul unit fruktosa, yang diawali dengan molekul glukosa dan selanjutnya terikat gugus fruktosa. Derajat polimerisasi inulin tergantung pada faktor-faktor antara lain jenis tanaman, iklim dan kondisi pertumbuhan, waktu panen dan waktu penyimpanan setelah panen (Chi et al. 2011). Inulin ditemukan pada artichoke, globe thistle (Echinops ritro) dan Viguiera discolor, dengan DP tinggi (Vergauwen et al. 2003).

Inulin termasuk fruktan dengan DP lebih panjang dari oligofruktosa. Oleh karena itu, fermentasi inulin akan memakan waktu yang lebih lama dan bertahan melalui kolon proksimal, akibatnya, inulin mungkin berpotensi memiliki efek yang lebih positif pada distal kolon daripada fruktan rantai pendek seperti FOS atau seperti oligofruktosa. Inulin dengan rantai fruktan yang panjang memiliki potensi yang lebih tinggi daripada oligofruktosa dalam menginduksi efek prebiotik di wilayah distal dari usus besar. Perbedaan potensi prebiotik antara fruktan yang berbeda tercermin terhadap interaksinya dengan epitel usus besar atau dengan organisme inang (Hughes et al. 2001). Hal ini menunjukkan bahwa campuran oligo- dan/atau polisakarida yang terdiri dari unit fruktosa dengan konfigurasi β-pada anomeric C2 pada inulin menyebabkan tipe fruktan tahan

(31)

terhadap hidrolisis oleh enzim pencernaan usus manusia, karena memiliki

kekhususan pada ikatan α -glikosidik (Roberfroid 2007).

Fruktooligosakarida (FOS)

Fruktooligosakarida (FOS) adalah karbohidrat dari famili fruktan, terdiri dari bermacam-macam gugus polimer fruktosa. FOS merupakan campuran dari rantai pendek jenis inulin yang disintesis dari sukrosa. Campuran ini hanya mencakup rantai pendek inulin jenis fruktan yang memiliki struktur kimia GFn dan tambahan 1-3 unit fruktosa setelah melalui proses enzimatis dengan residu fruktosa dari sukrosa (DP maksimum 4). Sedangkan istilah oligofruktosa (hidrolisat inulin) merupakan FOS yang mengandung campuran GFn dan Fn yang diproduksi secara hidrolisis parsial dari inulin, dengan DP maksimum <10 dan kemudian mengalami

pemisahan fisik untuk menghilangkan semua rantai panjang (DP ≥ 10) dari inulin

tipe fruktan (Kelly 2009). FOS terdapat pada berbagai jenis tanaman, dan disimpan sebagai karbohidrat oleh tanaman. Struktur kimia FOS ditunjukkan dengan symbol GFn, dimana G menunjukkan unit glukosil, F menunjukkan unit

fruktosil, sedangkan n nmenunjukkan jumlah unit yang terikat oleh α -(2-1)-fruktosa. Umumnya jenis FOS termasuk 'neosugar', yang merupakan campuran dari tiga oligosakarida dengan panjang yang berbeda, seperti kestose (GF2),

nystose (GF3) dan β-fructosylnystose (GF4). Struktur kimia FOS dapat dilihat pada

Gambar 3.

Gambar 3. Struktur pada FOS komersial (Duar 2011)

FOS secara komersial dapat diproduksi melalui dua metoda berbeda, sehingga menghasilkan produk akhir yang berbeda pula. Pada metode pertama FOS secara komersial disintesa dari sukrosa (disakarida) melalui reaksi transfruktosilasi menggunakan enzim β-fruktofuranosidase dari Aspergillus niger. Proses ini menghasilkan campuran oligosakarida yang mengandung satu terminal

glukosa dan terikat dengan dua hingga empat unit fruktosa (α-D-Glu-(1-2)-[(β -D-Fru-(1-2)-]n dimana n=2-4). Derajat polimerisasi dari oligosakarida ini adalah 2-4. Metode produksi FOS yang kedua yaitu melalui hidrolisis enzimatik terkontrol

(32)

dari polisakarida dari substrat inulin yang diekstrak dari chicory, dengan menggunakan aksi enzim endoinulinase. Campuran FOS yang dihasilkan biasa dinamakan sebagai ‘oligofruktosa’, hampir sama dengan yang dihasilkan oleh proses transfruktosilasi kecuali banyaknya oligosakaridanya yang tidak memiliki

terminal glukosa. Campuran ini mengandung α-D-Glu-(1-2)-[(β-D-Fru-(1-2)-]n dimana n=2-9, dengan panjang (DP 2-λ) dan β-D-Fru-(1-2)-[(β-D-Fru-(1-2)-]n dimana n=1-9 (Singh et al. 2010).

Saat ini telah dikembangkan fruktooligosakarida yang disintesis dari substrat inulin secara enzimatik oleh endoinulinase yang berpotensi sebagai prebiotik. Pengembangan produksi senyawa prebiotik baru dalam menghasilkan fruktooligosakarida dapat diproduksi dari hidrolisis substrat inulin menggunakan enzim inulinase, yang berasal dari kapang, ragi maupun bakteri. Inulinase akan memotong atau menghidrolisis inulin secara spesifik pada ikatan β-2-1 fruktofuransida. Pemutusan ikatan tesebut secara spesifik dapat meningkatkan efektivitas jumlah FOS yang dihasilkan dengan DP yang lebih rendah (Singh et al. 2010). Susilowati et al. (2013) berhasil menghidrolisis inulin dengan menggunakan enzim inulinase dari kapang Acremonium sp.-CBS3 yang diisolasi

dari kulit umbi dahlia merah, dimana kapang tersebut menghasilkan aktivitas enzim inulinase dalam jumlah yang tinggi. Kapang Acremonium sp-.CBS3 ini

dapat menghasilkan enzim inulinase yang dapat menghidrolisis inulin menjadi senyawa dengan BM 540-700 diidentifikasikan sebagai fruktooligosakarida dengan DP 2-7.

Dalam penggolongan serat pangan, FOS termasuk dalam serat fungsional karena memiliki efek fisiologis yang berguna bagi kesehatan manusia. Karena

adanya konfigurasi β pada monomer fruktosa, FOS tidak dapat dihidrolisis oleh

enzim pencernaan usus halus (Roberfroid 2007). FOS tidak diserap atau terdegradasi dalam saluran pencernaan manusia bagian atas. FOS memasuki usus besar utuh dan dimetabolisme oleh mikrobiota. FOS diakui sebagai prebiotik karena memenuhi semua kriteria yang dibutuhkan. Oleh karena FOS akan mencapai usus besar tanpa dimetabolisme dan kemudian terfermentasi oleh mikrobiota yang ada kolon menjadi laktat dan SCFA (Niness 1999). Beberapa studi in vitro menyebutkan bahwa FOS secara selektif terfermentasi oleh bifidobakteria dan laktobasili (Bouhnik et al 2007; Macfarlane et al. 2008). Secara khusus, sejumlah studi manusia telah menunjukkan efek bifidogenik dari FOS pada dosis mulai dari 1 sampai 31 g/hari (Bouhnik et al. 2007).

Galaktooligosakarida (GOS)

GOS didefinisikan sebagai campuran zat yang dihasilkan dari laktosa, yang terdiri antara 2 dan 8 unit sakarida, dengan salah satu unit menjadi terminal glukosa dan unit sakarida, sisanya merupakan galaktosa dan disakarida yang terdiri dari 2 unit galaktosa (Tzortzis 2009). GOS terbentuk melalui perlakuan

enzimatik laktosa oleh enzim β-galaktosidase, dengan aktivitas reaksi transgalaktosilasi, dan menghasilkan beberapa oligomer dengan panjang rantai yang berbeda-beda. Dalam reaksi 4'-atau 6'-galaktosil laktosa, oligosakarida panjang, disakarida dan transgalaktosilasi terbentuk oligosakarida non-reduksi.

(33)

Sumber mikroba β-galaktosidase mempengaruhi pemanfaatan substrat oleh bakteri usus (Depeint et al. 2008).

Reaksi enzimatik sederhana untuk menghasilkan galaktooligosakarida

(GOS) dari laktosa menggunakan β-galaktosidase. Dimana n bisa berkisar 0-6 meskipun sebagian besar enzim asli menghasilkan GOS dengan n antara 1-2 ditunjukkan pada Gambar 4.

Gambar 4. Reaksi galaktooligosakarida (GOS) dari laktosa menggunakan β -galaktosidase (Regil et al. 2013)

Aksi fisiologis GOS, tergantung pada komposisi campuran. Beberapa studi in vitro dan in vivo menunjukkan GOS tidak tercerna dan stabil dihidrolisis oleh enzim pencernaan dan lebih dari 90% dari GOS masuk ke dalam usus besar (van Loo et al. 1999).

Tri dan tetra GOS secara in vitro tidak terhidrolisis oleh enzim α-amilase saliva manusia, asam lambung buatan, α-amilase pankreas babi, Sebaliknya, sebagian disakarida dicerna oleh enzim usus (Chonan et al. 2004). Dalam studi lain, hanya sejumlah kecil dari 4-galactosyllactose dicerna oleh homogenat dari mukosa usus kecil tikus (Otsuka et al. 1990).

GOS telah diakui dan memiliki status aman (GRAS) di Amerika Serikat, status non-novel food di Uni Eropa, dan dianggap sebagai makanan untuk kesehatan tertentu (FOSHU) di Jepang (Tzortzis dan Vulevic 2009). Satu-satunya efek samping dari GOS dikenal sejauh ini adalah diare osmotik sementara yang terjadi ketika kelebihan konsumsi GOS, mirip dengan laktosa yang tidak diserap (dalam gejala laktosa intoleran individu). Jumlah GOS yang tidak menyebabkan diare osmotik diperkirakan sekitar 0,3-0,4 g/kg berat badan, atau sekitar 20 g per tubuh manusia (Sako et al. 1999).

Sinbiotik

Penggunaan prebiotik dan probiotik dalam bentuk kombinasi sering disebut sebagai sinbiotik, namun berdasarkan Food & Agriculture Organization PBB (FAO) merekomendasikan bahwa istilah "sinbiotik" digunakan hanya jika memberikan manfaat kesehatan secara sinergis (Pineiro et al. 2008). Bakteri probiotik dapat berkolonisasi pada usus bagian atas untuk mencegah perekatan bakteri patogen pada saluran usus tersebut, serta dapat membantu dalam pencernaan. Kombinasi prebiotik dan probiotik memiliki efek sinergis karena selain meningkatkan pertumbuhan strain bakteri menguntungkan yang ada di usus besar, juga memberikan efek fisiologis bagi kesehatan.

Hernandez et al. (2012) mengemukakan bahwa prebiotik dapat meningkatkan kelangsungan hidup bakteri probiotik. Kombinasi bifidobakteria

(34)

dan oligofruktosa dilaporkan sinergis dalam mencegah resiko kanker usus pada tikus dibandingkan dengan ketika diberi secara tersendiri (Gallaher et al. 1999). Studi lain melaporkan bahwa sinbiotik mengandung Pediococcus pentoseceus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus paracasei, dan L. plantarum dengan

empat serat difermentasi yaitu β-glucan, inulin, pektin, dan pati resisten dapat mengurangi terjadinya infeksi pasca-operasi, dari 48% menjadi 13% pada 66 pasien transplantasi hati (Rayes et al. 2005). Kombinasi probiotik dan prebiotik dapat menurunkan kolesterol yang ditunjukkan dengan pengujian in vivo dan in vitro. Beberapa penelitian yang relevan terkait penghilangan / penurunan kolesterol secara in vitro, ditunjukan pada Tabel 1.

Tabel 1. Kombinasi efektif prebiotik terhadap isolat probiotik untuk menurunkan kolesterol secara in vitro

Isolat Probiotik Jenis Prebiotik Konsentrasi

prebiotik (%) b/v

Penurunan

kolesterol Referensi

L. acidophilus ATCC

4962

Kombinasi : Mannitol

FOS Inulin

4.14 3.28 5.82

58.142

µg/mL

Liong dan Shah 2005a

L. casei ASCC 292

Kombinasi : FOS Maltodextrin

4.95 6.64

50.66µg/mL Liong dan Shah 2005b

L. plantarum LS12

Kombinasi : Mannitol

GOS

5.20 4.50

75.9 % Zhang et al. 2007 L. delbrueckii

subsp.bulgaricus LB 340

Rafinosa 0.50 34.68 mg/g

Ziar et al. 2013

S. thermophilus TA040

atauLactobacillus

rhamnosus LBRE-LSAS

Lactulose 0.50 26.37 mg/g 22.75 mg/g B. animalis subsp. lactis

(35)

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan ini dilakukan di laboratorium Bahan Alam, Pangan dan Farmasi (BAPF) di Pusat Penelitian Kimia-LIPI pada bulan Mei - Desember 2014.

Bahan

Bahan utama oligosakarida yang digunakan dalam penelitian ini adalah Inulin komersial ORAFTI®, FOS dari ORAFTI®, GOS komersial dari JINAO® (Anhui China), dan hidrolisat inulin (Laboratorium Puslit Kimia-LIPI). Bakteri Asam Laktat (BAL) yaitu, isolat BAL lokal yang bersumber dari ASI (Pediocococcus pentosaceus 1-A38, Lactobacillus rhamnosus R23) dan isolat BAL lokal dari tempe (Lactobacillus plantarum 1-S27202, L. fermentum S21209) yang diperoleh dari Laboratorium SEAFAST Center IPB, dan isolat komersial Lactobacillus acidophilus FNCC 0051 merupakan isolat dari pencernaan manusia, diperoleh dari UGM.

Bahan kimia yang digunakan untuk persiapan kultur isolat BAL dan pengujian fermentabilitas pertumbuhan isolat BAL pada prebiotik yaitu NaCl fisiologis MRS Agar, MRS Broth, MRSC broth tanpa glukosa (MRS-C) : pepton, yeast extract, Tween 80, K2HPO4, Na-asetat, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O. Pada

pengujian penghilangan kolesterol yaitu, cholesterol PEG-600 ( polyoxyethanyl-cholesteryl sebacate, Sigma), ox-bile, o-phtaldealdehida, KOH (33% b/v), hexana, asam sulfat pekat, etanol 96% serta untuk penentuan senyawa organik dan Short Chain Fatty Acid yaitu standar asam laktat, asam asetat, asam propionat dan asam butirat.

Alat

Autoclaf, inkubator, laminar flow cabinet, spektrofotometer, HPLC, pipet mikro, filter syringe cellulose acetat ukuran pori 0,22µm, sentrifuge, vortex, waterbath, hotplate dan alat-alat gelas lainnya yang digunakan untuk analisa.

Metode Penelitian

Penelitian yang dilakukan terdiri dari 3 (tiga) tahapan, sebagai berikut : Tahap pertama mengevaluasi lima isolat bakteri asam laktat (BAL) dari sumber yang berbeda, yaitu Lactobacillus fermentum S21209 dan Lactobacillus plantarum 1-S27202 dari tempe, Lactobacillus rhamnosus R23 dan Pediococcus pentosaceus 1-A38 dari ASI dan isolat komersial Lactobacillus acidophilus FNCC 0051 dari percernaan manusia dalam kemampuannya menurunkan kolesterol secara in vitro, sehingga diperoleh kultur isolat BAL terpilih untuk digunakan pada tahap selanjutnya, dengan parameter pengujian terhadap total BAL dan kadar kolesterol dalam medium. Tahap kedua dilakukan evaluasi kemampuan isolat BAL untuk memetabolisme oligosakarida (Inulin, Hidrolisat Inulin, FOS serta GOS) dengan parameter pengujian pertumbuhan BAL yang

(36)

diukur dengan absorbansinya pada 620 nm, pH (derajat keasaman), total gula yang dikonsumsi dan asam organik (asam laktat) dan SCFA (asam asetat, asam propionat, dan asam butirat) dari isolat BAL terpilih. Tahap ketiga dilakukan evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida dilakukan pada media berbasis MRS dengan berbagai oligosakarida tunggal (5% GOS, 5% FOS, 5% inulin dan 5% hidrolisat inulin) dan kombinasi sumber karbon (5% FOS+ 5% GOS, 5% FOS + 5% inulin, 5% FOS + 5% hidrolisat inulin, 5% GOS + 5% inulin, 5% GOS + 5% hidrolisat inulin, 5% inulin + 5% hidrolisat inulin), sebagai kontrol digunakan media berbasis MRS tanpa gula dan dengan glukosa. Konsentasi 5% hidrolisat inulin dihitung berdasarkan berat kering hidrolisat inulin (kadar air 61.825%). Parameter pengujian analisis kadar kolesterol, profil asam organik (asam laktat) dan SCFA (asam asetat, butirat dan propionat), total gula yang dikonsumsi serta yield total asam. Tahapan penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 5. Tahapan Alur Penelitian Tahap I

Evaluasi Isolat BAL Lactobacillus fermentum S21209 & Lactobacillus

plantarum 1-S27202 dari tempe, Lactobacillus rhamnosus R23 &

Pediococcus pentosaceus 1-A38 dari ASI

dan isolat komersial Lactobacillus

acidophilus FNCC 0051 dari percernaan

manusia dalam menurunkan kolesterol secara in vitro

Parameter Uji : Total BAL dan kadar

kolesterol dalam medium

Tahap II Evaluasi Kemampuan

Isolat BAL untuk memetabolisme oligosakarida (Inulin, Hidrolisat Inulin, FOS,

GOS) Kultur Isolat

BAL Terpilih

Tahap III

Evaluasi Kemampuan Isolat BAL terpilih untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida :

 Tunggal A = Tanpa Gula

B = 5% Glukosa(non prebiotik) C = 5% GOS

D = 5 % FOS E = 5% Inulin

F = 5% Hidrolisat inulin (b.k)*  Kombinasi

G = 5% FOS + 5% GOS H= 5% FOS + 5% Inulin

I = 5% FOS +5% Hidrolisat Inulin (b.k) J = 5% GOS + 5% Inulin

K = 5% GOS + 5% Hidrolisat Inulin (b.k) L = 5% Inulin + 5% Hidrolisat Inulin(b.k) *) 5% hidrolisat inulin dihitung

berdasarkan berat kering hidrolisat inulin

Parameter Uji : 1. OD 620

2. Total Gula

3. pH (derajat keasaman) 4. Asam organik (asam

laktat) dan SCFA dari isolat terpilih (asam asetat, asam propionat, asam butirat dan asam laktat)

Parameter Uji : 1. Kadar kolesterol dalam

medium dan pelet 2. Total BAL

3. Total gula dikonsumsi 4. Asam organik (asam laktat )

termasuk SCFA (asam asetat, asam propionat, asam butirat )

(37)

Prosedur Penelitian

Evaluasi isolat BAL dalam menurunkan kolesterol secara in vitro (Liong dan Shah 2005a; Zhang et al. 2007)

Evaluasi isolat BAL dalam menurunkan kolesterol dilakukan dalam medium MRSB berisi 0,30% oxbile dan 80µg/mL larutan kolesterol larut air. Sebelumnya dipersiapkan larutan kolesterol larut air (10mg/mL) yang telah disterilisasi dengan membran filter cellulose acetat 0,22µm. Ke dalam medium MRSB yang telah ditambahkan 0,3% oxbile diinokulasikan sebesar 1% v/v kultur isolat BAL, berumur 24 jam dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Liong dan Shah 2005a; Zhang et al. 2007). Total BAL dihitung dengan Standar Plate Count (SPC) (BAM 2001). Untuk pengukuran kadar kolesterol, kultur disentrifugasi 10.000g selama 10 menit pada suhu 4oC dan dilakukan pengukuran kadar kolesterol pada medium (supernatan) atau pada sel pelet dengan menggunakan metode kalorimetri (Gilliland et al. 1985). Sel pelet dicuci sebanyak 2 (dua) kali dengan larutan PBS (Phosphate Buffer Saline) dan sel pellet yang telah dicuci di-resuspensikan kembali dengan air destilasi sejumlah volume yang sama dengan media awal. Penurunan konsentrasi kolesterol pada media ditentukan berdasarkan selisih antara konsentrasi kolesterol yang ditambahkan di awal sebelum masa inkubasi dengan konsentrasi kolesterol yang tersisa pada media (supernatan). Konsentrasi kolesterol yang terikat pada sel dengan mengukur kadar kolesterol dari sel pelet yang telah di-resuspensi dengan air destilat.

Evaluasi kemampuan isolat BAL untuk tumbuh pada oligosakarida

Evaluasi kemampuan isolat BAL untuk memetabolisme oligosakarida dilakukan pada medium berbasis MRS dengan mengganti glukosa dengan oligosakarida (Zhang et al. 2007). Isolat BAL diinokulasikan sebesar 1% v/v, ke dalam 10 mL media berbasis MRS yang mengandung 5% b/v oligosakarida selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Semua percobaan diulang sebanyak tiga kali. Kemampuan pertumbuhan bakteri ditentukan berdasarkan optical density pada 620 nm (OD620) yang diukur dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis Hitachi U-2001. Pengukuran pH dan total gula dilakukan pada 0 dan 24 jam. Pengukuran gula dilakukan dengan metode fenol sulfat (Dubois et al. 1956). Selain itu terhadap supernatan L. acidophilus dan L. rhamnosus dilakukan pengukuran profil asam organik termasuk SCFA (Short Chain Fatty Acid) menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Dubey dan Mistry 1996), merk Young Lin YL 9170 dengan detektor refractive index, kolom Aminex HPX-87H (7.8 mm ×300 mm) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) serta suhu utama dipertahankan pada 65oC, sedangkan fase gerak 0.009 mol/L H2SO4 dengan laju alir 0.6 mL/menit.

(38)

Evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida (Liong dan Shah 2005a; Zhang et al. 2007)

Evaluasi kemampuan isolat BAL terpilih untuk menurunkan kolesterol dengan keberadaan oligosakarida dilakukan pada media berbasis MRS, dengan berbagai oligosakarida tunggal (5% GOS, 5% FOS, 5% inulin dan 5% hidrolisat inulin) dan kombinasi sumber karbon (5% FOS+ 5% GOS, 5% FOS + 5% inulin, 5% FOS + 5% hidrolisat inulin, 5% GOS + 5% inulin, 5% GOS + 5% hidrolisat inulin, 5% inulin + 5% hidrolisat inulin), sebagai kontrol digunakan media berbasis MRS tanpa gula dan dengan glukosa. Inkubasi kultur dan analisis kadar kolesterol dengan menggunakan metode kalorimetri (Gilliland et al. 1985), serta profil asam organik (asam laktat) termasuk SCFA (asam asetat, butirat dan propionat) dilakukan seperti di atas.

Prosedur Analisis

Total Gula Metode Fenol-Sulfat (Dubois et al. 1956)

Prinsip metode TS (total sugar) yang digunakan untuk mengukur total gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula sederhana, oligosakarida, dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat yang akan menghasilkan warna jingga kekuningan yang stabil.

Pada pengukuran total gula dipersiapkan larutan standar glukosa dengan konsentrasi masing-masing 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; dan 0,5 g/L, selanjutnya sebanyak 0,5 mL dari masing-masing larutan dimasukkan ke dalam tabung yang terpisah, kemudian rendam dalam waterbath, dan masing-masing tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL H2SO4 pekat dengan hati-hati melalui dinding tabung. Selanjutnya

sampel didiamkan selama 10 menit, dan divorteks dan didiamkan kembali selama 20 menit. Pengukuran absorbansi menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm, sehingga diperoleh persamaan linier sebagai kurva standar. Pengukuran sampel dilakukan mengikuti prosedur yang sama, namun pada konsentrasi glukosa diganti dengan sebanyak 0,5 mL sampel, kemudian nilai pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

Total BAL (Standard Plate Count /SPC) (BAM 2001)

Perhitungan jumlah bakteri BAL didalam kultur dilakukan beberapa tahapan pengujian, yaitu dari beberapa pengenceran kultur BAL selanjutnya pada cawan petri diinokulasi dengan 0,1 mL kultur bakteri dengan menggunakan metode tuang dengan MRSA dilakukan sebanyak 2 kali ulangan (duplo), selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C selama 72 jam. Koloni yang tumbuh berukuran 0,1-0,5 mm dihitung. Cara perhitungan koloni berdasarkan SPC dengan batasan bahwa standar yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 25-250 (BAM 2001)

N = jumlah koloni pada cawan (n1 + 0,1 n2) x d

(1)

50 Lampiran 12. Hasil analisis statistik penurunan kolesterol pada medium,

pengikatan kolesterol pada sel pelet aktivitas

L. rhamnosus

R23

di dalam media berbasis MRS dengan keberadaan oligosakarida

tunggal dan kombinasi.

One-way ANOVA: Penurunan kolesterol dalam media+BAL (

L. rhamnosus

R23) versus sumber karbon (oligosakarida) tunggal

Source DF SS MS F P SUMBER KARBON (OLIGOSAKA 5 1446.34 289.27 75.51 0.000 Error 12 45.97 3.83

Total 17 1492.31

S = 1.957 R-Sq = 96.92% R-Sq(adj) = 95.64%

Level N Mean StDev 5% bk. Hidrolisat Inulin 3 10.750 2.883 5% FOS 3 29.167 1.041 5% Glukosa 3 22.943 0.768 5% GOS 3 25.333 2.887 5% Inulin 3 21.167 1.528 Tanpa Gula 3 3.167 1.528

Pooled StDev = 1.957

Grouping Information Using Tukey Method

SUMBER KARBON (OLIGOSAKARIDA) N Mean Grouping 5% FOS 3 29.167 A

5% GOS 3 25.333 A B 5% Glukosa 3 22.943 B 5% Inulin 3 21.167 B 5% bk. Hidrolisat Inulin 3 10.750 C Tanpa Gula 3 3.167 D

Means that do not share a letter are significantly different.

One-way ANOVA: Penurunan kolesterol dalam media+BAL (

L.rhamnosus

R23) versus kombinasi sumber karbon (oligosakarida)

Source DF SS MS F P SUMBER KARBON (OLIGOSAKA 5 184.3 36.9 1.86 0.176 Error 12 237.8 19.8

Total 17 422.1

S = 4.452 R-Sq = 43.66% R-Sq(adj) = 20.18%

Level N Mean StDev 5% FOS + 5% bk.Hidrolisa 3 19.000 3.464 5% FOS + 5% GOS 3 21.167 2.754 5% FOS + 5% Inulin 3 23.833 7.572 5% GOS + 5% bk. Hidrolis 3 14.833 4.907 5% GOS + 5% Inulin 3 22.833 0.764 5% Inulin + 5% bk. Hidro 3 23.833 4.163

Pooled StDev = 4.452

Grouping Information Using Tukey Method

SUMBER KARBON (OLIGOSAKARIDA) N Mean Grouping 5% FOS + 5% Inulin 3 23.833 A

(2)

51

5% GOS + 5% Inulin 3 22.833 A

5% FOS + 5% GOS 3 21.167 A 5% FOS + 5% bk.Hidrolisat Inulin 3 19.000 A 5% GOS + 5% bk. Hidrolisat Inulin 3 14.833 A

Means that do not share a letter are significantly different.

One-way ANOVA: Pengikatan kolesterol pada sel pelet

L.rhamnosus R23

versus sumber karbon (oligosakarida) tunggal

Source DF SS MS F P Oligosakarida Tunggal 5 764.79 152.96 30.99 0.000 Error 11 54.29 4.94

Total 16 819.08

S = 2.222 R-Sq = 93.37% R-Sq(adj) = 90.36%

Level N Mean StDev 5% FOS 3 4.944 1.988 5% Glukosa 3 12.778 3.097 5% GOS 2 24.250 2.475 5% Hidrolisat Inulin 3 17.500 2.291 5% Inulin 3 8.778 1.988 Media Tanpa Gula +BAL 3 3.833 1.155

Pooled StDev = 2.222

Grouping Information Using Tukey Method

Oligosakarida Tunggal N Mean Grouping 5% GOS 2 24.250 A

5% Hidrolisat Inulin 3 17.500 A B 5% Glukosa 3 12.778 B C 5% Inulin 3 8.778 C D 5% FOS 3 4.944 D Media Tanpa Gula +BAL 3 3.833 D

Means that do not share a letter are significantly different.

One-way ANOVA: Pengikatan kolesterol pada sel pelet

L.rhamnosus R23

versus kombinasi sumber karbon (oligosakarida)

Source DF SS MS F P Oligosakarida Kombinasi 5 64.70 12.94 6.02 0.008 Error 10 21.51 2.15

Total 15 86.21

S = 1.467 R-Sq = 75.05% R-Sq(adj) = 62.57%

Level N Mean StDev 5% FOS + 5% bk.Hidrolisa 3 7.667 2.179 5% FOS + 5% Inulin 3 7.889 0.631 5% FOS+5% GOS 2 4.082 0.356 5% GOS + 5% bk. Hidrolis 3 3.278 0.674 5% GOS +5% Inulin 2 6.583 0.354 5% Inulin + 5% bk. Hidro 3 8.500 2.242

Pooled StDev = 1.467

Grouping Information Using Tukey Method

(3)

52

5% Inulin + 5% bk. Hidrolisat Inulin 3 8.500 A

5% FOS + 5% Inulin 3 7.889 A 5% FOS + 5% bk.Hidrolisat Inulin 3 7.667 A 5% GOS +5% Inulin 2 6.583 A B 5% FOS+5% GOS 2 4.082 A B 5% GOS + 5% bk. Hidrolisat Inulin 3 3.278 B

Means that do not share a letter are significantly different.

Lampiran 13. Hasil perhitungan statistik total asam organik termasuk SCFA oleh

aktivitas

L. rhamnosus

R23 dari oligosakarida tunggal dan

kombinasi dalam medium yang mengandung kolesterol.

One-way ANOVA: Total SCFA

L.rhamnosus

R23 versus oligosakarida

tunggal

Source DF SS MS F P oligosakarida 4 8624.019 2156.005 6871.07 0.000 Error 5 1.569 0.314

Total 9 8625.588

S = 0.5602 R-Sq = 99.98% R-Sq(adj) = 99.97%

Level N Mean StDev 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 107.680 0.000 5% FOS 2 82.320 0.424 5% Glukosa 2 167.315 0.233 5% GOS 2 143.480 0.651 5% Inulin 2 116.645 0.955

Pooled StDev = 0.560

Grouping Information Using Tukey Method

oligosakarida N Mean Grouping 5% Glukosa 2 167.315 A

5% GOS 2 143.480 B 5% Inulin 2 116.645 C 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 107.680 D 5% FOS 2 82.320 E

Means that do not share a letter are significantly different.

One-way ANOVA: Total SCFA

L.rhamnosus

R23 versus kombinasi

oligosakarida

Source DF SS MS F P oligosakarida 5 4764.3 952.9 11.97 0.004 Error 6 477.8 79.6

Total 11 5242.1

S = 8.924 R-Sq = 90.89% R-Sq(adj) = 83.29%

Level N Mean StDev 5% FOS + 5% bk.Hidrolisa 2 105.08 0.66 5% FOS + 5% GOS 2 157.61 0.00 5% FOS + 5% Inulin 2 111.94 1.27 5% GOS + 5% bk. Hidrolis 2 153.07 21.76 5% GOS + 5% Inulin 2 145.81 0.97 5% Inulin + 5% bk. Hidro 2 135.99 1.19

(4)

53

Pooled StDev = 8.92

Grouping Information Using Tukey Method

oligosakarida N Mean Grouping 5% FOS + 5% GOS 2 157.61 A

5% GOS + 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 153.07 A 5% GOS + 5% Inulin 2 145.81 A B 5% Inulin + 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 135.99 A B C 5% FOS + 5% Inulin 2 111.94 B C 5% FOS + 5% bk.Hidrolisat Inulin 2 105.08 C

Means that do not share a letter are significantly different.

Lampiran 14. Hasil analisis statistik

yield

asam organik yang dihasilkan oleh

isolat

L. rhamnosus

R23 dari oligosakarida tunggal dan kombinasi

dalam medium yang mengandung kolesterol

One-way ANOVA:

Yield L. rhamnosus

R23 versus oligosakarida tunggal

Source DF SS MS F P

oligosakarida 4 20.75001 5.18750 9733.78 0.000 Error 5 0.00266 0.00053

Total 9 20.75268

S = 0.02309 R-Sq = 99.99% R-Sq(adj) = 99.98%

Level N Mean StDev 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 3.5236 0.0000 5% FOS 2 4.1450 0.0214 5% Glukosa 2 4.6619 0.0065 5% GOS 2 7.5278 0.0341 5% Inulin 2 3.8663 0.0316

Pooled StDev = 0.0231

Grouping Information Using Tukey Method

oligosakarida N Mean Grouping 5% GOS 2 7.5278 A

5% Glukosa 2 4.6619 B 5% FOS 2 4.1450 C 5% Inulin 2 3.8663 D 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 3.5236 E

One-way ANOVA:

Yield L. rhamnosus

R23 versus kombinasi oligosakarida

Source DF SS MS F P

oligosakarida 5 46.0731 9.2146 2 58.63 0.000

Error 6 0.2138 0.0356 Total 11 46.2868

S = 0.1888 R-Sq = 99.54% R-Sq(adj) = 99.15%

Level N Mean StDev 5% FOS + 5% bk.Hidrolisa 2 1.0164 0.0064 5% FOS + 5% GOS 2 1.5332 0.0000 5% FOS + 5% Inulin 2 1.8350 0.0207 5% GOS + 5% bk. Hidrolis 2 3.2224 0.4581

(5)

54

5% GOS + 5% Inulin 2 1.2973 0.0086

5% Inulin + 5% bk. Hidro 2 6.6891 0.0584

Pooled StDev = 0.1888

Grouping Information Using Tukey Method

oligosakarida N Mean Grouping 5% Inulin + 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 6.6891 A

5% GOS + 5% bk. Hidrolisat Inulin 2 3.2224 B 5% FOS + 5% Inulin 2 1.8350 C 5% FOS + 5% GOS 2 1.5332 C D 5% GOS + 5% Inulin 2 1.2973 C D 5% FOS + 5% bk.Hidrolisat Inulin 2 1.0164 D

(6)