BIO-DEGRADASI SELULOSA HASIL BIO-PRETREATMENT JERAMI PADI SECARA FERMENTASI PADAT MENGGUNAKAN ISOLAT ACTINOMYCETES AcP-1 DAN AcP-7 (BIODEGRADATION OF CELLULOSE IN SOLID STATE FERMENTATION PRE-TREATED RICE STRAW BY ACTINOMYCETES AcP-1 AND AcP-7 ISOLATE

BIO.DEGRADASI SELULOSA HASIL BIO-PRETREATMENT JERAMI PADI SECARA FERMENTASI PADAT MENGGUNAKAN ISOLAT

ACTINOMYCEIES AcP-1

DAN AcP-7

/$mod

(l{lski

Skripsi

Sebagai SalahSatu Syard untuk Memperoleh Gelar SARJANA SAINS

Pada Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan llmu Pengetahuan AIam

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR I.AMPUNG

2013

P.'-:".8

\\I_grr

I

ABSTRACT

BIODEGRADATION OF CELLULOSE IN SOLID STATE FERMENTATION PRE-TREATED RICE STRAW BY

ACTINOMYCETES AcP-1 AND AcP-7 ISOLATE

By Ahmad Ruzki

Cellulose is primary component of plant cells wall, in which in rice straw the content of reach 34% repectively. Efforts to increase the economic value of rice straw is done by converting the polymer into simple sugars that could be utilized as a transition in the field of biotechnology products. This study was conducted to optimize rice straw pre-treated hydrolysis process and to characterize reducing sugar content that release in process. Two condition in fermentation has been set up, each time of incubation and different pH, to obtain optimum condition fermentation by two isolate actinomycetes AcP-1 and AcP-7. Result of this treatment show that optimum condition were reached at 12nd day fermentation in pH 7,5. Some of chemical parameter which are used as guide to obtain the optimum fermentation condition have reached the peak at this condition. Fermentation by actinomycetes AcP-1 isolat has optimum performance on decreasing of cellulose content was 10,595%, and cellulase activity was 1,164 U mL-1 respectively. On the other hand, fermentation by actinomycetes AcP-7 isolat has optimum performance on decreasing of cellulose content was 10,580%, and cellulase activity was 0,997 U mL-1 respectively. Reducing sugar which analyzed by DNS method shows that hydrolysis by AcP-1 isolate release reducing sugar at15,134 mg mL-1, and AcP-7 isolate at 14,803 mg mL-1. In addition, retention time of glucose from both of fermentation filtrates was slighty different. Chromatogram from HPLC analyze shows for AcP-1 filtrate the retention time peak at 8,911 minute, however AcP-7 filtrate at 8,911.

ABSTRAK

BIO-DEGRADASI SELULOSA HASIL BIO-PRETREATMENT JERAMI PADI SECARA FERMENTASI PADAT MENGGUNAKAN ISOLAT

ACTINOMYCETES AcP-1 DAN AcP-7

Oleh Ahmad Ruzki

Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel tanaman. Seperti pada limbah jerami padi, diketahui kandungan selulosa mencapai 34,2% berat kering. Upaya peningkatan nilai ekonomis dari jerami padi banyak dilakukan antara lain memanfaatkanya sebagai sumber gula pereduksi yang dapat digunakan sebagai transisi produk senyawa kimia lainnya seperti etanol, asam sitrat, asam asetat dan produk fermentasi lainnya. Penelitian dilakukan untuk mengetahui adanya gula pereduksi yang dihasilkan dari substrat jerami padi hasil bio-pretreatment yaitu dengan mendegradasi kandungan. Dua perlakuan diberikan masing-masing waktu fermentasi dan variasi pH dengan perbandingan substrat:buffer (1:3) untuk memperoleh kondisi optimum dengan melihat beberapa parameter kimia sebagai indikator. Dua isolat Actinomycetes AcP-1 dan AcP-7, yang digunakan masing-masing sebagai agen biologi menunjukkan waktu optimum yang sama yaitu pada hari ke-12 dan pada pH 7,5. Kesimpulan ini diambil dari parameter kimia yang menunjukkan nilai optimum pada waktu dan pH parameter yang diujikan. Hasil pengukuran beberapa parameter kimia pada kondisi fermentasi optimum oleh isolat AcP-1 untuk kandungan selulosa pada substrat menurun 10,595 % dan aktivitas enzim selulase optimum sebesar 1,164 U/mL. Sedangkan hasil pengukuran beberapa parameter kimia oleh isolat AcP-7 untuk kandungan selulosa pada substrat menurun 10,580 %, aktivitas selulase optimum sebesar 0,997 U/mL. Berdasarkan kondisi optimum yang diperoleh produk fermentasi dianalisis dengan metode DNS dan KCKT. Hasil analisis gula pereduksi total dilakukan dengan metode DNS oleh isolat AcP-1 sebesar 15,134 mg/mL dan oleh isolat AcP-7 sebesar 14,803 mg/mL. Sementara dengan metode KCKT diperoleh glukosa pada waktu retensi 8,911 menit untuk isolat AcP-1 dan 8,904 menit untuk isolat AcP-7.

\ama

Mahasiswa

:

Nomor Pokok Mahasiswa :

Jurusan

:

Fakultas

:

ACTINOMYCETES AcP-l DAN AcP-7

,{hmadcQlzkl

0817011016 Kimia

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Heri Satria, M.Si.

\-rP 19711001 200501

I

002

MENYETUJUI 1. Komisi Pembimbing

2. Ketua Jurusan Kimia

Kamisah D. Pandiangan, M.Si. NrP 19721205 199703 2 001

%

Dr. Eng.

S*ril,

Dwi Yuwono, _{M.T. f .-r} NIP 19740705 200003 I 001

M

ft

r'

rimPenguji

til*lwt

Ketua

:

Heri Satria, M.Si.

:

Kamisah D. Pandiangan, M.Si.

Penguji

Bukan Pembimbing

:

Dra.Aspita Laila' M.S.

Ilmu PengetahuanAlam akultas Matematika dan

Mf?

12 1 001

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ... i

DAFTAR GAMBAR ... iii

DAFTAR TABEL ... iv

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang ... 1

B. Tujuan Penelitian ... 3

C. Manfaat Penelitian ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA A. Selulosa ... 5

B. Enzim ... 7

C. Enzim Selulase ... 8

D. Hidrolisis ... 10

1. Hidrolisis Enzim ... 10

2. Hidrolisis Asam ... 11

E. Actinomycetes ... 11

F. Fermentasi Fase Padat (Solid State Fermentation / SSF) ... 14

1. Proses Fermentasi Fase Padat ... 15

1.1. Persiapan Substrat ... 15

1.2. Persiapan Inokulum ... 16

1.3. Persiapan Wadah ... 16

1.4. Inokulasi dan Pengerjaan ... 16

1.5. Proses Fermentasi Fase Padat ... 16

1.6. Kultivasi ... 16

2. Keuntungan Fermentasi Fase Padat ... 16

3. Aplikasi Fermentasi Fase Padat ... 17

G. Analisis Gula Reduksi ... 18

H. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ... 21

III. METODOLOGI PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian ... 25

C. Prosedur Penelitian ... 26

1. Pembuatan Inokulum ... 26

2. Optimasi Fermentasi Substrat Jerami ... 26

3. Pengukuran Parameter Fermentasi Fase Padat ... 27

3.1 Pengukuran Kadar Selulosa ... 27

3.2 Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase ... 28

4. Pengukuran Gula Pereduksi Total dengan Metode DNS ... 29

4.1 Pengukuran Gula Pereduksi Total dengan Metode DNS . 29 4.2 Pengukuran Produk Fermentasi dengan KCKT ... 29

5. Pembuatan Media ... 30

5.1. Pembuatan Media YMA ... 30

5.2. Pembuatan Media YM ... 30

5.3. Pembuatan Media Fermentasi ... 30

6. Pembuatan Pereaksi ... 30

6.1. Pembuatan Buffer Fosfat ... 30

6.1.1. Larutan Stok A (NaH2PO4·2H2O 0,2 M) ... 30

6.1.2. Larutan Stok B (Na2HPO4·2H2O 0,2 M) ... 31

6.2. Pembuatan Buffer Sitrat Fosfat ... 31

6.2.1. Larutan Stok A (Asam Sitrat 0,1 M) ... 31

6.2.2. Larutan Stok B (Na2HPO4·2H2O 0,2 M) ... 31

6.3. Pembuatan Pereaksi DNS ... 31

6.4. Pembuatan NaCl 0,85 % ... 31

7. Pembuatan Kurva Standar Glukosa ... 31

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Optimasi Fermentasi Fase Padat ... 34

B. Pengukuran Parameter Fermentasi Fase Padat ... 35

a. Pengukuran Kadar Selulosa ... 35

b. Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase ... 38

C. Pengukuran Hasil Produk Fermentasi ... 41

1. Pengukuran Gula Pereduksi Total dengan Metode DNS ... 41

2. Pengukuran Produk Fermentasi dengan Metode KCKT ... 44

V. SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan ... 47

B. Saran ... 48

DAFTAR PUSTAKA ... 49

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel tanaman.

Keberadaan selulosa biasa ditemukan pada limbah pertanian seperti jerami padi, jerami jagung, jerami gandum, jerami tongkol, tandan kosong kelapa sawit dan bagase tebu. Seperti pada limbah jerami padi, diketahui kandungan selulosa mencapai 34,2% berat kering (Wyman et al., 2002). Selulosa berpotensi tinggi untuk didegradasi menjadi produk akhir yang berguna seperti glukosa dan gluko-oligosakarida.

Secara kimia selulosa merupakan senyawa polimer glukosa yang tersusun dari unit-unit β-1,4-glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β–1,4-D-glikosida (Han

et al., 1995). Ikatan ini dapat didegradasi dengan baik secara Fermentasi Fase

Padat (Solid State Fermentation/SSF) dan hidrolisis enzim dengan menggunakan enzim selulase.

Enzim selulase merupakan kelompok enzim yang diproduksi mikroorganisme dalam degradasi selulosa. Enzim ini berperan dalam hidrolisis selulosa dengan

memecah ikatan β-1,4-D-glikosida untuk menghasilkan oligosakarida maupun glukosa. Dengan enzim tersebut selulosa mampu didegradasi dengan baik

menjadi komponen gula sederhana, seperti glukosa (Onsori, Zamani, Mottalebi., 2005).

Enzim selulase dapat dihasilkan dari beberapa genus bakteri pendegradasi selulosa salah satunya adalah Actinomycetes. Beberapa spesies Actinomycetes yang diketahui memiliki kemampuan untuk mendegradasi selulosa adalah Streptomyces sp. AT7 (Al-Tai et al., 1989), Streptomycesviridosporus (Pasti et al., 1990),

Microbispora bispora (Waldron et al., 1986), Streptomycesmurinus (Howard et

al., 2003), Thermomonas sp. (George, 2001), Micromonospora chalcea,

Streptomycesroselflavus dan Nacardiodes fulvus (Abdulla & El-Shatoury, 2006).

Untuk memproduksi enzim selulase dapat dilakukan dengan menggunakan metode Fermentasi Fase Padat (Solid State Fermentation/SSF) yang merupakan proses fermentasi yang melibatkan zat padat dalam suatu fasa cair (Moo-Young et al., 1983). Proses SSF sebenarnya hampir sama dengan proses hidrolisis dan proses fermentasi, tetapi proses hidrolisis dan fermentasi pada SSF dilakukan dalam satu tempat. Proses SSF membutuhkan bahan mentah alami sebagai sumber karbon. Untuk proses fermentasi ini dapat dilihat berdasarkan

karakteristik (pH, perbandingan substrat: buffer dan waktu inkubasi), aktifitas enzim selulase ditentukan berdasarkan pada glukosa dengan metode kolonimetri DNS (Adney dan Baker, 2008).

Berdasarkan uraian di atas maka pada penelitian ini telah dilakukan biodegradasi selulosa hasil bio-pretreatment jerami padi menggunakan metode Fermentasi Fase Padat (Solid State Fermentation/SSF) oleh isolat Actinomycetes AcP-1 dan AcP-7 menjadi glukosa. Dengan memperhatikan optimasi fermentasi pH dengan cara

melakukan pengukuran beberapa parameter meliputi pengukuran APPL, kadar selulosa aktivitas enzim selulase dan kandungan gula pereduksi selama proses fermentasi jerami padi oleh isolat Actinomycetes AcP-1dan AcP-7.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Mendapatkan kondisi fermentasi optimum dalam biodegradasi selulosa jerami padi secara Fermentasi Fase Padat (Solid State Fermentation/SSF) oleh isolat

Actinomycetes AcP-1dan AcP-7.

2. Mengkarakterisasi beberapa parameter dalam biodegradasi selulosa seperti kadar selulosa, aktivitas enzim selulase dan kandungan gula pereduksi hasil biodegradasi jerami padi oleh isolat Actinomycetes AcP-1dan AcP-7. 3. Menganalisis produk biodegradasi optimum jerami padimenggunakan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

C. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi tentang karakteristik degradasi lignoselulosa pada umumnya dan optimasi biodegradasi selulosa jerami padi secara Fermentasi Fase Padat (Solid State Fermentation/SSF) menggunakan isolat Actinomycetes AcP-1 dan AcP-7. Gula pereduksi hasil fermentasi

alkohol, asam sitrat, asam glutamat dan lainnya, sehingga mampu meningkatkan komoditas ekonomi limbah jerami padi.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Selulosa

Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel tanaman. Kandungan selulosa pada dinding sel tanaman tingkat tinggi sekitar 35-50% dari berat kering tanaman (Saha, 2004). Selulosa merupakan polimer glukosa dengan ikatan β-1,4 glukosida dalam rantai lurus. Bangun dasar selulosa berupa suatu selobiosa yaitu dimer dari glukosa. Rantai panjang selulosa terhubung secara bersama melalui ikatan hidrogen dan gaya van der Waals (Perez et al. 2002).

Selulosa mengandung sekitar 50-90% bagian berkristal dan sisanya bagian amorf (Aziz et al., 2002). Selulosa hampir tidak pernah ditemui dalam keadaan murni di alam, melainkan selalu berikatan dengan bahan lain seperti lignin dan

hemiselulosa. Selulosa terdapat dalam tumbuhan sebagai bahan pembentuk dinding sel dan serat tumbuhan. Molekul selulosa merupakan mikrofibil dari glukosa yang terikat satu dengan lainnya membentuk rantai polimer yang sangat panjang. Adanya lignin serta hemiselulosa di sekeliling selulosa merupakan hambatan utama untuk menghidrolisis selulosa (Sjostrom, 1995).

Selulosa merupakan polisakarida yang terdiri atas satuan-satuan dan mempunyai massa molekul relatif yang sangat tinggi, tersusun dari 2.000-3.000 glukosa.

Rumus molekul selulosa adalah (C6H10O5)n. Selulosa merupakan komponen

utama penyusun dinding sel tanaman yaitu senyawa polimer glukosa yang tersusun dari nit-unit β-1,4-glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β -1,4-D-glikosida (Han et al., 1995).

Gambar 1. Struktur Kimia Selulosa (Sixta, 2006).

Ikatan β-1,4 glukosida pada serat selulosa dapat dipecah menjadi monomer

glukosa dengan cara hidrolisis asam atau enzimatis. Kesempurnaan pemecahan selulosa pada saluran pencernaan ternak tergantung pada ketersediaan enzim pemecah selulosa yaitu selulase. Saluran pencernaan manusia dan ternak non

ruminansia tidak mempunyai enzim yang mampu memecah ikatan β-1,4 glukosida

sehingga tidak dapat memanfaatkan selulosa. Ternak ruminansia dengan bantuan enzim yang dihasilkan mikroba rumen dapat memanfaatkan selulosa sebagai sumber energi. Pencernaan selulosa dalam sel merupakan proses yang kompleks yang meliputi penempelan sel mikroba pada selulosa, hidrolisis selulosa dan fermentasi yang menghasilkan asam lemak.

Hidrolisis sempurna selulosa akan menghasilkan monomer selulosa yaitu glukosa, sedangkan hidrolisis tidak sempurna akan menghasilkan disakarida dari selulosa yaitu selobiosa (Fan dkk, 1982). Selulosa dapat dihidrolisis menjadi glukosa dengan menggunakan media air dan dibantu dengan katalis asam atau enzim.

Selanjutnya glukosa yang dihasilkan dapat difermentasi menjadi menjadi produk fermentasi yang nantinya dapat diolah lagi menjadi etanol.

B. Enzim

Enzim merupakan protein sel hidup yang berperan sebagai biokatalisator dalam proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di-luar sel. Enzim merupakan katalisator sejati yang dapat meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik dengan nyata, suatu reaksi kimia akan berlangsung sangat lambat tanpa adanya enzim. Enzim tidak mampu mengubah titik keseimbangan dari reaksi yang dikatalisisnya dan enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi tersebut (Lehninger, 1982).

Menurut Poedjiadi (1994), enzim merupakan protein dengan struktur tiga dimensi yang kompleks yang aktif di bawah kondisi khusus dan hanya dengan substrat spesifik. Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim

merupakan produk protein sel hidup yang berperan sebagai biokatalisator dalam proses biokimia, baik yang terjadi di dalam sel maupun di luar sel.

Enzim merupakan katalisator sejati yang meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik dengan nyata, tanpa enzim, suatu reaksi kimia akan berlangsung amat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik kesetimbangan reaksi yang

dikatalisisnya; enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi tersebut (Lehninger, 1982).

C. Enzim Selulase

Enzim selulase merupakan kumpulan dari beberapa enzim yang bekerja bersama untuk hidrolisis selulosa. Mikroorganisme tertentu menghasilkan partikel yang dinamakan selulosom. Partikel inilah yang akan terdisintegrasi menjadi enzim-enzim, yang secara sinergis mendegradasi selulosa (Belitz dkk, 2008).

Menurut Salam dan Gunarto (1999), selulase merupakan enzim yang dapat memutuskan ikatan glukosida β-1,4 di dalam selulosa. Dalam menghidrolisis senyawa selulosa, kemampuan selulase sangat digantungkan pada substrat yang di gunakan.

Enzim selulase merupakan salah satu kelompok enzim yang termasuk dalam suatu sistem yang diproduksi mikroorganisme dalam degradasi material sel tumbuhan. Enzim ini termasuk dalam famili glikosil hidrolase. Enzim selulase berperan dalam hidrolisis selulosa dengan memecah ikatan β-1,4-D-glikosida untuk menghasilkan oligosakarida maupun glukosa. Berdasarkan aktivitasnya terhadap berbagai substrat, selulase diklasifikasikan menjadi tiga tipe, yaitu endoglukanase (endo- β-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4), β-glukosidase (β-D-glucoside

glucohydrolase, EC 3.2.1.21) dan selobiohidrolase atau eksoglukanase (exo-β

-1,4-glucanase, EC 3.2.1.91) (Zhang et al., 2006; Doi et al., 2003).

Endoglukanase menghidrolisis ikatan internal β-1,4-D-glikosida secara random

pada situs amorf dari rantai polisakarida selulosa untuk menghasilkan oligosakarida dan menambah ujung rantai yang baru, eksoglukanase

menghasilkan selobiosa atau glukosa sebagai produk utama, dan glikosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa untuk mengeliminasi penghambatan selobiosa (Gambar 2).

Gambar 2. Skema hidrolisis selulosa oleh sistem selulase non-kompleks (Zhang

et al. 2006).

Fungsi terpenting dari enzim adalah kemampuannya menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Kemampuan enzim dalam mendegradasi substrat dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, pH serta temperatur (Lehninger, 1982).

D. Hidrolisis

Hidrolisis meliputi proses pemecahan polisakarida di dalam biomassa lignoselulosa, yaitu: selulosa dan hemiselulosa menjadi monomer gula

penyusunnya (glukosa & xilosa). Hidrolisis sempurna selulosa menghasilkan glukosa, sedangkan hemiselulosa menghasilkan beberapa monomer gula pentosa (C5) dan heksosa (C6). Secara umum teknik hidrolisis dibagi menjadi dua, yaitu: hidrolisis dengan enzim dan hidrolisis dengan asam.

1. Hidrolisis Enzim

Hidrolisis enzim merupakan proses penguraian suatu polimer yang kompleks menjadi monomer penyusunnya dengan menggunakan enzim (Perez et al., 2002). Hidrolisis enzimatis memiliki beberapa keuntungan dibandingkan hidrolisis asam, antara lain: tidak terjadi degradasi gula hasil hidrolisis, kondisi proses yang lebih lunak (suhu rendah, pH netral), berpotensi memberikan hasil yang tinggi, dan biaya pemeliharaan peralatan relatif rendah karena tidak ada bahan yang korosif (Taherzadeh & Karimi, 2008) (Hamelinck et al., 2005). Beberapa kelemahan dari hidrolisis enzimatis antara lain adalah membutuhkan waktu yang lebih lama, dan kerja enzim dihambat oleh produk. Di sisi lain harga enzim saat ini lebih mahal daripada asam sulfat, namun demikian pengembangan terus dilakukan untuk menurunkan biaya dan meningkatkan efisiensi hidrolisis maupun fermentasi (Sanchez and Cardona, 2007).

2. Hidrolisis asam

Di dalam metode hidrolisis asam, biomassa lignoselulosa dipaparkan dengan asam pada suhu dan tekanan tertentu selama waktu tertentu dan menghasilkan monomer gula dari polimer selulosa dan hemiselulosa. Beberapa asam yang umum

digunakan untuk hidrolisis asam antara lain adalah asam sulfat (H2SO4), asam

perklorat, dan HCl. Asam sulfat merupakan asam yang paling banyak diteliti dan dimanfaatkan untuk hidrolisis asam (Taherzadeh and Karimi, 2008). Hidrolisis asam dapat dikategorikan melalui dua pendekatan umum, yaitu hidrolisis asam konsentrasi tinggi pada suhu rendah dan hidrolisis asam konsenrasi rendah pada suhu tinggi. Pemilihan antara dua cara tersebut pada umumnya didasarkan pada beberapa hal yaitu laju hidrolisis, hasil total hidrolisis, tingkat degradasi produk dan biaya total proses produksi (Kosaric et al., 1983).

E. Actinomycetes

Actinomycetes merupakan mikroorganisme tanah yang umum dijumpai pada berbagai jenis tanah. Populasinya berada pada urutan kedua setelah bakteri, bahkan kadang-kadang hampir sama (Alexander, 1961; Elberson et al., 2000).

Actinomycetes hidup sebagai safrofit dan aktif mendekomposisi bahan organik sehingga dapat meningkatkan kesuburan tanah (Nonomura and Ohara, 1969).

Actinomycetes merupakan salah satu mikroorganisme yang mampu mendegradasi selulosa di samping bakteri, kapang, dan khamir (Abe et al., 1979; Nakase et al., 1994; Xu et al., 1996).

Jenis Actinomycetes tergantung pada tipe tanah (Davies and Williams, 1970), karakteristrik fisik, kadar bahan organik, dan pH lingkungan (Xu et al., 1996). Jumlah Actinomycetes meningkat dengan adanya bahan organik yang mengalami dekomposisi (Nonomura and Ohara, 1971).

Actinomycetes merupakan genus bakteri yang filamentous yang membentuk miselia, bersifat gram positif, dan sebagian besar membentuk spora.

Actinomycetes adalah mikroorganisme peralihan antara bakteri dan jamur karena mikroorganisme ini mempunyai sifat-sifat seperti bakteri dan jamur. Oleh sebab itu, lingkungan yang menjadi habitat bagi bakteri dan jamur adalah lingkungan yang tepat bagi kelangsungan hidup Actinomycetes. Sehingga Actinomycetes

tersebar luas di alam (Paul and Clark, 1989).

Walaupun Actinomycetes dikatakan sebagai mikroorganisme peralihan antara bakteri dan fungi (Alexander, 1977), tetapi Actinomycetes mempunyai ciri yang khas, yang cukup membatasinya menjadi satu kelompok yang jelas berbeda. Pada medium cair, pertumbuhan Actinomycetes ditandai dengan keruhnya medium dan terbentuk lapisan tipis di permukaan medium. Menurut Rao (1994), pada

lempeng agar, Actinomycetes dapat dibedakan dengan mudah dari bakteri, dimana koloni bakteri tumbuh dengan cepat dan berlendir, sedangkan Actinomycetes

muncul perlahan dan berbubuk serta melekat erat pada permukaan agar. Umumnya, Actinomycetes tidak toleran terhadap asam dan jumlahnya menurun pada pH 5,0 (Jiang dan Xu, 1985; Jiang et al., 1988). Rentang pH yang cocok untuk pertumbuhan Actinomycetes ini sekitar 6,5–8,0 dan 25-300C (Nonomura

Actinomycetes adalah 25-30ºC, tetapi ada beberapa Actinomycetes termofilik yang dapat tumbuh pada temperatur sekitar 55–650C seperti Streptomyces dan

Thermoactinomycetes (Rao, 1994).

Medium yang baik untuk menumbuhkan Actinomycetes adalah medium yang mengandung glukosa, gliserol atau tepung sebagai sumber karbon; nitrat atau kasein sebagai sumber nitrogen dan mineral-mineral tertentu seperti NaCl, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, FeSO4.7H2O, inkubasi biasanya selama 2-7 hari

(Fithria, 2007).

Berdasarkan klasifikasinya, Actinomycetes termasuk kelas Schizomycetes, ordo

Actinomycetales yang dikelompokkan menjadi empat familia, yaitu:

Mycobacteriaceae, Actinomycetaeceae, Streptomyceae dan Actinoplanaceae. Genus yang paling banyak dijumpai adalah Streptomyces (hampir 70%),

Nocardia, dan Micronospora. Koloni Actinomycetes muncul perlahan,

menunjukkan konsistensi berbubuk dan melekat erat pada permukaaan media. Pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan adanya miselium ramping bersel satu yang bercabang membentuk spora aseksual untuk perkembang biakannya (Lechevalier dan Lechevalier, 1967; Nonomura dan Ohara, 1971).

Beberapa spesies dari genus Actinomycetes memiliki peranan penting dalam mendekomposisi beberapa jenis polimer dan kemampuan kapasitas biodegradasi makromolekul ini didukung oleh produksi enzim ekstraseluler yang beragam (Wendishch dan Kutzner, 1992; Ramachandra et al., 1987; Yamac dan Tamer, 2008).

F. Fermentasi Fase Padat (Solid State Fermentation / SSF)

Fermentasi pertumbuhan mikroba dan pembentukan produk bergantung dari permukaan pada substrat padat. Subtrat tradisional yang dapat digunakan dalam fermentasi berupa hasil produk agrikultur seperti beras, tepung, maisena, tebu, dan lain-lain. Substrat tersebut mendukung organisme miselium untuk tumbuh pada konsentrasi nutrisi yang tinggi, dan menghasilkan berbagai macam enzim ekstraseluler seperti sejumlah filamen jamur dan beberapa bakteri (Actinomycetes

dan satu strain dari Bacillus) (Pandey et al., 2008).

Fermentasi fase padat atau sering disebut Solid State Fermentation (SSF) pertama kali dikenalkan oleh Takagi et al., (1977), yang telah berhasil mengkombinasikan enzim selulase dan yeast Sacharomyces cerevisiae untuk fermentasi gula menjadi etanol. Fermentasi fase padat dapat didefinisikan sebagai proses fermentasi yang melibatkan zat padat dalam suatu fasa cair (Moo-Young et al., 1983). Proses SSF sebenarnya hampir sama dengan proses hidrolisis dan proses fermentasi, tetapi proses hidrolisis dan fermentasi pada SSF dilakukan dalam satu tempat. Proses SSF membutuhkan bahan mentah alami sebagai sumber karbon dan bahan inert sebagai matriks padatan. Substrat padat (matrik) harus cukup akan kelembaban dan memiliki area permukaan substrat yang lebar.

Berdasarkan dari sifat fisik Fermentasi Fase Padat dibagi menjadi dua kelompok, antara lain:

2. Fermentasi padatan tersuspensi dalam kolom dengan sirkulasi larutan. Jamur yang digunakan biasanya aerob obligat.

Gambar 3. Proses Fermentasi Fase Padat.

Konsentrasi air sebagai moisture (pelembab) sangat menentukan jalannya fermentasi padat. Perubahan partikel padat yang lembab dan fase gas dalam sistem Fermentasi Fase Padat melibatkan hifa dan organisme uniseluler yang di tunjukkan oleh Gambar 3a. Sedangkan sistem lain yang melibatkan pertumbuhan pada zat padat, tetapi tidak didefinisikan sebagai Fermentasi Fase Padat selama jumlah air antara partikel besar (Moo-Young et al., 1983).

1. Proses Fermentasi Fase Padat

Mitchel et al. (2006) juga menjelaskan tahapan-tahapan proses Fermentasi Fase Padat secara umum, antara lain:

1.1. Persiapan Substrat, dimana substrat harus dipotong, digiling,

dan nutrisi disebut dengan pra-perawatan substrat untuk menambah ketersediaan gizi.

1.2. Persiapan Inokulum, tipe dan persiapan inokulum tergantung pada mikroorganisme yang digunakan. Banyak proses fermentasi fase padat melibatkan hifa khamir, maka digunakan spora hasil inokulasi. Tujuan dari langkah ini untuk mengembangkan sebuah inokulum dengan tingkat kelangsungan hidup mikoorganisme yang tinggi.

1.3. Persiapan Wadah, dimana wadah harus dibersihkan setelah fermentasi sebelumnya dan perlu disterilkan sebelum penambahan substrat. 1.4. Inokulasi dan Pengerjaan, pengerjaan tahapan ini dengan menyebarkan

substrat pada media yang telah disterilkan secara hati-hati untuk menghindari kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. 1.5. Proses Fermentasi Fase Padat, pada proses ini banyak hal yang harus

diperhatikan antara lain pH medium, suhu, dan waktu inkubasi, kelembaban.

1.6. Kultivasi, pada tahapan ini memerlukan bantuan mekanis untuk

memisahkan substrat padat dari medium. Penggunaan kertas saring dan sentrifugasi dapat dipakai untuk memisahkan substrat.

2. Keuntungan Fermentasi Fase Padat

Fermentasi fase padat memiliki beberapa keuntungan, antara lain biaya lebih murah, media produksi dapat menggunakan residu agroindustri, menggunakan sedikit air, limbah yang dihasilkan sedikit, proses sederhana, menggunakan wadah dalam jumlah kecil tetapi menghasilkan konsentrasi produk tinggi.

3. Aplikasi Fermentasi Fase Padat

Holker et al., (2004) dan Pandey (2000) menguraikan beberapa aplikasi dari SSF secara tradisional yang digunakan oleh banyak negara, antara lain :

1.1. Tempe, dimana tempe melibatkan kultivasi dari khamir Rhizopus

oligosporus pada kedelai yang direbus, kemudian digoreng dan dimakan sebagai pengganti daging. Makanan fermentasi ini sangat terkenal di Indonesia.

1.2. Tahapan koji dalam pembuatan kecap yang melibatkan kultivasi dari khamir Aspergillus oryzae dalamkedelai rebus. Proses SSF miselium khamir menutupi kedelai dan menginjeksikan ke dalam campuran enzim. Kedelai hasil fermentasi kemudian dipindahkan ke dalam air asin selama beberapa bulan sehingga akan menghasilkan saus yang berwarna coklat tua.

1.3. “ang-kak” atau anggur merah melibatkan kultivasi dari khamir Monascus purpureus pada beras yang direbus. Produksi khamir menghasilkan pigmen berwarna merah gelap, pada tahap akhir fermentasi beras hasil fermentasi dikeringkan dan dihaluskan menjadi bubuk yang akan digunakan sebagai pewarna saat memasak.

Selain aplikasi di atas, lebih dari tiga dekade banyak ketertarikan pada proses teknologi SSF. Kebanyakan dari aplikasi tersebut menghasilkan produk-produk seperti enzim, pigmen, senyawa aromatik, senyawa kimia, antibiotik, dan agen pengontrol biologis. Selain itu banyak aplikasi penggunaan mikroorganisme

dalam SSF sebagai bagian dari proses perantara, yaitu pewarnaan zat warna, biobleaching, biopulping, dan bioremediation.

G. Analisis Gula Reduksi

Gula reduksi hasil hidrolisis asam dapat dianalisis secara kualitatif untuk

mengidentifikasi apakah sampel mengandung gula reduksi atau tidak dan secara kuantitatif untuk menentukan kadar gula reduksi yang terbentuk. Untuk maksud tersebut, analisis gula reduksi secara kualitatif dapat dilakukan dengan uji

Benedict, uji Fehling, uji Barfoed, uji Tollens, dan uji Molisch (Mathews, 2000).

Analisis gula reduksi secara kuantitatif dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain dengan metode Luff Schoorl (Kowalski et al., 2013), Nelson-Somogyi (Woiciechowski et al., 2002) dan DNS (Lone et al., 2012). Metode DNS

merupakan metode yang paling banyak digunakan untuk menentukan kadar gula reduksi. Dalam metode DNS digunakan reagen dinitro salisilat (DNS). Bahan-bahan kimia yang diperlukan untuk membuat reagen DNS adalah asam 3,5-dinitrosalisilat, NaOH, Na2SO3, Na-K-tartarat, fenol, dan akuades. DNS

merupakan senyawa aromatis yang dapat bereaksi dengan gula reduksi

membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat, suatu senyawa yang mampu menyerap radiasi gelombang elektromagnetik pada panjang gelombang maksimum 540 nm (Adney and Baker, 2008). Semakin tinggi kadar gula reduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin banyak pula molekul asam 3-amino-5- nitrosalisilat yang terbentuk, sehingga absorbansi sampel akan semakin tinggi.

Reaksi antara gula reduksi dengan DNS merupakan reaksi redoks pada gugus aldehid gula dan teroksidasi menjadi gugus karboksil. Sementara itu, DNS sebagai oksidator akan tereduksi membentuk asam 3-amino dan 5- nitrosalisilat. Reaksi ini berlangsung dalam suasana basa dan suhu tinggi sekitar 90-100 °C. Bila terdapat gula reduksi pada sampel, maka larutan DNS yang awalnya

berwarna kuning akan bereaksi dengan gula reduksi sehingga menimbulkan warna jingga kemerahan (Kusmiati dan Agustini, 2010).

Reaksi antara DNS dengan glukosa adalah sebagai berikut :

Gambar 4. Reaksi glukosa dengan DNS.

Sampel yang telah direaksikan dengan DNS selanjutnya ditentukan kadar gula reduksinya menggunakan spektrofotometer UV-vis. Spektrofotometer UV-vis adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorbansi suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber cahaya UV menggunakan lampu Hidrogen atau Deuterium dan sumber cahaya tampak menggunakan lampu Tungsten. Larutan sampel yang akan dianalisis diukur absorbansi sinar ultra violet atau sinar tampaknya.

Konsentrasi larutan sampel yang dianalisis akan sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis ini didasarkan pada Hukum Lambert-Beer yang menyatakan hubungan antara absorbansi cahaya dengan konsentrasi zat dalam

larutan. Secara sistematik, Hukum Lambert-Beer dapat dinyatakan dengan persamaan berikut.

A = - log T = log = ε . b . c Dimana:

A = absorbansi T = transmitansi

I0 = intensitas cahaya masuk

It = intensitas cahaya yang diteruskan oleh larutan sampel

ε = absorbtivitas molar (Lmol-1cm-1)

b = ketebalan lapisan larutan sampel (panjang jalur absorbsi) (cm) c = konsentrasi sampel (mol L-1)

Agar dapat menentukan kadar gula reduksi pada sampel, terlebih dahulu dibuat kurva standar menggunakan larutan glukosa. Kurva standar dibuat dengan mengalurkan absorbansi pada panjang gelombang 540 nm dengan konsentrasi larutan standar (Adney and Baker, 2008). Dari kurva standar tersebut akan didapatkan persamaan garis, yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi dan absorbansi dengan persamaan umum:

y = ax + b, dimana y merupakan absorbansi, a merupakan slope, x

merupakan konsentrasi sampel, dan b merupakan intersep. Dengan mensubstitusi nilai absorbansi sampel ke persamaan tersebut dan kemudian diplotkan terhadap kurva standar, maka dapat diketahui konsentrasi atau kadar gula reduksi pada sampel.

H. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) adalah salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metodeanalisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diamcairan atau padat. KCKT merupakan suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair untuk pemisahan sekaligus untuk analisis senyawa berdasarkan kekuatan atau kepolaran fasa geraknya.

Berdasarkan polaritas relatif fasa gerak dan fasa diamnya, KCKT dibagi menjadi dua, yaitu fasa normal yang umumnya digunakan untuk identifikasi senyawa nonpolar sehingga fasa gerak yang digunakan kurang polar dibandingkan fasa diam dan fasa terbalik yang umumnya digunakan untuk identifikasi senyawa polar, menggunakan fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam (Gritter dkk, 1991). Prinsip pemisahan senyawa menggunakan KCKT adalah perbedaan distribusi komponen diantara fasa diam dan fasa geraknya. Semakin lama

Gambar 5. Diagram alat HPLC (Clark, 2007).

Pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) efisiensi waktu dan tingkat kemurnian senyawa yang akan diisolasi dapat dilakukan dengan cepat dan maksimal. Hal ini terkait dari beberapa kelebihan dari teknik KCKT yang digunakan (Johnson dan Stevenson, 1991; Snyder and Kirkland, 1979). Kelebihan itu antara lain :

a. Cepat : waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikan sekitar 15-30 menit, bahkan untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated) dapat dicapai waktu kurang dari 5 menit.

b. Resolusi : berbeda dengan kromatografi gas (KG), kromatografi cair

mempunyai dua fasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.

c. Sensitivitas detektor : detektor absorpsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari

bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluorosensi dan Elektrokimia dapat 34 mendeteksi sampai picogram (10-12 gram). Dan beberapa detektor lain juga dapat digunakan dalam KCKT seperti spektrofotometer massa, Indeks refraksi, ELSD dan lain sebagainya.

d. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali. Hal ini disebabkan karena keseluruhan sampel yang disuntikkan kedalam kolom dapat terdorong keluar oleh tekanan yang tinggi.

e. Mudah rekoveri sampel : umumnya detektor yang digunakan dalam KCKT tidak menebabkan destruktif (kerusakan) terhadap komponen sampel yang diananlisis, oleh karena itu sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detektor. Pelarutnya dapat dihilangkan dengan cara

menguapkannya.

Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan salah satu metode pemisahan yang memanfaatkan teknologi dalam proses pemisahan suatu senyawa campuran atau suatu analit.

Secara umum metoda kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai prinsip kerja yang sama seperti kromatografi kolom, dimana proses pemisahan senyawa terjadi akibat adanya keseimbangan distribusi antara zat terlarut (sampel) yang di

adsorbsi adsorben dan pelarut yang mengalir melewati kolom. Hal yang

membedakan sistem kromatografi ini adalah proses pemisahan komponen sampel di dalam kolom dilakukan pada sistem tekanan tinggi dengan tingkat ukuran partikel fasa diam yang diperkecil dan tingkat sensitifitas pemisahan dapat

menggunakan beberapa macam detektor yang dapat diganti. Metode kromatografi kinerja tinggi sangat efisien untuk memisahkan campuran senyawa yang memiliki sifat yang hampir sama.

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Maret sampai bulan Agustus 2013 di Laboratorium Instrumentasi dan Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, pH meter,

shaker inkubator (inkubator goyang), autoklaf model S-90N, Laminar air flow

CRUMA model 9005-FL, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) KNAUER HPLC FLD & RID, Inkubator P-Selecta, spektrofotometer UV-VIS Hitachi U-2010, oven, lemari pendingin, magnetic stirrer, penangas air, jarum ose, kertas saring, Erlenmeyer, cawan petri, mikropipet, tabung reaksi dan peralatan umum laboratorium lainnya.

Bahan-bahan yang digunakan adalah jerami padi hasil bio-pretretment dengan ukuran ± 40 mesh, Isolat Actinomycetes Acp-1 dan AcP-7, medium YMA (Yeast Malt Agar), media inokulum YM (Yeast Malt), (jerami padi, yeast ekstrak,

Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, larutan mineral), buffer

fosfat, buffer sitrat-fosfat, DNS, akuades, NaCl, antibiotik (Nistatine dan

Streptomycine), bircwood xylan (Sigma Chemical Co.), CMC (Sigma Chemical Co), asam asetat glasial 80%, asam nitrat pekat dan kertas saring.

C. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Inokulum

Inokulum isolat actinomycetes AcP-1 dan Acp-7 dibuat menggunakan media yeast maltosa cair (YM) dengan komposisi 4 g ekstrak khamir ditambahkan 10 g ekstrak malt dan 15 g glukosa dalam 1 liter media, kemudian disterilkan pada suhu 121ºC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Ke dalam 10 mL media inokulum diinokulasikan 1 ose isolat dan dinkubasi selama 96–120 jam hingga jumlah sel mencukupi.

2. Optimasi Fermentasi Substrat Jerami

Sebanyak 10 mL inokulum isolat Actinomycetes Acp-1 dan AcP-7 yang telah ditumbuhkan pada media YM selama 96–120 jam diinokulasikan ke dalam media fermentasi steril yang berisi 10 g substrat jerami padi hasil bio-pretreatment dengan ukuran ± 40 mesh, yang telah ditambahkan dengan 30 mL buffer fosfat sebagai moisture (pelembab) dengan membuat variasi pH media masing-masing pH: 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5, kemudian diinkubasi sampai dengan 21 hari (Beg et al., 2000). Kultur dilakukan

dengan menggunakan wadah kaca dengan memperhatikan sisa ruang di atasnya untuk memberikan suasana fakultatif aerobik. Hal yang harus diperhatikan dalam fermentasi adalah perubahan substrat jerami secara fisik hingga semua substrat terdekomposisi untuk mendapatkan gambaran kondisi fermentasi yang ideal. Setiap selang waktu 3 hari dilakukan pemanenan dengan menambahkan 100 mL akuades yang telah disterilkan dan disaring untuk memisahkan filtratnya untuk diamati beberapa

parameter fermentasi yang diuraikan pada prosedur 3.

3. Pengukuran Parameter Fermentasi

3.1. Pengukuran Kadar Selulosa

Sebanyak 1 g substrat jerami padi hasil bio-pretreatment berukuran ± 40 mesh dimasukkan ke dalam labu bundar, tambahkan 15 mL asam asetat 80% dan 1,5 mL asam nitrat 14 M, kemudian direfluks selama 20 menit. Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring Whatman No. 91 yang telah diketahui bobotnya (A). Setelah dilakukan penyaringan, padatan hasil dari refluks dicuci dengan etanol. Erlenmeyer dan corong dibilas dengan air suling sebanyak 3 kali. Kertas saring beserta residu dikeringkan pada oven dengan suhu 100-105oC selama 1-2 jam. Kertas saring didinginkan dan ditimbang bobotnya (B). Kertas saring dengan residu diabukan pada suhu 540oC, lalu didinginkan dan ditimbang bobotnya (C).

Keterangan :

B = Bobot kertas saring dan residu setelah dioven (g) A = Bobot kertas saring (g)

C = Bobot abu (g) (Soest and Wine, 1967)

3.2. Pengukuran Aktivitas Enzim Selulase

Aktivitas selulase diujikan dengan melihat aktivitas endoglukanase dengan pengujian enzim pada substrat karboksimetil selulosa (CMC, Sigma). Sebanyak 1 mL substrat 0,5% CMC ditambahkan 0,9 mL 0,02 M buffer fosfat pH optimum. Kemudian larutan ini ditambahkan 0,1 mL filtrat hasil fermentasi (ekstrak kasar enzim) dihomogenisasi dan diinkubasi pada suhu 30oC selama 30 menit lalu ditambahkan 2 mL pereaksi DNS dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Kontrol: sebanyak 1 mL substrat 0,5% karboksimetil selulosa (CMC, sigma) ditambahkan 0,9 mL 0,2 M buffer fosfat pH optimum lalu diinkubasi pada suhu 30oC selama 30 menit. Kemudian ditambahkan 0,1 mL ekstrak enzim dan 2 mL filtrat hasil fermentasi dan 2 mL pereaksi DNS dan segera

dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi masing-masing larutan dilakukan

pada λ 540 nm (Miller, 1959).

Satu unit aktivitas enzim selulase didefinisikan sebagai jumlah 1 µ mol glukosa yang dihasilkan per menit untuk setiap mL enzim pada

Keterangan :

V = Volume sampel (mL) FP = Faktor pengenceran (g)

4. Pengukuran Hasil Produk Fermentasi

4.1. Pengukuran Gula Pereduksi Total dengan Metode DNS Sebanyak 2 mL filtrat hasil fermentasi dihomogenisasi lalu

ditambahkan 2 mL pereaksi DNS dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang. Pengukuran absorbansi masing-masing larutan dilakukan pada λ 540 nm (Miller, 1959).

4.2. Pengukuran Produk Fermentasi dengan KCKT

Filtrat dianalisis dengan menggunakan KCKT pada kondisi reaksi sebagai berikut :

- Kolom : Karbohidrat

- Detektor : Indeks bias

- Pelarut : Akuabides

- Konsentrasi Standar : 400 ppm - Volume injeksi : 10-20 µL - Temperatur kolom : Suhu ruang Standar yang digunakan adalah glukosa dan xilosa.

5. Pembuatan Media

5.1. Pembuatan media YMA (Yeast Malt Agar)

Medium YMA terdiri dari 4 g ekstrak khamir, 10 g ekstrak malt, 15 g glukosa, 15 g agar-agar per 1 liter media, diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC dan tekanan 2 atm, kemudian ditambahkan dengan 50 µg/L Nistatine dan 25 µg/L Streptomycine.

5.2. Pembuatan media inokulum YM (Yeast Malt)

Medium YM terdiri dari 4 g ekstrak khamir, 10 g ekstrak malt dan 15 g glukosa dalam 1 liter media, kemudian diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC dan tekanan 2 atm.

5.3. Pembuatan media fermentasi

Sebanyak 10 g jerami padi dan buffer fosfat dengan variasi pH 6, 7 dan 8, serta perbandingan substrat: volume yaitu 1:1, 1:2 dan 1:3, kemudian diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC dengan tekanan 1 atm (Yamac dan Tamer, 2008).

6. Pembuatan Pereaksi

6.1. Pembuatan Buffer Fosfat

6.1.1. Larutan Stok A (NaH2PO4·2H2O 0,2 M)

Sebanyak 27,8 g NaH2PO4·2H2O dilarutkan dengan air suling

6.1.2. Larutan Stok B (Na2HPO4·2H2O 0,2 M)

Sebanyak 35,6 g Na2HPO4·2H2O dilarutkan dengan air suling

hingga volume 1000 mL.

6.2. Pembuatan Buffer Sitrat-Fosfat

6.2.1. Larutan Stok A (Asam Sitrat 0,1 M)

Sebanyak 19,21 g asam sitrat dilarutkan dengan air suling hingga volume 1000 mL.

6.2.2. Larutan Stok B (Na2HPO4·2H2O 0,2 M)

Sebanyak 35,6 g Na2HPO4·2H2O dilarutkan dengan air suling

hingga volume 1000 mL.

6.3. Pembuatan Pereaksi DNS

Larutan A : 3 g NaOH; 0,6 g fenol; 3 g DNS dalam 240 mL air suling. Larutan B : 0,25 g Na-sulfit; 2 g Na-K-tartarat dan 5 mL air suling. Sebanyak 3 mL larutan B ditambahkan pada 240 mL larutan A dan ditambahkan air suling hingga volume 300 mL.

6.4. Pembuatan NaCl 0,85%

Sebanyak 0,85 g NaCl dilarutkan dengan air suling hingga volume 100 mL.

7. Pembuatan Kurva Standar Glukosa

Konsentrasi gula pereduksi diperoleh dengan menggunakan kurva standar glukosa pada konsentrasi 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 dan 5,0

mg/mL. Sebanyak 2 mL larutan standar ditambahkan 2 mL pereaksi DNS dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang. Absorbansi larutan dibaca menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada λ 540 nm. Hasil yang diperoleh diplotkan untuk mempeoleh kurva regresi linier dengan absorbansi sebagai y dan konsentrasi larutan standar sebagai sumbu x.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa : 1. Kondisi fermentasi optimum didapat pada waktu 12 hari dan pH 7,5 ditinjau dari

aktivitas selulase tertinggi.

2. Karakterisasi parameter-parameter hasil fermentasi dilihat pada kondisi optimum : a. Pengukuran kadar selulosa yang hilang untuk isolat AcP-1 sebesar 10,595 %

dan 10,580 % untuk isolat AcP-7.

b. Pengukuran aktivitas enzim selulase untuk isolat AcP-1 sebesar 1,164 U/mL dan 0,997 U/mL untuk isolat AcP-7.

3. Hasil produk fermentasi berdasarkan kondisi optimum yang didapat : a. Pengukuran gula pereduksi total dengan metode DNS untuk isolat AcP-1

sebesar 15,134 mg/mL dan sebesar 14,803 mg/mL untuk isolat AcP-7.

b. Pengukuran glukosa dengan metode KCKT menunjukkan waktu retensi untuk isolat AcP-1 pada 8,911 menit dan untuk isolat AcP-7 pada 8,904 menit.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh pada penelitian ini, maka untuk penelitian selanjutnya disarankan untuk menggunakan metode fermentasi bertahap agar mendapatkan hasil yang lebih optimum dan mempelajari lebih lanjut karakter enzim selulase yang dihasilkan oleh Actinomycetes AcP-1 dan AcP-7 pada media jerami padi hasil bio-pretreatment sehingga dapat menghasilkan produk fermentasi yang lebih bermanfaat seperti bio-etanol, asam sitrat, asam glutamat dan produk fermentasi lain yang lebih bermanfaat.

DAFTAR PUSTAKA

Abe, S., Horii, S., and Kameoka, K. 1979. Application of enzymatic analysis with glucoamylase, pronase and cellulase to various fedds for cattle. Journal of Animal Science. 48: 1483-1490.

Adney, B., and Baker, J. 2008. Measurement of Cellulase Activities-Laboratory Analytical Procedur (LAP). Technical Report.

Alexander, M. 1961. Introduction to Soil Microbiology. 1nd ed. New York: J Wiley and Sons.

Alexander, M. 1977. Introduction of soil Microbiology. 2nd ed. New York: J Wiley and Sons.

AL-Tai, A.M., Abdul-Razzak S., Al-Ittiyah, S.S., Abdul-Noer, B.A. 1989. Cellulase Production from Actinomycetes isolated from iraqi soils: II. cel growth and cellulase activity of Streptomycetes sp. strain AT7 at different temperature. Journal of Islamic Academy of Science. 2: 185-188.

Aziz, A.A., Husin, M., and Mokhtar, A. 2002. Preparation of cellulose from oil palm empty fruit bunches via ethanol digestion: effect of acid and alkali catalysts.Journal of Oil Palm Research. 14: 9-14.

Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, K., Hoondal, G.S. 2000. Microbial Xylanases and their industrial applications. Journal of Appl Microbiol Biotechnol. 56: 326-338.

Belitz, H.D., Grosch, W., and Schieberle, P. 2008. Food Chemistry, 4th ed. Berlin: Springer-Verlag. 327-337.

Clark, J. 2007. Kromatografi Cair kinerja Tinggi (HPLC). http://www.Chem-is-try.org. [10 September 2011].

Dashtban. 2009. Fungal Bioconversion of Lignocellulosic Residue: Opportunities and Perspectives. Journal of Biology Science. 17: 578-595.

Datta, R. 1981. Acidogenic fermentation of lignocellulose-acid yield and conversionof components. Biotechnol and Bioeng. 3: 2167-2170.

Davies, F.L., and Williams, S.T. 1970. Studies on the ecology of Actinomycetes in soil. I. The occurrence and distribution of Actinomycetes in a pine forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 2: 227-238.

Doi, R.H., Kosugi, A., Murashima, K., Tamaru, Y., and Han, S.O. 2003. Cellulosomes from Mesophilic Bacteria. Journal of Bacteriol. 185: 907-4914.

Efendy, D.L.P. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.

http://epository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf. [22 April 2011].

Ekawati, I. 2008. Dekomposisi Komponen Lignoselulosa Jerami Padi Oleh Beberapa Isolat Bakteri. Jurnal Natural 7.

Elberson, M.A., Malekzadeh, F., Yazdi, M.T., Kameranpour, N., Noori-Dloii, M.R., Matte, M.H., Shahamat, M., Colwell, R.R., and Sowers, K.R. 2000.

Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soil.

International Journal on Systematic and Evolution Microbiology. 50: 993-996.

Fan, L.T., Lee, Y.H., and Gharpuray, M.M. 1982. The Nature of Lignocellulosics and Their Pretreatment for Enzymatic Hydrolysis. Advances in Bichemical. Engineering. 23: 158–187.

Fithria, N. 2007. Uji Antibakteri Isolat Actinomycetes dari Callispongia sp. yang Terdapat Di Pulau Tegal dan Pulau Tangkil Perairan Teluk Lampung.

[Skripsi] Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung. George, S.P. 2001. Molecular and Biochemical Aspects of extremophilic Actinomycetes. Division of Biochemical Sciences National Chemical Laboratory Pune. India.

Gritter. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung. 34-35, 186.

Gritter, R.J., Bobbit, J.M., and Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi. 2nd ed. ITB. Bandung. 108-109, 160-179.

Hakim, L.I. 2009. Studi Hidrolisis Selulosa Jerami Padi Menggunakan

Actinomycetes Isolat Lokal. [Skripsi] Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Hamelinck, C.N., Hooijdonk, Gv., Faaij, A.P.C. 2005. Ethanol from

lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass and Bioenergy. 28: 384-410.

Han, S.J., Yoo, Y.J., Kang, H.S. 1995. Characterizatin of Bifunctional Cellulase and its Structural Gene. Journal of Biological Chemistry. 270: 26012-26019.

Holker, U., Hofer, M., and Lenz, J. 2004. Biotechnological advantages of laboratory-scale solid state fermentation with fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 64: 175–186.

Howard, R.L., Abosti, E., Rensburg, E.L.Jv., Howard, S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal Biotechnology. 2: 602-619.

Jhonson, E.L., and Stevenson, R. 1991. Dasar-dasar Kromatografi Cair. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. ITB. Bandung. 50-55.

Jiang, C.L., and Xu, L.H. 1985. Isolation methods for study of actinomycete population. Microbiology. 12: 218-220.

Jiang, C.L., Xu, L.H., and Guo, G.Y. 1988. The investigation on actinomycete population and resources in some areas in Yunnan. V. The actinomycetes in the frigid mountains. Acta Microbiologica Sinica. 28: 198-205.

Kosaric, N., Wieczorek, A., Cosentino, G.P., Magee, R.J., and Prenosil, J.E. 1983. Ethanol fermentation. In Biotechnology. H.-J. Rehm & G. Ree, H. Dellweg. Verlag Chemie, Weinheim. 3: 257-385.

Kowalski, S., Marcin L., and Wiktor, B. 2013. Applicabality of Physico-chemical Parameters of Honey for Identification of The Botanical Origin. Acta Scientiarum Polonorum. 2: 51-59.

Kusmiati dan Agustini N.W.S. 2010. Pemanfaatan Limbah Onggok untuk Produksi Asam Sitrat dengan Penambahan Mineral Fe dan Mg pada Substrat Menggunakan Kapang Trichoderma Sp dan Aspergillus Niger.

Seminar Nasional Biologi. 856-866.

Lechevalier, M.P., and Lechevalier, H.A. 1980. The chemotaxonomy of Actinomycete. In: Dietz, A. and W.D. Thayer ed. Actinomycetes

Taxonomy. Special publication no. 6. Arlington, Va.: Society for Industrial Microbiology.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Alih Bahasa oleh Maggy Thenawijaya. Erlangga. Jakarta. 235-277.

Lone, M.A., Wani, M.R., Bhat N.A., Sheikh, S.A., and Reshi, M.A. 2012. Evaluation of Cellulase Enzyme Secreted by Some Common and Stirring Rhizosphere Fungi of Juglans Regia L. by DNS Method. Journal of Enzyme Research. 3: 18-22.

Maranatha, B. 2008. Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia Pada Berbagai Substrat Limbah Pertanian. [Skripsi] Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Mathews, Hv. and Ahern. 2000. Biochemistry, 3rd Edition. San Francisco.

Benjamin/Cummings. 278-310.

Miller, G.L. 1952. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Analytical Chemistry. 31: 426-428.

Mitchel, D., Krieger, N., and Berovic, M. 2006. Solid-State Fermentation Bioreactors. Springer-Verlag Berlin. Heidelberg.

Moore, H.K. 1919. Process of Making Ethyl Alcohol from Wood.United State of America. 217: 323-540.

Moo-Young, M., Moriera, A., and Tengerdy, R. 1983. Principles of solid state fermentation, Dalam The Filamentous Fungi, Fungal Technology.

London: JE Smith, DR Berry, & B Kritiansen , Edward Arnold.

Nakase, T., Matofumi, S., Masako, T., Makiko, H., Takushi, H., and Sakuzo, F. 1994. A taxonomic study on cellulolytic yeasts and yeast-like

microorganisms isolated in Japan I. Ascomycetous yeasts genera Candida and Williopsis, and a yeast-like genus Prototheca. Journal ofGenetical Applied Microbiology. 40: 519-531.

Noermala, S.R., Purbowatiningrum, R.S., Nies, S.M. 2013. Aktivitas Fusarium oxysporum dalam Menghidrolisis Enceng Gondok (Eichhornia crassipes) dengan Variasi Temperatur. 1: 220-225.

Nonomura, H., and Ohara, Y. 1969. Distribution of soil actinomycetes. The isolation and classification of genus Streptosporangium. Journal of Fermentation Technology. 38: 405-709.

Nonomura, H., and Ohara, Y. 1971. Distribution of soil actinomycetes. Green spore group of Microtetraspora, its preferential isolation and taxonomic characteristics. 49: 1-912.

Onsori, H., Zamani, M.R., Motalebbi, M. 2005. Identification of Over Producer Strain of endo- β-1,4-gluconase in Aspergillus Species; Characterization

of Crude Carboxymethyl Cellulose. African Journal of Biotechnology. 41:

26-30.

Pandey, A., Ricardo, C., and Larroche, C. 2008. Current Developments in Solid-state Fermentation. Asiatech Publishers, INC. New Delhi.

Pasti, M.B., Pametto, A.L., Nuti, M.P., Crawford, D.L. 1990. Lignin-Solubilizing Ability of Actinomycetes Isolated from Termite (Termitidae) Gut. App. And Env. Microb. 56: 2213-2218.

Paul, E.A., and Clark, F.E. 1989. Soil Microbiology and Biochemistry. 2nd ed.

Academic. London.

Perez, J., Munoz-Dorado, J., Rubia, Td., Martinez, J. 2002. Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview.

Int. Microbiol. 5: 53-63.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta. 427. Ramachandra, M., Crawford, D.L., Pametto, A.L. 1987. Extracellular enzyme

activities during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type genetically manipulated strains. App. And Env. Microb. 53: 2754-2760.

Rao, N.S.S. 1994. Soil Microorganisms and Plant Growth. Oxford and IBM Publishing Co. London.

Rimbani, M. 2013. Optimasi Bio-Pretreatment Jerami Padi Secara Fermentasi Fase Padat Oleh Isolat ActinomycetesAcP-1 dan AcP-7. [Skripsi] Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Saha, B.C. 2004. Lignocellulose Biodegradation and Application in Biotechnology. US Government Work. American Chemical Society. 2-14. Salam, dan Gunarto. 1999. Enzim Selulase Dari Trichoderma spp. Jurnal

Mikrobiologi Indonesia. 2.

Sanchez, O.J., and Cardona, C.A. 2007. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks., Bioresource Technology, p. doi: 10.1016/jbiortech.2007.11.013 Article in Press.

Sjostrom, E. 1995. Kimia Kayu, Dasar-Dasar dan Penggunaan. 2nd ed. Sastrohamidjojo H, penerjemah. Gadjah Mada University. Yogyakarta. Snyder, L.R., and Kirkland, J.J. 1979. Introduction to Modern Liquid

Chromatography. 2nd ed. New York: J Wiley and Sons.

Taherzadeh, M., and Karimi, K. 2008. Pretreatment of lignocellulosic waste to improve ethanol and biogas production. International Journal Molecular Science. 9: 1621-1651.

Takagi, M., Abe, S., Suzuki, G., Emert, G., and Yata, N. 1977. A method for production of alcohol direct from cellulose using cellulase and yeast. Proceedings of the Bioconversion Symposium IIT, Delhi. 551-571.

Soest, P.Jv., and Wine, R.H. 1967. Use of detergents in the analysis of fibrous feed. IV. Determination of plant cell-wall contituents. Journal of the Association Analytical Chemist. 50: 50-55.

Wendish, F.K., and Kurtzner, H.J. 1992. Role of Streptomycetaceae in biodegradation. The Procaryotes, A Handbook on The Bacteria:

Ecophysiology, Isolaton, Identification, Application. Springer-Verlag. 2nd ed. New York: Balow A, Truper H, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH. Winarno, F.G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. PT Gramedia Pustaka Utama.

Jakarta. 224.

Woiciechowski, A.L., Nitsche S., Pandey A., and Soccol, C.R. 2002. Acid and Enzymatic Hydrolysis to Recover Reducing Sugar from Cassava Baggase: An Economic Study. Brazilian Archieves of Biology and Technology, An International Journal. 45: 393-400.

Woldron, Jr.C.R., Becker-Vallone, C.A., Eveleigh, D.E. 1986. Isolation and characterization of cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. Applied Microbiology Biotechnol. 24: 477-486.

Wyman, C.E. 2002. Potential Synergies and Challenges in Refining Cellulosic Biomass to Fuels. Biotechnol Progress.

Xu, L.H., Li, Q.R., and Jiang, C.L. 1996. Diversity of soil Actinomycetes in Yunnan, China. Applied Environmental Microbiology. 62: 244-248. Yamac, M., and Tamer, A.U. 2008. Lignin degradation and acid precipitable

polymeric lignin (APPL) accumulation by selected Streptomyces strain in submerged and solid state culture system. JABS. 2: 55-61.

Zhang, Y.H.P., Himmel, M.E., and Mielenz, J.R. 2006. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 24: 452-481.

DAFTAR PUSTAKA

Abe, S., Horii, S., and Kameoka, K. 1979. Application of enzymatic analysis with glucoamylase, pronase and cellulase to various fedds for cattle. Journal of Animal Science. 48: 1483-1490.

Adney, B., and Baker, J. 2008. Measurement of Cellulase Activities-Laboratory Analytical Procedur (LAP). Technical Report.

Alexander, M. 1961. Introduction to Soil Microbiology. 1nd ed. New York: J Wiley and Sons.

Alexander, M. 1977. Introduction of soil Microbiology. 2nd ed. New York: J Wiley and Sons.

AL-Tai, A.M., Abdul-Razzak S., Al-Ittiyah, S.S., Abdul-Noer, B.A. 1989. Cellulase Production from Actinomycetes isolated from iraqi soils: II. cel growth and cellulase activity of Streptomycetes sp. strain AT7 at different temperature. Journal of Islamic Academy of Science. 2: 185-188.

Aziz, A.A., Husin, M., and Mokhtar, A. 2002. Preparation of cellulose from oil palm empty fruit bunches via ethanol digestion: effect of acid and alkali catalysts. Journal of Oil Palm Research. 14: 9-14.

Beg, Q.K., Kapoor, M., Mahajan, K., Hoondal, G.S. 2000. Microbial Xylanases and their industrial applications. Journal of Appl Microbiol Biotechnol. 56: 326-338.

Belitz, H.D., Grosch, W., and Schieberle, P. 2008. Food Chemistry, 4th ed. Berlin: Springer-Verlag. 327-337.

Clark, J. 2007. Kromatografi Cair kinerja Tinggi (HPLC). http://www.Chem-is-try.org. [10 September 2011].

Dashtban. 2009. Fungal Bioconversion of Lignocellulosic Residue: Opportunities and Perspectives. Journal of Biology Science. 17: 578-595.

Datta, R. 1981. Acidogenic fermentation of lignocellulose-acid yield and conversionof components. Biotechnol and Bioeng. 3: 2167-2170.

Davies, F.L., and Williams, S.T. 1970. Studies on the ecology of Actinomycetes in soil. I. The occurrence and distribution of Actinomycetes in a pine forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 2: 227-238.

Doi, R.H., Kosugi, A., Murashima, K., Tamaru, Y., and Han, S.O. 2003. Cellulosomes from Mesophilic Bacteria. Journal of Bacteriol. 185: 907-4914.

Efendy, D.L.P. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi.

http://epository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasi-effendy2.pdf. [22 April 2011].

Ekawati, I. 2008. Dekomposisi Komponen Lignoselulosa Jerami Padi Oleh Beberapa Isolat Bakteri. Jurnal Natural 7.

Elberson, M.A., Malekzadeh, F., Yazdi, M.T., Kameranpour, N., Noori-Dloii, M.R., Matte, M.H., Shahamat, M., Colwell, R.R., and Sowers, K.R. 2000. Cellulomonas persica sp. nov. and Cellulomonas iranensis sp. nov., mesophilic cellulose-degrading bacteria isolated from forest soil.

International Journal on Systematic and Evolution Microbiology. 50: 993-996.

Fan, L.T., Lee, Y.H., and Gharpuray, M.M. 1982. The Nature of Lignocellulosics and Their Pretreatment for Enzymatic Hydrolysis. Advances in Bichemical. Engineering. 23: 158–187.

Fithria, N. 2007. Uji Antibakteri Isolat Actinomycetes dari Callispongia sp. yang Terdapat Di Pulau Tegal dan Pulau Tangkil Perairan Teluk Lampung. [Skripsi] Jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung. George, S.P. 2001. Molecular and Biochemical Aspects of extremophilic Actinomycetes. Division of Biochemical Sciences National Chemical Laboratory Pune. India.

Gritter. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung. 34-35, 186.

Gritter, R.J., Bobbit, J.M., and Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi. 2nd ed. ITB. Bandung. 108-109, 160-179.

Hakim, L.I. 2009. Studi Hidrolisis Selulosa Jerami Padi Menggunakan

Actinomycetes Isolat Lokal. [Skripsi] Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Hamelinck, C.N., Hooijdonk, Gv., Faaij, A.P.C. 2005. Ethanol from

lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and long-term. Biomass and Bioenergy. 28: 384-410.

Han, S.J., Yoo, Y.J., Kang, H.S. 1995. Characterizatin of Bifunctional Cellulase and its Structural Gene. Journal of Biological Chemistry. 270: 26012-26019.

Holker, U., Hofer, M., and Lenz, J. 2004. Biotechnological advantages of laboratory-scale solid state fermentation with fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 64: 175–186.

Howard, R.L., Abosti, E., Rensburg, E.L.Jv., Howard, S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African Journal Biotechnology. 2: 602-619.

Jhonson, E.L., and Stevenson, R. 1991. Dasar-dasar Kromatografi Cair. Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. ITB. Bandung. 50-55.

Jiang, C.L., and Xu, L.H. 1985. Isolation methods for study of actinomycete population. Microbiology. 12: 218-220.

Jiang, C.L., Xu, L.H., and Guo, G.Y. 1988. The investigation on actinomycete population and resources in some areas in Yunnan. V. The actinomycetes in the frigid mountains. Acta Microbiologica Sinica. 28: 198-205.

Kosaric, N., Wieczorek, A., Cosentino, G.P., Magee, R.J., and Prenosil, J.E. 1983. Ethanol fermentation. In Biotechnology. H.-J. Rehm & G. Ree, H. Dellweg. Verlag Chemie, Weinheim. 3: 257-385.

Kowalski, S., Marcin L., and Wiktor, B. 2013. Applicabality of Physico-chemical Parameters of Honey for Identification of The Botanical Origin. Acta Scientiarum Polonorum. 2: 51-59.

Kusmiati dan Agustini N.W.S. 2010. Pemanfaatan Limbah Onggok untuk Produksi Asam Sitrat dengan Penambahan Mineral Fe dan Mg pada Substrat Menggunakan Kapang Trichoderma Sp dan Aspergillus Niger. Seminar Nasional Biologi. 856-866.

Lechevalier, M.P., and Lechevalier, H.A. 1980. The chemotaxonomy of Actinomycete. In: Dietz, A. and W.D. Thayer ed. Actinomycetes

Taxonomy. Special publication no. 6. Arlington, Va.: Society for Industrial Microbiology.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Alih Bahasa oleh Maggy Thenawijaya. Erlangga. Jakarta. 235-277.

Lone, M.A., Wani, M.R., Bhat N.A., Sheikh, S.A., and Reshi, M.A. 2012. Evaluation of Cellulase Enzyme Secreted by Some Common and Stirring Rhizosphere Fungi of Juglans Regia L. by DNS Method. Journal of Enzyme Research. 3: 18-22.

Maranatha, B. 2008. Aktivitas Enzim Selulase Isolat Asal Indonesia Pada Berbagai Substrat Limbah Pertanian. [Skripsi] Departemen Biologi FMIPA Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Mathews, Hv. and Ahern. 2000. Biochemistry, 3rd Edition. San Francisco. Benjamin/Cummings. 278-310.

Miller, G.L. 1952. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Analytical Chemistry. 31: 426-428.

Mitchel, D., Krieger, N., and Berovic, M. 2006. Solid-State Fermentation Bioreactors. Springer-Verlag Berlin. Heidelberg.

Moore, H.K. 1919. Process of Making Ethyl Alcohol from Wood.United State of America. 217: 323-540.

Moo-Young, M., Moriera, A., and Tengerdy, R. 1983. Principles of solid state fermentation, Dalam The Filamentous Fungi, Fungal Technology. London: JE Smith, DR Berry, & B Kritiansen , Edward Arnold.

Nakase, T., Matofumi, S., Masako, T., Makiko, H., Takushi, H., and Sakuzo, F. 1994. A taxonomic study on cellulolytic yeasts and yeast-like

microorganisms isolated in Japan I. Ascomycetous yeasts genera Candida and Williopsis, and a yeast-like genus Prototheca. Journal of Genetical Applied Microbiology. 40: 519-531.

Noermala, S.R., Purbowatiningrum, R.S., Nies, S.M. 2013. Aktivitas Fusarium oxysporum dalam Menghidrolisis Enceng Gondok (Eichhornia crassipes) dengan Variasi Temperatur. 1: 220-225.

Nonomura, H., and Ohara, Y. 1969. Distribution of soil actinomycetes. The isolation and classification of genus Streptosporangium. Journal of Fermentation Technology. 38: 405-709.

Nonomura, H., and Ohara, Y. 1971. Distribution of soil actinomycetes. Green spore group of Microtetraspora, its preferential isolation and taxonomic characteristics. 49: 1-912.

Onsori, H., Zamani, M.R., Motalebbi, M. 2005. Identification of Over Producer Strain of endo- β-1,4-gluconase in Aspergillus Species; Characterization of Crude Carboxymethyl Cellulose. African Journal of Biotechnology. 41: 26-30.

Pandey, A., Ricardo, C., and Larroche, C. 2008. Current Developments in Solid-state Fermentation. Asiatech Publishers, INC. New Delhi.

Pasti, M.B., Pametto, A.L., Nuti, M.P., Crawford, D.L. 1990. Lignin-Solubilizing Ability of Actinomycetes Isolated from Termite (Termitidae) Gut. App. And Env. Microb. 56: 2213-2218.

Paul, E.A., and Clark, F.E. 1989. Soil Microbiology and Biochemistry. 2nd ed. Academic. London.

Perez, J., Munoz-Dorado, J., Rubia, Td., Martinez, J. 2002. Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int. Microbiol. 5: 53-63.

Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Universitas Indonesia. Jakarta. 427. Ramachandra, M., Crawford, D.L., Pametto, A.L. 1987. Extracellular enzyme

activities during lignocellulose degradation by Streptomyces spp.: a comparative study of wild-type genetically manipulated strains. App. And Env. Microb. 53: 2754-2760.

Rao, N.S.S. 1994. Soil Microorganisms and Plant Growth. Oxford and IBM Publishing Co. London.

Rimbani, M. 2013. Optimasi Bio-Pretreatment Jerami Padi Secara Fermentasi Fase Padat Oleh Isolat Actinomycetes AcP-1 dan AcP-7. [Skripsi] Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Saha, B.C. 2004. Lignocellulose Biodegradation and Application in Biotechnology. US Government Work. American Chemical Society. 2-14. Salam, dan Gunarto. 1999. Enzim Selulase Dari Trichoderma spp. Jurnal

Mikrobiologi Indonesia. 2.

Sanchez, O.J., and Cardona, C.A. 2007. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks., Bioresource Technology, p. doi: 10.1016/jbiortech.2007.11.013 Article in Press.

Sjostrom, E. 1995. Kimia Kayu, Dasar-Dasar dan Penggunaan. 2nd ed. Sastrohamidjojo H, penerjemah. Gadjah Mada University. Yogyakarta. Snyder, L.R., and Kirkland, J.J. 1979. Introduction to Modern Liquid

Chromatography. 2nd ed. New York: J Wiley and Sons.

Taherzadeh, M., and Karimi, K. 2008. Pretreatment of lignocellulosic waste to improve ethanol and biogas production. International Journal Molecular Science. 9: 1621-1651.

Takagi, M., Abe, S., Suzuki, G., Emert, G., and Yata, N. 1977. A method for production of alcohol direct from cellulose using cellulase and yeast. Proceedings of the Bioconversion Symposium IIT, Delhi. 551-571.

Soest, P.Jv., and Wine, R.H. 1967. Use of detergents in the analysis of fibrous feed. IV. Determination of plant cell-wall contituents. Journal of the Association Analytical Chemist. 50: 50-55.

Wendish, F.K., and Kurtzner, H.J. 1992. Role of Streptomycetaceae in biodegradation. The Procaryotes, A Handbook on The Bacteria:

Ecophysiology, Isolaton, Identification, Application. Springer-Verlag. 2nd ed. New York: Balow A, Truper H, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH. Winarno, F.G. 2004. Kimia Pangan dan Gizi. PT Gramedia Pustaka Utama.

Jakarta. 224.

Woiciechowski, A.L., Nitsche S., Pandey A., and Soccol, C.R. 2002. Acid and Enzymatic Hydrolysis to Recover Reducing Sugar from Cassava Baggase: An Economic Study. Brazilian Archieves of Biology and Technology, An International Journal. 45: 393-400.

Woldron, Jr.C.R., Becker-Vallone, C.A., Eveleigh, D.E. 1986. Isolation and characterization of cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. Applied Microbiology Biotechnol. 24: 477-486.

Wyman, C.E. 2002. Potential Synergies and Challenges in Refining Cellulosic Biomass to Fuels. Biotechnol Progress.

Xu, L.H., Li, Q.R., and Jiang, C.L. 1996. Diversity of soil Actinomycetes in Yunnan, China. Applied Environmental Microbiology. 62: 244-248. Yamac, M., and Tamer, A.U. 2008. Lignin degradation and acid precipitable

polymeric lignin (APPL) accumulation by selected Streptomyces strain in submerged and solid state culture system. JABS. 2: 55-61.

Zhang, Y.H.P., Himmel, M.E., and Mielenz, J.R. 2006. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol. Adv. 24: 452-481.