Produksi Dan Karakterisasi Xilanase Mikroba Yang Diisolasi Dari Tongkol Jagung.

SKRIPSI

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI XILANASE MIKROBA YANG DIISOLASI DARI TONGKOL JAGUNG

Oleh: Inda Setyawati

F24102008

2006

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI XILANASE MIKROBA YANG DIISOLASI DARI TONGKOL JAGUNG

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh: Inda Setyawati

F24102008

2006

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

PRODUKSI DAN KARAKTERISASI XILANASE MIKROBA YANG DIISOLASI DARI TONGKOL JAGUNG

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh: Inda Setyawati

F24102008

Dilahirkan pada tanggal 24 Mei 1984 Di Sabang, Nanggroe Aceh Darussalam

Tanggal lulus: 4 September 2006

Menyetujui, Bogor, September 2006

Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono Pembimbing Skripsi

Mengetahui,

Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc. Ketua Departemen

Inda Setyawati. F24102008. PRODUKSI DAN KARAKTERISASI XILANASE MIKROBA YANG DIISOLASI DARI TONGKOL JAGUNG. Di bawah bimbingan Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono, M.Sc.

RINGKASAN

Enzim penghidrolisis xilan melibatkan dua tipe utama yaitu endo-β -1,4-xilanase (EC. 3.2.1.8) dan β-xilosidase (EC. 3.2.1.37). Enzim-enzim tersebut bekerjasama menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi rantai pendek xilooligosakarida dan xilosa. Xilanase (enzim penghidrolisis xilan) merupakan salah satu enzim yang banyak dimanfaatkan secara luas dalam bidang industri pangan maupun non pangan serta mempunyai dampak positif terhadap lingkungan (clean processing). Xilan (hemiselulosa) yang merupakan substrat xilanase banyak terdapat pada tongkol jagung yaitu sebesar 40 %. Dalam penelitian ini dilakukan isolasi mikroorganisme pendegradasi xilan (hemiselulosa) yang terdapat pada tongkol jagung busuk. Selain itu tongkol jagung itu sendiri dimanfaatkan sebagai substrat kasar (crude) dari mikroorganisme yang diisolasi. Penelitian yang dilakukan merupakan salah satu upaya diversifikasi pemanfaatan produk samping hasil pengolahan jagung.

Penelitian dimulai dengan mengisolasi mikroba penghasil xilanase dari tongkol jagung busuk. Dari hasil pemilahan diperoleh 12 isolat mampu menghasilkan clearing zone pada media yang mengandung oat spelt xylan 0.7 %, salah satu diantaranya adalah isolat yang diberi kode MBXiK4 yaitu memiliki indeks xilanolitik cukup tinggi (5.81) dan aktivitas enzim yang tertinggi (5.29 U/ml (pengukuran I), 1.78 U/ml (pengukuran II)). Isolat lokal yang terbaik tersebut digunakan untuk optimasi kondisi produksi enzim, karakterisasi enzim xilanase dan β-xilosidase. Hasil optimasi produksi oleh isolat MBXiK4 menunjukkan aktivitas enzim tertinggi (11.59 U/ml) terjadi pada hari ketiga, konsentrasi tongkol jagung 1%, dengan kondisi pH 7 dan suhu 37oC. Hasil ini tidak berbeda jauh jika dibandingkan dengan menggunakan substrat oat spelt xylan 0.7 % yang menghasilkan aktivitas enzim tertinggi sebesar 11.37 U/ml pada pH 7 dan suhu 37oC.

Enzim xilanase yang dihasilkan dari isolat MBXiK4 tersebut memiliki karakteristik yang potensial untuk dimanfaatkan bagi industri yang memerlukan suhu tinggi dan pH alkali dalam aplikasinya. Enzim tersebut memiliki suhu optimum 70oC dan masih stabil pada kisaran pH yangg luas yaitu 4-10 (pH tertinggi pada pH 6 dalam bufer fosfat sitrat 100mM). Selama lima jam, enzim xilanase tersebut masih memiliki aktivitas di atas 50 % pada suhu 70oC dan pH 6, sedangkan pada suhu 70oC dan pH 10 enzim hanya mampu bertahan dengan aktivitas di atas 50 % selama satu jam. Berbeda dengan xilanase, β-xilosidase yang dihasilkan tidak memiliki aktivitas yang signifikan, enzim ini hanya memiliki aktivitas optimum pada suhu 37oC dan pH 5.91 yaitu sebesar 13.19 U/ml. Oleh karena itu dapat diperkirakan bahwa enzim xilanolitik utama yang dihasilkan oleh isolat MBXiK4 adalah endoxilanase. Hal ini berpotensi untuk memanfaatkan enzim yang dihasilkan sebagai katalis untuk produksi xilooligosakarida. Analisis SDS-PAGE menunjukkan dugaan berat molekul protein sampel dalam ekstrak enzim hasil pengendapan amonium sulfat adalah

15.1 kDa, 25.4 kDa, 37.2 kDa, 54.5 kDa, 64.2 kDa dan 113.7 kDa. Untuk mengetahui pita manakah yang mempunyai aktivitas xilanase, masih perlu dilakukan analisis zimogram.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sabang pada tanggal 24 Mei 1984. Penulis adalah anak kedua dari tiga bersaudara pasangan Parsilan, S.Ip dan Yunniar. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN Angkasa V pada tahun 1996, kemudian melanjutkan pendidikan di SMPN I Kalijati dan lulus pada tahun 1999. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan ke SMAN I Subang dan lulus pada tahun 2002. Selepas SMA penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) sebagai mahasiswa departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian.

Selama menjalankan pendidikan di IPB penulis sempat menjadi asisten praktikum mata kuliah Analisis Pangan dan mengikuti program Distance Learning (DE) dari Texas A & M University, USA yang berkerjasama dengan SEAFAST CENTER tahun 2006 dan mengambil mata kuliah Food Microbiology. Selain itu juga penulis sempat menjadi pengajar Kimia Dasar di Lembaga Bimbingan Belajar MSC. Kegiatan organisasi yang pernah diikuti penulis diantaranya adalah panitia open house SEAFAST CENTER tahun 2006, panitia BAUR tahun 2004, panitia MPF (Techno F) tahun 2004 dan Lepas Landas Sarjana tahun 2003. Skripsi ini merupakan hasil penelitian penulis sebagai penghargaan bagi peneliti unggul dari Bogasari Nugraha VIII tahun 2005, PT. Indofood Sukses Makmur Tbk.

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Produksi dan Karakterisasi Xilanase Mikroba dari Tongkol Jagung”. Penelitian ini merupakan salah satu upaya diversifikasi produk samping hasil pengolahan jagung yang didanai oleh Bogasari Nugraha VIII, PT. Indofood Sukses Makmur Tbk. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada:

1. Prof. Dr.Ir. Maggy T Suhartono atas bimbingan, perhatian dan dorongan yang kuat selama penulis menjalani studi di Institut Pertanian Bogor.

2. Prof. Dr. Ir. Fransiska Zakaria, MSc. atas kesediannya meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan saran dalam penulisan skripsi ini.

3. Dr. Ir. Budiatman Satiawihardja, M.Sc. atas kesediannya meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan saran dalam penulisa skripsi ini.

4. Pihak Bogasari Nugraha, PT. Indofood Sukses Makmur Tbk., yang telah memberikan dana penelitian.

5. Orang-orang yang tercinta Mama, Bapak, Kak Pina, dan Dini atas kasih sayang, do’a dan pengorbanannya.

6. Teman-teman seperjuangan: Fenni dan Prasna.

7. Warga Lab. MB: Bu Sri, Bu Ika, Bu Lukie, Bu Rika, Bu Ummu, Bu Eni, Mbak Agnes dan yang lainnya. Terimakasih atas segala bantuan, diskusi dan masa-masa indah yang penulis jalani selama penelitian.

8. Team kelompok A2: Nisvi, Christ, Tina dan Fajar.

9. Teman-teman ITP’39: Oga, Mumus, Dhenok, Eva, Manginar, Novi, Sari, Hana, Dora, Ajeng, Fafa, Karen, Shinta, Nanda, Ribka, Didin, Bekti, Dadik dan semuanya yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu. Terimakasih atas bantuannya selama penulis menempuh studi serta kenangan manis selama di ITP.

10. Sahabat-sahabatku di Asrama A2: Ulung, Oqi, Dewi, Erisya, Mel, Indri dan Erna. Terimakasih untuk kesan pertama yang menyenangkan di IPB.

10. Teman-teman di Maharlika atas: Fermut, Iffa, Fera, M’Vivin, Upie, Pipit, Ayang, Fitri1, M’Ifat, Nina, Qiqo, Liano, Ayu, Fitri2, Iin, Ari, Ria, Ranche,

Anna, Hamtoh dan Nucy. Terimaksih atas atas dorongan dan masa-masa indah di kos.

11. Teknisi laboran ITP untuk semua bantuannya selama penulis menjalankan studi di ITP, IPB.

12. Pegawai di tata usaha yang telah banyak membantu penulis.

Bogor, September 2006

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

Kata Pengatar ... i

Daftar Isi ... iii

Daftar Tabel ... v

Daftar Gambar ... vi

Daftar Lampiran ... vii

I. PENDAHULUAN ... 1

A. LATAR BELAKANG ... 2

B. TUJUAN DAN SASARAN ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

A. HEMISELULOSA DAN XILAN ... 4

B. TONGKOL JAGUNG ... 7

C. ENZIM XILANOLITIK ... 8

D. MANFAAT ENZIM XILANASE ... 11

E. PRODUKSI XILANASE DARI MIKROORGANISME ... 13

F. MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA PENGHASIL XILANASE ... 16

D. REGULASI SINTESIS XILANASE ... 18

III. BAHAN DAN METODE ... 20

A. BAHAN DAN ALAT ... 20

B. TEMPAT DAN WAKTU PELAKSANAAN PENELITIAN ... 20

C. METODOLOGI PENELITIAN ... 21

1. Isolasi Mikroba dari Tongkol Jagung Busuk ... 21

2. Seleksi Isolat ... 22

3. Analisis Aktivitas Enzim Xilanase ... 23

4. Analisis Aktivitas β-Xilosidase ... 24

5. Penentuan Kadar Protein ... 25

6. Penentuan Kadar Gula Pereduksi ... 25

7. Analisis Proksimat Bahan Baku Tongkol Jagung ... 25

9. Optimasi Produksi Enzim ... 27

10. Pengendapan Enzim Xilanase dengan Amonium Sulfat ((NH4)2SO4 ... 28

11. Karakterisasi Enzim Xilanolitik ... 28

12. Analisis SDS-PAGE ... 29

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 31

A. ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENGHASIL XILANASE ... 31

B. HASIL UJI PROKSIMAT TONGKOL JAGUNG ... 34

C. OPTIMASI PRODUKSI ENZIM ... 34

1. Optimasi Produksi pada Media Oat Spelt Xylan ... 35

2. Pengaruh Konsentrasi Substrat, pH dan Suhu pada Media Tongkol Jagung ... 38

D. PEMEKATAN ENZIM XILANASE ISOLAT MBXiK4 ... 41

E. KARAKTERISASI ENZIM XILANOLITIK ISOLAT MBXiK4 .... 42

1. Penentuan pH Optimum ... 43

2. Penentuan Suhu Optimum ... 45

3. Stabilitas Suhu ... 47

F. ANALISIS SDS-PAGE ... 48

V. KESIMPILAN DAN SARAN ... 52

A. KESIMPULAN ... 52

B. SARAN ... 52

DAFTAR PUSTAKA ... 54

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Kadar xilan berbagai limbah pertanian ... 2

Tabel 2. Beberapa mikroorganisme penghasil xilanase ... 15

Tabel 3. Komposisi media pertumbuhan mikroorganisme penghasil xilanase ... 17

Tabel 4. Komposisi media pertumbuhan xilanase ... 21

Tabel 5. Aktivitas enzim xilanase berbagai isolat MBXiK4 ... 32

Tabel 6. Hasil uji proksimat tongkol jagung ... 34

Tabel 7. Hasil pengendapan amonium sulfat ... 42

Tabel 8. Marker untuk SDS-PAGE ... 49

Tabel 9. Penetapan berat molekul sampel ... 49

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur xilan dan enzim yang terlibat dalam hidrolisisnya ... 5

Gambar 2. Enzim xilanase dari Bacillus circulans (1XNB) ... 10

Gambar 3. Regulasi biosintesis xilanase ... 19

Gambar 4. Diagram alir pembuatan media ... 22

Gambar 5. Cacahan tongkol jagung ... 26

Gambar 6. Metode delignifikasi menggunakan NaOCl 1% ... 27

Gambar 7. (A) Berbagai isolat MBXi yang pada media oat spelt xylan, (B) Indeks xilanolitik berbagai isolat MBXi ... 31

Gambar 8. Koloni isolat MBXiK4 ... 33

Gambar 9. Kurva produksi xilanase harian oleh isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan ... 35

Gambar 10. Kadar gula pereduksi isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan ... 36

Gambar 11. Bobot biomassa isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan ... 37

Gambar 12. Kadar protein isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan ... 38

Gambar 13. Kurva produksi enzim harian isolat MBXiK4 pada berbagai konsentrsi tongkol jagung ... 39

Gambar 14. Pengaruh suhu dan pH terhadap produksi xilanase oleh isolat MBXiK4 pada media tongkol jagung 1% ... 41

Gambar 15. Pengendapan ekstrak kasar enzim xilanase dengan amonium sulfat ... 42

Gambar 16. Optimasi pH (A) aktivitas xilanase, (B) aktivitas β- xilosidase ... 44

Gambar 17. Optimasi pH (A) aktivitas relatif xilanase, (B) aktivitas relatif β-xilosidase ... 45

Gambar 18. Optimasi suhu (A) aktivitas xilanase, (B) aktivitas relatif β -xilosidase ... 46

Gambar 19. Stabilitas suhu (A) xilanase, (B) β- xilosidase ... 48

Gambar 20. Hasil analisis SDS-PAGE. (A) Ekstrak hasil pengendapan amonium sulfat 50 % (b/v), (B) Ekstrak kasar enzim

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Metode Analisis Proksimat ... 59

Lampiran 2. Kurva Standar ... 64

Lampiran 3. Hasil Screening Isolat Penghasil Xilanase ... 66

Lampiran 4. Aktivitas Enzim Xilanase Berbagai Isolat MBXi ... 67

Lampiran 5. Kadar Protein dan Aktivitas Xilanase Spesifik Hasil pengukuran II ... 68

Lampiran 6. Hasil Uji Proksimat Tongkol Jagung ... 69

Lampiran 7. Aktivitas Xilanase pada Media Oat Spelt Xylan ... 71

Lampiran 8. Kadar Gula Pereduksi Supernatan Isolat MBXiK4 dan Bobot Biomassa pada Media Oat Spelt Xylan ... 72

Lampiran 9. Aktivitas Xilanase Isolat MBXiK4 pada Media Tongkol Jagung ... 73

Lampiran 10. Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik Xilanase Isolat MBXiK4 pada Media Tongkol Jagung ... 74

Lampiran 11. Pengaruh pH dan Suhu Pertumbuhan Terhadap Aktivitas Xilanase Isolat MBXiK4 pada Media Tongkol Jagung 1%... 75

Lampiran 12. Karakterisasi Enzim Xilanase Isolat MBXiK4 ... 76

Lampiran 13. Karakterisasi Enzim β-Xilosidase Isolat MBXiK4 ... 78

Lampiran 14. Komposisi Gel Elekttroforesis, Bufer Elektroforesis dan Bufer Sampel ... 79

I. PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG

Xilan merupakan komponen hemiselulosa yang paling banyak ditemukan pada dinding sel tanaman. Sebagai biomassa yang dapat terbaharuhi (renewable) dan tersedia secara melimpah di alam, xilan mempunyai potensi yang sangat besar untuk dikembangkan menjadi produk akhir yang berguna. Oleh karena itu, selama dekade terakhir ini, potensi bioteknologi dari aplikasi xilan dan enzim penghidrolisis xilan (xilanase) telah menjadi perhatian utama dari para peneliti. Enzim penghidrolisis xilan melibatkan dua tipe utama yaitu endo-β-1,4-xilanase (EC. 3.2.1.8) dan β -xilosidase (EC. 3.2.1.37). Kedua enzim tersebut menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi rantai pendek xilooligosakarida dan xilosa.

Xilanase banyak diaplikasikan di berbagai industri, dilaporkan bahwa nilai penjualan xilanase untuk setiap tahunnya adalah mencapai $ 60 juta US (Anonim, 2006a). Xilanase juga sangat bermanfaat dalam bidang industri pangan seiring dengan berkembangnya teknologi pangan fungsional dan rekayasa proses pangan. Manfaat xilanase untuk pangan fungsional adalah pembuatan gula xilosa dan produksi xilooligosakarida. Xilosa dimanfaatkan secara luas sebagai pemanis non kalori pada produk-produk permen karet, es krim, baked goods, fruits spreads, dan pasta gigi. Xilooligosakarida merupakan oligosakarida fungsional yang memiliki karakteristik bermanfaat, seperti low cariogenity, tidak dapat dicerna, dapat bertindak sebagai serat yang mempengaruhi pertumbuhan baik flora usus (menstimulasi bifidobacterial), mempunyai kemampuan menahan air, dan bersifat antifreezing, serta dimanfaatkan juga sebagai pemanis buatan. Xilanase dalam rekayasa proses pangan dimanfaatkan untuk penjernihan jus, ekstraksi kopi, flavor, minyak nabati, dan pati, serta untuk meningkatkan kualitas roti. Xilanase juga dimanfaatkan secara luas untuk pencampuran pada makanan ternak dan biokonversi limbah pertanian yang tinggi akan bahan lignoselulosa.

Produksi enzim terutama xilanase belum ada di Indonesia. Xilanase belum banyak dikenal di kalangan pengusaha walaupun potensi pemanfaatannya sangat luas dan mempunyai dampak positif terhadap lingkungan (clean processing). Beberapa kendala produksi xilanase antara lain tidak tersedianya strain mikroorganisme unggul dan kurangnya pengetahuan tentang teknologi produksi enzim. Menurut pakar negara maju bahwa negara yang kaya akan keanekaragaman hayati, termasuk Indonesia merupakan sumber mikroorganisme maupun tanaman yang potensial untuk bioproses menghasilkan enzim (Richana, 2002).

Xilan yang merupakan substrat bagi enzim xilanase banyak dijumpai pada tanaman-tanaman tahunan dan khususnya limbah-limbah pertanian seperti tongkol jagung, bagas tebu, jerami padi, dedak gandum, dan biji kapas. Kandungan xilan dalam tongkol jagung adalah yang tertinggi diantara limbah-limbah pertanian lainnya, yaitu dapat mencapai 40g/100g (Yang, et al., 2005), 31.3 % (Parajo, et al., 2004), 31.94 % (Agustina, 2000). Kadar xilan dalam berbagai limbah industri pertanian dapat dilihat pada Tabel 1. Tingginya kadar xilan dalam tongkol jagung tersebut berpotensi untuk mendapatkan strain mikroorganisme penghasil enzim xilanase dari tongkol jagung busuk. Penelitian ini juga memanfaatkan tongkol jagung itu sendiri sebagai substrat kasar (crude) dari mikroorganisme yang diisolasi. Penggunaan tongkol jagung sebagai substrat kasar tersebut merupakan salah satu upaya yang efektif untuk menghasilkan enzim xilanase dalam skala industri besar, karena penggunaan substrat sintetik akan meningkatkan biaya produksi.

Tabel 1. Kadar xilan berbagai limbah pertanian

Limbah pertanian Kadar xilan (%) Sumber

Tongkol jagung 31.3

Parajo, et al., 2004 Sekam padi 15.6

Sekam gandum 26.8 Tongkol jagung 31.94

Agustina, 2000 Ampas umbi garut 6.86

Onggok 0.4 % Sekam padi 29.91

Potensi pemanfaatan tongkol jagung untuk bioproses industri enzim juga didukung oleh semakin banyaknya limbah tongkol jagung yang dihasilkan akibat penggunaan jagung sebagai bahan pangan dan pakan meningkat. Berdasarkan catatan pada tahun 2005, produksi jagung di Indonesia sangat tinggi yaitu sebanyak 12,52 juta ton pipilan kering, naik sebesar 1.30 juta ton (11.57 %) dibandingkan dari produksi jagung tahun 2004 (Anonim, 2006b). Dari total 12,52 juta ton jagung pipilan yang diproduksi di Indonesia pada tahun 2005, dapat diperkirakan banyak sekali limbah tongkol jagung yang dihasilkan. Oleh karena itu perlu adanya pemanfaatan tongkol jagung secara intensif untuk meningkatkan nilai ekonomisnya dan tidak terbuang begitu saja sebagai limbah.

B. TUJUAN DAN SASARAN

Tujuan penelitian secara umum adalah memanfaatkan limbah tongkol jagung sebagai media sumber karbon untuk produksi enzim xilanase oleh mikroorganisme yang diisolasi dari tongkol jagung busuk. Sasaran penelitian ini adalah mendapatkan mikroorganisme penghasil xilanase dari tongkol jagung busuk, mengetahui karakteristik enzim yang dihasilkan, serta optimasi kondisi produksi enzim dengan menggunakan tongkol jagung sebagai substrat.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. HEMISELULOSA DAN XILAN

Hemiselulosa merupakan salah satu komponen lignoselulosa penyusun dinding sel tanaman, selain selulosa dan lignin. Perbedaan selulosa dan hemiselulosa adalah rantai molekulnya yang lebih pendek dan dari percabangan rantai molekul. Rantai utama hemiselulosa dapat terdiri dari satu jenis monomer (homopolimer), seperti xilan, namun ada juga yang terdiri dari dua unit atau lebih monomer (heteropolimer), seperti glukomanan. Beberapa unit monomer penyusun rantai utama sering tersubtitusi oleh gugus samping yang merupakan percabangan rantai molekul, seperti asam 4-0-metilglukuronat, galaktosa, dan sebagainya (Fengel & Wegener, 1989). Monomer-monomer penyusun hemiselulosa adalah gula-gula anhidro, yang terdiri dari heksosa (manosa, glukosa, galaktosa), pentosa (xilosa, arabinosa), asam heksuronat dan deoksi heksosa.

Menurut Wenzl (1990), komponen-komponen monomer hemiselulosa dapat dibagi dalam beberapa tipe sebagai berikut :

1. Glukomanan, yaitu hemiselulosa dimana monomer penyusunnya terdiri dari β-D-glukopiranosa dan β-D-manopiranosa.

2. Arabinogalaktan, yaitu hemiselulosa dimana monomer penyusunnya adalah β-D-galaktopiranosa dan α-L-arabinosa.

3. Xilan, yaitu hemiselulosa dimana monomer penyusunnya adalah β -D-xilopiranosa.

Polisakarida hemiselulosa yang paling banyak ditemukan pada dinding sel tanaman adalah xilan, yaitu sekitar 30-35 % dari total berat kering (Joseleau, et al., 1992 di dalam Tuohy, et al., 1995). Oleh karena itu xilan terdapat di hampir semua tanaman, kebanyakan dijumpai pada tanaman-tanaman tahunan dan limbah-limbah pertanian seperti tongkol jagung, bagas tebu, jerami padi, dedak gandum, dan biji kapas. Komponen xilan pada tanaman tersebut tersebut lebih banyak ditemukan pada kayu keras golongan angiospermae (15-30 %, b.k), dibandingkan pada kayu lunak golongan gymnospermae (7-12 %, b.k) (Subramaniyan dan Prema, 2002).

Secara umum, rantai utama xilan terdiri dari unit D-xilopiranosa yang dihubungkan oleh ikatan β-(1,4)-D-glikosidik. Struktur xilan semacam ini dapat ditemukan pada kayu keras, kayu lunak, dan rumput-rumputan. Namum ada juga xilan yang rantai utamanya dihubungkan oleh ikatan β -(1,3)-D-glikosidik, yaitu pada tanaman alga laut. Struktur xilan tersebut memiliki bentuk fibrillar yang lebih kristalin dan tidak terikat dengan molekul selulosa. Pada rumput laut tertentu, seperti Palmaria palmata, struktur rantai utama xilannya merupakan gabungan ikatan β-(1,3)-D-glikosidik dan β -(1,4)-D-glikosidik (Tuohy, et al., 1995).

Rantai utama xilan sering tersubtitusi oleh α-L-arabinofuranosa yang terikat pada karbon nomor tiga dari gugus xilosa, D-glukuronat atau 0-2-metil-D-glukuronat yang terikat pada karbon nomor dua dari gugus xilosa. Beberapa dari gugus xilosanya kadang-kadang terasetilisasi. Interaksi xilan dengan lignin, selulosa dan polimer lainnya dihubungkan oleh ikatan kovalen dan non kovalen. Lignin yang merupakan senyawa yang melingkupi xilan terikat secara esterifikasi pada residu asam 4-0-metil-D-glukuronat (Subramaniyan dan Prema, 2002). Struktur xilan terlihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur xilan dan enzim yang terlibat dalam hidrolisisnya

Ikatan 1,3- α-L-arabionofuranosa

α-glukuronidase Ikatan asam

α-1.2-4-0-metil-D-glukuronat

β

-xilosidase

Ikatan β-1,4-D-xilopiranosa

endoxilanase

asetil-xilan-esterase α-arabinofuronosidase

Selain karakteristik ikatan glikosidik yang menghubungkan unit D-xilopiranosa dalam rantai utamanya, gugus samping yang tersubtitusi pada rantai utama xilan juga berbeda-beda untuk setiap tanaman. Struktur xilan kayu keras disubtitusi oleh 10 % gugus asam 4-0-metilglukuronat dan 70 % dari unit-unit xilosanya disubtitusi oleh gugus 0-asetil. Oleh karena itu struktur xilan kayu keras membentuk molekul 0-asetil-4-0-metilglukuronoxilan (Tuohy, et al., 1995). Derajat polimerisasi rantai-rantai utama xilan kayu keras bervariasi antara sekitar 100 dan 200 tergantung pada spesies kayu dan cara isolasi. Di samping unit-unit utama, xilan kayu keras hanya mengandung sejumlah kecil rhamnosa dan asam galakturonat. Gugus rhamnosa dan asam galakturonat tersebut ada yang terikat pada ujung pereduksi xilan. Hal ini menyebabkan molekul xilan tahan terhadap alkali, karena asam galakturonat membuatnya stabil setelah unit pereduksi dari xilosa dihilangkan.

Berbeda dengan xilan kayu keras, xilan kayu lunak membentuk struktur arabino-4-0-metilglukuronoxilan. Derajat polimerisasi lebih dari 120 unit dan secara umum tidak terasetilisasi. Xilan kayu lunak memiliki gugus 4-0-metilglukuronosil lebih banyak dibandingkan xilan kayu keras. Perbandingan rata-rata unit gula yang menyusun xilan kayu lunak adalah 100 : 20 : 13 (xilosa : 4-0-metilglukuronat : arabinosa). Xilan dari tanaman rumput-rumputan dan sereal juga membentuk struktur arabino-4-0-metilglukuronoxilan, akan tetapi memiliki derajat polimerisasi yang lebih rendah yaitu sekitar 70. Struktur xilannya tersubtitusi oleh gugus asam 4-0-metilglukuronat yang lebih sedikit jika dibandingkan dengan xilan kayu keras, sedangkan gugus α-L-arabinosilnya lebih banyak. Xilan dari tanaman rumput-rumputan juga terasetilasi, yaitu sekitar 2-5% dari berat kering (Tuohy et al., 1995).

Struktur tiga dimensi xilan hampir sama dengan polisakarida tanaman lainnya, yaitu memiliki struktur yang beragam dan polimolekuler. Rantai xilan bercabang dan strukturnya tidak berbentuk kristal, sehingga lebih mudah dimasuki pelarut dibandingkan dengan selulosa. Xilan juga dihubungkan oleh ikatan hidrogen antar sesama molekulnya yang membentuk struktur twofold

extended ribbon. Twofold extended ribbon β-(1,4)-D-xilan dilaporkan memiliki struktur yang lebih fleksibel dibandingkan dengan β-(1,4)-D-selulosa yang membentuk twofold helix. Hal ini dikarenakan hanya satu ikatan hidrogen yang mampu dibentuk oleh residu xilosil pada xilan dibandingkan dengan selulosa, yaitu dapat membentuk dua ikatan hidrogen pada residu glukosilnya (Subramaniyan dan Prema, 2002).

B. TONGKOL JAGUNG

Tongkol jagung adalah tempat pembentukan lembaga dan gudang penyimpanan makanan untuk pertumbuhan biji jagung. Tongkol jagung tersebut merupakan modifikasi dari cabang dan mulai berkembang pada ruas-ruas batang dengan diameter 3-5 cm. Umumnya jagung mengandung kurang lebih 30 % tongkol jagung sedangkan sisanya adalah kulit dan biji. Menurut Maynard dan Loosli (1993) komposisi kimia tongkol jagung terdiri dari 35,5 % serat kasar, 2.5 % protein, 0.12 % kalsium, 0.04 % fosfor dan zat-zat lainnya sebesar 38.16 %. Lebih lanjut Irawadi (1992) menyatakan bahwa tongkol jagung mengandung selulosa (40 %), hemiselulosa (36 %), lignin (16 %) serta zat-zat lainnya sebesar 6 %.

Kandungan xilan dalam tongkol jagung adalah yang tertinggi diantara limbah-limbah pertanian lainnya, yaitu dapat mencapai 40 % (Yang, et al., 2005), 31.3 % (Parajo, et al., 2002), 31.94 % (Agustina, 2000). Komposisi xilan dalam tongkol jagung bervariasi untuk setiap varietas, ditemukan oleh satu grup peneliti bahwa xilan dari tongkol jagung mengandung 95 % xilan, 5 % asam glukuronat dan 0,5 % metoksil. Sedangkan grup peneliti lainnya menyatakan bahwa tongkol jagung mengandung 94 % xilan dan 3 % asam glukuronat (Whistler, 1950). Namun menurut Garcia, et al. (2000), struktur kimia xilan dari tongkol jagung terutama mengandung asam D-glukuronat, L-arabinosa, dan D-xilosa dengan komposisi masing-masing komponen tersebut adalah 2:7:19 atau mengandung sekitar 7 % asam glukuronat, 25 % arabinosa, dan sekitar 68 % xilosa. Fraksi xilan dari tongkol jagung juga memiliki banyak gugus yang terasetilasi (Garrotte et al., 2002). Strukrur xilan dari tongkol jagung ini berbeda dengan oat spelt xylan dan birch wood xylan.

Komposisi kimia oat spelt xilan mengandung 15 % asam glukuronat, 10 % arabinosa dan 75 % xilosa, sedangkan komposisi kimia birch wood xylan mengandung 90 % xilosa dan mengandung sedikit gugus cabang (Kubata et al., 1994). Potensi pemanfaatan xilan dari tongkol jagung yang telah dilakukan adalah untuk produksi xilooligosakarida (Yang, et al., 2005) dan produksi enzim xilanase non selulase (Damaso, et al., 2002). Xilan dari tongkol jagung juga dilaporkan sebagai salah satu sumber biomassa yang sangat potensial untuk produksi xilooligosakarida (Yang, et al., 2005).

C. ENZIM XILANOLITIK

Struktur kompleks xilan membutuhkan beberapa enzim yang bekerjasama dalam menghidrolisis xilan secara total. Kelompok enzim tersebut disebut enzim-enzim xilanolitik. Enzim-enzim yang utama dalam menghidrolisis xilan adalah endo-β-1,4-xilanase (β-1,4-D-xylan xylanohydrolase; EC.3.2.1.8) dan β-1,4-xilosidase (β-1,4-D-xylosidase xylohydrolase; EC.3.2.1.37). Gugus samping yang menyusun xilan dibebaskan oleh enzim α-arabinofuronosidase (EC.3.2.1.55), α-glucuronidase (E.C.3.2.1.1), asetilxilanesterase (EC.3.1.1.6), serta esterase yang membebaskan gugus asetil, koumaril dan ferulil (Tuohy, et al., 1995).

a. β-xilosidase (1,4-β-D-xilan xilohidrolase, E.C.3.2.1.37)

β-xilosidase yaitu enzim yang mampu menghidrolisis xilooligosakarida rantai pendek menjadi xilosa. Menurut Wagschal et al. (2005), tipe enzim β-xilosidase memutuskan monomer xilosa dari gugus non pereduksi. Namun β-xilosidase endogenus yang dimurnikan dari tepung terigu dapat menyerang substrat (xilooligosakarida) dari ujung pereduksi maupun dari ujung non pereduksi (memiliki aktivitas ekso-enzim) (Cleemput, et al., 1997). Selain xilooligosakarida rantai pendek, β -xilosidase juga dapat menghidrolisis aril-β-D-xilopiranosida, alkil-β -D-xilopiranosida, aril-β-L-arabinoglukosida, aril-β-D-glukoriranosida, xilobiosa, dan xilotriosa. Aktivitas enzim akan menurun dengan meningkatnya rantai xilooligosakarida. Sebagian besar enzim β-xilosidase yang berhasil dimurnikan masih menunjukkan adanya aktivitas

transferase. Xilosa yang dihasilkan sebagai produk hidrolisis juga merupakan inhibitor. Hal ini menyebabkan enzim ini kurang dapat dimanfaatkan industri penghasil xilosa. Enzim β-xilosidase yang berhasil dimurnikan dari Bacillus thermoleoverans IT-08 oleh Puspaningsih (2004), memiliki massa molekul relatif 80 kDa dengan pH optimum 6 dan suhu optimum 70oC.

b. Endoxilanase (1,4-β-D-xilan xilohidrolase, E.C.3.2.1.8)

Hidrolisis xilan oleh endoxilanase menghasilkan xilooligosakarida dan xilosa. Endoxilanase mampu memutus ikatan β-1,4 pada bagian dalam rantai xilan secara acak. Ikatan yang diputus ditentukan berdasarkan panjang rantai substrat, derajat percabangan, ada atau tidaknya gugus subtitusi, dan pola pemutusan dari enzim hidrolase tersebut. Menurut Cleemput, et al. (1997), hampir semua endoxilanase menghidrolisis rantai utama xilan pada bagian yang tidak tersubtitusi oleh gugus arabinosa. Umumnya hampir semua endoxilanse merupakan protein yang terdiri dari subunit tunggal (Tuohy, et al., 1995). Enzim endoxilanase sangat potensial untuk dimanfaatkan bagi industri penghasil xilooligosakarida.

Berdasarkan sifat fsiko kimianya (berat molekul dan titik isoelektrik), Wong, et al. (1988) mengklasifikasikan endoxilanase mikroba ke dalam dua kelompok, yaitu kelompok yang memiliki berat molekul tinggi (> 30 kDa) dengan pH isoelektrik rendah dan kelompok enzim yang memiliki berat molekul kecil (< 30 kDa) dengan pH isoelektrik tinggi. Kelompok endoxilanase yang memiliki berat molekul tinggi dan pI rendah disebut juga famili F, sedangkan kelompok endoxilanse yang memiliki masa molekul rendah dan pI tinggi disebut juga famili G. Perbedaan sifat katalitik dari kedua famili tersebut adalah famili F mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah titik cabang dan mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua residu xilopiranosil non-subtitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili G menggunakan tiga residu xilopiranosil no-subtitusi. Bedasarkan hal tersebut endoxilanase famili F mempunyai beberapa aktivitas katalitik

yang sama dengan β-xilosidase. Salah satu enzim xilanase dari Bacillus circulans dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Enzim xilanase dari Bacillus circulans (1XNB) (Jeffries, 1996) c. α-L-arabinofuranosidase (EC.3.2.1.55)

α-L-arabinofuranosidase berfungsi untuk menghidrolisis ujung non pereduksi dari gugus α-L-arabinofuronosil yang terikat dengan polisakarida yang mengandung arabinosa. Keberadaan enzim α -L-arabinofuranosidase sangat penting dalam degradasi xilan secara total. Adanya subtituen α-L-arabinofuranosida dalam struktur xilan dapat secara kuat menghambat aktivitas endoxilanase dan β-xilosidase yang berakibat menghalangi degradasi total polimer xilan. Hal ini dikarenakan struktur α -L-arabinofuranosida cukup besar, sehingga akan menjadi halangan ruang bagi aktivitas endoxilanase dan β-xilosidase (Shallom dan Shoham, 2003).

d . α-D-glukuronidase (E.C.3.2.1.1)

α-D-glukuronidase berfungsi untuk menghidrolisis ikatan α -1,2-D-glikosidik antara xilosa dan asam D-glukuronat atau ikatan 4-0-metil eter. Menurut Subramaniyan dan Prema (2002), hidrolisis ikatan α-1,2 adalah titik kritis dalam hidrolisis xilan secara enzimatik. Hal ini diduga

karena ikatan 4-0-metil membentuk barier dalam degradasi kayu yang hampir sama dengan ikatan antara lignin dan karbohidrat.

e. Asetil xilan esterase (EC.3.1.1.6)

Asetil xilan esterase diperlukan untuk memutuskan ikatan antara xilosa dan asam asetat. Selain asetil xilan esterase, kelompok enzim esterase lainnya juga diperlukan untuk melepaskan ikatan antara xilan dengan komponen lignin. Aktivitas ferulil esterase berfungsi untuk memutus ikatan antara gugus samping arabinosa dengan asam ferulat dan aktivitas ρ-kumoril esterase berfungsi untuk memutus ikatan antara gugus samping arabinosa dengan asam ρ-kumorat (Subramaniyan dan Prema, 2002).

E. MANFAAT ENZIM XILANASE

Enzim xilanase merupakan produk bioteknologi yang memiliki banyak kegunaan baik di bidang pangan maupun non pangan. Beberapa kegunaan enzim xilanase dalam bidang pangan antara lain:

1. Pembuatan Gula Xilosa.

Xilanase dalam pembuatan gula xilosa digunakan untuk menghidrolisis xilan (hemiselulosa) menjadi gula xilosa. Tongkol jagung merupakan sumber yang sangat berpotensi dalam pembuatan gula xilosa. Hal ini diperkenalkan pertama kali pada tahun 1959 oleh Stone dan Lotz. Lebih lanjut, Whistler (1950) menyatakan bahwa D-xilosa pada umumnya diperoleh dari tongkol jagung dan biji kapas. Oleh karena itu isolasi mikroba penghasil enzim xilanase secara langsung dari tongkol jagung, diharapkan mampu untuk menghasilkan enzim xilanase yang potensial dalam menghasilkan gula xilosa untuk skala industri besar.

Gula xilosa sendiri banyak digunakan untuk konsumsi penderita diabetes. Ditinjau dari sifatnya yang tidak dapat dimetabolisme, xilosa sangat sesuai digunakan sebagai pemanis pada permen karet karena di samping tidak menyebabkan kegemukan juga tidak merusak gigi. Di Malaysia, gula xilosa banyak digunakan untuk campuran pasta gigi karena

dapat berfungsi memperkuat gigi. Xilosa dapat pula digunakan sebagai media fermentasi untuk menghasilkan bahan tambahan pangan menggunakan mikroorganisme dan dapat pula digunakan untuk memperoleh pigmen astaxanthin.

Kristal xilosa dapat diubah menjadi xilitol (C5H12O5) dengan cara hidrogenasi katalitik, yang merupakan proses komersial di Finlandia. Xilitol yang termasuk pemanis grup poliol ini digunakan secara luas pada berbagai produk pangan termasuk chewing gums, sweets, es krim, baked good, dan fruit spreads. Saat ini 80-90 % chewing gum yang dijual di Asia diformulasi menggunakan xilitol (Anonim, 2006c). Dengan beragamnya kegunaan gula xilosa maka perlu adanya inovasi ke arah produksi xilosa tersebut. Inovasi tersebut diantaranya dengan menggunakan enzim penghidrolisis xilan.

2. Produksi Xilooligosakarida

Xilooligosakarida merupakan oligosakarida fungsional yang saat ini baru mulai dikembangkan. Senyawa ini memiliki karakteristik yang bermanfaat, seperti low cariogenity, tidak dapat dicerna, dapat bertindak sebagai serat yang mempengaruhi pertumbuhan baik flora usus (menstimulasi bifidobacterial), mempunyai kemampuan menahan air, dan bersifat antifreezing. Xilooligosakarida juga dimanfaatkan sebagai pemanis buatan. Beberapa penelitian enzim yang potensial untuk menghasilkan xilooligosakarida adalah xilanse dari Trichoderma longibrachiatum. Xilooligosakarida yang dihasilkannya memiliki komponen utama xilobiosa, xilotetraosa, dan xilopentosa (Chen, et al., 1997). Enzim xilanase yang diperlukan untuk produksi xilooligosakarida adalah yang memiliki aktivitas endoxilanse tinggi dan β-xilosidase rendah (Vazquez, et al., 2000).

3. Proses Industri Makanan dan Minuman

Xilanase dapat juga digunakan untuk menjernihkan jus, ekstraksi kopi, minyak nabati, pati, dan flavor (Wong dan Saddler, 1993). Kombinasi xilanase dengan selulase dan pektinase dapat digunakan untuk penjernihan jus dan likuifikasi buah dan sayuran. Selain itu xilanase juga

digunakan untuk meningkatkan kualitas roti. Efisiensi xilanase dalam perbaikan kualitas roti yang telah dilakukan yaitu xilanase yang berasal dari Aspergillus niger var awamori yang ditambahkan ke dalam adonan roti menghasilkan kenaikan volume spesifik roti. Kualitas roti juga dapat ditingkatkan dengan melakukan kombinasi penambahan xilanase dan amilase (Maat et al., 1992).

Manfaat lain dari xilanase adalah pada bidang non pangan seperti untuk proses biokonversi limbah pertanian, untuk proses pembuatan kertas (bleaching), dan untuk makanan ternak. Enzim xilanase dalam proses biokonversi limbah digunakan untuk menghidrolisis limbah yang tinggi kadar lignoselulosa seperti jerami, tongkol jagung, onggok (ampas tapioka, garut), kulit jagung, bagas tebu, sabut, serta tandan kosong kelapa sawit. Hal ini berguna untuk mengurangi tingkat pencemaran lingkungan yang sering menimbulkan masalah. Xilanase untuk proses biobleaching pulp berguna untuk menghidrolisis xilan agar lignin dari pulp kertas dapat dengan mudah dihilangkan. Cara ini digunakan untuk mengurangi penggunaan klorin sebagai bleaching agent, sehingga pencemaran racun limbah kimia dapat dihindari. Pemanfaatan enzim xilanase untuk makanan ternak telah dilakukan oleh Bedford dan Classen (1992), yang melaporkan bahwa campuran pakan ayam boiler dengan xilanase dapat mengurangi viskositas pencernaan sehingga meningkatkan pencapaian berat karena efisiensi konversi makanan.

F. PRODUKSI XILANASE DARI MIKROORGANISME

Xilanase pada dasarnya dapat diperoleh dari berbagai organisme, seperti bakteri, alga, fungi, protozoa, crustacea, serangga dan benih tanaman. Namun umumnya organisme yang banyak ditemukan memproduksi xilanase adalah kapang dan bakteri. Beberapa jenis bakteri dan kapang diketahui mampu menghasilkan xilanase secara ekstraseluler. Beberapa mikroorganisme penghasil xilanase dapat dilihat pada Tabel 2. Xilanase yang dihasilkan oleh bakteri umumnya memiliki karakteristik pH optimum dan suhu optimum yang lebih beragam. Bacillus sp. 41M-1 menghasilkan xilanase dalam kondisi

alkalofilik, xilanase yang dihasilkannya memiliki pH optimum 9, suhu optimum 50oC dan berat molekul 36 kDa (Nakamura et al., 1993). Dung et al. (1993) melakukan penelitian β-1,4-xilanase 2 dan 3 dari Aeromonas Caviae W-61. pH optimum dari xilanase tersebut masing-masing adalah 5.5 (β -1,4-xilanase 2) dan 5.0 (β-1,4-xilanase 3), sedangkan suhu optimumnya adalah 45oC (β-1,4-xilanase 2) dan 50oC (β-1,4-xilanase 3). Ruiz-Arribas et al. (1995) telah mendapatkan Streptomyces halstedi JM8 penghasil xilanase (xys I) yang diisolasi dari jerami, xilanase yang dihasilkannya memiliki pH optimum sekitar 6 dan suhu optimum 60oC.

Xilanase yang dihasilkan dari kapang umumnya memiliki pH optimum yang lebih kecil dan bersifat kurang termostabil dibandingkan xilanase dari bakteri. Sebagai contoh Trichoderma longibrachiatum menghasilkan xilanase yang dengan berat molekul 37.7 kDa memiliki pH optimum 5.0-6.0 dan suhu optimum 45oC (Chen et al., 1996). Namun tidak semua xilanase dari kapang memiliki suhu optimum rendah. Salah satunya adalah xilanase dari kapang termofilik Thermomyces lanuginosus IOC-4145 yang diproduksi dengan menggunakan substrat tongkol jagung. Xilanase yang dihasilkan memiliki pH optimum 6 dan suhu optimum 75oC (Damaso, et al., 2002). Termostabil xilanase juga diproduksi oleh Aspergillus niger, xilanase yang dihasilkannya memiliki berat molekul 36 kDa, pH optimum 7.5 dan suhu optimum 60oC. Xilanase tersebut juga masih memiliki aktivitas relatif 50 % selama 15 menit pada suhu 100oC (Coral, et al., 2002). Xilanase dari kapang juga dilaporkan memiliki aktivitas yang lebih tinggi, tetapi juga diikuti dengan adanya aktivitas selulase (Subramaniyan dan Prema, 2002). Hal ini mengakibatkan xilanase dari kapang tidak cocok untuk digunakan untuk aplikasi proses industri yang membutuhkan enzim untuk mendegradasi xilan, tetapi tidak mendegradasi selulosa seperti proses bleaching pulp.

Tabel 2. Beberapa mikroorganisme penghasil xilanase

Mikroorganisme

Suhu pertumbuhan

(oC)

Aktivitas optimum Berat molekul

(kDa)

Suhu (oC) pH

Bakteri

Aeromonas sp. 30 30-55 5.0-7.0 22.0-58.0

Bacillus sp. 37-50 50-70 6.0-10.0 16.0-43.0

Clostridium sp. 37-65 50-75 5.5-7.0 29.0-72.0

Fibrobacter

succinogenes 37 39 7.0 53.7

Streptomyces sp. 36-50 50-72 4.5-8.0 21.0-50.0

Thermanobacterium 60 80 6.2 24.0-350.0

Thermonospora

curvata 55 75 6.8-7.8 15.0-36.0

Thermatoga sp. 77-80 80-105 5.4-6.2 40.0-120.0

Kapang

Aspergillus sp. 24-30 45-60 4.5-6.0 22.0-46.5

Aureobasidium sp. 28 45-54 4.5-4.8 20.0-25.0

Bipolaris sorokina 28 70 5.5 30.0

Criptococcus flavus 20 55 4.5 25.0

Fusarium oxysporium 26 50 5.0 80.0

Gloeophyllum trabeum 22 80 4.0 39.0

Humicola grisea 40 70 5.5 25.5

Myrothecium

verrucaria 30 45 5.5 15.9

Neurospora crassa 28 50 4.8 33.0

Penicillium sp. 25 40 6.0 35.0

Trichoderma sp. 25-30 50-60 3.5-6.5 18.0-32.0

G. MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA PENGHASIL XILANASE Menurut Richana (2002), komposisi medium fermentasi mikroba penghasil xilanase dapat sederhana atau kompleks tergantung jenis mikroba dan kondisi fermentasinya, dan dapat juga merupakan medium sintetik atau medium kasar (crude). Medium sintetik cocok digunakan untuk skala laboratorium dan industri kecil karena mempunyai beberapa keuntungan antara lain setiap komponen dapat dengan mudah dikurangi atau ditambahkan. Selain itu, pada medium sintetik biasanya tidak membentuk buih selama proses berlangsung dan kesalahan atau kelainan yang mungkin terjadi selama fermentasi akibat komposisi yang kurang tepat dapat dicegah. Untuk industri skala besar medium sintetik tidak sesuai digunakan, oleh karena itu perlu adanya inovasi baru penemuan medium kasar (crude) seperti pemanfaatan limbah berlignoselulosa untuk menghasilkan enzim xilanase dalam skala besar.

Sumber karbon utama bagi produksi enzim xilanase adalah xilan yang banyak terdapat pada limbah hasil pertanian. Xilan akan dihidrolisis oleh enzim xilanase menghasilkan xilosa (C5H10O5). Penggunaan xilan dalam produksi xilanase skala besar terlalu mahal. Sebagai sumber alternatif karbon selain xilan dapat digunakan jerami padi, tongkol jagung, bagas tebu, kulit pisang, limbah ekstrak minyak biji kapas dan limbah hasil pertanian lainnya. Penggunaan jerami padi sebagai substrat telah diteliti oleh Park et al. (1992). Hal ini dilakukan dengan memotong jerami padi sepanjang 10 mm, kemudian dipanaskan 121oC selama 1 jam. Sesudah penyaringan, xilan kasar diendapkan dengan etanol 99 % dan diinkubasi selama 24 jam. Sedangkan pemanfaatan ampas/limbah ekstrak minyak biji kapas sebagai pengganti xilan telah dilakukan oleh Yoshida et al. (1994).

Unsur-unsur mineral perlu juga ditambahkan dalam bentuk garam dengan konsentrasi yang tepat seperti garam magnesium, fosfor, kalium, kalsium, sulfur dan klor (Stanbury dan Whitaker, 1984). Menurut Nakamura et al. (1993) dan Dung et al. (1993), komposisi media untuk produksi xilanase, masing-masing untuk alkalofilik dan netral dapat dilihat pada Tabel 3. Selain faktor-faktor nutrisi, parameter bioproses lainnya juga

mempengaruhi aktivitas dan produktivitas xilanase yang dihasilkan pada waktu proses fermentasi, yaitu seperti pH, suhu dan agitasi (Kulkarni, et al., 1999).

Tabel 3. Komposisi media pertumbuhan mikroorganisme penghasil xilanase

Bahan Komposisi (%)

Media alkali Media netral

Polipepton 0,5 -

Ekstrak khamir 0,1 0,2

K2PO4 0,1 1,5

MgSO4.7H2O 0,02 0,025

Xilan (sumber karbon) 0,5 0,7

NaCl - 0,25

NH4Cl - 0,5

Na2HPO4 - 5,0

Sumber : Nakamura et al. (1993); Dung et al. (1993)

Menurut Stanbury dan Whitaker (1984), formulasi media dalam pertumbuhan dan produksi hasil fermentasi merupakan suatu tahap penting untuk mendesain percobaan dalam skala kerja. Oleh karena itu perlu adanya pengaturan komposisi media dan pemilihan substrat yang tepat bagi pertumbuhan suatu mikroba agar dapat menghasilkan enzim xilanase dalam jumlah maksimal. Pemilihan substrat menjadi bagian penting dalam suatu proses produksi enzim, karena substrat dan produk hasil hidrolisis enzim biasanya merupakan induser utama bagi mikroorganisme dalam mensekresikan enzim. Karni et al. (1993), melaporkan bahwa produksi xilanase dengan menggunakan sumber karbon xilosa menghasilkan aktivitas yang lebih optimal dibandingkan dengan menggunakan sumber karbon xilan. Sedangkan Rawashdesh, et al. (2005), melaporkan bahwa aktivitas xilanase optimal didapatkan dari fermentasi menggunakan xilan murni (0.5%) sebagai sumber karbon dibandingkan dengan campuran xilosa 0.2 % dan xilan 0.3% sebagai sumber karbon.

D. REGULASI SINTESIS XILANASE

Sintesis xilanse dapat terjadi secara konstitutif maupun induktif. Xilanase yang disintesis secara konstitutif akan mendegradasi xilan yang merupakan heteropolisakarida berukuran besar dan tidak dapat masuk begitu saja ke dalam sel. Hidrolisis xilan tersebut menghasilkan fragmen yang mempunyai berat molekul rendah, seperti xilosa, xilobiosa, xilotriosa, dan oligosakarida lainnya. Xilosa dan xilooligomer yang berukuran kecil tersebut dapat dengan mudah masuk ke dalam sel bakteri dan menginduksi sintesis xilanase melalui beberapa mekanisme yang berbeda. Regulasi sintesis xilanase dapat dilihat pada (Gambar 2).

Wang, et al. (1992) dan Gomes, et al. (1994) di dalam Subramaniyan dan Prema (2002), menjelaskan dua mekanisme induksi xilanse oleh xilooligomer melalui dua mekanisme. Mekanisme pertama, xilooligomer ditransport langsung ke dalam sel dan kemudian dihidrolisis oleh β-xilosidase intraseluler menjadi xilosa. Mekanisme ini didukung oleh keberadaan β -xilosidase intraseluler yang secara umum terdapat di dalam mikroorganisme. Mekanisme kedua, xilooligomer dihidrolisis menjadi xilosa selama proses transportasi melalui membran ke dalam matriks sel. Hidrolisis dilakukan oleh transporter penghidrolisis (hydrolitic transporters) yang memiliki sisi aktif untuk memecah ikatan ekso-β-1,4 seperti yang dimiliki oleh β-xilosidase. Tahapan ini dapat dilakukan jika enzim β-xilosidase juga memiliki aktivitas transferase.

Kedua mekanisme di atas akan menghsilkan xilosa yang merupakan induser dalam sintesis xilanse. Senyawa xilosa juga kemudian mengalami proses transglikosilasi menghasilkan XylB1-2Xyl dan GlcB1-2Xyl. Senyawa ini bertindak sebagai induser tambahan terhadap gen penyandi enzim xilanolitik. Menurut Kulkarni, et al. (1999), xilanase dihasilkan oleh kultur Bacillus circulans yang ditumbuhkan pada media yang mengandung xilosa, manosa dan selebiosa, tetapi xilanase tidak dihasilkan pada media yang mengandung glukosa. Represi katabolit oleh glukosa merupakan fenomena yang umum dijumpai dalam biosintesis xilanase.

Gambar 3. Regulasi biosintesis xilanase (Kulkarni et al., 1999) EKSPRESI XILANASE

Glukosa/xilosa Membran sel

Alat sekresi Alat sekresi

Aktivitas xilanase konstitutif

Xilan Xilooligosakarida

+

xilobiosa

+

xilosa Xilosidase

Induksi xilanase primer

Mono/hetero disakarida

Glukosa

Induksi xilanase tahap kedua

Xilobiase Sitoplasma

Permease(s)

Xilanase Xilosidase Transglikosidase

III. BAHAN DAN METODE

A. BAHAN DAN ALAT

Bahan-bahan yang digunakan adalah tongkol jagung hibrida CP 2 utuh dan busuk. Tongkol jagung diperoleh dari Desa Cikole, Kecamatan Lembang, Jawa Barat. Tongkol jagung hibrida CP2 busuk diperoleh dengan cara disimpan pada suhu lembab selama dua bulan di daerah Bogor, Jawa Barat. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah ekstrak khamir (Oxoid), K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaCl, NH4Cl, Na2HPO4, CuSO4.5H2O, NaOH, Na-K tartrat, Na2CO3, NaOCl, oat spelt xylan (Sigma), bacto agar (Oxoid), tryptone, 3,5-Dinitro salycilic acid (Sigma), D-xilosa (Sigma), substrat paranitrophenyl-β -D-xylopiranoside (Sigma), paranitrophenol (Sigma), etanol 95 %, buffer tris-HCl, bufer fosfat sitrat, bufer fosfat, bufer glisin-NaOH, coomassie brilliant blue G-250 (Sigma), bovine serum albumine (Sigma), kertas saring dan bahan untuk SDS-PAGE (Lampiran 14). Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, gelas piala, labu erlenmeyer, gelas ukur, labu takar, tabung reaksi, jarum ose, botol semprot, inkubator, sheaker, spektrofotometer, alat sterilisasi, pH-meter, pipet mikro, oven, pengaduk stirer, sentrifuse, kertas saring, alat penyaring, dan mesin penggiling.

B. TEMPAT DAN WAKTU PELAKSANAAN PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas, Bioteknologi, IPB. Waktu pelaksanaan selama 10 bulan yang dimulai pada bulan November 2005 sampai dengan Agustus 2006.

C. METODOLOGI PENELITIAN

Langkah-langkah yang dilakukan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Isolasi Mikroba dari Tongkol Jagung Busuk

Isolasi mikroba dilakukan dari tongkol jagung hibrida CP 2 busuk. Tongkol jagung busuk tersebut dihancurkan dan dimasukkan ke dalam air aquades steril. Sebanyak 1.0 ml suspensi mikroba diinokulasi ke dalam 25 ml media cair oat spelt xylan 0.7 % dan diinkubasi menggunakan sheaker selama satu hari. Hasil kultivasi disebarkan ke media padat sebanyak 0.1 ml dengan menggunakan spreader dan diinkubasi selama dua hari. Seleksi koloni dilakukan secara bertahap sampai diperoleh isolat murni berdasarkan zona bening yang dihasilkan di sekeliling koloni. Galur-galur yang mempunyai kemampuan menghasilkan xilanase ditumbuhkan pada media agar miring, kemudian diawetkan dalam gliserol 50 % dan disimpan pada suhu -20oC. Komposisi media yang digunakan untuk mengisolasi mikroba penghasil xilanase dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Komposisi media pertumbuhan xilanase

Substrat Komposisi Media

(% b/V) Ekstrak khamir 0.2

K2HPO4 1.5 MgSO4.7H2O 0.025 Oat spelt xylan 0.7

pH 7.0 NaCl 0.25 NH4Cl 0.5 Na2HPO4 0.5 Sumber : Dung et al. (1993)

Gambar 4. Diagram alir pembuatan media 2. Seleksi Isolat

Seleksi isolat penghasil xilanase terbaik dilakukan dengan mengukur indeks xilanolitik dan aktivitas enzim ekstrak kasar (supernatan). Pengujian indeks xilanolitik isolat dilakukan dengan mengukur area bening yang dihasilkan oleh masing-masing isolat pada media padat oat spelt xylan 0.7 %. Ekstrak kasar enzim untuk pengujian aktivitas xilanase diperoleh dari hasil sentrifuse inokulum masing-masing isolat. Metode inokulasi dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan cara memasukkan sebanyak satu ose masing-masing isolat ke dalam 25 ml media cair oat spelt xylan 0.7 % dalam erlenmeyer 100 ml dan dengan cara memasukkan 10 % inokulum starter masing-masing isolat yang memiliki OD 0.600 ke dalam 10 ml media cair oat spelt xylan 0.7 % dalam tabung reaksi. Media inokulum starter yang digunakan adalah Luria Broth yang terdiri dari tryptone 1 %, ekstrak khamir 1 %, dan NaCl 1 %. Inkubasi dilakukan di dalam penangas air bergoyang selama 18 jam pada suhu 37oC. Isolat yang memiliki indeks xilanolitik dan aktivitas enzim yang cukup tinggi dipilih untuk dikarakterisasi lebih lanjut.

Disterilisasi dengan otoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC

Komposisi Media % b/V

Aquades Na2CO3 1 %

Diatur pH sampai pH = 7.0

3. Analisis Aktivitas Enzim Xilanase

Analisis aktivitas xilanase dilakukan terhadap pengujian seleksi isolat, optimasi produksi enzim (pengaruh konsentrasi substrat, penentuan pH dan suhu optimum produksi), hasil endapan amonium sulfat, karakteristik xilanase (pH optimum, suhu optimum dan stabilitas suhu). Pengujian aktivitas enzim xilanase dilakukan dengan metode Miller (1959)* yang telah dimodifikasi. Aktivitas xilanase ditentukan dengan mengukur gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis 0.5 ml oat spelt xylan (0.5 % dalam 50 mM bufer Tris.HCl pH 7.5) oleh 0.05 ml enzim pada suhu 37oC selama 15 menit. Banyaknya gula pereduksi diukur dengan menggunakan metode DNS (3,5-dinitrosalysilic acid) secara spektrofotometri ( =550 nm). Satu unit aktivitas xilanase menunjukkan

mol xilosa yang dihasilkan per menit untuk setiap ml enzim atau mg protein.

Standar xilosa dibuat pada kisaran 200-2000 ppm xilosa/ml dari stok 2000 ppm xilosa. Sebanyak 0.5 ml masing-masing larutan standar dicampur dengan 0.5 ml akuades, kemudian ditambah 1 ml pereaksi DNS. Tabung dimasukkan dalam penangas air mendidih selama 15 menit, kemudian didinginkan dan diabsorbansi pada panjang gelombang 550 nm. *

)Modifikasi dilakukan pada perbandingan antara substrat, bufer dan enzim pada larutan reaksi, serta jumlah pereaksi.

(Cs – Ck) x 1000 Aktivitas enzim (U/ml) =

BM xilosa x T x VE Keterangan :

Cs : Konsentrasi xilosa sampel (mg/ml) Ck : Konsentrasi xilosa kontrol (mg/ml) BM xilosa : 150.3 mg/mmol

T : Waktu inkubasi reaksi enzim (menit) VE : Volume enzim yang ditambahkan (ml)

4. Analisis Aktivitas β-Xilosidase

Analisis aktivitas β-xilosidase dilakukan terhadap karakterisasi enzim β-xilosidase yang meliputi penentuan aktivitas pH optimum, aktivitas suhu optimum dan stabilitas suhu. Pengujian aktivitas β -xilosidase dilakukan dengan substrat ρ-nitrofenol-β-D-xilopyranosida berdasarkan metode Ratanakhanokchai et al. (1998)* yang telah dimodifikasi. Sebanyak 500 l substrat 0.9 mM PNP-β-D-xilopiranosida diinkubasi bersama-sama enzim (50 l) pada suhu 37oC selama 60 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 0.1 ml Na2CO3 0.4 M. Aktivitas enzim ditentukan dengan mengukur jumlah ρ-nitrofenol yang dilepaskan dan diukur nilai absorbansinya pada 405 nm. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mol ρ-nitrofenol yang dihasilkan dalam waktu satu menit per ml enzim pada kondisi percobaan.

Sebagai standar digunakan ρ-nitrofenol pada kisaran 0.1-0.5 mM dalam bufer fosfat 50 mM pH 7. Sebanyak 500 l masing-masing larutan standar diinkubasi dengan 50 l bufer fosfat 50 mM pH 7 pada suhu 37oC selama 60 menit. Setelah inkubasi ditambahkan 1 ml Na2CO3 0.4 M dan diabsorbansi pada 405 nm.

*

)Modifikasi dilakukan pada perbandingan antara substrat, bufer dan enzim pada larutan reaksi, serta jumlah pereaksi.

(Cs – Ck) x 1000 Aktivitas enzim (U/ml) =

T x VE Keterangan :

Cs : Konsentrasi xilosa sampel (mM) Ck : Konsentrasi xilosa kontrol (mM) T : Waktu inkubasi reaksi enzim (menit) VE : Volume enzim yang ditambahkan (ml)

5. Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein dilakukan terhadap pengujian seleksi isolat (pengukuran I), optimasi produksi enzim (pengaruh konsentrasi substrat, pengaruh pH dan suhu pertumbuhan) dan hasil endapan amonium sulfat. Kadar protein diukur dengan metode Bradford (1976). Sebanyak 100 l enzim di dalam aquades 1 ml direaksikan dengan 1 ml pereaksi Coomasive Brilliant Blue G-250, kemudian divorteks dan didiamkan selama 5 menit. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Blanko menggunakan 1.1 ml aquades yang direaksikan dengan 1 ml pereaksi Coomasive Brilliant Blue G-250. Standar protein menggunakan Bovin Serum Albumin (BSA) pada kisaran 0.02-0.2 mg protein/ml dari stok BSA 1 mg/ml.

6. Penentuan Kadar Gula Pereduksi

Penentuan kadar gula pereduksi dilakukan dengan metode Apriyantono, et al. (1989)* yang telah dimodifikasi. Sebanyak 0.5 ml larutan ditambahkan 1.5 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut diletakkan dalam air mendidih selama 5 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Setelah itu dilakukan pembacaan pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 550 nm. Blanko dibuat seperti di atas hanya menggunakan aquades atau buffer. Sebagai standar digunakan larutan xilosa dengan konsentrasi 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, dan 1.0 mg/ml.

*

)Modifikasi dilakukan pada perbandingan antara sampel dan jumlah pereaksi yang sama.

7. Analisis Proksimat Bahan Baku Tongkol Jagung

Analisis proksimat bahan baku tongkol jagung meliputi analisis kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, kadar serat kasar dan kadar lignolosa. Prosedur analisis proksimat terdapat pada lampiran 1.

8. Delignifikasi Tongkol Jagung

Sebelum digunakan sebagai substrat, tongkol jagung mengalami perlakuan pendahuluan berupa pengecilan ukuran dan delignifikasi. Delignifikasi dilakukan untuk memisahkan bagian lignin dari selulosa dan hemiselulosa. Tongkol jagung yang telah didelignifikasi memiliki warna yang lebih coklat dibandingkan tongkol jagung yang belum didelignifikasi. Perbandingan tongkol jagung yang belum didelignifikasi dan yang telah didelignifikasi dapat dilihat pada Gambar 5.

(A) (B)

Gambar 5. Cacahan tongkol jagung (A) sebelum delignifikasi, (B) setelah delignifikasi

Proses delginifikasi dilakukan sebagai berikut. Cacahan tongkol jagung 32 mesh sebanyak 100 g dimasukkan ke dalam wadah stoples plastik dan direndam dalam larutan NaOCl 1 % selama 5 jam pada suhu ruang. Setelah 5 jam, sampel dibilas dengan air dan disaring sampai pH netral. Sampel kemudian dikeringkan pada suhu 50oC selama 48 jam (Agustina, 2000).

Gambar 6. Metode delignifikasi menggunkan NaOCl 1 % (Agustina, 2000) 9. Optimasi Produksi Enzim

a. Penentuan Komposisi Tongkol Jagung Optimum

Optimasi produksi enzim dilakukan pada substrat tongkol jagung yang mengandung ekstrak khamir 0.2 %, K2HPO4 1.5 %, MgSO4.7H2O 0.025 %, NaCl 0.25 %, NH4Cl 0.5 %, dan Na2HPO4 0.5 %. Sebanyak 10 % kultur starter yang memiliki OD 0,600 diinokulasi ke dalam media 50 ml dalam erlenmeyer 125 ml, dengan komposisi tongkol jagung 1 %, 3 %, 5 %, dan 7 %. Penentuan komposisi tongkol jagung terbaik dilakukan dengan membuat kurva produksi enzim harian pada masing-masing komposisi tongkol jagung. Optimasi media juga dilakukan pada media oat spelt xylan, sebagai perbandingan penggunaan kualitas tongkol jagung sebagai substrat.

Cacahan tongkol jagung

Perendaman dalam NaOCl 1 % selama 5 jam pada suhu 28oC

Pencucian

Penyaringan

Lignin

Pengeringan

pada suhu 50oC selama 48 jam

b. Penentuan pH dan Suhu Optimum Produksi Enzim

Komposisi media tongkol jagung terbaik digunakan untuk menentukan pH dan suhu optimum produksi enzim. Penentuan pH optimum dilakukan pada kisaran pH 5, 6, 7, 8, dan 9, sedangkan optimasi suhu dilakukan pada kisaran suhu 37oC dan 45oC. Hasil kondisi optimum digunakan untuk produksi enzim pada tahap selanjutnya, yaitu pengendapan enzim xilanase dengan amonium sulfat dan karakterisasi enzim xilanase.

10. Pengendapan Enzim Xilanase dengan Amonium Sulfat ((NH4)2SO4) Pengendapan enzim ini dilakukan untuk memperoleh kondisi optimum fraksinasi dengan berbagai persentase kejenuhan amonium sulfat. Persentase amonium sulfat yang digunakan adalah pada kisaran (NH4)2SO4 20-60 % (b/v). Enzim diendapkan dalam keadaan dingin sambil diaduk perlahan menggunakan pengaduk megnetik. Enzim yang mengendap selanjutnya disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm, suhu 4oC selama 30 menit. Endapan enzim dilarutkan dalam bufer Tris.HCl 100 mM pH 7.5. Aktivitas endapan enzim yang tertinggi menunjukkan persentase kejenuhan amonium sulfat optimum yang selanjutnya akan digunakan dalam pengendapan enzim xilanase skala satu liter.

11. Karakterisasi Enzim Xilanolitik

Hasil pengendapan amonium sulfat optimum dari satu liter supernatan digunakan untuk karakterisasi enzim xilanase dan enzim β -xilosidase. Karakterisasi meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, stabilitas pH, dan termostabilitas.

1. pH Optimum

Penentuan pH optimum enzim xilanase dan β-xilosidase dilakukan pada pH 4, 5, 6 (bufer fosfat sitrat 100mM), pH 6, 7, 8 (bufer fosfat 100 mM) dan pH 8,9,10 (bufer glisin NaOH 100mM). Penentuan pH optimum ini dilakukan dengan pengujian aktivitas

enzim menggunakan bufer-bufer tersebut dan diinkubasi pada suhu 37oC.

2. Suhu Optimum

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan pengujian aktivitas enzim yang diinkubasi pada bufer pH optimum pada suhu 27oC, 37oC, 50oC, 60oC, 70oC dan 80oC.

3. Stabilitas Suhu

Stabilitas suhu diuji dengan menginkubasi enzim dalam bufer pH optimum 100 mM pada suhu 70oC dengan waktu sampling 30 menit. Sampel kemudian direaksikan dengan 0.5 % oat spelt xylan dalam bufer optimum dan diinkubasi pada suhu optimum.

12.Analisis SDS-PAGE

Elektroforesis protein dengan SDS-PAGE dilakukan dengan menggunakan gel pemisah 10 % poliakrilamida dan gel penahan 4 % poliakrilamida (Laemli, 1970). Tahapan analisis SDS-PAGE adalah sebagai berikut.

1. Pembuatan Gel

Cetakan gel berupa dua lempeng kaca dihimpitkan dan diantaranya diletakkan pemisah (spacer) pada bagian tepi, lalu dijepit dengan klip dan diberdirikan di atas lempeng kaca. Larutan gel pemisah (separating gel) dibuat dengan komposisi seperti tercantum dalam Lampiran.14 dimasukkan ke dalam lempeng kaca. Setelah gel tersebut mengeras kemudian dimasukkan gel penahan ke atasnya. Sisir pencetak sumur segera dimasukkan ke bagian gel penahan sebelum gel mengeras.

2. Pelarian sampel

Lempeng kaca yang berisi gel yang sudah mengeras dimasukkan ke dalam alat elektroforesis dan diikuti dengan larutan bufer. Protein (20 μl) disuspensikan dalam bufer sampel (100μl), diinkubasi pada

95oC selama 1 menit, dan diisikan ke dalam gel poliakrilamid sebanyak 12 l. Standar marker LMW (Low Molecular Weight) yang sebelumnya telah dilarutkan dalam bufer sampel juga diisikan ke dalam sumur sebanyak 12 l. Kemudian sampel dan standar marker dilarikan dalam gel elektroforesis selama 1.5 - 2 jam pada tegangan 100 V, 50 A. Setelah elektroforesis gel diwarnai dengan Coomasive Briliant Blue (CBB) untuk melihat protein yang terpisah dan diukur jarak migrasi pewarna dari batas atas gel pemisah.

4. Pewarnaan Coomasive Brilliant Blue (CBB)

Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna Coomasive Briliant Blue R-250 (campuan 0.1 g CBB R-250, metanol 40 ml, asam asetat 10 ml, dan 100 ml aquades). Pewarnaan dalam larutan CBB dilakukan selama 30 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna kemudian dihilangkan dengan campuran larutan 40 ml metanol dan 10 ml asam asetat.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENGHASIL XILANASE

Isolasi bakteri dilakukan langsung dari tongkol jagung hibrida yang dibusukkan selama kurang lebih dua bulan. Metode yang digunakan untuk isolasi adalah metode pengamatan visual berdasarkan difusi zona bening (halo) yang terbentuk di bawah dan di sekitar koloni yang ditumbuhkan pada medium padat yang disuplementasikan dengan xilan. Hasil pemilahan isolat bakteri didapatkan 12 koloni membentuk zona bening setelah 18 jam inkubasi dalam media yang mengandung oat splet xylan 0.7 % yang menunjukkan adanya degradasi senyawa xilan oleh enzim-enzim ekstraseluler (xilanolitik) yang dihasilkan bakteri. Isolat-isolat tersebut kemudian diberi kode MBXiK1-MBXiK9 (untuk isolat yang berwarna kuning) dan MBXiP1-MBXiP3 (untuk isolat yang berwarna putih). Setelah itu, masing-masing bakteri diukur indeks xilanolitiknya berdasarkan perbandingan diameter halo yang terbentuk terhadap diameter koloni. Ukuran indeks xilanolitik dari isolat-isolat yang mampu merombak xilan dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7. (A) Berbagai isolat MBXi yang pada media oat spelt xylan,

(B) Indeks xilanolitik berbagai isolat MBXi 3 .1 1

4 .3 0 6 .7 7

5 .8 1 6 .2 3

4 .0 8 5 .3 3

2 .1 0 6 .1 1

3 .2 9 2 .6 7

5 .0 8

0 1 2 3 4 5 6 7 In d e k s X ila n o lit ik

K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 P 1 P 2 P 3

Kode Isolat

K1 K2

K3 K4 K5

P1 K9 P2 K6 K7 K8 P3

Pemilihan isolat yang menghasilkan enzim xilanase terbaik tidak hanya dilakukan berdasarkan indeks xilanolitik yang dihasilkan, tetapi juga ditentukan berdasarkan aktivitas enzim yang dihasilkan setelah bakteri ditumbuhkan pada media cair yang mengandung oat spelt xylan 0.7 %. Hasil pengukuran aktivitas enzim masing-masing isolat dapat dilihat pada Tabel 5. Pengukuran aktivitas enzim terhadap berbagai isolat MBXi dilakukan sebanyak dua kali. Pengukuran I merupakan hasil inokulasi sebanyak satu ose isolat ke dalam erlenmeyer 100 ml yang berisi 25 ml media oat spelt xylan. Pengukuran II merupakan hasil inokulasi 10 % inokulum yang memiliki OD (optical density) 0.6 ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml media oat spelt xylan.

Tabel 5. Aktivitas enzim xilanase berbagai isolat MBXi

Berdasarkan Tabel 5 menunjukkan bahwa aktivitas enzim hasil pengukuran I mempunyai rata-rata aktivitas enzim yang lebih tinggi yaitu 1.53 U/ml dibandingkan aktivitas enzim hasil pengukuran II yaitu 0.81 U/ml. Namun terdapat pengecualian yaitu pada isolat MBXiK6 dan MBXiK7 yang memiliki aktivitas xilanase hasil pengukuran II lebih tinggi dibandingkan aktivitas xilanase hasil pengukuran I. Pengukuran I dilakukan dari produksi enzim yang dihasilkan secara aerob yaitu bakteri diinokulasi dalam erlenmeyer yang memiliki ruang udara lebih besar dan faktor agitasi yang

Kode isolat

Pengukuran I Pengukuran II

Aktivitas Xilanase (U/ml)

Aktivitas xilanase

(U/ml)

Kadar protein (mg/ml)

Aktivitas enzim spesifik

(U/mg)

MBXiK1 2.59 1.27 0.16 7.85

MBXiK2 2.45 0.34 0.15 2.29

MBXiK3 2.40 1.58 0.15 10.84

MBXiK4 5.29 1.78 0.15 11.97

MBXiK5 2.48 0.99 0.14 6.88

MBXiK6 1.25 1.32 0.14 9.11

MBXiK7 0.50 1.59 0.17 9.56

MBXiK8 0.06 0.00 0.15 0.00

MBXiK9 0.90 0.87 0.14 6.35

MBXiP1 0.25 0.00 0.15 0.00

MBXIP2 0.05 0.03 0.16 0.17

MBXiP3 0.10 0.00 0.17 0.00

lebih tinggi, sedangkan pengukuran II dilakukan dalam tabung reaksi yang memiliki ruang udara lebih kecil dan faktor agitasi yang lebih kecil (anaerob). Berdasarkan hal tersebut menunjukkan bahwa bakteri-bakteri hasil pemilihan dari tongkol jagung busuk tersebut lebih cenderung bersifat aerobik (membutuhkan oksigen). Selanjutnya untuk optimasi produksi enzim dilakukan dalam kondisi aerob.

Hubungan indeks xilanolitik dan aktivitas enzim xilanase berdasarkan Gambar 7 dan Tabel 5 tidak berkorelasi nyata. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7 yang menunjukkan bahwa isolat yang memiliki indeks xilanolitik tertinggi adalah isolat MBXiK3 yaitu sebesar 6.77, namun berdasarkan Tabel 5 isolat yang memiliki aktivitas enzim xilanase tertinggi adalah isolat MBXiK4 yaitu sebesar 2.40 U/ml (pengukuran I) dan 1.58 U/ml atau 10.84 U/mg (pengukuran II). Sementara itu, MBXiP3 yang memiliki indeks xilanolitik cukup tinggi yaitu 5.08, hanya memiliki aktivitas xilanase 0.10 U/ml (pengukuran I) dan tidak memiliki aktivitas xilanase pada pengukuran II. Selanjutnya untuk penentuan optimasi produksi dan karakterisasi enzim xilanase digunakan isolat MBXiK4, karena memiliki indeks xilanolitik cukup tinggi yaitu 5.81 dan aktivitas enzim xilanase tertinggi yaitu 5.30 U/ml (pengukuran I) dan 1.78 U/ml atau 11.97 U/mg (pengukuran II). Isolat MBXiK4 terlihat pada Gambar 8.

Gambar 8. Koloni isolat MBXiK4

B. HASIL UJI PROKSIMAT TONGKOL JAGUNG

Kandungan proksimat tongkol jagung berdasarkan hasil penelitian dapat dilihat pada Tabel 6. Hasil penelitian menunjukkan bahwa serat kasar merupakan kandungan yang tertinggi dalam tongkol jagung hibrida, yaitu 34.92 %. Hal ini tidak terlalu berbeda dari hasil penelitian Maynard dan Loosli (1993) yang menyebutkan bahwa komposisi kimia tongkol jagung terdiri dari 35.5 % serat kasar, 2.5 % protein, 0.12 % kalsium, 0.04 % fosfor dan zat-zat lainnya sebesar 38.16 %. Kandungan serat kasar mengalami penurunan yang signifikan setelah mengalami proses delignifikasi, yaitu menjadi 22.71 %. Hal ini dikarenakan proses delignifikasi telah menyebabkan larutnya komponen-komponen hemiselulosa dan selulosa. Akan tetapi xilan yang merupakan salah satu komponen hemiselulosa, pada dasarnya tahan pada kondisi delignifikasi dengan NaOCl, yaitu karena adanya gugus asam galakturonat dan rhamnosa yang terikat pada ujung pereduksi xilan sehingga dapat membuat struktur xilan lebih stabil terhadap kondisi alkali.

Tabel 6. Hasil uji proksimat tongkol jagung

Perlakuan Komposisi Persentase (b.b)

Persentase (b.k)

Sebelum delignifikasi

Air 8.68 9.50

Abu 1.88 2.06

Protein 2.95 3.24

Lemak 0.02 0.02

Karbohidrat total

(by different) 86.47 94.68 Serat kasar 31.89 34.92

Lignolosa 42.80 46.93

Setelah delignifikasi

Air 8.79 9.63

Serat kasar 20.72 22.71

C. OPTIMASI PRODUKSI ENZIM

Optimasi produksi enzim xilanase dilakukan dengan membuat kurva produksi enzim pada berbagai komposisi substrat serta penentuan suhu dan pH optimum produksi enzim. Optimasi produksi enzim sangat penting untuk mendapatkan jumlah enzim yang maksimal. Substrat atau sumber karbon yang digunakan untuk optimasi produksi adalah tongkol jagung 32 mesh yang telah

9.82

11.37 _10.91

9.80 9.77

0 3 6 9 12 15

0 1 2 3 4 5 6

Waktu (Hari)

A

k

ti

v

it

a

s x

ila

n

a

se

(

U

/ml

)

mengalami proses delignifikasi. Sebagai perbandingan penggunaan kualitas tongkol jagung sebagai substrat, optimasi produksi enzim juga dilakukan pada media yang mengandung oat spelt xylan 0.7 %.

1. Optimasi Produksi Enzim pada Media Oat Spelt Xylan

Kurva produksi enzim xilanase pada media oat spelt xylan oleh isolat MBXiK4 dapat dilihat pada Gambar 9. Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan bahwa aktivitas enzim xilanase optimum diproduksi pada hari kedua, yaitu 11.37 U/ml atau 27.26 U/mg dan semakin menurun pada hari-hari berikutnya. Ruiz Arribas et al. (1995), melaporkan bahwa produksi enzim xilanase dari Streptomyces JM 8 yang diisolasi dari jerami padi telah menghasilkan aktivitas enzim sebesar 4.12 U/ml atau 32.03 U/mg. Kultur tersebut ditumbuhkan pada media yang mengandung 1 % ekstrak khamir, 10.3 % sukrosa, 0.5 % oat spelt xylan dan 5 mM MgCl2 serta diinkubasi pada suhu 28oC.

Gambar 9. Kurva produksi xilanase harian oleh isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan

Penurunan produksi enzim xilanase disebabkan karena aktivitas pertumbuhan sel telah menurun setelah memasuki fase stasioner, selain itu pecahnya sel yang mati akan melepaskan protease endogenous yang akan menghidrolisis enzim. Faktor-faktor lainnya adalah terjadinya turn over enzim dan banyaknya gula monomer yang menyebabkan represi pada gen penyandi enzim. Namun berdasarkan data kadar gula pereduksi (Gambar

0.06 0.06

0.05 0.05 0.05

0.04

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08

0 1 2 3 4 5 6

Waktu (Hari)

K

a

d

a

r gul

a

pe

re

duk

si

(m

g

/m

l)

10.) terlihat bahwa kadar gula pereduksi tidak menunjukkan pengaruhnya terhadap penurunan aktivitas enzim xilanase.

Gambar 10. Kadar gula pereduksi isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan

Secara umum semakin lama waktu produksi enzim xilanase, kadar gula pereduksi dalam supernatan tidak mengalami perubahan cukup nyata dan menunjukkan juga bahwa produksi enzim tidak berbanding lurus terhadap konsentrasi gula pereduksi terlarut. Kadar gula pereduksi tertinggi terjadi pada hari ke-0 (sebelum ditambahkan inokulum bakteri) yaitu 0.06 mg/ml dan pada hari pertama yaitu (0.06 mg/ml). Tingginya kadar gula pereduksi pada hari ke-0 disebabkan sebagian xilan mengalami degradasi akibat pemanasan sterilisasi (121oC). Selanjutnya gula-gula pereduksi tersebut menjadi induser untuk sintesis enzim xilanase. Hal ini dapat dilihat bahwa produksi xilanase pada hari pertama telah mencapai aktivitas yang cukup tinggi (9.82 U/ml). Aktivitas enzim yang cukup tinggi tersebut seharusnya menyebabkan tingginya aktivitas katalitik enzim dalam mendegradasi xilan menjadi gula pereduksi (seperti xilosa), akan tetapi pada hari-hari selanjutnya kadar gula pereduksi tidak mengalami peningkatan yaitu 0.05 mg/ml (hari kedua) dan 0.04 mg/ml (hari kelima), melainkan mengalami penurunan konsentrasi walaupun tidak cukup nyata. Hal ini menunjukkan bahwa kemungkinan gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis enzim xilanase digunakan sebagai sumber energi utama bagi isolat MBXiK4.

6.07 5.25

6.13 5.15

6.56

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0

0 1 2 3 4 5 6

Waktu (Hari)

B

obot

bi

om

a

ssa (

m

g

/m

l)

Seperti halnya kadar gula pereduksi, bobot biomassa kultur isolat MBXiK4 dalam media aot spelt xylan juga tidak mengalami perubahan yang cukup nyata dari hari ke hari dan tidak menunjukkan korelasi nyata terhadap aktivitas enzim xilanase yang dihasilkan. Hal ini dapat dilihat bahwa bobot biomassa kering pada hari pertama adalah 6.07 mg/ml dan pada hari kelima adalah 6.56 mg/ml. Kurva bobot biomassa sel dapat dilihat pada Gambar 11. Pengukuran bobot biomassa kering tersebut merupakan bobot endapan sel dan substrat hasil sentrifus inokulum yang kemudian dikeringkan semalam pada suhu 50oC. Bobot biomassa substrat oat spelt xylan yang disuplementasikan ke dalam media yaitu 0.7 g/100 ml (7 mg/ml). Bobot ini sebenarnya mengalami penurunan setelah substrat disterilisasi karena terjadinya proses degradasi menghasilkan gula pereduksi terlarut sebesar 0.06 mg/ml. Seharusnya bobot substrat kering tersebut berkurang dengan meningkatnya kemampuan degradasi oat splet xylan oleh enzim xilanase yang dihasilkan oleh sel, akan tetapi bobot biomassa sel dapat mengalami peningkatan seiring dengan peningkatan konsentrasi sel.

Gambar 11. Bobot biomassa isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan Berbeda dengan kadar gula pereduksi dan bobot biomassa. Kadar protein terlarut mengalami peningkatan setiap hari. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 12. Kadar protein pada hari pertama adalah 0.40 mg/ml, dan terus meningkat sampai hari kelima 0.82 mg/ml. Kadar protein tersebut dipengaruhi oleh sekresi enzim ekstraseluler (xilanase,

0.40 0.42 0.43 0.73

0.82

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0 1 2 3 4 5 6

Waktu (Hari)

K

a

da

r pr

ot

e

in (

m

g/

m

l)

selulase, protease dan sebagainya) yang dihasilkan oleh isolat MBXiK4 dan protein terlarut dari sel yang mati.

Gambar 12. Kadar protein isolat MBXiK4 pada media oat spelt xylan 2. Pengaruh Konsentrasi Substrat, pH dan Suhu Terhadap Produksi

Xilanase pada Media Tongkol Jagung

Pengaruh konsentrasi substrat tongkol jagung terhadap aktivitas enzim xilanase dapat dilihat pada Gambar 13. Berdasarkan hasil pengamatan menunjukkan bahwa produksi enzim xilanase dari isolat MBXiK4 mencapai maksimal pada komposisi tongkol jagung 1 % (b/v), hari ketiga yaitu sebesar 11.59 U/ml dan semakin menurun pada hari-hari berikutnya.

7.16 11.22 11.59 9.93 9.78 9.20 8.92 8.92 7.81 1.59 3.27 3.62 5.20 5.51

6.12 6.16 6.36

4.21 0.50 1.97 2.71 3.35 4.94

4.50 4.64 4.96

2.76 0.41 0.88 1.66 2.16 2.32 3.05 3.19 4.12 2.27 0 2 4 6 8 10 12 14

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Waktu (hari) A k ti v it a s x ila n a s e ( U /m l)

Substrat tongkol jagung 1 % Substrat tongkol jagung 3 % Substrat tongkol jagung 5 % Substrat tongkol jagung 7 %

Gambar 13. Kurva produksi enzim harian isolat MBXiK4 pada berbagai konsentrsi tongkol jagung

Aktivitas enzim juga semakin menurun dengan semakin tingginya kadar substrat tongkol jagung, hal ini terlihat aktivitas enzim pada konsentrasi substrat tongkol jagung 7% < 5% < 3%. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi substrat proses sekresi enzim xilanase semakin lama dan jumlahnya semakin sedikit. Berdasarkan hasil tersebut juga didapatkan bahwa optimasi produksi enzim xilanase dengan menggunakan substrat tongkol jagung 1 % (11.59 U/ml pada hari ketiga) memiliki aktivitas xilanase yang tidak jauh berbeda dibandingkan dengan hasil optimasi dengan menggunakan xilan murni yaitu oat spelt xylan 0.7% (11.37 U/ml pada hari kedua). Hal ini dapat disebabkan karena substrat tongkol jagung mengandung komponen-komponen lain yang dapat menginduksi produksi xilanase oleh isolat MBXiK4 dan tidak terdapat dalam oat spelt xylan. Hasil tersebut juga menunjukkan bahwa penggunaan tongkol jagung sebagai substrat kasar untuk produksi enzim lebih ekonomis dibandingkan dengan menggunakan oat spelt xylan yang merupakan xilan murni dan dengan harga yang lebih mahal. Damaso, et.al. (2002), melaporkan bahwa produksi enzim xilanase dari kapang

Thermomyces lanuginosus IOC-4145 yang diinkubasi selama empat hari telah menghasilkan aktivitas enzim sebesar 516 U/ ml dan aktivitas spesifik enzim sebesar 85 U/mg protein. Media yang digunakan untuk produksi enzim xilanase oleh Thermomyces lanuginosus IOC-4145 adalah tongkol jagung 3% (b/v), pepton 1 % (b/v), meat extract 1 % (b/v), NaCl 1 % (b/v), dan K2HPO4 0.1 % (b/v). Produksi xilanase dari limbah lignoselulosa lainnya juga telah dilakukan oleh Xu, et al. (2005), yang menemukan bahwa produksi xilanase dari dedak gandum oleh isolat Pseudomonas sp. WLU024 (strain hasil mutagenesis) dapat mencapai aktivitas optimum 1245 U/ml selama satu hari. Media yang digunakannya adalah 7 % (b/v) dedak gandum, 0.8 % (b/v) (NH4)2SO4, dan 0.4 % (b/v) K2HPO4. Xu, et al. (2005) juga menemukan bahwa produksi xilanase oleh Pseudomonas sp. WLU024 sangat dipengaruhi oleh komponen sumber nitrogen anorganik ((NH4)2SO4). Penambahan (NH4)2SO4 sampai batas optimalnya dapat meningkatkan aktivitas enzim sebesar 20 %. Oleh karena itu untuk meningkatkan aktivitas optimum xilanase oleh isolat MBXiK4 masih perlu dilakukan optimasi produksi lebih lanjut mengenai pengaruh komponen nitrogen dan mineral-mineral lain terhadap produksi xilanase. Perbandingan hasil penelitian xilanase isolat MBXiK4 terhadap xilanase dari bakteri lain dapat dilihat pada Tabel 10.

Kondisi optimum untuk produksi enzim xilanase oleh isolat MBXiK4 dilakukan suhu 37oC dan pH 7 yaitu dapat dilihat pada Gambar 14. yang menunjukkan bahwa pada kondisi tersebut produksi enzim mencapai aktivitas 9.63 U/ml. Berdasarkan hasil pengamatan menunjukkan bahwa kondisi produksi enzim xilanase sangat dipengaruhi oleh kondisi suhu dan tidak dipengaruhi nyata oleh perubahan pH. Hal ini dapat dilihat pada kurva, umumnya aktivitas enzim cukup tinggi pada suhu 37oC dan mengalami penurunan drastis pada suhu 45oC. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa isolat MBXiK4 merupakan bakteri yang bersifat mesofilik alkalofilik.

7.58

9.63

7.89

7.06

0.59

0.00 0.00 0.00

0 2 4 6 8 10 12

6 7 8 9

pH

A

k

ti

v

it

a

s x

ilan

a

se

(

U

/m

l)

Suhu 37oC Suhu 45oC

Gambar 14. Pengaruh suhu dan pH terhadap produksi xilanase oleh isolat MBXiK4 pada media tongkol jagung 1%

D. PEMEKATAN ENZIM XILANASE ISOLAT MBXiK4

Tujuan pemekatan ekstrak kasar enzim adalah untuk memisahkan dan sekaligus memurnikan secara parsial enzim xilanolitik dari protein-protein lain yang terdapat dalam ekstrak kasar (supernatan). Hal ini akan menyebabkan aktivitas enzim setelah dipekatkan akan lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas ekstrak kasarnya. Pemekatan enzim xilanase dari isolat MBXiK4 dilakukan dengan teknik pengendapan amonium sulfat. Pengendapan dengan amonium sulfat ini didasarkan pada persamaan sifat kepolaran dari amonium sulfat dan air. Penambahan garam amonium sulfat ke dalam larutan protein akan menarik molekul air dari sekitar permukaan molekul protein, akibatnya protein tidak lagi terlindungi molekul air, melainkan beragregasi dengan sesamanya dan kemudian mengendap (Scopes, 1987). Hasil pengendapan amonium sulfat enzim xilanase dapat dilihat pada Gambar 15 dan Tabel 7. Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan bahwa pengendapan ekstrak kasar enzim xilanase dapat diperoleh secara optimum pada penambahan amonium sulfat 50 % (b/v), yaitu aktivitas meningkat sebesar 110.01 % dari aktivitas ekstrak kasar enzim dengan kadar protein tertinggi yaitu 1.65 mg/ml. Hasil pengendapan ekstrak kasar enzim xilanase dengan amonium sulfat yang paling tinggi didapatkan dengan penambahan

amonium sulfat 60 % (b/v), yaitu aktivitas meningkat sebesar 140.64 % dari ekstrak kasar enzim, tetapi kadar protein lebih kecil dari hasil penambahan amonium sulfat 50 % (b/v).

Gambar 15. Pengendapan ekstrak kasar enzim xilanase dengan amonium sulfat, C (kontrol, ekstrak kasar enzim xilanase)

Tabel 7. Hasil pengendapan amonium sulfat

[(NH4)2SO4] (% b/v) Aktivitas xilanase (U/ml) Kadar protein (mg/ml) Aktivitas spesifik xilanase (U/mg) Aktivitas relatif (%) Peningkatan aktivitas (%)

C 6.02 0.62 9.76 100.00 0.00

20% 6.41 0.52 12.39 106.40 6.40

30% 10.23 0.87 11.80 169.94 69.94

40% 12.39 1.52 8.13 205.85 105.85

50% 12.65 1.65 7.68 210.01 110.01

60% 14.49 1.61 9.00 240.64 140.64

C : Kontrol (ekstrak kasar enzim xilanase)

E. KARAKTERISASI ENZIM XILANOLITIK ISOLAT MBXiK4

Karakterisasi enzim bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas enzim sehingga penggunaan enzim dapat disesuaikan dengan kondisi optimumnya. Karakterisasi enzim xilanolitik pada penelitian ini meliputi penentuan pH optimum, suhu optimum, dan stabilitas suhu. Enzim xilanolitik

0.00 6.40 69.94 105.85 110.01 140.64 0 50 100 150 P a n in g kat an akt iv it as ( % )

C 20% 30% 40% 50% 60%

15.1 kDa, 25.4 kDa, 37.2 kDa, 54.5 kDa, 64.2 kDa dan 113.7 kDa. Untuk mengetahui pita manakah yang mempunyai aktivitas xilanase, masih perlu dilakukan analisis zimogram.

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sabang pada tanggal 24 Mei 1984. Penulis adalah anak kedua dari tiga bersaudara pasangan Parsilan, S.Ip dan Yunniar. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SDN Angkasa V pada tahun 1996, kemudian melanjutkan pendidikan di SMPN I Kalijati dan lulus pada tahun 1999. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan ke SMAN I Subang dan lulus pada tahun 2002. Selepas SMA penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) sebagai mahasiswa departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian.

Selama menjalankan pendidikan di IPB penulis sempat menjadi asisten praktikum mata kuliah Analisis Pangan dan mengikuti program Distance Learning (DE) dari Texas A & M University, USA yang berkerjasama dengan SEAFAST CENTER tahun 2006 dan mengambil mata kuliah Food Microbiology. Selain itu juga penulis sempat menjadi pengajar Kimia Dasar di Lembaga Bimbingan Belajar MSC. Kegiatan organisasi yang pernah diikuti penulis diantaranya adalah panitia open house SEAFAST CENTER tahun 2006, panitia BAUR tahun 2004, panitia MPF (Techno F) tahun 2004 dan Lepas Landas Sarjana tahun 2003. Skripsi ini merupakan hasil penelitian penulis sebagai penghargaan bagi peneliti unggul dari Bogasari Nugraha VIII tahun 2005, PT. Indofood Sukses Makmur Tbk.

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Produksi dan Karakterisasi Xilanase Mikroba dari Tongkol Jagung”. Penelitian ini merupakan salah satu upaya diversifikasi produk samping hasil pengolahan jagung yang didanai oleh Bogasari Nugraha VIII, PT. Indofood Sukses Makmur Tbk. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada:

1. Prof. Dr.Ir. Maggy T Suhartono atas bimbingan, perhatian dan dorongan yang kuat selama penulis menjalani studi di Institut Pertanian Bogor.

2. Prof. Dr. Ir. Fransiska Zakaria, MSc. atas kesediannya meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan saran dalam penulisan skripsi ini.

3. Dr. Ir. Budiatman Satiawihardja, M.Sc. atas kesediannya meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan saran dalam penulisa skripsi ini.

4. Pihak Bogasari Nugraha, PT. Indofood Sukses Makmur Tbk., yang telah memberikan dana penelitian.

5. Orang-orang yang tercinta Mama, Bapak, Kak Pina, dan Dini atas kasih sayang, do’a dan pengorbanannya.

6. Teman-teman seperjuangan: Fenni dan Prasna.

7. Warga Lab. MB: Bu Sri, Bu Ika, Bu Lukie, Bu Rika, Bu Ummu, Bu Eni, Mbak Agnes dan yang lainnya. Terimakasih atas segala bantuan, diskusi dan masa-masa indah yang penulis jalani selama penelitian.

8. Team kelompok A2: Nisvi, Christ, Tina dan Fajar.

9. Teman-teman ITP’39: Oga, Mumus, Dhenok, Eva, Manginar, Novi, Sari, Hana, Dora, Ajeng, Fafa, Karen, Shinta, Nanda, Ribka, Didin, Bekti, Dadik dan semuanya yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu. Terimakasih atas bantuannya selama penulis menempuh studi serta kenangan manis selama di ITP.

10. Sahabat-sahabatku di Asrama A2: Ulung, Oqi, Dewi, Erisya, Mel, Indri dan Erna. Terimakasih untuk kesan pertama yang menyenangkan di IPB.

10. Teman-teman di Maharlika atas: Fermut, Iffa, Fera, M’Vivin, Upie, Pipit, Ayang, Fitri1, M’Ifat, Nina, Qiqo, Liano, Ayu, Fitri2, Iin, Ari, Ria, Ranche,

Anna, Hamtoh dan Nucy. Terimaksih atas atas dorongan dan masa-masa indah di kos.

11. Teknisi laboran ITP untuk semua bantuannya selama penulis menjalankan studi di ITP, IPB.

12. Pegawai di tata usaha yang telah banyak membantu penulis.

Bogor, September 2006

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

Kata Pengatar ... i

Daftar Isi ... iii

Daftar Tabel ... v

Daftar Gambar ... vi

Daftar Lampiran ... vii

I. PENDAHULUAN ... 1

A. LATAR BELAKANG ... 2

B. TUJUAN DAN SASARAN ... 3

II. TINJAUAN PUSTAKA ... 4

A. HEMISELULOSA DAN XILAN ... 4

B. TONGKOL JAGUNG ... 7

C. ENZIM XILANOLITIK ... 8

D. MANFAAT ENZIM XILANASE ... 11

E. PRODUKSI XILANASE DARI MIKROORGANISME ... 13

F. MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA PENGHASIL XILANASE ... 16

D. REGULASI SINTESIS XILANASE ... 18

III. BAHAN DAN METODE ... 20

A. BAHAN DAN ALAT ... 20

B. TEMPAT DAN WAKTU PELAKSANAAN PENELITIAN ... 20

C. METODOLOGI PENELITIAN ... 21

1. Isolasi Mikroba dari Tongkol Jagung Busuk ... 21

2. Seleksi Isolat ... 22

3. Analisis Aktivitas Enzim Xilanase ... 23

4. Analisis Aktivitas β-Xilosidase ... 24

5. Penentuan Kadar Protein ... 25

6. Penentuan Kadar Gula Pereduksi ... 25

7. Analisis Proksimat Bahan Baku Tongkol Jagung ... 25

9. Optimasi Produksi Enzim ... 27

10. Pengendapan Enzim Xilanase dengan Amonium Sulfat ((NH4)2SO4 ... 28

11. Karakterisasi Enzim Xilanolitik ... 28

12. Analisis SDS-PAGE ... 29

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 31

A. ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENGHASIL XILANASE ... 31

B. HASIL UJI PROKSIMAT TONGKOL JAGUNG ... 34

C. OPTIMASI PRODUKSI ENZIM ... 34

1. Optimasi Produksi pada Media Oat Spelt Xylan ... 35

2. Pengaruh Konsentrasi Substrat, pH dan Suhu pada Media Tongkol Jagung ... 38

D. PEMEKATAN ENZIM XILANASE ISOLAT MBXiK4 ... 41

E. KARAKTERISASI ENZIM XILANOLITIK ISOLAT MBXiK4 .... 42

1. Penentuan pH Optimum ... 43

2. Penentuan Suhu Optimum ... 45

3. Stabilitas Suhu ... 47

F. ANALISIS SDS-PAGE ... 48

V. KESIMPILAN DAN SARAN ... 52

A. KESIMPULAN ... 52

B. SARAN ... 52

DAFTAR PUSTAKA ... 54