Karakteristik dan Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis aries) yang Dibekukan dalam Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim dengan Metode One atau Two Step.
KARAKTERISTIK DAN STATUS AKROSOM
SPERMATOZOA DOMBA (Ovis aries) YANG DIBEKUKAN
DALAM PENGENCER TRIS KUNING TELUR ATAU TRIS
SUSU SKIM DENGAN METODE ONE ATAU TWO STEP
DEVI ANIANTI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakteristik dan
Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis aries) yang Dibekukan dalam
Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim dengan Metode One atau Two
Step adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Devi Anianti
NIM B04110028
ABSTRAK
DEVI ANIANTI. Karakteristik dan Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis
aries) yang Dibekukan dalam Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim
dengan Metode One atau Two Step. Dibimbing oleh NI WAYAN KURNIANI
KARJA dan I KETUT MUDITE ADNYANE.
Penelitian bertujuan untuk mengetahui karakteristik (motilitas, viabilitas,
membran plasma utuh) dan status akrosom utuh spermatozoa domba (Ovis aries)
yang dibekukan dalam pengencer tris kuning telur atau tris susu skim dengan
metode one atau two step. Semen dikoleksi dari domba kemudian dibagi dua dan
diencerkan dalam pengencer tris kuning telur atau tris susu skim dengan metode
one step (OS-KT dan OS-SK) dan two step (TS-KT dan TS-SK). Penelitian
menunjukkan bahwa setelah ekuilibrasi kualitas spermatozoa sama antar semua
kelompok (P>0.05). Persentase motilitas spermatozoa post thawing pada
kelompok OS-SK lebih rendah daripada spermatozoa pada kelompok OS-KT
(P0.05). Berdasarkan hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa pengencer tris kuning telur lebih baik dalam mempertahankan
motilitas spermatozoa dibandingkan dengan pengencer tris susu skim. Metode
pemberian gliserol (one step dan two step) tidak berpengaruh nyata terhadap
kualitas spermatozoa post thawing.
Kata kunci: one step, two step, susu skim, kuning telur
ABSTRACT
DEVI ANIANTI. Characteristics and Acrosome Status of Ram’s Spermatozoa
Cryopreserved in Tris-Egg Yolk or Tris-Skim Milk Extenders by Using One or
Two Step Methods. Supervised by NI WAYAN KURNIANI KARJA and I
KETUT MUDITE ADNYANE.
This research was conducted to study characteristics (motility, viability,
plasma membrane integrity) and intact acrosome status of ram’s spermatozoa
cryopreserved in tris-egg yolk or tris-skim milk extenders with one or two step
method. Semen was collected from local ram, devided and extended in tris-egg
yolk or tris-skim milk by using one step method (OS-KT and OS-SK) and two
step method (TS-KT and TS-SK). The results showed that equilibrated
spermatozoa had similar quality in all groups (P>0.05). Percentage of post-tahwed
motility spermatozoa in OS-SK group was lower than OS-KT group (P0.05). In
conclusion, tris-egg yolk extender was better than tris-skim milk extender to
prevented the motility of spermatozoa after cryopreservation. Futhermore, one or
two step methods were not significantly effected to the quality of post-thawing
spermatozoa.
Keywords: one-step method, two-step method, skim milk, egg yolk
KARAKTERISTIK DAN STATUS AKROSOM
SPERMATOZOA DOMBA (Ovis aries) YANG DIBEKUKAN
DALAM PENGENCER TRIS KUNING TELUR ATAU TRIS
SUSU SKIM DENGAN METODE ONE ATAU TWO STEP
DEVI ANIANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang
berjudul Karakteristik dan Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis aries) yang
Dibekukan dalam Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim dengan
Metode One atau Two Step.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD dan Drh I Ketut Mudite Adnyane,
MSi, PhD, PAVet selaku dosen Pembimbing atas segala bimbingan,
masukan, nasehat, dan dukungannya selama proses penelitian dan penulisan
skripsi ini.
2. Dr Drh Koekoeh Santoso, selaku dosen Pembimbing Akademik yang telah
memberikan nasehat dan dukungannya selama ini dalam kegiatan akademik.
3. Mama, Papa, Kakak-kakak (Erna Anggraeni, Maria Ulfah, Vani Amalia)
dan Adik (Miftahul Fallah) atas semua dukungan, baik moral maupun
materi yang telah diberikan selama ini kepada penulis.
4. Kak Aisyah, Mbak Umul, Ka Aras, dan Ka Eki atas semua bantuan dan
arahan yang diberikan kepada penulis pada saat penelitian.
5. Teknisi Unit Rehabilitasi Reproduksi, Pak Bondan dan Selly Anggraeni atas
bantuan yang diberikan kepada penulis pada saat penelitian.
6. Rekan satu penelitian sperma domba (Prista Ayu Nurjanah, Citra Ayu
Lestari dan Faisal Amri Satrio) atas semangat, dukungan, dan bantuannya
selama penelitian.
7. Sahabat-sahabat (Filika Amalia Isman, Sa’adah Daroyni Alhasanah,
Rahajeng Harnastiti, Fauziyyah, Slyvia Oscarina) atas kebersamaan,
dukungan, dan bantuan yang diberikan selama ini kepada penulis.
8. Rekan satu amanah, rekan Ganglion 48, dan semua pihak yang turut serta
membantu penulis sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, adanya kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan oleh
penulis untuk kesempurnaan tulisan ini.
Semoga bermanfaat bagi semua pihak, khususnya bagi penulis sendiri.
Bogor, Agustus 2015
Devi Anianti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Alat
3
Metode Penelitian
3
Analisis Data
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
SIMPULAN DAN SARAN
5
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
11
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL
1 Kualitas semen segar domba lokal (Ovis aries)
5
DAFTAR GAMBAR
1 Motilitas spermatozoa semen segar, setelah ekulibrasi, dan post thawing
2 Viabilitas spermatozoa semen segar, setelah ekulibrasi, dan post
thawing
3 Membran plasma utuh spermatozoa semen segar, setelah ekulibrasi, dan
post thawing
4 Persentase status akrosom spermatozoa semen segar dan post thawing
5 Status akrosom spermatozoa domba dengan pewarnaan histokimia lektin
metode FITC
6
7
8
9
10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Inseminasi buatan (IB) merupakan salah satu bioteknologi reproduksi yang
digunakan dalam upaya peningkatan populasi dan mutu genetik ternak (Koibur
2005). Teknologi inseminasi buatan di Indonesia sudah dikenal sejak tahun 1950an. Berbagai hasil penelitian menunjukkan conseption rate (CR) hasil IB pada
domba masih bervariasi antara 25–45%, hasil ini lebih rendah dari angka konsepsi
pada sapi sebesar 76.73% (Koibur 2005). Inseminasi buatan dengan metode
cervical insemination seperti pada babi dan domba menggunakan semen beku
masih menghasilkan angka kebuntingan dan jumlah kelahiran yang rendah.
Banyak faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan inseminasi buatan, salah
satunya adalah kualitas semen beku yang digunakan saat inseminasi.
Pembekuan semen adalah proses penghentian sementara kegiatan hidup dari
sel tanpa mematikan fungsi sel (Mumu 2009). Akan tetapi, masalah yang sering
dihadapi dalam proses pembekuan adalah cold shock dan terbentuknya kristal es
sehingga menyebabkan kerusakan sel pada spermatozoa ayam arab (Iskandar et al.
2006). Selama proses pembekuan dan pencairan kembali juga dapat menyebabkan
kerusakan pada membran plasma dan tudung akrosom (Bag et al. 2002).
Kerusakan tudung akrosom ini dapat menyebabkan keluarnya enzim-enzim yang
diperlukan spermatozoa dalam proses fertilisasi. Hal tersebut akan menyebabkan
penurunan fertilitas dari spermatozoa. Upaya untuk mengatasi hal tersebut, selama
proses pembekuan semen biasanya ditambahkan bahan krioprotektan ke dalam
pengencer. Krioprotektan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya kristal es
dan menstabilkan membran plasma spermatozoa domba (Saili et al. 2009).
Upaya untuk meminimalkan kerusakan spermatozoa selain dengan
penambahan krioprotektan, dapat dilakukan dengan menambahkan bahan
pengencer ke dalam semen kerbau (Rizal et al. 2008). Penambahan bahan
pengencer bertujuan untuk menyediakan sumber energi bagi spermatozoa
sehingga menjamin kelangsungan hidup spermatozoa selama penyimpanan atau
pembekuan (Suharyati dan Hartono 2011). Pengencer berbahan dasar tris mampu
memelihara daya hidup spermatozoa sapi, karena berperan sebagai penyangga
yang baik dengan toksisitas yang rendah (Negoro 2011). Secara umum, kuning
telur biasanya ditambahkan dalam bahan pengencer yang berfungsi melindungi
spermatozoa dari kejutan dingin (cold shock) selama penyimpanan (Tsutsui et al.
2003). Menurut Farina (2011) kualitas semen sapi pesisir yang terbaik setelah
pengenceran terdapat pada bahan pengencer tris kuning telur dibandingkan
dengan pengencer susu skim.
Gliserol merupakan krioprotektan yang paling sering digunakan dalam
pembekuan semen (Azizah dan Arifiantini 2009). Menurut Mumu (2009), gliserol
dapat mencegah pengumpulan molekul-molekul air dan akan memodifikasi kristal
es yang terbentuk di dalam medium sewaktu pembekuan sehingga menghambat
kerusakan sel secara mekanis pada pembekuan semen sapi simental. Gliserol
termasuk kedalam krioprotektan intraseluler yang dapat keluar masuk membran.
Hal ini dikarenakan gliserol memiliki berat molekul yang kecil sehingga bersifat
permeabel dan dapat menstabilkan membran plasma spermatozoa selama proses
2
pembekuan. Akan tetapi, metode pemberian gliserol ke dalam medium perlu
mendapatkan perhatian karena gliserol selain berfungsi memberikan perlindungan,
gliserol juga dapat menyebabkan kerusakan pada struktur spermatozoa.
Metode one step atau satu tahap pada pemberian krioprotektan dilakukan
dengan menambahkan gliserol pada medium sebelum medium diekuilibrasi, pada
suhu 5 °C selama 120 menit. Sedangkan metode two step atau dua tahap
dilakukan dengan menambahkan gliserol pada medium setelah medium
diekuilibrasi. Metode one step lebih mudah dan lebih praktis untuk dilakukan
dibandingkan dengan metode two step (Silva et al. 2003). Penelitian Herdis et al.
(1999) menyatakan integritas spermatozoa kerbau lumpur (Bubalus bubalis)
terbaik dicapai pada pemberian gliserol two step. Hal ini diduga berhubungan
dengan lamanya kontak antara gliserol dengan spermatozoa (Salamon dan
Maxwell 1995).
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik dan status
akrosom spermatozoa domba (Ovis aries) setelah dibekukan dalam pengencer tris
kuning telur atau tris susu skim dengan metode one atau two step.
Manfaat Penelitian
Memberikan informasi tentang bahan pengencer dan metode pemberian
gliserol terbaik yang dapat digunakan antara pengencer tris kuning telur atau tris
susu skim serta metode one step atau two step pada spermatozoa domba.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai April 2015. Evaluasi
spermatozoa dan kriopreservasi dilakukan di Laboraturium Fertilisasi In Vitro
Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi.
Evaluasi status akrosom spermatozoa dilakukan di Laboratorium Histologi Bagian
Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan
Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah semen segar domba, NaCl
0.9%, NaCl 3%, eosin-negrosin 2%, pengencer tris kuning telur, pengencer tris
susu skim, gliserol, penicillin streptomicin, aquades, alkohol, nitrogen cair,
phosphate buffer saline (PBS), propidium iodine (PI), dan pewarna lektin peanut
agglutinin (PNA) yang dilabel fluorescen isothiocyanate (FITC).
3
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain heating table, water
bath, mikropipet kapasitas (10 μl, 100 µl dan 1000 µl), tabung Eppendorf 2.5 ml,
pipet Pasteur, tube, obyek glass, cover glass, counting chamber, counter, straw,
kertas tisu, kotak penyimpanan, inkubator CO2, mikroskop cahaya, mikroskop
epifluorescens, gelas beker, dan vagina buatan.
Metode Penelitian
Koleksi Semen
Percobaan dilakukan menggunakan semen segar yang dikoleksi dari domba
jantan dewasa kelamin berumur 1–2 tahun dengan bobot badan berkisar antara
25–30 kg. Domba dipelihara secara intensif dalam kandang individual yang
berada di Unit Rehabilitasi Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor. Sumber makanan pokok domba adalah pakan hijauan dan
konsentrat, serta air minum yang diberikan secara ad libitum. Penampungan
semen dilakukan sebanyak dua kali seminggu (untuk menjaga kualitas dan
kuantitas semen) menggunakan vagina buatan yang bertemperatur antara 40–
42 °C.
Bahan Pengencer
Penelitian ini menggunakan buffer tris yang dibuat dari 0.3025 g tris
(hidroxymethyl amino-methane) (Merck, Germany), 0.17 g asam sitrat (Merck,
Germany), 0.125 g fruktosa (Merck, Germany) yang dilarutkan dalam 8 ml
aquades (Wittayarat et al. 2012). Komposisi dasar pengencer tris kuning telur
untuk 10 ml adalah buffer tris 8 ml, kuning telur 2 ml ditambah streptomisin 1000
μg/ml dan penisilin 1000 IU/ml. Komposisi dasar pengencer tris susu skim untuk
10 ml terdiri atas buffer tris 10 ml, susu skim 0.15 g, ditambah streptomisin 1000
μg/ml dan penisilin 1000 IU/ml.
Kriopreservasi Spermatozoa
Semen segar setelah dikoleksi, dievaluasi karakteristiknya secara
makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis meliputi volume, warna dan
konsistensi. Sedangkan evaluasi mikroskopis meliputi motilitas, viabilitas,
membran plasma utuh (MPU), status akrosom dan konsentrasi semen untuk
menentukan jumlah pengencer yang akan ditambahkan. Semen yang mempunyai
motilitas diatas 70% yang dapat diproses menjadi semen beku. Semen dibagi
kedalam dua bagian. Bagian semen pertama diencerkan dalam pengencer tris
kuning telur dan dibekukan dengan metode one step (OS-KT) atau two step (TSKT). Bagian semen kedua diencerkan dalam pengencer tris susu skim dan
dibekukan dengan metode one step (OS-SK) atau two step (TS-SK).
Metode pembekuan semen dengan gliserolisasi one step, pada pengencer tris
kuning telur (OS-KT) dan tris susu skim (OS-SK) yang masing-masing telah
diberi semen ditambahkan gliserol 3% secara perlahan-lahan pada suhu kamar.
Kemudian diekulibrasi pada suhu 5 °C selama 2 jam. Metode pembekuan semen
dengan gliserolisasi two step, pada pengencer tris kuning telur (TS-KT) dan tris
4
susu skim (TS-SK) yang masing-masing telah diberi semen, diekuilibrasi pada
suhu 5 °C selama 2 jam. Setelah diekuilibrasi selama 2 jam dilakukan evaluasi
mikroskopis pada semua tube.
Ketika akhir periode ekuilibrasi, semen dengan metode one step langsung
dimasukan ke dalam straw dengan ukuran 0.25 ml. Sedangkan semen dengan
metode two step terlebih dahulu ditambah gliserol 3%. Setelah itu, dilakukan
pengemasan dengan cara memasukkan semen ke dalam straw berukuran 0.25 ml
(I.V.M.,France). Straw diletakkan pada Styrofoam plate dalam uap nitrogen cair
berjarak sekitar 4 cm dari permukaan nitrogen cair selama 20 menit dan segera
dimasukkan ke dalam kontainer nitrogen cair untuk penyimpanan semen selama
10 menit. Setelah penyimpanan, straw dicairkan pada air bersuhu 32 °C selama 30
detik dan dievaluasi kembali.
Evaluasi Karakteristik dan Status Akrosom
1. Motilitas spermatozoa
Penilaian motilitas spermatozoa dilakukan secara visual. Persentase motilitas
spermatozoa dinilai dengan cara meneteskan semen yang telah diencerkan
dengan larutan 0.9% NaCl pada gelas objek lalu ditutup dengan gelas penutup.
Pengamatan terhadap spermatozoa yang bergerak progresif dilakukan secara
subjektif dengan mikroskop cahaya menggunakan pembesaran 400 . Penilaian
yang diberikan berkisar antara 0–100%.
2. Viabilitas (Spermatozoa Hidup)
Pengamatan viabilitas dilakukan menggunakan metode pewarnaan eosinnegrosin (Cocchia et al. 2011). Sebanyak 10 µl sampel semen ditambah dengan
40 µl eosin-negrosin kemudian dicampur diatas gelas objek dan dibuat preparat
ulas. Setelah itu, dikeringkan menggunakan heating table selama 15 detik.
Sebanyak 200 spermatozoa diamati dengan mikroskop cahaya pembesaran
400 . Spermatozoa yang dikategorikan hidup adalah spermatozoa yang tidak
menyerap warna sehingga bagian kepala spermatozoa tidak terwarnai
(berwarna putih). Spermatozoa yang dikategorikan mati adalah spermatozoa
yang menyerap warna sehingga bagian kepala spermatozoa akan terwarnai
(berwarna merah).
3. Integritas Membran Plasma Spermatozoa
Penilaian integritas membran plasma spermatozoa diperiksa menggunakan
metode hypoosmotic swelling test (HOS-Test) dengan komposisi 0.135 g
fruktosa dan 0.0737 g trisodium citrate 2H2O dalam 10 ml air mili-Q. Sampel
semen sebanyak 20 µl diencerkan dengan 80 µl larutan HOS dan dibiarkan
selama 10 menit dalam water bath bertemperatur 37 ºC. Kemudian teteskan 10
µl sampel semen pada gelas objek yang ditutup dengan gelas penutup dan
dilakukan evaluasi dengan pembesaran 400
pada 200 spermatozoa.
Spermatozoa yang memiliki membran plasma utuh ditandai dengan ekor yang
melingkar, sedangkan spermatozoa yang membran plasmanya tidak utuh
ditandai dengan ekor yang lurus (Perez-Llano et al. 2006).
5
4. Status Akrosom dengan Metode FITC
Sebanyak 3 μl semen diulas pada gelas objek dan dikeringudarakan. Gelas
objek dicelupkan ke dalam larutan etanol absolut untuk difiksasi. Setelah 10
menit gelas objek dikeringudarakan dan diteteskan larutan flourescen
isothiocyanate (FITC) (Sigma, St. Luis MO) sebanyak 25 µl (konsentrasi 10
µg/ml dalam PBS) kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit.
Preparat tersebut ditetesi dengan propidium iodide (PI) (Sigma, St. Luis MO)
sebanyak 5 µl (konsentrasi 10 µg/ml dalam PBS) dan diinkubasi selama 7
menit. Setelah diinkubasi, preparat dicuci dalam larutan PBS sebanyak dua kali
untuk membersihkan sisa pereaksi yang tidak berikatan, lalu ditutup dengan
gelas penutup ukuran 24 24 mm. Pemeriksaan status akrosom dilakukan
menggunakan mikroskop epiflourecen (Nikkon, Eclipse E600, Japan) pada
panjang gelombang 380–420 nm dalam ruang gelap. Jumlah spermatozoa yang
diamati pada setiap perlakuan adalah 200 spermatozoa. Hasil pemeriksaan
dengan metode FITC dibedakan menjadi dua, yaitu spermatozoa dengan
akrosom berwarna hijau dikategorikan sebagai akrosom intak (utuh), sementara
spermatozoa yang tidak berwarna hijau dikategorikan sebagai akrosom rusak
(tidak utuh) sesuai metode Cocchia et al. (2011).
Analisis Data
Persentase karakteristik spermatozoa (motilitas, viabilitas, dan membran
plasma utuh) serta status akrosom spermatozoa ditansformasikan secara Arcsin
sebelum dianalisis. Data yang telah ditransformasi, diuji dengan ANOVA
dilanjutkan dengan uji Fisher’s Protected Least Significant Difference (PLSD)
menggunakan program Statview (Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA, USA).
Perbedaan P
SPERMATOZOA DOMBA (Ovis aries) YANG DIBEKUKAN
DALAM PENGENCER TRIS KUNING TELUR ATAU TRIS
SUSU SKIM DENGAN METODE ONE ATAU TWO STEP
DEVI ANIANTI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakteristik dan
Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis aries) yang Dibekukan dalam
Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim dengan Metode One atau Two
Step adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Devi Anianti
NIM B04110028
ABSTRAK
DEVI ANIANTI. Karakteristik dan Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis
aries) yang Dibekukan dalam Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim
dengan Metode One atau Two Step. Dibimbing oleh NI WAYAN KURNIANI
KARJA dan I KETUT MUDITE ADNYANE.
Penelitian bertujuan untuk mengetahui karakteristik (motilitas, viabilitas,
membran plasma utuh) dan status akrosom utuh spermatozoa domba (Ovis aries)
yang dibekukan dalam pengencer tris kuning telur atau tris susu skim dengan
metode one atau two step. Semen dikoleksi dari domba kemudian dibagi dua dan
diencerkan dalam pengencer tris kuning telur atau tris susu skim dengan metode
one step (OS-KT dan OS-SK) dan two step (TS-KT dan TS-SK). Penelitian
menunjukkan bahwa setelah ekuilibrasi kualitas spermatozoa sama antar semua
kelompok (P>0.05). Persentase motilitas spermatozoa post thawing pada
kelompok OS-SK lebih rendah daripada spermatozoa pada kelompok OS-KT
(P0.05). Berdasarkan hasil penelitian dapat
disimpulkan bahwa pengencer tris kuning telur lebih baik dalam mempertahankan
motilitas spermatozoa dibandingkan dengan pengencer tris susu skim. Metode
pemberian gliserol (one step dan two step) tidak berpengaruh nyata terhadap
kualitas spermatozoa post thawing.
Kata kunci: one step, two step, susu skim, kuning telur
ABSTRACT
DEVI ANIANTI. Characteristics and Acrosome Status of Ram’s Spermatozoa
Cryopreserved in Tris-Egg Yolk or Tris-Skim Milk Extenders by Using One or
Two Step Methods. Supervised by NI WAYAN KURNIANI KARJA and I
KETUT MUDITE ADNYANE.
This research was conducted to study characteristics (motility, viability,
plasma membrane integrity) and intact acrosome status of ram’s spermatozoa
cryopreserved in tris-egg yolk or tris-skim milk extenders with one or two step
method. Semen was collected from local ram, devided and extended in tris-egg
yolk or tris-skim milk by using one step method (OS-KT and OS-SK) and two
step method (TS-KT and TS-SK). The results showed that equilibrated
spermatozoa had similar quality in all groups (P>0.05). Percentage of post-tahwed
motility spermatozoa in OS-SK group was lower than OS-KT group (P0.05). In
conclusion, tris-egg yolk extender was better than tris-skim milk extender to
prevented the motility of spermatozoa after cryopreservation. Futhermore, one or
two step methods were not significantly effected to the quality of post-thawing
spermatozoa.
Keywords: one-step method, two-step method, skim milk, egg yolk
KARAKTERISTIK DAN STATUS AKROSOM
SPERMATOZOA DOMBA (Ovis aries) YANG DIBEKUKAN
DALAM PENGENCER TRIS KUNING TELUR ATAU TRIS
SUSU SKIM DENGAN METODE ONE ATAU TWO STEP
DEVI ANIANTI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Kedokteran Hewan
pada
Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang
berjudul Karakteristik dan Status Akrosom Spermatozoa Domba (Ovis aries) yang
Dibekukan dalam Pengencer Tris Kuning Telur atau Tris Susu Skim dengan
Metode One atau Two Step.
Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Drh Ni Wayan Kurniani Karja, MP, PhD dan Drh I Ketut Mudite Adnyane,
MSi, PhD, PAVet selaku dosen Pembimbing atas segala bimbingan,
masukan, nasehat, dan dukungannya selama proses penelitian dan penulisan
skripsi ini.
2. Dr Drh Koekoeh Santoso, selaku dosen Pembimbing Akademik yang telah
memberikan nasehat dan dukungannya selama ini dalam kegiatan akademik.
3. Mama, Papa, Kakak-kakak (Erna Anggraeni, Maria Ulfah, Vani Amalia)
dan Adik (Miftahul Fallah) atas semua dukungan, baik moral maupun
materi yang telah diberikan selama ini kepada penulis.
4. Kak Aisyah, Mbak Umul, Ka Aras, dan Ka Eki atas semua bantuan dan
arahan yang diberikan kepada penulis pada saat penelitian.
5. Teknisi Unit Rehabilitasi Reproduksi, Pak Bondan dan Selly Anggraeni atas
bantuan yang diberikan kepada penulis pada saat penelitian.
6. Rekan satu penelitian sperma domba (Prista Ayu Nurjanah, Citra Ayu
Lestari dan Faisal Amri Satrio) atas semangat, dukungan, dan bantuannya
selama penelitian.
7. Sahabat-sahabat (Filika Amalia Isman, Sa’adah Daroyni Alhasanah,
Rahajeng Harnastiti, Fauziyyah, Slyvia Oscarina) atas kebersamaan,
dukungan, dan bantuan yang diberikan selama ini kepada penulis.
8. Rekan satu amanah, rekan Ganglion 48, dan semua pihak yang turut serta
membantu penulis sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, adanya kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan oleh
penulis untuk kesempurnaan tulisan ini.
Semoga bermanfaat bagi semua pihak, khususnya bagi penulis sendiri.
Bogor, Agustus 2015
Devi Anianti
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Manfaat Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Bahan
2
Alat
3
Metode Penelitian
3
Analisis Data
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
SIMPULAN DAN SARAN
5
10
Simpulan
10
Saran
10
DAFTAR PUSTAKA
11
RIWAYAT HIDUP
13
DAFTAR TABEL
1 Kualitas semen segar domba lokal (Ovis aries)
5
DAFTAR GAMBAR
1 Motilitas spermatozoa semen segar, setelah ekulibrasi, dan post thawing
2 Viabilitas spermatozoa semen segar, setelah ekulibrasi, dan post
thawing
3 Membran plasma utuh spermatozoa semen segar, setelah ekulibrasi, dan
post thawing
4 Persentase status akrosom spermatozoa semen segar dan post thawing
5 Status akrosom spermatozoa domba dengan pewarnaan histokimia lektin
metode FITC
6
7
8
9
10
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Inseminasi buatan (IB) merupakan salah satu bioteknologi reproduksi yang
digunakan dalam upaya peningkatan populasi dan mutu genetik ternak (Koibur
2005). Teknologi inseminasi buatan di Indonesia sudah dikenal sejak tahun 1950an. Berbagai hasil penelitian menunjukkan conseption rate (CR) hasil IB pada
domba masih bervariasi antara 25–45%, hasil ini lebih rendah dari angka konsepsi
pada sapi sebesar 76.73% (Koibur 2005). Inseminasi buatan dengan metode
cervical insemination seperti pada babi dan domba menggunakan semen beku
masih menghasilkan angka kebuntingan dan jumlah kelahiran yang rendah.
Banyak faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan inseminasi buatan, salah
satunya adalah kualitas semen beku yang digunakan saat inseminasi.
Pembekuan semen adalah proses penghentian sementara kegiatan hidup dari
sel tanpa mematikan fungsi sel (Mumu 2009). Akan tetapi, masalah yang sering
dihadapi dalam proses pembekuan adalah cold shock dan terbentuknya kristal es
sehingga menyebabkan kerusakan sel pada spermatozoa ayam arab (Iskandar et al.
2006). Selama proses pembekuan dan pencairan kembali juga dapat menyebabkan
kerusakan pada membran plasma dan tudung akrosom (Bag et al. 2002).
Kerusakan tudung akrosom ini dapat menyebabkan keluarnya enzim-enzim yang
diperlukan spermatozoa dalam proses fertilisasi. Hal tersebut akan menyebabkan
penurunan fertilitas dari spermatozoa. Upaya untuk mengatasi hal tersebut, selama
proses pembekuan semen biasanya ditambahkan bahan krioprotektan ke dalam
pengencer. Krioprotektan ini berfungsi untuk mencegah terbentuknya kristal es
dan menstabilkan membran plasma spermatozoa domba (Saili et al. 2009).
Upaya untuk meminimalkan kerusakan spermatozoa selain dengan
penambahan krioprotektan, dapat dilakukan dengan menambahkan bahan
pengencer ke dalam semen kerbau (Rizal et al. 2008). Penambahan bahan
pengencer bertujuan untuk menyediakan sumber energi bagi spermatozoa
sehingga menjamin kelangsungan hidup spermatozoa selama penyimpanan atau
pembekuan (Suharyati dan Hartono 2011). Pengencer berbahan dasar tris mampu
memelihara daya hidup spermatozoa sapi, karena berperan sebagai penyangga
yang baik dengan toksisitas yang rendah (Negoro 2011). Secara umum, kuning
telur biasanya ditambahkan dalam bahan pengencer yang berfungsi melindungi
spermatozoa dari kejutan dingin (cold shock) selama penyimpanan (Tsutsui et al.
2003). Menurut Farina (2011) kualitas semen sapi pesisir yang terbaik setelah
pengenceran terdapat pada bahan pengencer tris kuning telur dibandingkan
dengan pengencer susu skim.
Gliserol merupakan krioprotektan yang paling sering digunakan dalam
pembekuan semen (Azizah dan Arifiantini 2009). Menurut Mumu (2009), gliserol
dapat mencegah pengumpulan molekul-molekul air dan akan memodifikasi kristal
es yang terbentuk di dalam medium sewaktu pembekuan sehingga menghambat
kerusakan sel secara mekanis pada pembekuan semen sapi simental. Gliserol
termasuk kedalam krioprotektan intraseluler yang dapat keluar masuk membran.
Hal ini dikarenakan gliserol memiliki berat molekul yang kecil sehingga bersifat
permeabel dan dapat menstabilkan membran plasma spermatozoa selama proses
2
pembekuan. Akan tetapi, metode pemberian gliserol ke dalam medium perlu
mendapatkan perhatian karena gliserol selain berfungsi memberikan perlindungan,
gliserol juga dapat menyebabkan kerusakan pada struktur spermatozoa.
Metode one step atau satu tahap pada pemberian krioprotektan dilakukan
dengan menambahkan gliserol pada medium sebelum medium diekuilibrasi, pada
suhu 5 °C selama 120 menit. Sedangkan metode two step atau dua tahap
dilakukan dengan menambahkan gliserol pada medium setelah medium
diekuilibrasi. Metode one step lebih mudah dan lebih praktis untuk dilakukan
dibandingkan dengan metode two step (Silva et al. 2003). Penelitian Herdis et al.
(1999) menyatakan integritas spermatozoa kerbau lumpur (Bubalus bubalis)
terbaik dicapai pada pemberian gliserol two step. Hal ini diduga berhubungan
dengan lamanya kontak antara gliserol dengan spermatozoa (Salamon dan
Maxwell 1995).
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui karakteristik dan status
akrosom spermatozoa domba (Ovis aries) setelah dibekukan dalam pengencer tris
kuning telur atau tris susu skim dengan metode one atau two step.
Manfaat Penelitian
Memberikan informasi tentang bahan pengencer dan metode pemberian
gliserol terbaik yang dapat digunakan antara pengencer tris kuning telur atau tris
susu skim serta metode one step atau two step pada spermatozoa domba.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai April 2015. Evaluasi
spermatozoa dan kriopreservasi dilakukan di Laboraturium Fertilisasi In Vitro
Bagian Reproduksi dan Kebidanan, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi.
Evaluasi status akrosom spermatozoa dilakukan di Laboratorium Histologi Bagian
Anatomi, Histologi dan Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan
Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah semen segar domba, NaCl
0.9%, NaCl 3%, eosin-negrosin 2%, pengencer tris kuning telur, pengencer tris
susu skim, gliserol, penicillin streptomicin, aquades, alkohol, nitrogen cair,
phosphate buffer saline (PBS), propidium iodine (PI), dan pewarna lektin peanut
agglutinin (PNA) yang dilabel fluorescen isothiocyanate (FITC).
3
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain heating table, water
bath, mikropipet kapasitas (10 μl, 100 µl dan 1000 µl), tabung Eppendorf 2.5 ml,
pipet Pasteur, tube, obyek glass, cover glass, counting chamber, counter, straw,
kertas tisu, kotak penyimpanan, inkubator CO2, mikroskop cahaya, mikroskop
epifluorescens, gelas beker, dan vagina buatan.
Metode Penelitian
Koleksi Semen
Percobaan dilakukan menggunakan semen segar yang dikoleksi dari domba
jantan dewasa kelamin berumur 1–2 tahun dengan bobot badan berkisar antara
25–30 kg. Domba dipelihara secara intensif dalam kandang individual yang
berada di Unit Rehabilitasi Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut
Pertanian Bogor. Sumber makanan pokok domba adalah pakan hijauan dan
konsentrat, serta air minum yang diberikan secara ad libitum. Penampungan
semen dilakukan sebanyak dua kali seminggu (untuk menjaga kualitas dan
kuantitas semen) menggunakan vagina buatan yang bertemperatur antara 40–
42 °C.
Bahan Pengencer
Penelitian ini menggunakan buffer tris yang dibuat dari 0.3025 g tris
(hidroxymethyl amino-methane) (Merck, Germany), 0.17 g asam sitrat (Merck,
Germany), 0.125 g fruktosa (Merck, Germany) yang dilarutkan dalam 8 ml
aquades (Wittayarat et al. 2012). Komposisi dasar pengencer tris kuning telur
untuk 10 ml adalah buffer tris 8 ml, kuning telur 2 ml ditambah streptomisin 1000
μg/ml dan penisilin 1000 IU/ml. Komposisi dasar pengencer tris susu skim untuk
10 ml terdiri atas buffer tris 10 ml, susu skim 0.15 g, ditambah streptomisin 1000
μg/ml dan penisilin 1000 IU/ml.
Kriopreservasi Spermatozoa
Semen segar setelah dikoleksi, dievaluasi karakteristiknya secara
makroskopis dan mikroskopis. Evaluasi makroskopis meliputi volume, warna dan
konsistensi. Sedangkan evaluasi mikroskopis meliputi motilitas, viabilitas,
membran plasma utuh (MPU), status akrosom dan konsentrasi semen untuk
menentukan jumlah pengencer yang akan ditambahkan. Semen yang mempunyai
motilitas diatas 70% yang dapat diproses menjadi semen beku. Semen dibagi
kedalam dua bagian. Bagian semen pertama diencerkan dalam pengencer tris
kuning telur dan dibekukan dengan metode one step (OS-KT) atau two step (TSKT). Bagian semen kedua diencerkan dalam pengencer tris susu skim dan
dibekukan dengan metode one step (OS-SK) atau two step (TS-SK).
Metode pembekuan semen dengan gliserolisasi one step, pada pengencer tris
kuning telur (OS-KT) dan tris susu skim (OS-SK) yang masing-masing telah
diberi semen ditambahkan gliserol 3% secara perlahan-lahan pada suhu kamar.
Kemudian diekulibrasi pada suhu 5 °C selama 2 jam. Metode pembekuan semen
dengan gliserolisasi two step, pada pengencer tris kuning telur (TS-KT) dan tris
4
susu skim (TS-SK) yang masing-masing telah diberi semen, diekuilibrasi pada
suhu 5 °C selama 2 jam. Setelah diekuilibrasi selama 2 jam dilakukan evaluasi
mikroskopis pada semua tube.
Ketika akhir periode ekuilibrasi, semen dengan metode one step langsung
dimasukan ke dalam straw dengan ukuran 0.25 ml. Sedangkan semen dengan
metode two step terlebih dahulu ditambah gliserol 3%. Setelah itu, dilakukan
pengemasan dengan cara memasukkan semen ke dalam straw berukuran 0.25 ml
(I.V.M.,France). Straw diletakkan pada Styrofoam plate dalam uap nitrogen cair
berjarak sekitar 4 cm dari permukaan nitrogen cair selama 20 menit dan segera
dimasukkan ke dalam kontainer nitrogen cair untuk penyimpanan semen selama
10 menit. Setelah penyimpanan, straw dicairkan pada air bersuhu 32 °C selama 30
detik dan dievaluasi kembali.
Evaluasi Karakteristik dan Status Akrosom
1. Motilitas spermatozoa
Penilaian motilitas spermatozoa dilakukan secara visual. Persentase motilitas
spermatozoa dinilai dengan cara meneteskan semen yang telah diencerkan
dengan larutan 0.9% NaCl pada gelas objek lalu ditutup dengan gelas penutup.
Pengamatan terhadap spermatozoa yang bergerak progresif dilakukan secara
subjektif dengan mikroskop cahaya menggunakan pembesaran 400 . Penilaian
yang diberikan berkisar antara 0–100%.
2. Viabilitas (Spermatozoa Hidup)
Pengamatan viabilitas dilakukan menggunakan metode pewarnaan eosinnegrosin (Cocchia et al. 2011). Sebanyak 10 µl sampel semen ditambah dengan
40 µl eosin-negrosin kemudian dicampur diatas gelas objek dan dibuat preparat
ulas. Setelah itu, dikeringkan menggunakan heating table selama 15 detik.
Sebanyak 200 spermatozoa diamati dengan mikroskop cahaya pembesaran
400 . Spermatozoa yang dikategorikan hidup adalah spermatozoa yang tidak
menyerap warna sehingga bagian kepala spermatozoa tidak terwarnai
(berwarna putih). Spermatozoa yang dikategorikan mati adalah spermatozoa
yang menyerap warna sehingga bagian kepala spermatozoa akan terwarnai
(berwarna merah).
3. Integritas Membran Plasma Spermatozoa
Penilaian integritas membran plasma spermatozoa diperiksa menggunakan
metode hypoosmotic swelling test (HOS-Test) dengan komposisi 0.135 g
fruktosa dan 0.0737 g trisodium citrate 2H2O dalam 10 ml air mili-Q. Sampel
semen sebanyak 20 µl diencerkan dengan 80 µl larutan HOS dan dibiarkan
selama 10 menit dalam water bath bertemperatur 37 ºC. Kemudian teteskan 10
µl sampel semen pada gelas objek yang ditutup dengan gelas penutup dan
dilakukan evaluasi dengan pembesaran 400
pada 200 spermatozoa.
Spermatozoa yang memiliki membran plasma utuh ditandai dengan ekor yang
melingkar, sedangkan spermatozoa yang membran plasmanya tidak utuh
ditandai dengan ekor yang lurus (Perez-Llano et al. 2006).
5
4. Status Akrosom dengan Metode FITC
Sebanyak 3 μl semen diulas pada gelas objek dan dikeringudarakan. Gelas
objek dicelupkan ke dalam larutan etanol absolut untuk difiksasi. Setelah 10
menit gelas objek dikeringudarakan dan diteteskan larutan flourescen
isothiocyanate (FITC) (Sigma, St. Luis MO) sebanyak 25 µl (konsentrasi 10
µg/ml dalam PBS) kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit.
Preparat tersebut ditetesi dengan propidium iodide (PI) (Sigma, St. Luis MO)
sebanyak 5 µl (konsentrasi 10 µg/ml dalam PBS) dan diinkubasi selama 7
menit. Setelah diinkubasi, preparat dicuci dalam larutan PBS sebanyak dua kali
untuk membersihkan sisa pereaksi yang tidak berikatan, lalu ditutup dengan
gelas penutup ukuran 24 24 mm. Pemeriksaan status akrosom dilakukan
menggunakan mikroskop epiflourecen (Nikkon, Eclipse E600, Japan) pada
panjang gelombang 380–420 nm dalam ruang gelap. Jumlah spermatozoa yang
diamati pada setiap perlakuan adalah 200 spermatozoa. Hasil pemeriksaan
dengan metode FITC dibedakan menjadi dua, yaitu spermatozoa dengan
akrosom berwarna hijau dikategorikan sebagai akrosom intak (utuh), sementara
spermatozoa yang tidak berwarna hijau dikategorikan sebagai akrosom rusak
(tidak utuh) sesuai metode Cocchia et al. (2011).
Analisis Data
Persentase karakteristik spermatozoa (motilitas, viabilitas, dan membran
plasma utuh) serta status akrosom spermatozoa ditansformasikan secara Arcsin
sebelum dianalisis. Data yang telah ditransformasi, diuji dengan ANOVA
dilanjutkan dengan uji Fisher’s Protected Least Significant Difference (PLSD)
menggunakan program Statview (Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA, USA).
Perbedaan P