Seleksi bakteri asam laktat isolat ASI yang berpotensi menurunkan kolesterol secara in vitro

SELEKSI BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT ASI

YANG BERPOTENSI MENURUNKAN KOLESTEROL

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

SITI WINARTI

F24061660

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

IN VITRO SELECTION OF REDUCING CHOLESTEROL

ABILITY OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED FROM

BREAST MILK

Siti Winarti, Lilis Nuraida, and Endang Prangdimurti

Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, Bogor, West Java, Indonesia.

ABSTRACT

Hypercholesterol is a risk factor for cardiovascular disease, the leading cause of death in many countries. Several studies have shown that the reduction of excessive levels of cholesterol in the blood decreases the risks of cardiovascular disease. It is therefore important to develop ways of reducing serum cholesterol. Based on in vitro and in vivo studies, some of lactic acid bacteria (LAB) have potential probiotic properties can reduce total cholesterol levels. There are several mechanisms of LAB in reducing cholesterol. Some of them are their ability for assimilate cholesterol and deconjugate bile salt. Deconjugation ability correlates with bile salt hydrolase activity (BSH). Earlier researchers have isolated LAB from breast milk. The aim of this study were to obtain LAB that have ability in reducing cholesterol in vitro based on their ability for assimilate cholesterol and to evaluate their BSH activity.

Thirty seven of LAB isolated from breast milk were selected for their ability to grow in medium containing 2-propanol; sodium thioglycolate; oxgall; and also medium containing combination of them. There were thirteen isolates that capable to grow at medium containing all tested compounds, and further these isolates were evaluated for their acid and bile resistance, also assimilation and BSH activity. Results showed that most of isolates were capable to grow at medium containing 0.5% oxgall. Total cells of each isolate has decreased after incubated in low pH medium (pH2) with decreasing range about 0.57-7.24 log cfu/ml. Thirteen isolates tested had capability to assimilate

cholesterol at varying levels ranging from 0.86-14.97µg/ml, but BSH activity which tested by indirect

method showed that BSH activity were not detected for all isolates. Statistical analysis showed no significant correlation between acid resistance and cholesterol assimilating ability, also bile resistance and cholesterol assimilating ability. Based on their ability to assimilate cholesterol, three isolates i.e. Lactobacillus A38, Lactobacillus B2, and Pediococcus pentosaceus2 A16 were potential for reducing cholesterol.

Siti Winarti. F24061660. Seleksi Bakteri Asam Laktat Isolat ASI yang Berpotensi Menurunkan Kolesterol secara in vitro. Di bawah bimbingan Lilis Nuraida dan Endang Prangdimurti. 2011.

RINGKASAN

Kardiovaskular merupakan salah satu penyakit yang dapat menyebabkan kematian. Terdapat banyak faktor yang mempengaruhi timbulnya penyakit kardiovaskular, diantaranya adalah peningkatan kadar kolesterol khususnya LDL yang biasa disebut sebagai hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia terjadi jika kadar kolesterol melebihi batas normal. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa beberapa bakteri asam laktat (BAL) yang berpotensi sebagai probiotik dapat menurunkan total kolesterol baik secara in vitro maupun in vivo. Terdapat beberapa mekanisme BAL dalam menurunkan kolesterol, diantaranya adalah kemampuan BAL dalam mengasimilasi kolesterol dan mendekonjugasi garam empedu. Kemampuan mendekonjugasi garam empedu berhubungan dengan aktivitas bile salt hydrolase (BSH) yang dihasilkan oleh bakteri tersebut. Peneliti terdahulu telah berhasil mengisolasi bakteri asam laktat dari air susu ibu (ASI), dan beberapa dari isolat tersebut diketahui berpotensi sebagai probiotik.

Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan BAL isolat ASI yang berpotensi menurunkan kolesterol. Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah untuk mengetahui ketahanan BAL isolat ASI terhadap pH rendah dan garam empedu, kemampuan BAL isolat ASI dalam mengasimilasi kolesterol, dan aktivitas BSH dari BAL isolat ASI.

Penelitian ini terdiri dari empat tahap yang meliputi uji pertumbuhan BAL dalam media yang mengandung senyawa uji, uji ketahanan BAL terhadap pH rendah dan garam empedu, uji asimilasi kolesterol, dan uji aktivitas BSH. BAL isolat ASI yang diuji dalam penelitian ini berjumlah 37 isolat. Tahap pertama dilakukan dengan menumbuhkan masing-masing isolat dalam MRSB yang mengandung 2-propanol (4% v/v); natrium tioglikolat (0.2% b/v); oxgall (0.2 dan 0.3% b/v); dan MRSB yang mengandung kombinasi ketiganya (4% 2-propanol, 0.2% natrium tioglikolat, dan 0.3% oxgall) pada suhu 37°C. Adanya pertumbuhan ditandai dengan timbulnya kekeruhan pada media. Isolat-isolat yang mampu tumbuh pada media yang mengandung semua senyawa uji, diuji pada tahapan selanjutnya. Uji ketahanan terhadap pH dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada MRSB yang memiliki pH 2 selama 5 jam, sedangkan uji ketahanan terhadap garam empedu dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada MRSB yang mengandung 0.5% oxgall selama 24 jam. Uji asimilasi dilakukan dengan menumbuhkan isolat pada MRSB yang mengandung kolesterol, natrium tioglikolat dan oxgall kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 jam. Sebagai kontrol, media yang sama tidak diinokulasi oleh kultur. Kolesterol terasimilasi merupakan selisih konsentrasi kolesterol yang terdapat dalam media kontrol dengan media uji, yang diukur menggunakan metode o-ftalaldehida. Aktivitas BSH diuji dengan menumbuhkan isolat pada media MRSA yang mengandung 0.5% TDCA

(taurodeoxicholic acid) dan 0.37 g/L CaCl2. Adanya aktivitas BSH diketahui dengan terbentuknya

endapan di sekitar koloni.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua isolat mampu tumbuh pada media yang mengandung 2-propanol (4%) maupun natrium tioglikolat (0.2%) dengan tingkat pertumbuhan yang hampir sama dengan kontrol. Dengan demikian, adanya 2-propanol (4%) dan natrium tioglikolat (0.2%) tidak begitu berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri. Semua isolat juga mampu tumbuh pada media yang mengandung oxgall 0.2% dengan derajat pertumbuhan yang berbeda. Pada konsentrasi oxgall 0.3% dan waktu inkubasi 24 jam, dari 37 isolat yang diuji, terdapat 4 isolat yang tidak tumbuh (media tidak keruh). Pada inkubasi 48 jam, semua isolat dapat tumbuh pada konsentrasi oxgall 0.3%. Hal ini menunjukkan bahwa adanya garam empedu telah menghambat pertumbuhan BAL sehingga BAL membutuhkan waktu adaptasi yang lebih lama untuk dapat tumbuh. Dari 37 isolat dipilih 13 isolat untuk diuji pada tahapan selanjutnya, yaitu isolat Lactobacillus A6, A38, B2, B13, dan R3; L. fermentum A20; L. fermentum2 B11; L. acidophilus1 A8 dan A22; L. rhamnosus A23;

Pediococcus pentosaceus2 A16; serta Leuconostoc R1 dan R9. Pemilihan ini didasarkan pada

kemampuan isolat-isolat tersebut untuk dapat tumbuh pada media yang mengandung 2-propanol, natrium tioglikolat, oxgall, dan kombinasi ketiganya. Hal ini disesuaikan dengan kondisi pada uji asimilasi kolesterol yang dilakukan pada tahapan selanjutnya.

Hasil uji ketahanan terhadap pH menunjukkan terjadinya penurunan jumlah sel pada semua isolat yang ditumbuhkan pada media dengan pH 2 selama 5 jam. Dari 13 isolat yang diuji, hanya satu isolat yang mengalami penurunan jumlah sel <1 unit log cfu/ml (paling tahan), yaitu Lactobacillus

R3, sedangkan isolat lainnya mengalami penurunan jumlah sel >3 unit log cfu/ml. Uji ketahanan terhadap garam empedu juga menunjukkan adanya perubahan jumlah sel pada masing-masing isolat yang diuji. Dari 13 isolat yang diuji, sebanyak 6 isolat mengalami penambahan jumlah sel setelah inkubasi selama 24 jam dengan kisaran 0.22-0.32 log cfu/ml. Hal ini menunjukkan adanya pertumbuhan pada isolat-isolat tersebut. Sebaliknya, 7 isolat lainnya mengalami penurunan jumlah sel dengan kisaran 0.01-0.22 log cfu/ml. Semua isolat dapat dikatakan tahan terhadap garam empedu, kecuali isolat Leuconostoc R9 karena jumlahnya sudah menurun saat inkubasi 0 jam. Lactobacillus

R3, L. fermentum A20, dan Pediococcus pentosaceus2 A16 merupakan isolat yang mempunyai

ketahanan paling tinggi terhadap garam empedu dibandingkan isolat lainnya berdasarkan hasil analisis statistik. Ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu bersifat strain dependent dan dipengaruhi oleh komposisi asam lemak pada membran masing-masing strain yang diuji.

Tiga belas isolat yang diuji memiliki kemampuan mengasimilasi kolesterol secara in vitro

dengan kisaran 0.86-14.97 µg/ml. Kemampuan mengasimilasi ini bersifat strain dependent dan dipengaruhi oleh sifat kimia dan struktural dari peptidoglikan dinding sel masing-masing strain.

Lactobacillus A38, Lactobacillus B2, dan Pediococcus pentosaceus2 A16 merupakan isolat yang

memiliki aktivitas asimilasi terbesar dan berpotensi menurunkan kolesterol. Berdasarkan analisis statistik, tidak ada hubungan yang signifikan antara ketahanan terhadap pH, ketahanan terhadap garam empedu, maupun total ketahanan terhadap pH dan garam empedu dengan kemampuan mengasimilasi kolesterol pada BAL. BAL yang memiliki ketahanan tinggi terhadap pH rendah dan garam empedu belum tentu memiliki kemampuan mengasimilasi kolesterol tinggi.

Pengujian aktivitas BSH yang dilakukan dengan menggunakan metode tidak langsung menunjukkan bahwa aktivitas BSH tidak terdeteksi pada semua isolat yang diuji. Hal ini ditunjukkan dengan tidak adanya endapan yang terbentuk di sekitar koloni, yang menandakan tidak adanya aktivitas dekonjugasi terhadap garam empedu. Tidak terdeteksinya aktivitas BSH kemungkinan terjadi karena isolat-isolat tersebut tidak dapat menghasilkan BSH atau BSH yang dihasilkan terlalu sedikit sehingga tidak mampu untuk mendekonjugasi garam empedu. Selain itu, tidak terdeteksinya aktivitas BSH mungkin juga terjadi karena metode yang digunakan adalah metode tidak langsung (tidak secara langsung mengukur aktivitas BSH dari bakteri asam laktat).

SELEKSI BAKTERI ASAM LAKTAT ISOLAT ASI

YANG BERPOTENSI MENURUNKAN KOLESTEROL

SECARA IN VITRO

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN

pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,

Fakultas Teknologi Pertanian,

Institut Pertanian Bogor

Oleh

SITI WINARTI

F24061660

DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

Judul Skripsi : Seleksi Bakteri Asam Laktat Isolat ASI yang Berpotensi

Menurunkan Kolesterol secara

in vitro

Nama

: Siti Winarti

NIM

: F24061660

Menyetujui,

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc

Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si

NIP. 19621009 198703 2 002

NIP. 19680723 199203 2 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.

NIP. 19650814 199022 1 001

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Seleksi Bakteri Asam

Laktat Isolat ASI yang Berpotensi Menurunkan Kolesterol secara in vitro adalah hasil karya saya

sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Februari 2011 Yang membuat pernyataan

Siti Winarti F24061660

Sit seb Ne Hi (Su jal Te pe

Fo

anggota paduan suara Fa seminar, diantaranya Pela ISO 22000. Selain itu, p asisten praktikum Kimia Pangan (2010), serta m kewirausahaan.

Sebagai syarat unt skripsi dengan judul ”S Kolesterol secara in vitro

Prangdimurti, M.Si.

BIODATA PENULIS

Siti Winarti. Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tangg sebagai anak kedua dari enam bersaudara, dari pasang Nengsih. Penulis menyelesaikan jenjang pendidikan di Hilir (Sukabumi), SLTPN 1 Cibadak (Sukabumi), d (Sukabumi). Tahun 2006, penulis diterima di Institut Pe jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) dan masuk Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian perkuliahan penulis aktif sebagai anggota HIMITEPA

Food Processing Club divisi vegetarian (2008) dan

Fateta (PSF) (2007-2009). Penulis pernah mengikuti b elatihan Sistem Manajemen Halal (2008) dan Seminar , penulis juga menjadi asisten praktikum Kimia Dasar ia dan Biokimia Pangan (2008), dan asisten praktikum

mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM)

ntuk memperoleh gelar sarjana Teknologi Pertanian, Seleksi Bakteri Asam Laktat Isolat ASI yang Be

itro”, di bawah bimbingan Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.S

vi ggal 11 September 1988 ngan Adna Suharya dan di SDN Bojong Kawung dan SMAN 1 Cibadak Pertanian Bogor melalui uk Departemen Ilmu dan n IPB. Selama masa A (2007-2009), anggota n ekstrusi (2009), serta i beberapa pelatihan dan nar HACCP VI included

r TPB IPB (2008-2009), m Teknologi Pengolahan ) bidang penelitian dan

, penulis menyelesaikan Berpotensi Menurunkan .Sc dan Dr. Ir. Endang

iii

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT karena atas kehendak dan karunia-Nya, penelitian yang berjudul “Seleksi Bakteri Asam Laktat Isolat ASI yang Berpotensi Menurunkan Kolesterol secara in vitro” dapat diselesaikan. Penelitian ini dilakukan sebagai bagian dari tugas akhir untuk memperoleh gelar sarjana pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Penelitian ini dapat diselesaikan atas sumbangan pemikiran dan masukan dari pembimbing serta bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Orang tua penulis, Adna Suharya dan Nengsih, serta seluruh keluarga tercinta atas doa, dukungan, semangat, kasih sayang, dan pengorbanan yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2. Dr. Ir. Lilis Nuraida, M.Sc. selaku dosen pembimbing akademik dan pembimbing skripsi yang telah memberikan arahan, bimbingan, bantuan dan nasehat yang sangat berharga bagi penulis sehingga skripsi ini dapat diselesaikan.

3. Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si. selaku dosen pembimbing skripsi kedua yang telah memberikan arahan, bimbingan, dan saran bagi kelengkapan skripsi penulis.

4. Dr. Ir. Didah Nur Faridah, M.Si. yang telah bersedia menjadi dosen penguji dan memberikan saran bagi kelengkapan skripsi penulis.

5. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi yang telah memberikan dana melalui Hibah Kompetensi sehingga penelitian dapat dilaksanakan.

6. Tjahja Muhandri, STP, MT. yang selalu memberikan bimbingan, nasehat dan masukan pada penulis.

7. Bapak Usman Pato dan Ibu Netty Kusumawati yang senantiasa memberikan masukan pada penulis saat melakukan penelitian.

8. Teman-teman penelitian, Ivani, Juli, Neng, Ipit, Victor, Yogi, dan Ipan yang selalu memberi bantuan, semangat, dan harapan bagi penulis sehingga skripsi ini dapat diselesaikan.

9. Seluruh mahasiswa ITP 43, terutama Nisa, Rima, Dedes, Angga, Arini, Saida, Ovi, Nadia, dan Tsani yang telah menemani penulis selama perkuliahan.

10. Teman-teman TPB penulis (Mala, Iyus, Esti, dan Nana), Ifat, Lingga, ides, a Ade, kak Pengki, dan juga Refian atas bantuan, semangat, dan doa untuk penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

11. Teknisi laboratorium ITP dan SEAFAST atas segala bantuan yang diberikan kepada penulis selama melaksanakan penelitian.

Ucapan terima kasih juga penulis sampaikankepada seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, yang telah berkontribusi secara langsung maupun tidak langsung dalam penyelesaian tugas akhir ini. Semoga Allah SWT membalas seluruh kebaikan yang telah dilakukan.

Bogor, Februari 2011

iv

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ... iii

DAFTAR TABEL ... vi

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR LAMPIRAN ... viii

I. PENDAHULUAN ... 1

A. LATAR BELAKANG ... 1

B. TUJUAN PENELITIAN ... 2

C. MANFAAT PENELITIAN ... 2

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 3

A. BAKTERI ASAM LAKTAT ... 3

B. BAKTERI ASAM LAKTAT SEBAGAI PROBIOTIK ... 3

C. ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL AIR SUSU IBU ... 6

D. KOLESTEROL ... 7

E. MEKANISME PROBIOTIK DALAM MENURUNKAN KOLESTEROL DARAH .. 9

III. METODE PENELITIAN ... 13

A. BAHAN DAN ALAT ... 13

B. METODE PENELITIAN ... 13

1. Pemeliharaan Kultur ... 13

2. Uji Pertumbuhan BAL Isolat ASI pada Media yang Mengandung Senyawa Uji... 14

3. Uji Ketahanan terhadap pH Rendah dan Garam Empedu ... 15

4. Uji Asimilasi Kolesterol ... 15

5. Uji Aktivitas bile salt hydrolase (BSH) ... 16

C. METODE ANALISIS ... 16

1. Analisis Pertumbuhan BAL secara Kualitatif ... 16

2. Analisis Total BAL ... 17

3. Analisis Konsentrasi Kolesterol Terasimilasi ... 17

v

5. Analisis Statistik ... 18

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 20

A. PERTUMBUHAN BAL ISOLAT ASI PADA MEDIA YANG MENGANDUNG SENYAWA UJI ... 20

B. KETAHANAN TERHADAP pH RENDAH DAN GARAM EMPEDU ... 25

C. ASIMILASI KOLESTEROL ... 28

D. AKTIVITAS BILE SALT HYDROLASE (BSH) ... 33

V. SIMPULAN DAN SARAN ... 36

A. SIMPULAN ... 36

B. SARAN ... 36

DAFTAR PUSTAKA ... 37

vi

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 1. Kadar kolesterol total orang dewasa... 8 Tabel 2. Metabolisme kolesterol oleh bakteri di dalam usus ... 12 Tabel 3. Intensitas pertumbuhan BAL isolat ASI pada MRSB (kontrol), MRSB yang

mengandung 2-propanol (4%) dan MRSB yang mengandung natrium

tioglikolat (0.2%).. ... 22 Tabel 4. Intensitas pertumbuhan BAL isolat ASI pada MRSB yang mengandung 0%

(kontrol), 0.2%, dan 0.3% oxgall ... 23 Tabel 5. Intensitas pertumbuhan BAL isolat ASI pada MRSB (kontrol) dan MRSB

yang mengandung 2-propanol (4%), natrium tioglikolat (0.2%), dan oxgall (0.3%) . 24 Tabel 6. Beberapa hasil penelitian uji asimilasi kolesterol ... 30

vii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur kimia kolesterol ... 8

Gambar 2. Mekanisme penurunan kolesterol oleh bakteri asam laktat ... 9

Gambar 3. Metabolisme kolesterol oleh bakteri di dalam usus ... 11

Gambar 4. Diagram alir tahapan penelitian ... 14

Gambar 5. Diagram alir uji asimilasi kolesterol ... 16

Gambar 6. Diagram alir pengukuran kadar kolesterol dengan metode o-ftaladehida.. ... 19

Gambar 7. Perubahan jumlah BAL isolat ASI setelah inkubasi pada media yang memiliki pH 2 selama 5 jam ... 25

Gambar 8. Perubahan jumlah BAL isolat ASI setelah inkubasi pada media yang mengandung 0.5% garam empedu selama 24 jam ... 27

Gambar 9. Jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh BAL isolat ASI setelah inkubasi 20 jam pada suhu 37°C ... 29

Gambar 10. Hubungan ketahanan terhadap pH rendah (pH 2) dengan kolesterol yang dapat diasimilasi oleh BAL... 31

Gambar 11. Hubungan ketahanan terhadap 0.5 % garam empedu dengan kolesterol yang dapat diasimilasi oleh BAL ... 31

Gambar 12. Hubungan ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu dengan kolesterol yang dapat diasimilasi oleh BAL ... 32

Gambar 13. Hasil pengujian aktivitas BSH pada isolat A6, A8, A16, A20,A22, A23, dan A38 yang ditumbuhkan pada MRSA (A) dan MRSA yang mengandung 0.5% TDCA dan 0.37g/L CaCl2 (B) dengan menggunakan kertas saring ... 34

Gambar 14. Hasil pengujian aktivitas BSH pada isolat B2, B11, B13, R1, R3,dan R9 yang ditumbuhkan pada MRSA (A) dan MRSA yang mengandung 0.5% TDCA dan 0.37g/L CaCl2 (B) dengan menggunakan kertas saring ... 34

Gambar 15. Hasil pengujian aktivitas BSH pada isolat A6, A8, A16, A20, A22, A23, dan A38 yang ditumbuhkan pada MRSA (A) dan MRSA yang mengandung 0.5% TDCA dan 0.37g/L CaCl2 (B) tanpa menggunakan kertas saring ... 34

Gambar 16. Hasil pengujian aktivitas BSH pada isolat B2, B11, B13, R1, R3, dan R9 yang ditumbuhkan pada MRSA (A) dan MRSA yang mengandung 0.5% TDCA dan 0.37g/L CaCl2 (B) tanpa menggunakan kertas saring ... 35

viii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Ketahanan BAL isolat ASI terhadap pH rendah (pH 2) ... 42

Lampiran 2. Ketahanan BAL isolat ASI terhadap 0.5% garam empedu ... 43

Lampiran 3. Data ketahanan isolat A6, A8, dan A16 terhadap pH rendah (pH2) ... 44

Lampiran 4. Data ketahanan isolat A20, A22, dan A23 terhadap pH rendah (pH2) ... 45

Lampiran 5. Data ketahanan isolat A38, B2, dan B11 terhadap pH rendah (pH2) ... 46

Lampiran 6. Data ketahanan isolat B13, R1, dan R3 terhadap pH rendah (pH2) ... 47

Lampiran 7. Data ketahanan isolat R9 terhadap pH rendah (pH2) ... 48

Lampiran 8. Data ketahanan isolat A6, A8, dan A16 terhadap 0.5% garam empedu ... 49

Lampiran 9. Data ketahanan isolat A20, A22, dan A23 terhadap 0.5% garam empedu ... 50

Lampiran 10. Data ketahanan isolat A38, B2, dan B11 terhadap 0.5% garam empedu.. ... 51

Lampiran 11. Data ketahanan isolat B13, R1, dan R3 terhadap 0.5% garam empedu ... 52

Lampiran 12. Data ketahanan isolat R9 terhadap 0.5% garam empedu ... 53

Lampiran 13. Tabel dan kurva standar kolesterol ... 54

Lampiran 14. Jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh isolat A16, A22, A38, B2, dan B11 ... 55

Lampiran 15. Jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh isolat A8, R9, dan R3 ... 56

Lampiran 16. Jumlah kolesterol yang diasimilasi oleh isolat A6, A20,A23, B13, dan R1 ... 57

Lampiran 17. Hasil analisis statistik ketahanan BAL isolat ASI terhadap pH rendah ... 58

Lampiran 18. Hasil analisis statistik ketahanan BAL isolat ASI terhadap garam empedu ... 60

Lampiran 19. Hasil analisis statistik kolesterol yang diasimilasi oleh BAL isolat ASI ... 62

Lampiran 20. Hasil analisis statistik korelasi antara ketahanan terhadap pH, ketahanan terhadap garam empedu, total ketahanan terhadap pH dan garam empedu, dan kemampuan mengasimilasi kolesterol... 64 Lampiran 21. Gambar hasil pewarnaan Gram beberapa isolat bakteri asam laktat isolat ASI 65

1

I.

PENDAHULUAN

A.

LATAR BELAKANG

Kardiovaskular merupakan salah satu penyakit yang dapat menyebabkan kematian. Terdapat beberapa bentuk penyakit kardiovaskular, diantaranya adalah penyakit jantung koroner, penyakit serebrovaskular, dan penyakit vaskular perifer (Gustia 2010). Pada tahun 2004, WHO mencatat sekitar 17.1 juta orang meninggal karena penyakit kardiovaskular (29% dari jumlah kematian secara umum). Dalam kasus ini, sekitar 7.2 juta orang meninggal karena jantung koroner dan 5.7 juta orang karena stroke. WHO juga memperkirakan pada tahun 2030 kardiovaskular masih akan menjadi penyebab kematian utama di dunia (WHO 2009). Terdapat banyak faktor yang mempengaruhi timbulnya penyakit kardiovaskular, diantaranya adalah peningkatan kadar kolesterol khususnya LDL yang biasa disebut sebagai hiperkolesterolemia (Anonim 2010). Hiperkolesterolemia terjadi jika kadar kolesterol melebihi batas normal. Peningkatan kadar kolesterol dalam tubuh erat kaitannya dengan pola konsumsi yang kurang baik. Menurut Liong dan Shah (2005a), setiap penurunan kadar kolesterol sebesar 1% dapat menurunkan resiko terjadinya penyakit jantung koroner 2-3%.

Bakteri asam laktat (BAL) yang secara umum digunakan dalam industri fermentasi, saat ini banyak dimanfaatkan dalam bidang kesehatan. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa beberapa bakteri asam laktat dapat menurunkan kolesterol baik secara in vitro maupun in vivo

(Usman dan Hosono 1999; Ngatirah et al. 2000; Kusumawati 2002; Liong dan Shah 2005a; Lye et al. 2010a). Pengaruh bakteri asam laktat terhadap penurunan kolesterol diduga karena kemampuannya dalam mengasimilasi kolesterol dan mendekonjugasi garam empedu (Ngatirah et al. 2000). Kemampuan mendekonjugasi garam empedu berhubungan dengan adanya aktivitas enzim bile salt hydrolase (BSH) yang dihasilkan oleh bakteri tersebut.

Agar dapat melakukan fungsinya dalam menurunkan kolesterol, bakteri asam laktat harus tahan terhadap garam empedu yang disekresikan ke dalam usus. Dengan demikian BAL tersebut dapat tumbuh dan melakukan efek hipokolesterolemiknya. BAL yang tahan terhadap garam empedu sering dikaitkan dengan BAL yang berpotensi sebagai probiotik.

Bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik umumnya diisolasi dari sampel klinis. Hal ini didasarkan pada asumsi bahwa isolat klinis dapat bertahan pada kondisi saluran pencernaan manusia. Nuraida et al. (2007) telah berhasil mengisolasi bakteri asam laktat dari air susu ibu (ASI). Beberapa dari isolat tersebut berpotensi sebagai probiotik karena memiliki kemampuan tumbuh pada pH rendah (pH 2 selama 5 jam), tahan terhadap garam empedu (selama 5 jam pada konsentrasi 0.5%), serta memiliki daya hambat terhadap bakteri patogen seperti

Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus.

Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, beberapa BAL memiliki kemampuan dalam menurunkan kadar kolesterol. Kemampuan dan sifat yang dimiliki oleh masing-masing strain bervariasi sehingga perlu dilakukan seleksi. Pada penelitian ini dilakukan evaluasi mengenai kemampuan beberapa bakteri asam laktat isolat ASI dalam menurunkan kolesterol, berdasarkan kemampuannya untuk mengasimilasi kolesterol dan aktivitas BSH yang dimilikinya.

2

B.

TUJUAN PENELITIAN

Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan bakteri asam laktat isolat ASI yang berpotensi menurunkan kolesterol. Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Mengetahui ketahanan bakteri asam laktat isolat ASI terhadap pH rendah dan garam empedu 2. Mengetahui kemampuan bakteri asam laktat isolat ASI dalam mengasimilasi kolesterol 3. Mengetahui aktivitas BSH dari bakteri asam laktat isolat ASI.

C.

MANFAAT PENELITIAN

Manfaat dari penelitian ini adalah diperolehnya kultur bakteri asam laktat isolat ASI yang berpotensi sebagai penurun kolesterol. Informasi yang diperoleh dapat dijadikan sebagai dasar untuk dilakukannya uji secara in vivo, yang pada akhirnya diharapkan dapat digunakan untuk mencegah terjadinya penyakit akibat kadar kolesterol tinggi melalui aplikasi ke dalam bahan pangan ataupun yang lainnya.

3

II.

TINJAUAN PUSTAKA

A.

BAKTERI ASAM LAKTAT

Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri gram positif, katalase negatif, tidak membentuk spora, tidak mempunyai sitokrom, aerotoleran, anaerobik hingga mikroaerofilik, dan membutuhkan nutrisi yang kompleks. Bakteri asam laktat dapat bertahan dalam saluran pencernaan dan memberikan kontribusi terhadap kesehatan (Surono 2004).

Bakteri asam laktat mampu hidup pada berbagai habitat yang cukup luas di alam, seperti pada tanaman, saluran pencernaan, baik saluran pencernaan hewan maupun manusia, juga pada berbagai produk makanan fermentasi. Sifat terpenting dari BAL adalah kemampuannya memfermentasi gula menjadi asam laktat. BAL dapat memproduksi asam laktat dan metabolit lain yang bersifat antibakteri sehingga pertumbuhan mikroorganisme lain dapat dihambat (Savadogo et al. 2000).

Bakteri asam laktat dan Bifidobacteria termasuk dalam kelompok bakteri baik bagi manusia dan umumnya memenuhi status GRAS (Generally Recognized as Safe), yaitu aman bagi manusia. Kelompok bakteri ini tidak membusukkan protein, dan dapat memetabolisme berbagai jenis karbohidrat secara fermentatif menjadi asam laktat (Surono 2004).

Pada mulanya bakteri asam laktat terdiri dari empat genus, yaitu Lactobacillus,

Leuconostoc, Pediococcus, dan Streptococcus. Namun, klasifikasi terbaru menggolongkan BAL ke

dalam 12 genus, yaitu Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, dan

Weissela (Ray dan Bhunia 2008).

Secara fisiologis dan berdasarkan aktivitas metabolismenya, BAL dikelompokkan ke dalam dua sub grup, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. Bakteri asam laktat homofermentatif melibatkan jalur Embden Meyerhof, yaitu glikolisis, menghasilkan asam laktat, 2 mol ATP dari 1 molekul glukosa/heksosa dalam kondisi normal, tidak menghasilkan CO2, dan menghasilkan

biomassa sel dua kali lebih banyak dibanding bakteri asam laktat heterofermentatif. Bakteri asam laktat heterofermentatif, melalui jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase selain menghasilkan asam laktat juga menghasilkan etanol, CO2, asam asetat, senyawa cita rasa, mannitol, serta 1 mol ATP

dari heksosa, dan tidak mempunyai enzim aldolase. BAL heterofermentatif banyak dimanfaatkan dalam industri susu untuk menghasilkan keju dan senyawa flavor, senyawa cita rasa maupun pengental, yaitu eksopolisakarida (Surono 2004).

Bakteri asam laktat homofermentatif membentuk 90% atau lebih asam laktat murni, sehingga bakteri ini sering digunakan dalam pengawetan makanan. Produksi asam laktat dalam jumlah tinggi dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain yang dapat merusak makanan (Fardiaz 1992).

B.

BAKTERI ASAM LAKTAT SEBAGAI PROBIOTIK

Probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya (Salminen et al. 2004). FAO/WHO (2006) mendefinisikan probiotik sebagai mikroorganisme hidup yang jika diberikan dalam jumlah yang cukup akan memberikan keuntungan kesehatan bagi inangnya. Tidak semua bakteri yang

4 menguntungkan dapat digolongkan sebagai probiotik. Menurut Tomasik dan Tomasik (2003), mikroorganisme dapat digolongkan sebagai probiotik bila memenuhi beberapa persyaratan berikut: 1) Dapat melalui saluran pencernaan yang memiliki pH rendah dan bertahan terhadap garam

empedu dan tetap hidup

2) Dapat menempel pada sel epitel usus 3) Menstabilkan mikroflora di dalam usus 4) Tidak bersifat patogen terhadap inangnya

5) Bertahan hidup pada produk pangan dan dapat digunakan dalam pembuatan produk farmasi 6) Menggandakan diri dengan cepat, dengan pembentukan koloni temporari atau permanen pada

saluran pencernaan

7) Memiliki kekhususan yang dimiliki probiotik lainnya.

Bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik harus tahan terhadap asam lambung. Menurut Wildman dan Medeiros (2000), asam lambung memiliki pH sekitar 2.0. Asam lambung terdiri atas air (97-99%), musin (lendir) serta garam anorganik, dan enzim pencernaan (pepsin, renin, dan lipase).

Bakteri asam laktat harus dapat mempertahankan pH intraseluler lebih tinggi dibandingkan pH ekstraseluler agar dapat bertahan di dalam lingkungan asam (Siegumfeldt 2000). Oleh karena itu sel harus mempunyai barier terhadap aliran proton, yang umumnya adalah membran sitoplasma yang terdiri dari dua lapis fosfolipid (lipid bilayer). Pada bagian dalam dan pemukaan lapisan tersebut melekat protein dan glikoprotein. Lipid bilayer bersifat semipermeabel dan merupakan barier yang membatasi pergerakan senyawa yang keluar masuk antara sitoplasma dengan lingkungan luar (Cano dan Colome 1986 diacu dalam Kusumawati 2002). Komposisi asam lemak penyusun membran sitoplasma berbeda diantara spesies bakteri dan keragaman tersebut mempengaruhi karakteristik dan permeabilitasnya. Perbedaan kerentanan membran sitoplasma terhadap kondisi asam menentukan toleransi bakteri terhadap pH rendah. Beberapa protein dalam membran secara spesifik memfasilitasi pergerakan senyawa melewati membran. Komposisi dan struktur protein yang berbeda pada membran sitoplasma juga menentukan karakteristik dan permeabilitas membran tersebut. Keragaman asam lemak dan protein pada membran sitoplasma diduga mempengaruhi keragaman ketahanan bakteri terhadap pH rendah (Kusumawati 20002; Hartanti 2007).

Terdapat beberapa mekanisme bagaimana bakteri mengatur pH internalnya. Namun, mekanisme yang paling penting adalah translokasi proton oleh enzim ATP-ase (Hutkins dan Nannen 1993). Enzim ATP-ase melakukan reaksi reversibel dan bertindak sebagai pompa yang memindahkan ion. Enzim tersebut mengkatalisis gerakan proton menyebrangi membran sel sebagai akibat dari hidrolisis atau sintesis ATP. Pada bakteri yang tahan asam, pH optimal enzim tersebut lebih rendah dibandingkan dengan bakteri yang kurang tahan terhadap asam. Parameter lain yang terlibat dalam pengaturan pH internal adalah permeabilitas membran plasma terhadap proton. Faktor-faktor lain seperti kapasitas buffer sitoplasma, mempunyai pengaruh yang kecil terhadap pengaturan pH intraseluler (Bender et al. 1987).

Bila sel bakteri terpapar pada kondisi yang sangat asam, membran sel dapat mengalami kerusakan dan menyebabkan kehilangan komponen-komponen intraseluler seperti Mg, K, lemak, dan biasanya kerusakan ini dapat menyebabkan kematian pada sel. Kondisi ini dapat dideteksi dengan cara mengukur konsentrasi komponen intraseluler yang keluar dari dalam sel.

Jacobsen et al. (1999) menguji ketahanan bakteri asam laktat terhadap pH rendah. Dari 44 strain Lactobacillus yang diuji, terdapat 29 strain yang tahan terhadap pH rendah (2.5) selama 4 jam dan tidak ada satu pun yang dapat tumbuh setelah itu. Kusumawati (2002) juga melakukan

5 penelitian terhadap bakteri asam laktat yang diisolasi dari makanan fermentasi. Hasil penelitian tersebut menunjukkan ketahanan yang cukup tinggi pada 18 isolat yang diuji dengan penurunan log berkisar antara 0.04-1.1 log cfu/ml.

Penelitian Zavaglia et al. (1998) menunjukkan bahwa dari 40 isolat Bifidobacterium yang diperoleh dari feses bayi secara umum bersifat kurang tahan terhadap pH rendah. Ngatirah et al.

(2000) menguji ketahanan 9 isolat BAL terhadap pH rendah dan hasilnya menunjukkan penurunan jumlah sel yang cukup besar pada pH 2, yaitu berkisar antara 3.2-6.0 unit log cfu/ml.

Hartanti (2007) melakukan penelitian terhadap isolat Lactobacillus yang diisolasi dari air susu ibu. Dari 24 isolat yang diuji, terdapat 17 isolat yang mengalami penurunan log kurang dari 1 unit log cfu/ml, sedangkan 7 isolat lainnya mengalami penurunan log >7.0 unit log cfu/ml.

Setelah berhasil melalui lambung, probiotik akan memasuki saluran usus bagian atas dimana garam empedu disekresikan. Oleh karena itu, selain harus tahan terhadap asam, bakteri probiotik juga harus tahan terhadap garam empedu. Menurut Jacobsen et al. (1999), semua mikroba yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang ditambahkan 0.3% oxgall, dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu. Konsentrasi garam empedu sebesar 0.3% merupakan konsentrasi kritikal, nilai yang cukup tinggi untuk menyeleksi isolat yang tahan terhadap garam empedu.

Asam empedu primer disintesis dalam hati dari kolesterol. Asam empedu ini berkonjugasi dengan glisin atau taurin yang kemudian disekresikan ke dalam kantung empedu. Asam empedu tersebut dilepaskan ke dalam lumen duodenum dalam bentuk misel dengan asam lemak dan gliserol. Menurut Corzo dan Gilliland (1999), antara 5500 sampai 35000 mg asam empedu terkonjugasi disekresikan ke dalam usus manusia setiap harinya untuk membantu absorpsi lemak makanan, kolesterol, vitamin larut lemak, dan senyawa larut lemak yang lain. Asam empedu terkonjugasi diserap kembali di dalam usus halus (sekitar 97%) dan dikembalikan ke dalam hati melalui sirkulasi hepatik. Sebagian dari asam empedu bebas dikeluarkan melalui feses. Droault et al. (1999) melaporkan bahwa jumlah BAL yang terdapat pada bagian atas usus halus (jejunum) lebih rendah dibanding jumlah BAL yang terdapat di dalam ileum, cecum, dan kolon. Hal ini disebabkan konsentrasi garam empedu pada bagian jejunum lebih tinggi karena lokasinya paling dekat dengan saluran yang mengeluarkan garam empedu ke dalam usus. Oleh karena itu, laktobasili yang paling tahan terhadap garam empedu terdapat pada bagian tersebut.

Menurut De Smet et al. (1995), Lactobacillus mempunyai enzim yang dapat menghidrolisis garam empedu (bile salt hydrolase). Enzim ini mampu mengubah kemampuan fisik-kimia yang dimiliki oleh garam empedu sehingga tidak bersifat racun bagi BAL. Semakin tinggi konsentrasi garam empedu, maka jumlah sel Lactobacillus yang mati juga akan meningkat (Ngatirah et al. 2000; Kusumawati 2000).

Ngatirah et al. (2000) menguji ketahanan BAL yang diisolasi dari makanan fermentasi dan feses bayi terhadap garam empedu. Pengujian dilakukan pada MRSB yang mengandung garam empedu dengan konsentrasi 0.5%, 1%, 5%, dan 10%, serta diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Ketahanan terhadap garam empedu dihitung berdasarkan selisih unit OD (Optical Density) pada panjang gelombang 660 nm yang dicapai setelah inkubasi 24 jam dengan OD pada awal inkubasi yang hasilnya berkisar antara 1.16-2.34. Dari penelitian tersebut terdapat 11 isolat yang mampu tumbuh pada garam empedu sampai konsentrasi 10%. Selain itu, dari penelitian tersebut diketahui bahwa isolat yang diisolasi dari sumber yang sama memiliki ketahanan terhadap garam empedu yang beragam. Dengan kata lain, ketahanan terhadap garam empedu bersifat strain

6 Penelitian yang dilakukan Kusumawati (2002) terhadap BAL yang diisolasi dari makanan fermentasi asal Indonesia menunjukkan adanya perbedaan ketahanan untuk tumbuh pada lingkungan yang mengandung garam empedu 1% dan 5%. Perbedaan tersebut beragam untuk masing-masing isolat. Pada konsentrasi 1%, Lactobacillus acidophilus FNCC 116 mengalami penurunan log sebesar 0.68 unit log/ml dan hasil tersebut tidak berbeda nyata dengan beberapa isolat lainnya.

Hartanti (2007) menguji ketahanan 17 BAL isolat ASI terhadap 0.5% garam empedu selama 5 jam. Terdapat 3 isolat yang mengalami penurunan <1 log, 9 isolat mengalami penurunan 2.0-3.0 log cfu/ml, dan 5 isolat mengalami penurunan >7 log cfu/ml.

Produk-produk bakteri asam laktat seperti probiotik memiliki beberapa sifat fungsional yang sangat penting, diantaranya memperbaiki daya cerna laktosa, mengendalikan bakteri patogen dalam saluran pencernaan, menurunkan kolesterol serum, menghambat tumor, antimutagenik dan antikarsinogenik, mestimulasi sistem imun, mencegah sembelit, memproduksi vitamin B dan bakteriosin, serta inaktivasi berbagai senyawa beracun (Surono 2004).

C.

ISOLAT BAKTERI ASAM LAKTAT ASAL AIR SUSU IBU

Air Susu Ibu (ASI) merupakan cairan putih segar yang keluar dari kelenjar mamae seorang ibu sesaat setelah melahirkan bayi (Siregar 2004). ASI diproduksi karena pengaruh hormon prolaktin dan oksitoksin setelah kelahiran bayi. ASI yang keluar pertama kali dan berwarna kuning kental disebut kolostrum. Kolostrum keluar sejak hari pertama ibu melahirkan sampai hari ke-7 (bisa juga sampai hari ke-10). Kolostrum ini bertanggung jawab terhadap populasi mikrobiota dalam usus bayi karena mengandung faktor bifidus, yaitu sejenis karbohidrat yang mengandung nitrogen dan dapat menunjang pertumbuhan bakteri Lactobacillus bifidus (Surono 2004). Kolostrum juga mengandung imunoglobulin, sel imun, asam antimikroba, poliamida, oligosakarida, lisozim, serta glikoprotein seperti laktoferin dan peptida bioaktif yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba patogen (Isaacs 2005).

Menurut Young (1998) ASI mengandung banyak oligosakarida (fruktooligosakarida), yaitu suatu karbohidrat yang tidak dicerna dan merupakan makanan bagi bakteri menguntungkan. Selain itu, ASI juga mengandung laktoferin, yaitu protein yang berikatan dengan zat besi sehingga dapat menunjang pertumbuhan BAL dan menghambat pertumbuhan bakteri patogen tertentu, seperti

Staphylococcus aureus dan E. coli (Salminen et al. 2004). Bayi yang mengonsumsi ASI dengan

perkiraan sebanyak 800 ml/hari akan mengonsumsi bakteri komensal sekitar 105–107 koloni. Komposisi bakteri pada feses bayi merefleksikan komposisi bakteri pada air susu ibu (Martin et al. 2005).

Suasana asam yang terbentuk karena ASI merupakan sinyal bagi sistem pertahanan saluran cerna (IgA sekresi) dan pembentukan mukus pada permukaan saluran pencernaaan. Selain dipicu oleh lingkungan asam akibat keberadaan bakteri baik di dalam saluran pencernaan, ASI sendiri mengandung IgA sekresi. IgA sekresi merupakan faktor protektif mukosa saluran pencernaan. Peningkatan kadar IgA sekresi berkorelasi dengan peningkatan sistem pertahanan mukosa saluran cerna terhadap infeksi, sedangkan mukus yang melapisi permukaan sel epitel saluran cerna berfungsi sebagai barier agar mikroorganisme tidak dapat masuk ke dalam aliran darah. Dari beberapa penelitian terbukti bahwa bayi yang mendapat ASI eksklusif mempunyai kadar IgA sekresi yang lebih tinggi dibanding bayi yang mendapat susu formula. Data tersebut dapat menjawab mengapa bayi yang mendapat ASI mempunyai daya tahan tubuh alami yang lebih besar terhadap berbagai infeksi bakteri patogen. Beberapa hasil kajian juga memperlihatkan hubungan antara mikroorganisme (bakteri baik) dan proses stimulasi sistem pertahanan tubuh, baik dengan

7 cara menstabilkan keseimbangan mikroorganisme saluran cerna maupun dengan cara meningkatkan respon pertahanan tubuh. ASI terbukti merupakan modulator respons imun yang kuat, dengan terlihatnya kadar antibodi yang tinggi terhadap beberapa imunisasi pada bayi yang mendapat ASI eksklusif (IDAI 2009).

Martin et al. (2005) telah berhasil megisolasi bakteri asam laktat yang berpotensi sebagai probiotik dari ASI, yaitu Lactobacillus gaserii CECT5714, Lactobacillus gaserii CECT5715, dan

Lactobacillus fermentum CECT5716. Ketiga isolat ini diketahui memiliki potensi sebagai

probiotik yang tidak berbeda dengan strain bakteri asam laktat yang umumnya digunakan pada produk probiotik seperti Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus casei imunitas, dan

Lactobacillus johnsonii.

Beberapa hasil penelitian mengindikasikan bahwa bakteri asam laktat pada air susu ibu awalnya berasal dari mikroorganisme pada saluran pencernaan ibu menyusui melalui jalur endogenus. Bakteri non invasif dapat menyebar ke lokasi yang lain karena adanya sirkulasi limfosit di antara mukosal yang dihubungkan dengan sel jaringan limfoid. Bakteri yang distimulasi oleh sel dendritik dapat berpindah dari mukosa intestinal untuk berkolonisasi di atas permukaan mukosa seperti pada saluran pernapasan, saluran genitourinari, salivari, kelenjar air mata, dan kelenjar air susu ibu. Selama masa menyusui, kolonisasi bakteri pada kelenjar air susu ibu diseleksi oleh sel sistem imun dengan menggunakan hormon laktogenik. Proses penyeleksian ini memegang peranan penting dan bertanggung jawab terhadap komposisi bakteri pada air susu ibu (Martin et al. 2005).

Nuraida et al. (2007) juga telah berhasil mengisolasi bakteri asam laktat dari air susu ibu (ASI). Dari 31 sampel air susu ibu (ASI), diperoleh 87 isolat bakteri asam laktat. Isolat-isolat tersebut diidentifikasi berdasarkan pengamatan morfologi, ciri-ciri fisiologis, dan sifat-sifat biokimia bakteri. Dari penelitian tersebut juga diperoleh beberapa isolat yang berpotensi sebagai probiotik berdasarkan kemampuannya untuk bertahan pada kondisi asam (pH 2 selama 5 jam) dan keberadaan garam empedu (konsentrasi 0.5% selama 5 jam), serta daya hambat terhadap Bacillus

cereus, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus.

Sebanyak 37 BAL isolat ASI yang terdiri atas 34 isolat homofermentatif dan 3 isolat heterofermentatif, diuji kemampuannya dalam menurunkan kolesterol pada penelitian ini. Isolat homofermentatif yang diuji terdiri atas isolat Lactobacillus (A3, A6, A7, A11, A13, A25, A27, A30, A32, A38, B2, B10, B13, B16, R19-a2, R27, dan R32), Lactobacillus fermentum A20,

Lactobacillus fermentum2 B11, Lactobacillus acidophilus1 (A8 dan A22), Lactobacillus

rhamnosus (A15, A23, A24, A29, R12, R14, R21, R22, R23, R24, R26, dan R34), dan

Pediococcus pentosaceus2 A16, sedangkan isolat heterofermentatif terdiri atas Lactobacillus R3

dan Leuconostoc (R1 dan R9).

D.

KOLESTEROL

Kolesterol merupakan kelompok steroid, suatu zat yang termasuk golongan lipid. Metabolisme kolesterol erat hubungannya dengan metabolisme lipid (Girindra 1988). Kolesterol terdapat di dalam semua sel hewan sehingga tersebar luas di seluruh jaringan tubuh (Tillman et al. 1991). Pada mamalia, jaringan-jaringan yang diketahui mampu mensintesis kolesterol antara lain hati, korteks adrenal, kulit, usus, testis, lambung, otot, jaringan adipose, dan otak. Sekitar 17% berat kering otak terdiri dari kolesterol (Tillman et al. 1991).

Kolesterol mempunyai rumus molekul C27H45OH dan dapat dinyatakan sebagai 3

hidroksi-5,6 kolesten karena mempunyai satu gugus hidroksil pada atom C3 dan ikatan rangkap pada C5 dan

8 Gambar 1. Struktur kimia kolesterol (Almatsier 2003)

Kolesterol tubuh berasal dari dua sumber, yaitu kolesterol endogen yang diproduksi sendiri oleh tubuh dan kolesterol eksogen yang berasal dari makanan (Piliang dan Djojosoebagio 1990). Lebih dari separuh kolesterol tubuh berasal dari sintesis dalam tubuh (sekitar 700 mg per hari) dan sisanya berasal dari makanan sehari-hari. Sebanyak kurang lebih 10% kolesterol endogen dihasilkan oleh hati, 10% dihasilkan oleh usus, dan sisanya dihasilkan oleh jaringan lain. Pada dasarnya semua jaringan yang mengandung sel-sel berinti mampu mensintesis kolesterol. Fraksi mikrosomal (retikulum endoplasma) dan sitosol sel juga bertanggung jawab dalam sintesis kolesterol (Mayes 1996).

Kolesterol terdapat dalam jaringan dan lipoprotein plasma dalam bentuk kolesterol bebas atau gabungan dengan asam lemak rantai panjang sebagai ester kolesteril. Kolesterol memegang peranan penting karena merupakan sterol utama di dalam tubuh manusia serta merupakan komponen permukaan sel dan membran intraseluler. Fungsi lain dari kolesterol di dalam tubuh adalah sebagai prekursor pembentuk asam empedu yang dibutuhkan untuk mengemulsikan lemak pada usus halus. Kolesterol juga diperlukan pada sintesis hormonal dan merupakan unsur penting pada dinding sel. Selain itu, kolesterol merupakan prekursor semua senyawa steroid dalam tubuh, seperti kortikosteroid, hormon seks, asam empedu, dan vitamin D (Mayes 1996).

Jika jumlah kolesterol dari makanan berkurang, sintesis kolesterol di dalam hati dan usus meningkat untuk memenuhi kebutuhan jaringan dan organ lainnya. Kolesterol yang telah disintesis secara de novo, diangkut dari hati dan usus menuju jaringan peripheral dalam bentuk lipoprotein. Sebaliknya, jika jumlah kolesterol dari makanan meningkat, sintesis kolesterol di dalam hati dan usus akan menurun. Dengan demikian, laju sintesis kolesterol de novo berhubungan dengan jumlah kolesterol yang berasal dari makanan (Muchtadi et al. 2006).Tabel 1 menunjukkan kadar kolesterol darah pada orang dewasa.

Tabel 1. Kadar kolesterol total orang dewasa Kategori Kadar (mg/100 ml) Kadar normal/yang diinginkan <200 Cukup tinggi 200–239

Tinggi >240

Sumber : Wildman dan Medeiros (2000)

Kolesterol tidak larut dalam sistem larutan, oleh karena itu harus diangkut melalui lipoprotein plasma yang terdiri dari lemak polar, lesitin, apoprotein spesifik dan kolesterol bebas, serta lipid nonpolar, termasuk ester kolesterol dan trigliserida. Lipoprotein plasma terdiri atas

chylomicrons (kilomikron), very low density lipoprotein (VLDL), intermediate density lipoprotein

(IDL), low density lipoprotein (LDL), dan high density lipoprotein (HDL). Susunan tersebut dibuat berdasarkan meningkatnya densitas, konsentrasi protein dan fospolipid, serta menurunnya

konsentrasi trigliserida dalam saluran limfatik Jalur utama pe kolesterol oleh hati m garam empedu terkonj di dalam ileum dan dik empedu yang tidak te Jalur minor untuk pem dikeluarkan melalui ur atau kulit (50 mg/hari)

E.

MEKANISME PR

DARAH

Terdapat bebe Menurut Ngatirah (20 kemampuannya dalam peneliti menyebutkan pengikatan kolestero terdekonjugasi, konve asam lemak rantai pen dan Liong 2010; Lye asam laktat baik d pengurangan kolestero asam laktat dalam men

Gambar 2. Mekanism 2004)

Asimilasi diart menjadi bahan dengan

Pengikatan kole

da. Kilomikron dan VLDL yang terbentuk di dalam mu tik dan disekresikan melalui pembuluh darah.

pembuangan kolesterol dari tubuh (200-300 mg/hari) a menjadi asam empedu yang berikatan dengan glisin a

njugasi (Muchtadi et al. 2006). Lebih dari 97% asam e dikembalikan ke hati melalui pembuluh darah portal (M terserap didegradasi di dalam usus besar, kemudian embuangan kolesterol dilakukan melalui sintesis hormo urin (1 mg/hari), dan dikeluarkan melalui keringat atau ri) (Muchtadi et al. 2006).

PROBIOTIK DALAM MENURUNKAN K

berapa mekanisme bakteri probiotik dalam menurun 2000), pengaruh bakteri probiotik dalam menurunkan ko am mengasimilasi kolesterol dan mendekonjugasi gar an bahwa kemampuan menurunkan kolesterol juga rol oleh sel bakteri, ko-presipitasi kolesterol de versi kolesterol menjadi koprostanol oleh bakteri di dal

endek hasil fermentasi oleh probiotik yang melibatkan

e et al. 2010a; Lye et al. 2010b). Beberapa studi menu

dari jenis Bifidobakteria maupun Lactobacillus m rol secara in vitro maupun in vivo. Gambar 2 menunjuk enurunkan kolesterol.

sme penurunan kolesterol oleh bakteri asam laktat (d

artikan sebagai pengambilan bahan anorganik di alam gan molekul yang lebih kompleks (Yatim 1999). Men

kolesterol

Asam taurokolat

Asam kolat Enzim BS Penurunan kolesterol oleh bakteri asam laktat

lesterol oleh sel bakteri

Penurunan kolesterol pada serum darah manusia Dekonjugasi gar

9 mukosa usus diangkut ke

adalah melalui konversi atau taurin membentuk empedu diserap kembali (Macdonald 1983). Asam n dibuang melalui feses. on steroid (40 mg/hari), au hilang melalui rambut

KOLESTEROL

unkan kolesterol darah. kolesterol diduga karena aram empedu. Beberapa ga berhubungan dengan dengan garam empedu alam usus, dan produksi an adanya prebiotik (Ooi nunjukkan bahwa bakteri memberikan pengaruh ukkan mekanisme bakteri

diadaptasi dari Surono

lam untuk diolah tubuh enurut Elizabeth (1981), BSH

10 asimilasi adalah proses pengambilan molekul-molekul sederhana dari pangan yang telah dicerna, kemudian diserap ke dalam sel hidup serta dikonversi menjadi molekul kompleks yang menyusun suatu organisme. Kemampuan mengasimilasi kolesterol pada bakteri asam laktat pertama kali ditunjukkan oleh beberapa galur L. achidophilus yang diteliti oleh Gilliland et al. (1985). Kemampuan tersebut ditunjukkan dengan terjadinya penurunan konsentrasi kolesterol pada medium pertumbuhan bakteri karena kolesterol tersebut diasimilasi oleh bakteri. Pengambilan kolesterol ini terjadi hanya jika bakteri ditumbuhkan secara anaerob dengan adanya garam empedu pada medium pertumbuhan. Jumlah garam empedu yang dibutuhkan agar bakteri mampu mengambil kolesterol dari medium pertumbuhan setara dengan jumlah yang secara normal terdapat dalam usus. Oleh karena itu, kondisi yang dibutuhkan pada sistem in vitro diperkirakan menyerupai kondisi di dalam saluran usus. Aktivitas bakteri asam laktat dalam mengambil kolesterol pada saluran pencernaan mempunyai pengaruh positif karena kolesterol menjadi tidak tersedia untuk diserap ke dalam tubuh sehingga akan menurunkan konsentrasi kolesterol yang beredar dalam pembuluh darah. Hal tersebut berimplikasi menurunkan terjadinya penyakit degeneratif pada orang-orang yang menderita hiperkolesterolemia.

Beberapa penelitian yang telah dilakukan membuktikan adanya aktivitas asimilasi oleh bakteri asam laktat (Gilliland et al.1985; Buck dan Gilliland 1984; Usman dan Hosono 1999; Ngatirah et al. 2000). Bakteri asam laktat yang digunakan adalah galur-galur dari spesies L.

acidophilus (Gilliland et al. 1985; Buck dan Gilliland 1994), L. gasseri (Usman dan Hosono 1999)

serta berbagai spesies lain, yaitu L. plantarum, L. sake, Streptococcus sp., dan Enterococcus sp.

(Ngatirah et al. 2000). Sumber kolesterol yang digunakan bervariasi, baik berupa kolesterol murni, fraksi serum pleuro-pneumoniae like organism (PPLO), maupun misel kolesterol-fosfatidilkolin. Aktivitas asimilasi diamati dengan membandingkan jumlah kolesterol yang tersisa pada media yang diinokulasi dengan bakteri asam laktat dan kontrol (tidak diinokulasi bakteri). Hasil penelitian menunjukkan bahwa galur-galur yang diuji mempunyai aktivitas asimilasi kolesterol dengan derajat yang bervariasi dengan kisaran antara 8.2-83.3 µg/ml.

Berdasarkan hasil penelitian Noh et al. (1997), pada asimilasi kolesterol oleh L.

acidophilus, diduga terjadi penggabungan kolesterol pada membran seluler bakteri tersebut, sebab

sel bakteri yang ditumbuhkan dengan adanya oxgall dan misel kolesterol lebih tahan terhadap lisis karena sonikasi. Hal ini sesuai dengan yang dinyatakan oleh Purwaningsih dan Yuniastuti (2005), bahwa pada mekanisme asimilasi kolesterol bakteri asam laktat akan mengambil atau mengabsorpsi kolesterol dan lebih lanjut kolesterol akan bergabung dengan membran seluler bakteri sehingga bakteri tahan terhadap lisis.

Pengikatan kolesterol oleh sel bakteri membantu menurunkan kolesterol. Berdasarkan beberapa penelitian yang telah dilakukan, baik sel bakteri yang sedang tumbuh, istirahat, maupun sel bakteri yang sudah mati memiliki kemampuan untuk mengikat kolesterol. Sel yang sedang tumbuh memiliki kemampuan yang lebih tinggi dalam mengikat kolesterol dibanding sel yang sedang istirahat dan sel yang sudah mati (Liong dan Shah 2005a; Lye et al. 2010).

Dekonjugasi garam empedu membantu menurunkan kolesterol serum darah karena asam empedu terdekonjugasi memiliki kelarutan yang rendah sehingga sulit diserap kembali di dalam usus dan diekskresikan lebih cepat dibandingkan asam empedu yang terkonjugasi. Akibatnya lebih banyak kolesterol yang dibutuhkan untuk sintesis asam empedu baru untuk menggantikan asam empedu yang hilang. Dengan demikian jumlah kolesterol yang tersedia untuk diserap ke dalam tubuh menjadi berkurang. Asam empedu terdekonjugasi tidak berfungsi sebaik asam empedu terkonjugasi dalam membantu proses penyerapan kolesterol dalam usus. Selain itu, asam empedu terdekonjugasi lebih mudah menempel pada sel bakteri atau serat makanan dibandingkan asam

11 empedu terkonjugasi sehingga jumlah asam empedu yang diekskresikan meningkat (Usman dan Hosono 1999).

Enzim yang bertanggung jawab dalam proses dekonjugasi garam empedu adalah enzim bile

salt hydrolase (BSH) (E.C.3.5.1.24). Enzim ini akan memisahkan glisin atau taurin dari garam

empedu terkonjugasi sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau terdekonjugasi. BSH dimiliki oleh beberapa strain bakteri saluran pencernaan seperti Lactobacillus, Enterococcus,

Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus, dan Bacteriodes (Surono 2004).

Kolesterol juga dapat dikonversi menjadi koprostanol oleh bakteri di dalam usus, yang akan langsung dibuang melalui feses. Hal ini mengakibatkan turunnya jumlah kolesterol yang dapat diserap, sehingga dapat menurunkan konsentrasi kolesterol di dalam darah (Ooi dan Liong 2010). Gambar 3 dan Tabel 2 menunjukkan metabolisme kolesterol oleh bakteri usus menghasilkan koprostanol. Kemampuan mengkonversi kolesterol menjadi koprostanol telah dievaluasi oleh Chiang et al. (2008). Dalam penelitian tersebut, ditemukan bahwa kolesterol dehidrogenase/isomerase yang dihasilkan oleh bakteri Sterolibacterium denitrificans bertanggung jawab untuk mengkatalisis transformasi kolesterol menjadi cholest-4-en-3-one, yang merupakan kofaktor intermediet dalam konversi kolesterol menjadi koprostanol. Hasil penelitian tersebut menjadi dasar dilakukannya penelitian terhadap bakteri probiotik dalam mengkonversi kolesterol menjadi koprostanol. Lye et al. (2010b) melakukan penelitian mengenai konversi kolesterol menjadi koprostanol oleh strain L. acidophilus, L. bulgaricus, dan L. casei ATCC 393 melalui uji fluorometrik. Pada penelitian tersebut terdeteksi adanya kolesterol reduktase pada semua strain yang diuji. Hasil penelitian menunjukkan terjadinya penurunan konsentrasi kolesterol pada medium karena fermentasi oleh bakteri probiotik yang diikuti oleh meningkatnya konsentrasi koprostanol.

Gambar 3. Metabolisme kolesterol oleh bakteri di dalam usus (Macdonald 1983) K

12 Tabel 2. Metabolisme kolesterol oleh bakteri di dalam usus

Transformasi steroid Enzim yang Berperan

Organisme yang

terlibat Keterangan 1. Kolesterol

4-cholesten-3-one

Kolesterol dehidrogenase

E. coli

Eubacterium 21408

Produk ini merupakan produk intermediet dalam konversi kolesterol menjadi koprostanol

2. 4-cholesten-3-one

5β-cholestan-3-one

∆4_{-NDH (nuclear}

dehydrogenase) Eubacterium Bacteroides Clostridium Bifidobacterium 3. Kolesterol Koprostanol

∆5_{-NDH (nuclear}

dehydrogenase)

Eubacterium Konversi langsung

kolesterol menjadi koprostanol merupakan jalur yang tidak umum. Kebanyakan organisme memerlukan kolesterol dan plasmalogen sebagai faktor pertumbuhan spesifik

4. 4-cholesten

cholesta-1,4-dien-3-one

∆1_{-dehidrogenase E. coli Reaksi ini dapat}

menghasilkan 4 produk (Gambar 3)

5.

Cholesta-1,4-dien-3-one androsta-1,4-dien-3,17-dione

Desmolase Flora normal pada feses manusia

E. coli

Sumber : Macdonald (1983)

Prebiotik seperti inulin dan fruktooligosakarida bersifat larut, tidak dapat dicerna, viscous,

dan merupakan komponen yang dapat difermentasi. Prebiotik ini berkontribusi terhadap hipokolesterolemia melalui dua mekanisme, yaitu menurunkan tingkat absorpsi kolesterol dengan meningkatkan ekskresi kolesterol melalui feses dan produksi asam lemak rantai pendek (short

chain fatty acid, SCFA). Fermentasi prebiotik melibatkan berbagai proses metabolik oleh mikroba

pada kondisi anaerob untuk memecah komponen organik menghasilkan energi untuk pertumbuhan mikroba dan produksi SCFA. Butirat merupakan produk fermentasi utama dari inulin, sedangkan asetat diproduksi dari fruktooligosakarida. Efek hipokolesterolemik pada prebiotik erat kaitannya dengan SCFA yang dihasilkan. Butirat diketahui dapat menghambat sintesis kolesterol dalam hati dan menyediakan sumber energi bagi sel epitel kolon. Sementara itu, propionat menghambat sintesis asam lemak dalam hati yang menyebabkan turunnya tingkat sekresi triasilgliserol. Propionat juga terlibat dalam kontrol sintesis kolesterol hepatik sehingga dapat menurunkan sintesis kolesterol yang pada akhirnya berpengaruh terhadap turunnya kadar kolesterol dalam plasma (Ooi dan Liong 2010).

13

METODE PENELITIAN

A.

BAHAN DAN ALAT

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari kultur bakteri asam laktat isolat ASI yang berasal dari koleksi SEAFAST Center IPB, de Mann Rogosa Sharpe Broth

(MRSB) (Oxoid), de Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) (Oxoid), akuades, natrium tioglikolat (Sigma), kolesterol murni 95% (Sigma), oxgall (Merck), etanol (Merck), 2-propanol (Merck), KOH (Merck), n-hexan (Merck), gas nitrogen, asam asetat glasial (Merck), o-ftalaldehida (Sigma), H2SO4 pekat (Merck), sodium taurodeoksikolat (Sigma), CaCl2, NaCl (Merck), HCl 37% (Merck),

ungu kristal, lugol, dan safranin. Bakteri asam laktat isolat ASI yang digunakan berjumlah 37 isolat, yang terdiri dari 34 isolat homofermentatif dan 3 isolat heterofermentatif. Isolat homofermentatif yang digunakan terdiri atas Lactobacillus (A3, A6, A7, A11, A13, A25, A27, A30, A32, A38, B2, B10, B13, B16, R19-a2, R27, dan R32), Lactobacillus fermentum A20,

Lactobacillus fermentum2 B11, Lactobacillus acidophilus1 (A8 dan A22) Lactobacillus

rhamnosus (A15, A23, A24, A29, R12, R14, R21, R22, R23, R24, R26, dan R34); Pediococcus

pentosaceus2 A16, sedangkan isolat heterofermentatif terdiri atas Lactobacillus R3 dan

Leuconostoc (R1 dan R9).

Alat-alat yang digunakan terdiri atas peralatan gelas, neraca analitik, rak tabung reaksi, sudip, mikropipet, magnetic stirrer, tip, pipet mohr, bulb, sentrifuse, tabung sentrifuse, alumunium foil, membran filter steril 0.2 µl, autoklaf, bunsen, vortex, inkubator 37ºC, penangas air 60ºC,

refrigerator, hot plate, ruang asam, termometer, pH-meter, anoxomat, dan spektrofotometer.

B.

METODE PENELITIAN

Penelitian ini terdiri dari 4 tahap yang meliputi pengujian pertumbuhan BAL dalam media yang mengandung senyawa uji, pengujian ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu, pengujian kemampuan mengasimilasi kolesterol, serta pengujian aktivitas BSH pada BAL. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 4.

1.

Pemeliharaan Kultur (Dewanti-Hariyadi

et al

. 2003)

Dalam penelitian ini dilakukan pemeliharaan terhadap kultur yang digunakan, yang meliputi penyegaran dan pengawetan kultur. Kultur yang digunakan dalam penelitian ini berupa kultur terimobilisasi pada manik-manik. Oleh karena itu, kultur harus disegarkan terlebih dahulu.

Sebanyak kurang lebih 3 buah manik-manik dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml MRSB steril, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Selanjutnya dari tabung reaksi berisi kultur tersebut diambil sebanyak 0.1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi lain yang berisi 10 ml MRSB steril untuk diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Kultur yang telah diinkubasi siap untuk digunakan.

Pengawetan kultur perlu dilakukan untuk menjaga kualitas kultur. Pada penelitian ini pengawetan dilakukan dengan metode penjeratan (imobilisasi) pada manik-manik. Suspensi bakteri asam laktat yang sudah ditumbuhkan selama 24 jam dalam medium MRSB dimasukkan ke dalam tabung yang berisi gliserol steril (perbandingan kultur dan gliserol 4:1), kemudian dikocok merata. Setelah itu, campuran suspensi bakteri dan gliserol tersebut dimasukkan ke

14 dalam tabung yang berisi manik-manik, sampai manik-manik terendam. Campuran dikocok dan didiamkan selama 2-3 jam. Sisa cairan dipipet dan dibuang. Kultur yang telah terimobilisasi disimpan pada suhu -20°C.

Gambar 4. Diagram alir tahapan penelitian

2.

Uji Pertumbuhan BAL pada Media yang Mengandung Senyawa Uji

Sebanyak 50 µl kultur bakteri asam laktat dalam MRSB berumur 24 jam dimasukkan ke dalam masing-masing 5 ml media yang mengandung senyawa uji. Media tersebut antara lain : a. MRSB yang mengandung 2-propanol (4% v/v)

Tahap 3

Uji ketahanan terhadap pH dan garam empedu

Analisis:

Total BAL pada awal dan akhir inkubasi

Analisis: Konsentrasi

kolesterol terasimilasi

Analisis:

Zona presipitasi pada media

BAL isolat ASI yang berpotensi menurunkan kolesterol Tahap 2

Uji aktivitas

bile salt hydrolase

(BSH) Uji asimilasi

kolesterol

37 Isolat bakteri asam laktat isolat ASI

Uji pertumbuhan pada media MRSB yang mengandung senyawa uji, antara lain: 1. 2-propanol

2. natrium tioglikolat 3. garam empedu (oxgall)

4. kombinasi 2-propanol, natrium tioglikolat, dan garam empedu.

BAL Isolat ASI yang mampu tumbuh pada semua media yang mengandung

senyawa uji

Tahap 1 Analisis:

Pertumbuhan secara kualitatif

15 b. MRSB yang mengandung natrium tioglikolat (0.2% b/v)

c. MRSB yang mengandung oxgall (0.2% dan 0.3% b/v)

d. MRSB yang mengandung 2-propanol (4% v/v), natrium tioglikolat (0.2% b/v), dan oxgall (0.3% b/v).

Setelah diinokulasi, media a dan b diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Media c diinkubasi selama 24 dan 48 jam, sedangkan media d diinkubasi selama 20 dan 48 jam pada suhu 37°C. Sebagai kontrol, kultur bakteri asam laktat juga diinokulasikan ke dalam media MRSB yang tidak mengandung senyawa uji lalu diinkubasi pada suhu 37°C.

3.

Uji Ketahanan terhadap pH Rendah dan Garam Empedu

a. Uji Ketahanan terhadap pH Rendah (Ngatirah et al. 2000)

Sebanyak 1% (106-107 cfu/ml) kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam masing-masing diinokulasikan ke dalam MRSB yang terlebih dahulu diatur pH-nya sampai pH 2 menggunakan HCl 37%, kemudian diinkubasi selama 5 jam pada suhu 37ºC. Hal ini disesuaikan dengan lamanya makanan berada di dalam lambung, yaitu 2-6 jam (Gropper et al. 2009). Pada awal dan akhir inkubasi (0 dan 5 jam) dilakukan perhitungan jumlah total BAL dengan menggunakan metode hitungan cawan pada media MRSA.

b. Uji Ketahanan Terhadap Garam Empedu (Modifikasi Ngatirah et al. 2000)

Pengujian ini dilakukan sesuai dengan prosedur yang dilakukan Ngatirah et al. (2000), namun dalam penelitian ini tidak dilakukan pengukuran optical density (OD). Jumlah bakteri dihitung menggunakan metode hitungan cawan. Sebanyak 1% (106-107 cfu/ml) kultur yang telah disegarkan dalam MRSB selama 24 jam ditumbuhkan dalam media MRSB yang mengandung 0.5% oxgall, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Pada awal dan akhir inkubasi (0 dan 24 jam) dilakukan perhitungan jumlah total BAL dengan menggunakan metode hitungan cawan pada media MRSA.

4.

Uji Asimilasi Kolesterol secara

in vitro

(Modifikasi Kimoto

et al.

2002)

Uji asimilasi kolesterol pada penelitian ini menggunakan metode Kimoto et al. (2002) dengan modifikasi pada jumlah dan pelarut kolesterol yang digunakan. Kimoto et al. (2002) menggunakan etanol sebagai pelarut kolesterol dengan konsentrasi akhir kolesterol dalam broth sebesar 70 µg/ml. Dalam penelitian ini digunakan 2-propanol untuk melarutkan kolesterol. MRSB yang mengandung 0.2% natrium tioglikolat (b/v) dan 0.3% oxgall (b/v) ditambah dengan larutan kolesterol steril (2.5 mg/ml dalam 2-propanol) sehingga konsentrasi akhir kolesterol dalam broth 95 µg/ml. Sebanyak 10 ml campuran tersebut diinokulasi dengan 100 µl kultur bakteri asam laktat, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 jam. Setelah diinkubasi, sel dipisahkan dari larutan dengan sentrifugasi selama 10 menit pada 12000 x g dan suhu 4°C. Supernatan yang dihasilkan kemudian diukur kadar kolesterolnya. Diagram alir uji asimilasi ini dapat dilihat pada Gambar 5.

16

disterilisasi dengan membran filter disterilisasi pada suhu 121°C, 15 menit

diambil 10 ml ke dalam tabung reaksi

diinokulasi dengan 100 µl kultur

diinkubasi pada suhu 37°C, 20 jam

disentrifugasi pada 12000 x g, suhu 4°C, 10 menit

diukur kadar kolesterolnya

Gambar 5. Diagram alir uji asimilasi kolesterol (Modifikasi Kimoto et al. 2002)

5.

Uji Aktivitas

Bile Salt Hydrolase

(BSH) (Modifikasi Surono 2003)

Uji aktivitas enzim BSH dilakukan dengan metode Surono (2003) dengan modifikasi pada umur dan jumlah kultur yang digunakan, serta cara inokulasi kultur. Surono (2003) melakukan uji aktivitas BSH dengan mencelupkan kertas saring steril berdiameter 8 mm ke dalam kultur berumur 12 jam, kemudian kertas saring tersebut diletakkan di atas MRSA (kontrol) dan MRSA yang mengandung 0.5% sodium taurodeoksikolat (TDCA) dan 0.37 g/L CaCl2. Setelah itu dilakukan inkubasi secara anaerob pada suhu 37ºC selama 72 jam. Dalam

penelitian ini, kultur yang digunakan berumur 18 jam (kondisi stasioner). Inokulasi kultur pada media kontrol dan media uji dilakukan dengan dua cara. Cara pertama, kertas saring steril dibasahi dengan kultur sebanyak 10 µl. Setelah ditiriskan, kertas saring tersebut diletakkan di atas media kontrol dan media uji. Cara kedua dilakukan dengan meletakkan satu ose kultur pada media kontrol dan media uji.

C.

METODE ANALISIS

1.

Analisis Pertumbuhan secara Kualitatif

Adanya pertumbuhan BAL pada medium yang mengandung senyawa uji (2-propanol, natrium tioglikolat, oxgall, dan campuran ketiganya) diamati berdasarkan kekeruhan (kualitatif) yang terjadi pada media. Pengamatan dilakukan secara subjektif dengan membandingkan tingkat kekeruhan media yang mengandung senyawa uji dengan media kontrol (tidak mengandung senyawa uji).

MRSB yang mengandung 0.2% Natrium tioglikolat (b/v) dan 0.3% oxgall (b/v) larutan kolesterol

(2.5 mg/ml dalam 2-propanol)

supernatan pelet

17

2.

Analisis Total BAL (BAM 2001)

Dalam pengujian ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu perlu dilakukan perhitungan jumlah BAL pada media sebelum dan setelah inkubasi. Hal ini dilakukan untuk mengetahui ketahanan BAL tersebut terhadap perlakuan yang diberikan. Penentuan total BAL dilakukan dengan menggunakan metode hitungan cawan. Media diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Setelah itu, MRSA dituangkan ke dalam cawan petri tersebut, digoyang-goyangkan sampai merata, dibiarkan membeku, dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam. Total bakteri asam laktat sebelum dan setelah inkubasi dibandingkan. Total BAL dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut:

N

Σ _C

1xn1 0.1xn2 xd

Keterangan:

N = Jumlah koloni per ml atau per gram

Σ _{C = Jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung}

n1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung n2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung d = Pengenceran pada cawan pertama yang dihitung

Ketahanan terhadap pH rendah dan garam empedu dilihat berdasarkan perubahan jumlah sel bakteri yang terjadi setelah inkubasi, berdasarkan rumus di bawah ini:

a. Ketahanan terhadap pH rendah

Perubahan Σ _{sel =} Σ _{sel setelah inkubasi 5 jam -} Σ _{sel setelah inkubasi 0 jam}

b. Ketahanan terhadap garam empedu

Perubahan Σ _{sel =} Σ _{sel setelah inkubasi 24 jam -} Σ _{sel setelah inkubasi 0 jam}

3.

Analisis Konsentrasi Kolesterol Terasimilasi (Modifikasi Gilliland

et al.

1985)

Konsentrasi kolesterol terasimilasi ditentukan berdasarkan selisih konsentrasi kolesterol yang terdapat pada media kontrol (media yang tidak diinokulasi kultur) dengan media uji (diinokulasi dengan kultur). Konsentrasi kolesterol pada masing-masing media diukur dengan menggunakan reagen o-ftalaldehida (0.5 mg o-ftalaldehida dalam 1 ml asam asetat glasial) menurut Gilliland et al. (1985) dengan modifikasi jumlah supernatan yang dianalisis menjadi dua kali lipat. Metode ini merupakan analisis konsentrasi kolesterol secara kimiawi. Prinsip metode o-ftalaldehida adalah terjadinya reaksi antara kolesterol dengan o-ftalaldehida dan asam sulfat pekat membentuk senyawa kompleks yang berwarna. Warna yang terbentuk diukur pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna berbanding lurus dengan konsentrasi kolesterol.

Sebanyak 1 ml supernatan (yang diperoleh dari uji asimilasi pada Gambar 5) dimasukkan ke dalam tabung reaksi (dibuat duplo untuk masing-masing sampel). Selanjutnya ke dalam tabung tersebut ditambahkan 3 ml etanol 95%, divortex, ditambah 2 ml KOH 50%, lalu divortex kembali. Tabung tersebut dipanaskan di atas penangas air bersuhu 60°C selama 10 menit, lalu dibiarkan sampai suhu kamar dan setelah itu ditambah dengan 5 ml n-hexan. Setelah penambahan hexan, tabung berisi larutan divortex, selanjutnya ditambah 3 ml akuades

18 dan divortex kembali. Larutan dibiarkan selama 15 menit pada suhu kamar agar terjadi pemisahan. Sebanyak 2.5 ml lapisan hexan yang terpisah dipindahkan ke dalam tabung reaksi lain, kemudian dievaporasi pada suhu 60°C di bawah aliran gas nitrogen. Setelah evaporasi, ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 4 ml reagen o-ftalaldehida. Tabung dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat (dipipet secara perlahan). Selanjutnya isi tabung segera divortex dan dibiarkan kembali selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

Kurva standar dibuat dengan prosedur yang sama menggunakan kolesterol murni (95%) dengan jumlah 0, 20, 30, 40, 50, 60, dan 70 µg. Selisih konsentrasi kolesterol yang terdeteksi pada sampel yang diinokulasi dengan BAL isolat ASI dan kontrol (yang tidak diinokulasi dengan BAL isolat ASI ) dinyatakan sebagai kolesterol yang diasimilasi oleh BAL dalam µg/ml. Diagram alir pengukuran kadar kolesterol dapat dilihat pada Gambar 6.

4.

Analisis Zona Presipitasi (Surono 2003)

Adanya aktivitas BSH dalam mendekonjugasi garam empedu ditandai dengan terbentuknya zona presipitasi (endapan) di sekitar koloni pada media agar yang mengandung TDCA dan CaCl2, karena asam kolat hasil dekonjugasi oleh enzim BSH akan bereaksi dengan

CaCl2 membentuk garam yang mengendap.

5.

Analisis Statistik

Semua data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan one way ANOVA yang diikuti oleh uji lanjut Duncan untuk mengetahui perbedaan hasil pengujian di antara masing-masing isolat yang diuji. Selain itu, dilakukan pula analisis korelasi terhadap beberapa variabel yang diuji. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS.

19 dimasukan ke dalam tabung reaksi (dibuat duplo)

divortex

divortex

dipanaskan dalam penangas air 60°C selama 10 menit

didinginkan sampai suhu kamar

divortex

divortex

dibiarkan selama 15 menit

diambil sebanyak 2.5 ml

dimasukkan ke dalam tabung reaksi

dievaporasi pada suhu 60°C di bawah aliran gas nitrogen

didiamkan 10 menit pada suhu kamar

divortex

didiamkan selama 10 menit pada suhu kamar

diukur absorbansinya pada λ _{550 nm}

Gambar 6. Diagram alir pengukuran kadar kolesterol dengan metode

o-ftalaldehida (modifikasi Gilliland et al. 1985) 1 ml supernatan

3 ml etanol 95%

5 ml n-hexan 2 ml KOH 50%

3 akuades

Lapisan selain hexan Lapisan hexan

4 ml o-ftaladehida

20

HASIL DAN PEMBAHASAN

A.

PERTUMBUHAN

BAL

ISOLAT

ASI

PADA

MEDIA

YANG

MENGANDUNG SENYAWA UJI

1.

Pertumbuhan BAL Isolat ASI pada MRSB yang Mengandung 2-propanol

dan MRSB yang Mengandung Natrium tioglikolat

2-propanol (isopropil alkohol) merupakan senyawa dengan struktur C3H8O yang sering

digunakan sebagai pelarut, bahan baku industri, dan sebagai desinfektan. Pada tahapan penelitian selanjutnya, senyawa ini digunakan sebagai pelarut kolesterol dalam uji asimilasi kolesterol. Adapun natrium tioglikolat merupakan senyawa yang berfungsi sebagai penangkap oksigen (oxygen scavenger) untuk menciptakan kondisi anaerob pada media (Kimoto et al. 2002). Kondisi anaerob ini diciptakan untuk mencerminkan kondisi di dalam saluran pencernaan. Natrium tioglikolat dapat berikatan dengan oksigen terlarut dan menghilangkan oksigen pada medium. Pengujian pertumbuhan BAL dalam media yang mengandung 2-propanol dan media yang mengandung natrium tioglikolat dilakukan untuk mengetahui seberapa besar keberadaan 2-propanol ataupun natrium tioglikolat dapat mempengaruhi pertumbuhan BAL yang diuji.

Hasil pengujian pada Tabel 3 menunjukkan bahwa secara umum semua isolat dapat tumbuh dengan baik pada media yang mengandung 2-propanol (4% v/v) maupun natrium tioglikolat (0.2% b/v) dengan waktu inkubasi 24 jam. Hal ini ditandai dengan timbulnya kekeruhan pada media setelah masa inkubasi. Secara keseluruhan, tingkat kekeruhan pada media yang mengandung 2-propanol maupun natrium tioglikolat hampir sama dengan tingkat kekeruhan pada media kontrol (tanpa 2-propanol maupun natrium tioglikolat). Ini menunjukkan bahwa keberadaan 2-propanol maupun natrium tioglikolat tidak begitu berpengaruh terhadap pertumbuhan BAL yang diuji. Kemampuan BAL untuk tumbuh pada media yang mengandung natrium tioglikolat menunjukkan bahwa BAL tersebut mampu hidup pada kondisi anaerob. Hal ini sesuai dengan sifat yang dimiliki oleh BAL yaitu aerotoleran, anaerobik hingga mikroaerofilik (Surono 2004).

2.

Pertumbuhan BAL Isolat ASI pada MRSB yang Mengandung Oxgall

Selain diuji kemampuannya untuk tumbuh pada media yang mengandung 2-propanol dan natrium tioglikolat, semua isolat yang digunakan juga diuji kemampuannya untuk tumbuh pada media yang mengandung oxgall (garam empedu). Keberadaan oxgall dalam media dimaksudkan untuk menciptakan kondisi seperti di dalam pencernaan dimana garam empedu diekskresikan ke dalam saluran pencernaan. Pada pengujian ini, semua BAL yang digunakan ditumbuhkan dalam media MRSB yang mengandung 0.2% dan 0.3% oxgall, kemudian diinkubasi selama 24 dan 48 jam. Analisis terhadap pertumbuhan dilakukan secara subjektif dengan melihat tingkat kekeruhan dari media yang diinokulasi dengan kultur bakteri asam laktat setelah diinkubasi dan membandingkannya dengan media kontrol (tanpa oxgall).

Hasil yang diperoleh (Tabel 4) menunjukkan bahwa semua isolat yang diuji mampu tumbuh pada konsentrasi garam empedu 0.2% selama 24 dan 48 jam inkubasi dengan derajat pertumbuhan yang berbeda (berdasarkan tingkat kekeruhan). Pada konsentrasi garam empedu

60

Lampiran 18.Hasil analisis statistik ketahanan BAL isolat ASI terhadap garam empedu

Oneway

ANOVA

Perubahan_log_terhadap_garam_empedu

Sum of Squares Df Mean Square F Sig.

Between Groups .980 12 .082 6.452 .001

Within Groups .164 13 .013

Total 1.144 25

Descriptives

Perubahan

log_terhadap_garam_empedu

Kode

Isolat N Mean

Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for

Mean _{Minimum Maximum}

Lower Bound

Upper Bound

A6 2 -.0450 .21920 .15500 -2.0145 1.9245 -.20 .11 A8 2 -.2150 .03536 .02500 -.5327 .1027 -.24 -.19 A16 2 .2600 .08485 .06000 -.5024 1.0224 .20 .32 A20 2 .3100 .04243 .03000 -.0712 .6912 .28 .34 A22 2 -.1200 .05657 .04000 -.6282 .3882 -.16 -.08 A23 2 -.2100 .07071 .05000 -.8453 .4253 -.26 -.16 A38 2 -.0850 .12021 .08500 -1.1650 .9950 -.17 .00

B2 2 .2150 .06364 .04500 -.3568 .7868 .17 .26

B11 2 .2150 .02121 .01500 .0244 .4056 .20 .23

B13 2 .2450 .00707 .00500 .1815 .3085 .24 .25

R1 2 -.0800 .07071 .05000 -.7153 .5553 -.13 -.03 R3 2 .3200 .12728 .09000 -.8236 1.4636 .23 .41 R9 2 -.0100 .24042 .17000 -2.1701 2.1501 -.18 .16 Total 26 .0615 .21393 .04195 -.0249 .1479 -.26 .41

61

Post Hoc Tests Homogeneous Subsets

Perubahan_log_terhadap_garam_empedu

Duncan

Kode_isolat N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4

A8 2 -.2150

A23 2 -.2100

A22 2 -.1200

A38 2 -.0850

R1 2 -.0800

A6 2 -.0450 -.0450

R9 2 -.0100 -.0100 -.0100

B2 2 .2150 .2150 .2150

B11 2 .2150 .2150 .2150

B13 2 .2450 .2450

A16 2 .2600

A20 2 .3100

R3 2 .3200

Sig. .127 .051 .055 .413

62

Lampiran 19. Hasil analisis statistik kolesterol yang diasimilasi oleh BAL isolat ASI

Oneway

Descriptives

Kolesterol_yang_diasimilasi

Kode

Isolat N Mean

Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum Maximum Lower

Bound

Upper Bound

A6 2 1.7550 1.57685 1.11500 -12.4124 15.9224 .64 2.87

A8 2 3.5000 .12728 .09000 2.3564 4.6436 3.41 3.59

A16 2 14.0250 7.12057 5.03500 -49.9507 78.0007 8.99 19.06

A20 2 9.5500 .62225 .44000 3.9593 15.1407 9.11 9.99

A22 2 9.9250 .65761 .46500 4.0166 15.8334 9.46 10.39

A23 2 .8650 .48790 .34500 -3.5186 5.2486 .52 1.21

A38 2 14.9650 3.13248 2.21500 -13.1792 43.1092 12.75 17.18 B2 2 14.2750 1.36472 .96500 2.0135 26.5365 13.31 15.24 B11 2 11.9200 2.10718 1.49000 -7.0122 30.8522 10.43 13.41 B13 2 6.8200 4.73762 3.35000 -35.7458 49.3858 3.47 10.17

R1 2 5.3100 .14142 .10000 4.0394 6.5806 5.21 5.41

R3 2 5.6650 .61518 .43500 .1378 11.1922 5.23 6.10

R9 2 2.2600 1.14551 .81000 -8.0320 12.5520 1.45 3.07

Total 26 7.7565 5.28655 1.03678 5.6213 9.8918 .52 19.06

ANOVA

Kolesterol yang diasimilasi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 604.156 12 50.346 6.923 .001

Within Groups 94.534 13 7.272

63

Post Hoc Tests Homogeneous Subsets

Kolesterol yang diasimilasi

Duncan

Kode_isolat N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4

A23 2 .8650

A6 2 1.7550

R9 2 2.2600

A8 2 3.5000 3.5000

R1 2 5.3100 5.3100

R3 2 5.6650 5.6650 5.6650

B13 2 6.8200 6.8200 6.8200

A20 2 9.5500 9.5500 9.5500

A22 2 9.9250 9.9250 9.9250

B11 2 11.9200 11.9200

A16 2 14.0250

B2 2 14.2750

A38 2 14.9650

Sig. .070 .051 .054 .094

64

Lampiran 20. Hasil analisis statistik korelasi antara ketahanan terhadap pH, ketahanan terhadap garam empedu, total ketahanan terhadap pH dan garam empedu, dan kemampuan mengasimilasi kolesterol

Descriptive Statistics

Mean Std. Deviation N

Ketahanan_terhadap_pH -4.9346 1.85815 13 Ketahanan terhadap garam

empedu .0623 .20237 13

Total perubahan jumlah sel

karena pH dan garam_empedu -4.8723 1.98312 13 Kemampuan mengasimilasi

kolesterol 7.7569 5.01759 13

Correlations Ketahanan terhadap pH Ketahanan terhadap garam empedu Total ketahanan terhadap pH dan

garam empedu Kemampuan mengasimilasi kolesterol Ketahanan terhadap pH

Pearson Correlation 1 .584* .997** .080

Sig. (2-tailed) .036 .000 .794

N 13 13 13 13

Ketahanan terhadap garam empedu

Pearson Correlation .584* 1 .649* .466

Sig. (2-tailed) .036 .016 .108

N 13 13 13 13

Total perubahan jumlah sel karena pH dan garam empedu

Pearson Correlation .997** .649* 1 .123

Sig. (2-tailed) .000 .016 .689

N 13 13 13 13

Kemampuan mengasimilasi kolesterol

Pearson Correlation .080 .466 .123 1

Sig. (2-tailed) .794 .108 .689

N 13 13 13 13

*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

65

Lampiran 21. Gambar hasil pewarnaan Gram beberapa isolat bakteri asam laktat isolat ASI

Isolat A15 Isolat A16

Isolat R1 Isolat R3