Isolasi dan seleksi bakteri penambat nitrogen dan penghasil indole-3-acetic acid asal sampel tanah dari Jambi Indonesia
ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENAMBAT NITROGEN
DAN PENGHASIL INDOLE-3-ACETIC ACID ASAL SAMPEL
TANAH DARI JAMBI INDONESIA
ISMI ISTI’ANAH
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Seleksi
Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel
Tanah dari Jambi Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Ismi Isti’anah
NIM G34100036
ABSTRAK
ISMI ISTI’ANAH. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil
Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia. Dibimbing oleh
NISA RACHMANIA MUBARIK dan ARIS TJAHJOLEKSONO.
Mikrob yang terdapat di dalam tanah memainkan peranan penting dalam
produktivitas tanaman, terutama dalam proses penambatan nitrogen bebas di
alam dan menghasilkan substansi zat pemacu tumbuh seperti Indole-3-Acetic Acid
(IAA) eksogen. Kedua ciri tersebut diperlukan untuk memacu pertumbuhan
tanaman. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat
nitrogen dan penghasil IAA asal sampel tanah di Taman Nasional Bukit Dua
Belas (TNBD) Jambi. Isolasi dilakukan pada 17 sampel tanah yang diambil dari
daerah rhizosfer tanaman kelapa sawit. Media yang digunakan untuk isolasi ialah
media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB). Isolat yang dipilih
merupakan isolat yang dapat membentuk pelikel berwarna putih pada permukaan
media semisolid tersebut dan mampu mengubah warna media dari hijau menjadi
biru karena terjadi peningkatan pH. Isolasi menghasilkan sepuluh isolat terpilih
yang kemudian diidentifikasi morfologinya. Identifikasi morfologi koloni dan sel
menghasilkan lima isolat. Isolat yang menunjukkan pertumbuhan yang baik yaitu
isolat A13.1 yang diidentifikasi sebagai Pseudomonas luteola dengan
menggunakan KIT API 20 NE. Isolat A13.1 menghasilkan IAA eksogen tertinggi
pada waktu inkubasi hari ke-5 di media NfB. Konsentrasi IAA yang terukur
sebesar 33,88 ppm.
Kata kunci: IAA (Indole-3-Acetic Acid), mikrob, nitrogen, Nitrogen Free
Bromthymol Blue (NfB), rhizosfer
ABSTRACT
ISMI ISTI’ANAH. Isolation and Selection of Nitrogen-Fixing and Producing
Indole-3-Acetic Acid Bacteria from Soil Samples of Jambi Indonesia. Supervised
by NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TJAHJOLEKSONO.
Soil microbes plays an important role in crop productivity, especially in the
process of nitrogen fixation in free nature and produces growth promoting
hormone substances such as Indole-3-Acetic Acid (IAA) exogenous. Both of these
character are needed to promote of plant growth. This study aimed to isolate and
select nitrogen-fixing and producing IAA bacteria from soil samples in Taman
Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi. Isolation was performed in 17 soil
samples taken from the area of oil palm plant rhizosphere. The medium used for
the isolation of semisolid medium is Nitrogen Free Bromthymol Blue (NFB).
Isolates were selected to form an isolated white pellicle on the surface of the
semisolid media and the media is able to change color from green to blue due to
increase of pH. Isolation produced ten selected isolates were then identified its
morphology. Identification of colony morphology and cell produces five selected
isolates. Isolate A13.1 showed the best growth and identified as Pseudomonas
luteola using KIT API 20 NE. The.isolate produced maximum exogenous IAA at
5 days incubation at medium NfB. The amount of IAA was 33.88 ppm.
Keywords: IAA (Indole-3-Acetic Acid), microbes, nitrogen, Nitrogen Free
Bromthymol Blue (NfB), rhizosfer
ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENAMBAT NITROGEN
DAN PENGHASIL INDOLE-3-ACETIC ACID ASAL SAMPEL
TANAH DARI JAMBI INDONESIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil
Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia
Nama
: Ismi Isti’anah
NIM
: G34100036
Disetujui oleh
Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Pembimbing I
Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil’alamiin. Puji syukur kehadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga saya dapat menyelesaikan karya
ilmiah yang berjudul Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil
Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia. Terhitung dari
bulan Oktober 2013-Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
dan Bapak Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku pembimbing yang telah memberikan
pengarahan dan dukungan materi selama penelitian dan penyusunan skripsi. Ucapan
terima kasih disampaikan pula kepada Ibu Dra Hilda Akmal, M.Si selaku penguji,
atas saran dan diskusi yang diberikan. Tak lupa juga penulis ucapkan terima kasih
kepada Mba Eja, Kak Asril, Syifa, Suri, Rastya, Yuli, Ledy, Della, Yunita,
Sumayyah, Olip, Mita, Nisa, Epi, teman-teman asrama serta teman-teman
Laboratorium Mikrobiologi IPB yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, terutama
kedua orang tua (Ibu & Bapak), kakak-kakak (Mas Anifuddin, Mas Sofian, Mas
Iwan), kakak ipar (Mba Ika, Mba Mardha, Mba Ayu), dan keponakan-keponakan
(Yahya, Balqis, Sakhia, Salwa, Syahma, Arkaan) yang senantiasa memberikan
doa, dukungan, dan limpahan kasih sayang. Tak lupa penulis ucapkan terima
kasih kepada teman-teman Biologi 47 atas kerjasama, dukungan, dan
semangatnya.
Semoga karya ilmiah ini dapat menambah wawasan dan pengetahuan bagi
kita semua.
Bogor, Agustus 2014
Ismi Isti’anah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
ix
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
3
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
3
Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA
5
Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
6
PEMBAHASAN
7
SIMPULAN DAN SARAN
9
Simpulan
9
Saran
9
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL
1 Hasil seleksi bakteri penambat nitrogen bebas pada media
Congo Red Agar (CRA)
2 Hasil pertumbuhan lima isolat bakteri terpilih pada media NfB
3 Hasil uji biokimia/fisiologi isolat A13.1
4
5
7
DAFTAR GAMBAR
1 Warna media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB) sebelum
dan setelah dilakukan isolasi
2 Isolat A13.1 pada media seleksi CRA dan hasil pewarnaan Gram
3 Pertumbuhan isolat A13.1 dan produksi IAA yang dihasilkannya
4
5
6
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sampel tanah asal perkebunan kelapa sawit kawasan Hutan Taman
Nasional Bukit Dua Belas Jambi yang berhasil diseleksi pada media
CRA
2 Nilai absorbansi dan nilai log sel selama 7 hari inkubasi
3 Nilai absorbansi (OD 520 nm) isolat A13.1 dalam analisis IAA
4 Produksi IAA (ppm) selama 7 hari inkubasi
12
12
12
13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nitrogen merupakan kebutuhan pokok bagi seluruh organisme sebab
unsur nitrogen diperlukan dalam sintesis molekul-molekul protein yang
kompleks dan berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi organisme.
Oleh karena itu, nitrogen juga merupakan unsur hara yang penting bagi tanaman
karena merupakan salah satu unsur pupuk yang diperlukan dalam jumlah paling
banyak, sehingga bila kekurangan atau jumlah unsur tersebut tidak cukup maka
tanaman tidak dapat tumbuh dengan normal (Sanchez 1993). Penggunaan pupuk
kimia yang berlebihan dapat menyebabkan terjadinya penurunan kualitas di
lahan pertanian (Las et al. 2006). Salah satu solusi yang dapat diterapkan, yakni
dengan menggunakan pupuk hayati.
Indole-3-acetic acid (IAA) yang dikenal dengan nama hormon auksin
berfungsi mengendalikan beberapa mekanisme fisiologi tumbuhan, seperti proses
pembelahan sel dan diferensiasi jaringan tumbuhan. Hormon auksin yang
dihasilkan oleh tumbuhan disebut IAA endogen, sedangkan IAA eksogen
merupakan hormon yang dihasilkan oleh organisme selain tumbuhan (Haq dan
Dahot 2007). IAA eksogen yang dihasilkan oleh jenis mikrob tertentu merupakan
salah satu faktor untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman (Alexander 1977).
Mikrob yang terdapat di dalam tanah memainkan peranan penting dalam
produktivitas tanaman, terutama dalam proses penambatan nitrogen bebas di
alam dan sintesis zat pemacu tumbuh seperti IAA (Tilak et al. 2005). Beberapa
bakteri yang diketahui mampu menambat nitrogen dan mensintesis Indole-3acetic acid (IAA) yaitu Azotobacter, Azospirillum, dan Pseudomonas. Produksi
IAA antarspesies sangat bervariasi serta dipengaruhi oleh kondisi lingkungan,
tingkat pertumbuhan, dan ketersediaan substrat seperti asam amino
(Frankenberger dan Arshad 1995).
Aplikasi bakteri penambat nitrogen bebas dan penghasil IAA belum
dilakukan secara maksimal padahal Indonesia merupakan negara
megabiodiversitas dengan keanekaragaman hayati yang melimpah di seluruh
wilayahnya. Kendala yang masih muncul yaitu masih kurang tersedianya biakan
mikrob unggul. Oleh karena itu, diperlukan upaya bioprospeksi agar dapat
melindungi serta memberdayakan sumberdaya genetik dan hayati yang ada
(Riyadi 2008). Salah satu contoh upaya bioprospeksi yang dapat dilakukan ialah
mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat nitrogen yang hidup bebas dan
penghasil IAA asal Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi. TNBD
Jambi merupakan salah satu daerah yang mengalami deforestasi karena adanya
konversi lahan dari hutan hujan tropis menjadi perkebunan kelapa sawit dan karet.
Penelitian Purnamasari (2013) menyebutkan bahwa terdapat 40 isolat bakteri
selulolitik yang berhasil diisolasi dari sampel tanah perkebunan di sekitar kawasan
TNBD Jambi. Sedangkan publikasi mengenai mikrob penambat nitrogen yang
hidup bebas serta dapat mensintesis IAA di daerah TNBD Jambi belum ada,
sehingga eksplorasi di daerah tersebut sangat menarik untuk dilakukan.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat
nitrogen yang hidup bebas dan penghasil Indole-3-acetic acid (IAA) asal sampel
tanah dari Jambi Indonesia.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2013-Juni 2014 bertempat
di rumah kaca dan Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB.
Prosedur Penelitian
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Sebanyak 17 sampel tanah asal rhizosfer kelapa sawit masing-masing
diencerkan dari 10-1 hingga 10-4 menggunakan larutan garam fisiologis 0,85%.
Sebanyak 0,1 mL suspensi tanah tersebut diletakkan pada media semisolid NfB
(Nitrogen Free Bromthymol Blue) dan diinkubasi selama 7 hari. Komposisi media
NfB (dalam 1 liter) adalah sebagai berikut: asam malat 5,0 g, K2HPO4 0,5 g,
MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCl2.2H2O 0,02 g, indikator bromthymol blue
0,5% dalam KOH 0,2 M 2 mL, larutan vitamin B 1 mL, dan larutan hara mikro 2
mL dengan komposisi sebagai berikut CuSO4.5H2O 40 mg, ZnSO4.7H2O 0,12 g,
H2BO3 1,4 g, Na2MO4.2H2O 1,0 g, MnSO4.H2O 1,175 g, FeEDTA 1,64% 4 mL,
KOH 4,5 g. pH disesuaikan menjadi 6,8 dan ditambahkan 1,75 g agar-agar (Okon
et al.1977). Isolat yang didapatkan dari hasil isolasi kemudian diseleksi
menggunakan media CRA (Congo Red Agar).
Media CRA (dalam 1 liter), terdiri atas: asam malat 5,0 g, K2HPO4 0,5 g,
MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCl2.2H2O 0,02 g, indikator merah kongo
0,25% dalam akuades 10 mL, ekstrak khamir 0,05 g, dan larutan hara mikro 2 mL
dengan komposisi sebagai berikut CuSO4.5H2O 40 mg, ZnSO4.7H2O 0,12 g,
H2BO3 1,4 g, Na2MO4.2H2O 1,0 g, dan MnSO4.H2O 1,175 g, FeEDTA 1,64% 4
mL, KOH 4,5 g. pH disesuaikan menjadi 6,8 dan ditambahkan 15 g agar-agar
(Caceres 1982).
Karakter morfologi diidentifikasi dengan mengacu pada Holt et al. (1994).
Karakter morfologi yang diamati meliputi bentuk koloni, warna koloni, elevasi,
tepian, bentuk sel bakteri, dan pewarnaan Gram.
Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA
Isolat terpilih pada media seleksi CRA selanjutnya dibiakkan di dalam
media NfB pada suhu 30 oC sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm. Setiap 24
jam dilakukan pengambilan kultur untuk dilakukan pengukuran absorbansi pada
panjang gelombang 520 nm yang berlangsung sampai dengan 7 hari.
3
Analisis IAA dilakukan dengan metode kolorimetri menggunakan reagen
Salkowski (Gordon dan Weber 1950). Sebanyak 50 mL media cair NfB ditambah
dengan 1,0 mM triptofan (Trp). Media tersebut diinokulasi dengan 1 mL kultur
bakteri dalam media cair NfB yang telah berumur 24 jam. Kemudian diinkubasi
selama 7 hari pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 120 rpm. Kandungan
IAA di dalam media dihitung setiap 24 jam selama 7 hari berdasarkan kurva
standar IAA dengan perlakuan berupa media ditambah dengan Trp dan yang tidak
ditambah dengan Trp.
Kandungan IAA pada media kultur diuji dengan mengambil 1,5 mL kultur
ke dalam tabung mikro, kemudian kultur tersebut disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 10.000 g. Sebanyak 1 ml supernatan direaksikan dengan 4 mL
reagen Salkowski (150 mL H2SO4 pekat; 7,5 mL FeCl3.6H2O 0,5 M; dan 250 mL
akuades steril), diinkubasi selama 15 menit tanpa paparan cahaya, kemudian
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm menggunakan
spektrofotometer Genesys. Kandungan IAA di dalam media dapat diketahui
dengan menggunakan kurva standar pengukuran IAA dengan konsentrasi 0-50
ppm.
Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Ciri fisiologi diamati menggunakan KIT API 20 NE bioMérieux®sa yang
merupakan sebuah sistem yang terstandarisasi untuk mengidentifikasi bakteri
gram negatif yang bersifat nonenterik. Bakteri yang akan diuji menggunakan alat
KIT API 20 NE bioMérieux®sa ini akan melalui 8 uji konvensional, 12 uji
asimilasi, serta sebuah basis data sehingga dapat diidentifikasi jenis bakteri yang
diujikan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Sebanyak 36 isolat didapatkan dari proses isolasi 17 sampel tanah asal
rhizosfer kelapa sawit menggunakan media NfB. Isolat yang diduga memiliki
kemampuan menambat nitrogen bebas menunjukkan perubahan warna media dari
hijau menjadi biru dan membentuk pelikel berwarna putih pada permukaan media
(Gambar 1). Isolat-isolat tersebut kemudian diseleksi pada media CRA.
4
Gambar 1
Warna media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB)
sebelum dilakukan isolasi (a) dan warna media semisolid setelah
dilakukan isolasi pada hari ke-7 serta pelikel putih yang terbentuk
pada permukaan media (tanda panah) (b)
Sepuluh isolat terpilih dari hasil seleksi pada media CRA diidentifikasi
secara morfologi. Bentuk kesepuluh isolat tersebut ialah bundar dengan warna
merah muda hingga merah, memiliki tepian licin beraturan atau tidak beraturan,
serta elevasi yang cembung (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil seleksi bakteri penambat nitrogen bebas pada media Congo Red
Agar (CRA)
No
Kode Isolat
1
A4.1
Bentuk
Bundar
2
A6.0
Bundar
3
A6.1
Bundar
4
A12.0
Bundar
5
A12.1
Bundar
6
A13.1
Bundar
7
N1.0
Bundar
8
N2.1
Bundar
9
N6.1
Bundar
10
N7.1
Bundar
Ciri Koloni
Warna
Tepian
Merah
Licin,
muda
tidak
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
muda
tidak
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
(Jingga) beraturan
Merah
Licin,
muda
tidak
beraturan
Merah
Licin,
tidak
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Elevasi
Cembung
Ciri Sel
Bentuk
Gram
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Bulat
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa dari sepuluh isolat, sembilan
di antaranya memiliki bentuk sel batang (basil) dan satu isolat yaitu isolat A12.0
memiliki bentuk sel bulat (kokus). Sepuluh isolat terpilih tersebut termasuk ke
dalam Gram negatif yaitu ditandai dengan warna sel yang merah setelah diberi
5
perlakuan pewarnaan Gram. Morfologi salah satu isolat terpilih, yaitu isolat A13.1
dapat dilihat pada gambar 2.
1 mm
1 µm
a
b
Gambar 2 Isolat A13.1 pada media CRA (a) dan hasil pewarnaan Gram isolat
A13.1 pada perbesaran 1000x (b)
Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA
Sebanyak 5 dari 10 isolat terpilih, yaitu A6.0, A12.1, A13.1, N2.1, dan
N7.1 diuji kemampuan pertumbuhannya dalam media NfB selama masa inkubasi
24 jam. Pemilihan 5 isolat tersebut berdasarkan kemiripan morfologi dengan
kelompok bakteri penambat nitrogen dari genus Azospirillum. Isolat A13.1
memiliki nilai log sel tertinggi sebesar 10,924 pada waktu inkubasi 24 jam (Tabel
2).
Tabel 2 Hasil pertumbuhan lima isolat bakteri terpilih pada media NfB
Isolat
Nilai Log Sel
A6.0
10,082
Produksi IAA
(ppm)*
60
A13.1
10,924
33,88
N2.1
10,093
N6.1
10,892
N7.1
10,886
20
20
50
*Keterangan : Produksi IAA dihitung setelah masa inkubasi 5 hari
Kelima isolat menghasilkan IAA eksogen masing-masing pada waktu
inkubasi 120 jam pertumbuhannya, namun berdasarkan hasil penentuan kurva
standar, isolat A13.1 menunjukkan nilai log sel tertinggi sehingga dipilih untuk
diuji lebih lanjut pertumbuhannya pada media NfB. Kurva tumbuh diperlukan
untuk mengetahui fase pertumbuhan dari isolat A13.1 tersebut. Penghitungan
jumlah sel dilakukan setiap 24 jam selama 7 hari. Hasil kurva tumbuh
menunjukkan bahwa isolat A13.1 memiliki jumlah sel hingga 108 pada akhir fase
log. Isolat A13.1 mengalami fase log dari hari ke-2 hingga hari ke-3, kemudian
memasuki fase stasioner pada hari ke-3 hingga ke-5. Pertumbuhan isolat A13.1
pada medium produksi pH 6,8, suhu 30 oC menunjukkan bahwa pada hari ke-3
terjadi kenaikan angka rapat optis yang diukur pada panjang gelombang 520 nm
(Gambar 3). Nilai log sel dari isolat A13.1 tertinggi pada waktu inkubasi 120 jam
(hari ke-5) sebesar 8,448.
6
Gambar 3 Pertumbuhan isolat A13.1 (
dengan penambahan Trp (
(
)
) , produksi IAA pada media
), dan tanpa penambahan Trp
Proses seleksi selanjutnya yaitu menentukan kurva produksi sintesis IAA
eksogen oleh isolat A13.1. Pengukuran IAA dilakukan selama 7 hari dengan
menggunakan reagen Salkowski dengan pengukuran kurva standar IAA setiap
harinya. Nilai absorbansi tersebut diinterpolasikan pada persamaan garis dari
kurva standar IAA sehingga diperoleh konsentrasi antara 5 hingga 33,88 ppm
pada media dengan penambahan Trp. Sedangkan konsentrasi 0,041 hingga 0,93
ppm diperoleh pada perlakuan media tanpa penambahan Trp. Perlakuan dengan
menggunakan penambahan Trp menunjukkan sintesis IAA meningkat dari hari
pertama dan optimum pada hari ke-5 (Gambar 3).
Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Identifikasi secara fisiologi dilakukan menggunakan alat KIT API 20 NE
bioMérieux®sa. Kit API 20 NE terdiri atas 20 microtubes mengandung substrat
yang diinokulasi dengan larutan saline bacterial suspension. Selama masa
inkubasi 24 dan 48 jam, hasil reaksi metabolisme menghasilkan perubahan warna.
Reaksi yang berlangsung dibaca sesuai dengan Reading Table dan identifikasi
diperoleh dengan mengacu pada Indeks Analytical Profile pada perangkat lunak.
Berdasarkan identifikasi menggunakan alat KIT API 20 NE
bioMérieux®sa, isolat A13.1 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas luteola
sebesar 99%. Kesamaan ini meliputi bakteri yang termasuk ke dalam Gram
negatif, sel berbentuk batang, koloni berukuran 0,5-1,0 x1,5-5,0 μm. Ketika diuji
dengan KIT API 20 NE memberikan hasil oksidase negatif dan dapat
menggunakan asam malat sebagai sumber karbon (Tabel 3) serta suhu optimum
pertumbuhan pada 30-37oC.
7
Tabel 3 Hasil uji biokimia/fisiologi isolat A13.1
Reaksi pada KIT API 20 NE
Hasil reaksi
Reduksi nitrat ke nitrit (NO3)
Produksi indol (TRP)
Kemampuan fermentasi (GLU)
Arginine dihydrolase (ADH)
Urease (URE)
Hidrolisis β-glucosidase (ESC)
Hidrolisis protease (GEL)
β-glucosidase (PNG)
Asimilasi glukosa (GLU)
Asimilasi arabinosa (ARA)
Asimilasi mannosa (MNE)
Asimilasi mannitol (MAN)
Asimilasi N-Asetil-Glukosamin (NAG)
Asimilasi maltosa (MAL)
Asimilasi potassium glukonat (GNT)
Asimilasi capric acid (CAP)
Asimilasi adipic acid (ADI)
Asimilasi malat (MLT)
Asimilasi trisodium sitrat (CIT)
Asimilasi phenylacetic acid (PAC)
Cytochrome oxidase (OX)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Keterangan:
(+) = hasil positif, (-) = hasil negatif
Pembahasan
Isolasi bakteri yang dilakukan pada 17 sampel tanah rhizosfer di Jambi di
dalam media NfB bertujuan mengetahui kemampuan bakteri dalam proses
penambatan nitrogen bebas. Media NfB tidak mengandung unsur nitrogen pada
komposisi bahannya sehingga isolat yang dapat ditumbuhkan dalam media
tersebut ialah isolat yang mampu memfiksasi nitrogen bebas. Sebanyak 17 sampel
tanah yang diinokulasi ke dalam media semisolid NfB menghasilkan isolat-isolat
terpilih. Pemilihan isolat berdasarkan pada kemampuan dalam penambatan
nitrogen bebas. Adanya pelikel putih yang tumbuh di permukaan media
menunjukkan keberhasilan dari isolat yang memiliki kemampuan dapat menambat
nitrogen bebas (Kumar dan Pannerselvam 2013). Selain itu, bakteri yang diduga
dapat menambat nitrogen bebas juga memiliki kemampuan untuk mengubah pH
media menjadi lebih basa. Hal ini ditandai dengan perubahan warna media yang
semula berwarna hijau menjadi berwana kebiruan.
Isolat-isolat bakteri yang terpilih selanjutnya diseleksi menggunakan
media CRA (Congo Red Agar). Media CRA merupakan media modifikasi dari
NfB sehingga komposisi bahan yang menyusun media CRA sama dengan NfB.
Namun media CRA menggunakan indikator berupa merah kongo dan terdapat
ekstrak khamir. Penggunaan merah kongo sebagai indikator berperan dalam
membedakan serta memisahkan genus Rhizobium dari bakteri penambat nitrogen
bebas, seperti genus Azospirillum (Caceres 1982). Ekstrak khamir berfungsi
sebagai pemacu tumbuh sel di fase awal karena ekstrak khamir memiliki
8
kemampuan menyediakan faktor pertumbuhan, seperti asam malat yang
digunakan oleh bakteri dalam proses metabolisme serta menjaga pH media agar
tetap netral, yaitu 6,8-7,0 (Kung et al. 1996).
Hasil identifikasi secara fisiologi menggunakan alat KIT API 20 NE
bioMérieux®sa menunjukkan bahwa isolat A13.1 memilliki 99% kesamaan
dengan spesies Pseudomonas luteola. Isolat P. luteola memiliki karakteristik
sebagai PGPR (Planth Growth Promoting Bacteria), yaitu meningkatkan
pertumbuhan tanaman karena memproduksi fitohormon seperti auksin (Deshwal
et al. 2013). Ali dan Sabri (2010) menyatakan bahwa anggota dari genus
Pseudomonas sp. merupakan salah satu contoh dari bakteri tanah (rhizobakteria)
yang mampu menghasilkan IAA. Selain itu, Stieglmeier et al. (2009) melaporkan
bahwa P. luteola berhasil diisolasi dalam medium tanpa N sehingga diketahui
bahwa P. luteola merupakan bakteri penambat nitrogen bebas. Isolat ini termasuk
ke dalam kelompok Proteobacteria, yaitu kelompok dari Bacteria yang
anggotanya terdiri atas bakteri Gram negatif. Berdasarkan identifikasi 16S rRNA,
secara filogenetik filum Proteobacteria dibagi ke dalam 5 kelas, yaitu
Alphaproteobacteria,
Betaproteobacteria,
Gammaproteobacteria,
Deltaproteobacteria, dan Epsilonproteobacteria. Isolat A13.1 termasuk ke dalam
kelas Gammaproteobacteria. Isolat ini termasuk ke dalam kelas yang sama
dengan bakteri penambat nitrogen dari genus Azotobacter (Madigan et al. 2006).
Kurva tumbuh isolat A13.1 (Gambar 3) menunjukkan bahwa isolat A13.1
tersebut digolongkan sebagai bakteri yang tumbuh lambat karena pencapaian fase
log dari bakteri tersebut baru terjadi pada hari ke-3. Hal ini sesuai dengan
pernyataan bahwa bakteri yang hidup di rhizosfer umumnya merupakan bakteri
yang tumbuh lambat karena ketersediaan nutrisi yang terbatas (Rao 1994). Kurva
pertumbuhan bakteri juga berhubungan dengan kurva konsentrasi IAA yang
dihasilkan oleh isolat A13.1 (Gambar 3). IAA disintesis optimum sejak akhir fase
log dan mencapai konsentrasi tertinggi di akhir fase stasioner.
Produksi IAA pada media pertumbuhan isolat A13.1 didukung oleh
triptofan sebagai prekusor. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Zakharova
et al. (1999), Trp merupakan prekursor yang paling efisien digunakan bakteri.
IAA dapat disintesis dengan berbagai lintasan dan senyawa intermediet yang
berbeda. Menurut berbagai jalur sintesis IAA digunakan oleh prokariot, suatu
galur bakteri dapat menggunakan lebih dari satu jalur sintesis IAA. Jalur-jalur ini
dikelompokkan berdasarkan jenis senyawa antaranya, yaitu jalur indol asetamida
(IAM), asam indol-3-piruvat (IPA), triptamin (TAM), dan indol-3-asetonitril
(IAN) (Patten dan Glick 1996).
Jalur indol asetamida (IAM) merupakan jalur yang umum digunakan bakteri
dalam mensintesis IAA. Triptofan diubah menjadi indol asetamida oleh enzim
triptofan-2-monooksigenase. Gen yang terkait IAM telah terdeteksi pada berbagai
spesies Pseudomonas. Bakteri Pseudomonas luteola menggunakan triptofan
sebagai prekusor dalam proses produksi IAA melalui jalur indol asetamida (IAM).
Selain Pseudomonas luteola, bakteri-bakteri rhizosfer seperti Agrobacterium
tumefaciens, Rhizobium, dan Bradyrhizobium juga menggunakan jalur indol
asetamida (IAM) (Spaepen et al. 2007).
Produksi IAA diukur dengan metode kolorimetri yang mengindikasikan
adanya IAA dari tingkatan kepekatan warna yang terbentuk karena adanya cincin
indol (Lindow et al. 1998). Cincin indol terbentuk setelah supernatan isolat A13.1
9
direaksikan dengan reagen Salkowski. Salkowski merupakan reagen pewarna
yang dapat digunakan untuk menguji senyawa indol dan turunannya. Reagen
Salkowski akan mengoksidasi senyawa indol dan turunannya. Indol ialah senyawa
organik golongan aromatik yang memiliki struktur bisiklik yang terdiri atas cincin
benzena (Joule dan Mills 2000). IAA merupakan salah satu contoh senyawa yang
memiliki gugus indol sehingga akan memberikan konsentrasi warna merah muda.
Kepekatan warna berbanding lurus dengan peningkatan jumlah IAA yang
dihasilkan (Ehmann 1977).
Data mengenai kurva tumbuh serta konsentrasi IAA yang diperoleh dalam
penelitian dapat digunakan sebagai data awal sebelum isolat digunakan sebagai
formulasi pupuk hayati. Oleh karena itu, diperlukan pengujian lebih lanjut dari
isolat A13.1 dalam kemampuannya menambat nitrogen bebas. Kemampuan
penambatan jumlah nitrogen bebas dapat dilihat dari kemampuan isolat A13.1
dalam mereduksi asetilen dengan menggunakan metode Asetilene Reduction
Assay sehingga dapat diketahui keefektifan penggunaan isolat A13.1 dalam
pembuatan formulasi pupuk hayati. Proses identifikasi lebih lanjut dengan teknik
molekuler juga diperlukan agar isolat A13.1 dapat diidentifikasi sampai tingkat
spesies.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Bakteri penambat nitrogen yang hidup bebas dan dapat menghasilkan
Indole-3-Acetic Acid (IAA) dari Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi
berhasil diisolasi. Isolat terpilih yaitu isolat A13.1 yang merupakan bakteri Gram
negatif serta menunjukkan kemiripan dengan Pseudomonas luteola sebesar 99%.
Isolat A13.1 optimum mensintesis IAA pada hari ke-5, yaitu pada fase
pertumbuhan stasioner.
Saran
Penelitian ini merupakan penelitian pendahuluan sehingga diperlukan
pengujian lebih lanjut pada isolat-isolat terpilih lainnya. Selain itu, identifikasi
molekuler menggunakan 16S rRNA juga diperlukan agar diketahui secara pasti
spesies bakteri yang akan digunakan untuk proses aplikasi di lapangan.
10
DAFTAR PUSTAKA
Alexander M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. Ed ke-2. New York (US):
J Willey.
Ali B, Sabri AN. 2010. Rhizobacterial potential to alter auxin content and growth
of Vignata radiata (L.). World J Microbiol Biotech. 26(8):1397-1384.
Caceres EAR. 1982. Improved medium for isolation of Azospirillum spp. Appl
Environ Microbiol. 44(4):990-991.
Deshwal VK, Singh SB, Kumar P, Chubey A. 2013. Rhizobia unique plant
growth promoting rhizobacteria. Int J Life Sci. 2(2):53-55.
Ehmann A. 1977. The van urk-salkowski reagent- a sensitive and specific
chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic detection and
identification on indole derivatives. J Chrom. 132(1977):267-276.
Frankenberger M, Arshad WT. 1995. Phytohormones in Soils: Microbial
Production and Function. New York (US): Marcel Dekker Inc.
Gordon SA, Weber RP. 1950. Colorimetric estimation of indolacetic acid. Plant
Physiol. 26(1):192-195.
Haq I, Dahot MU. 2007. Micropropagation efficiency in banana (Musa spp.)
under different immersion systems. Pak J Biol Sci. 10(5):726-733.
Holt JG, Krig NR, Sneath P, Staley J, William S. 1994. Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Pennsylvania (US): Lipincott
Williams and Wilkins Company.
Joule JA, Mills K. 2000. Heterocyclic Chemistry. Oxford(UK): Blackwell Science
Kumar S, Pannerselvam A. 2013. Studies on Azospirillum isolated from the soils
of Thiruvarur Dt., Tamilnadu, India. Adv Appl Sci Res. 4(1):86-93.
Kung LJR, Kreck RST, Tung AO, Hession. 1996. Effect of a life yeast culture and
enzymes on in vitro ruminal fermentation and milk production of dairy
cow. J Dairy Sci. 80(5):2045-2051.
Las I, Setiyanto AP, Subagyono K. 2006. Isu dan pengelolaan lingkungan dalam
revitalisasi pertanian. J Litbang Pertan. 25(3): 1-8.
Lindow SE, Desurmont C, Elkins R, McGourty G, Clark E, Brandl MT. 1998.
Occurrence of indole-3-acetic acid producing bacteria on pear trees and
their association with fruit russet. Bacteriology 88(11):1151-1157.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2006. Brock: Biology of
Microorganisms. 12th Ed. San Fransisco (US): Pearson Education Inc.
Okon Y, Albrecht SL, Burris RH. 1977. Methods for growing Spirillum lipoferum
and for counting it in pure culture and in association with plants. Appl
Environ Microbiol. 33 (1):85-88.
Patten CL, Glick BR. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can J
Microbiol. 42(2):207-220.
Purnamasari D. 2013. Isolasi dan seleksi bakteri selulolitik penghambat
pertumbuhan cendawan pada tanaman kelapa sawit [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Rao NS. 1994. Mikrobiologi Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Susilo H,
penerjemah. Jakarta (ID): UI Press. Terjemahan dari: Soil Microorganisms
and Plant Growth. Ed ke-2.
11
Riyadi I. 2008. Potensi pengelolaan bioprospeksi terhadap pertumbuhan ekonomi
Indonesia. J Litbang Pertan. 27(2):69-73.
Sanchez PA. 1993. Sifat dan Pengelolaan Tanah Tropika. Bandung (ID) : ITB
Press.
Spaepen S, Jos V, Roseline R. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and
microorganism plant signaling. FEMS Microbiol Rev. 31:425–448
Stieglmeier M, Wirth R, Kminek G, Moisl-Eichinger C. 2009. Cultivation of
anaerobic and facultatively anaerobic bacteria from spacecraft-assosiated
clean rooms. Appl Environ Microbiol. 75(11): 3484-3491.
Tilak KVBR, Ranganayaki N, Pal KK, Saxena AK, Nautiyal CS. 2005. Diversity
of plant growth and soil health supporting bacteria. Curr Sci. 89(1):136150.
Zakharova E, Schcherbakov A, Brudnik V, Skripko N, Bulkhin N, Ignatov V.
1999. Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense.
Insight from quantum chemistry. Eur J Biochem. 259(2):572-576.
12
LAMPIRAN
Lampiran 1 Sampel tanah asal perkebunan kelapa sawit kawasan Hutan Taman
Nasional Bukit Dua Belas, Jambi yang berhasil diseleksi pada media
CRA
Plot
1
2
4
CRC Plot
B03
B03
B03
B02
B02
B02
BR4
BR4
No.
N1
N2
A4
A6
N6
N7
A12
A13
Sub plot
DE45
HI23
JJ45
B02
JJ67
FG07
BC23
BO43
Kode
1261
1253
1310
1306
1305
637
660
Lampiran 2 Nilai absorbansi dan nilai log sel selama 7 hari inkubasi
Waktu Inkubasi
(Hari ke-)
0
1
2
3
4
5
6
7
Nilai Absorbansi
OD520nm
0,296
0,595
0,607
0,868
0,872
0,881
0,718
0,684
Log Sel
0
2,612
2,857
8,18
8,265
8,448
5,122
4,427
Lampiran 3 Nilai absorbansi (OD 520 nm) isolat A13.1 dalam analisis IAA
Waktu Inkubasi
(Hari ke-)
0
1
2
3
4
5
6
7
(+) Trp
(-) Trp
0,023
0,133
0,189
0,409
0,590
0,643
0,634
0,608
0,001
0,022
0,031
0,041
0,047
0,072
0,015
0,015
13
Lampiran 4 Produksi IAA (ppm) selama 7 hari inkubasi
Waktu Inkubasi
(Hari ke-)
0
1
2
3
4
5
6
7
(+) Trp
(-) Trp
0
5
6,93
7,36
32
33,88
30,63
20,07
0
0
0
0,041
0
0,29
0
0,93
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Purbalingga pada tanggal 17 Mei 1992 dari ayah
Abdul Azis dan ibu Tumidjah. Penulis merupakan anak keempat dari empat
bersaudara. Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Purwokerto. Pada tahun
yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI) di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Peningkatan Prestasi
Akademik (PPA) dari DIKTI pada tahun 2011-2014. Pada tahun 2013 penulis
diterima sebagai mahasiswa program sinergi S1-S2 fast-track untuk program studi S2
Mikrobiologi.
Penulis aktif mengikuti beberapa kegiatan dalam masa studi seperti
menjadi peserta kompetisi olimpiade biologi pada OSN Pertamina (2011-2012)
dan ON-MIPA DIKTI tingkat regional III (2012-2013) serta kegiatan Organisasi
Mahasiswa Daerah (OMDA) Banyumas. Penulis juga aktif mengikuti lomba baca
puisi SPIRIT FMIPA IPB (2012-2013) dan IAC (IPB Art Contest). Penulis juga
menjadi anggota divisi Tatib (Tata Tertib) dalam acara Masa Perkenalan Departemen
Biologi “MORFOLOGI” tahun 2012-2013, divisi Tim Khusus Lomba Cepat Tepat
Biologi (LCTB) Pesta Sains Nasional IPB tahun 2012, serta beberapa kepanitiaan
lainnya.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
Biologi Dasar (2012) dan asisten responsi Sosiologi Umum (2012-2013). Tanggal
3-5 Juli 2012 penulis melaksanakan Studi Lapang di Taman Nasional Gunung
Gede-Pangrango (TNGGP) dengan judul Kekayaan Jenis Pinang di Kebun Raya
Cibodas. Setelah itu, pada bulan Juni hingga Juli 2013, penulis melaksanakan
Praktik Lapangan dengan topik Manajemen dan Proses Eksplorasi, Identifikasi,
serta Perawatan Fosil Hewan Famili Bovidae di Balai Pelestarian Situs Manusia
Purba (BPSMP) Sangiran.
DAN PENGHASIL INDOLE-3-ACETIC ACID ASAL SAMPEL
TANAH DARI JAMBI INDONESIA
ISMI ISTI’ANAH
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Isolasi dan Seleksi
Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel
Tanah dari Jambi Indonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Ismi Isti’anah
NIM G34100036
ABSTRAK
ISMI ISTI’ANAH. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil
Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia. Dibimbing oleh
NISA RACHMANIA MUBARIK dan ARIS TJAHJOLEKSONO.
Mikrob yang terdapat di dalam tanah memainkan peranan penting dalam
produktivitas tanaman, terutama dalam proses penambatan nitrogen bebas di
alam dan menghasilkan substansi zat pemacu tumbuh seperti Indole-3-Acetic Acid
(IAA) eksogen. Kedua ciri tersebut diperlukan untuk memacu pertumbuhan
tanaman. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat
nitrogen dan penghasil IAA asal sampel tanah di Taman Nasional Bukit Dua
Belas (TNBD) Jambi. Isolasi dilakukan pada 17 sampel tanah yang diambil dari
daerah rhizosfer tanaman kelapa sawit. Media yang digunakan untuk isolasi ialah
media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB). Isolat yang dipilih
merupakan isolat yang dapat membentuk pelikel berwarna putih pada permukaan
media semisolid tersebut dan mampu mengubah warna media dari hijau menjadi
biru karena terjadi peningkatan pH. Isolasi menghasilkan sepuluh isolat terpilih
yang kemudian diidentifikasi morfologinya. Identifikasi morfologi koloni dan sel
menghasilkan lima isolat. Isolat yang menunjukkan pertumbuhan yang baik yaitu
isolat A13.1 yang diidentifikasi sebagai Pseudomonas luteola dengan
menggunakan KIT API 20 NE. Isolat A13.1 menghasilkan IAA eksogen tertinggi
pada waktu inkubasi hari ke-5 di media NfB. Konsentrasi IAA yang terukur
sebesar 33,88 ppm.
Kata kunci: IAA (Indole-3-Acetic Acid), mikrob, nitrogen, Nitrogen Free
Bromthymol Blue (NfB), rhizosfer
ABSTRACT
ISMI ISTI’ANAH. Isolation and Selection of Nitrogen-Fixing and Producing
Indole-3-Acetic Acid Bacteria from Soil Samples of Jambi Indonesia. Supervised
by NISA RACHMANIA MUBARIK and ARIS TJAHJOLEKSONO.
Soil microbes plays an important role in crop productivity, especially in the
process of nitrogen fixation in free nature and produces growth promoting
hormone substances such as Indole-3-Acetic Acid (IAA) exogenous. Both of these
character are needed to promote of plant growth. This study aimed to isolate and
select nitrogen-fixing and producing IAA bacteria from soil samples in Taman
Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi. Isolation was performed in 17 soil
samples taken from the area of oil palm plant rhizosphere. The medium used for
the isolation of semisolid medium is Nitrogen Free Bromthymol Blue (NFB).
Isolates were selected to form an isolated white pellicle on the surface of the
semisolid media and the media is able to change color from green to blue due to
increase of pH. Isolation produced ten selected isolates were then identified its
morphology. Identification of colony morphology and cell produces five selected
isolates. Isolate A13.1 showed the best growth and identified as Pseudomonas
luteola using KIT API 20 NE. The.isolate produced maximum exogenous IAA at
5 days incubation at medium NfB. The amount of IAA was 33.88 ppm.
Keywords: IAA (Indole-3-Acetic Acid), microbes, nitrogen, Nitrogen Free
Bromthymol Blue (NfB), rhizosfer
ISOLASI DAN SELEKSI BAKTERI PENAMBAT NITROGEN
DAN PENGHASIL INDOLE-3-ACETIC ACID ASAL SAMPEL
TANAH DARI JAMBI INDONESIA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Judul Skripsi : Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil
Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia
Nama
: Ismi Isti’anah
NIM
: G34100036
Disetujui oleh
Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
Pembimbing I
Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Iman Rusmana, MSi
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Alhamdulillahirabbil’alamiin. Puji syukur kehadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga saya dapat menyelesaikan karya
ilmiah yang berjudul Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan Penghasil
Indole-3-Acetic Acid Asal Sampel Tanah dari Jambi Indonesia. Terhitung dari
bulan Oktober 2013-Juni 2014 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen
Biologi IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi
dan Bapak Dr. Aris Tjahjoleksono, DEA selaku pembimbing yang telah memberikan
pengarahan dan dukungan materi selama penelitian dan penyusunan skripsi. Ucapan
terima kasih disampaikan pula kepada Ibu Dra Hilda Akmal, M.Si selaku penguji,
atas saran dan diskusi yang diberikan. Tak lupa juga penulis ucapkan terima kasih
kepada Mba Eja, Kak Asril, Syifa, Suri, Rastya, Yuli, Ledy, Della, Yunita,
Sumayyah, Olip, Mita, Nisa, Epi, teman-teman asrama serta teman-teman
Laboratorium Mikrobiologi IPB yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, terutama
kedua orang tua (Ibu & Bapak), kakak-kakak (Mas Anifuddin, Mas Sofian, Mas
Iwan), kakak ipar (Mba Ika, Mba Mardha, Mba Ayu), dan keponakan-keponakan
(Yahya, Balqis, Sakhia, Salwa, Syahma, Arkaan) yang senantiasa memberikan
doa, dukungan, dan limpahan kasih sayang. Tak lupa penulis ucapkan terima
kasih kepada teman-teman Biologi 47 atas kerjasama, dukungan, dan
semangatnya.
Semoga karya ilmiah ini dapat menambah wawasan dan pengetahuan bagi
kita semua.
Bogor, Agustus 2014
Ismi Isti’anah
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
ix
DAFTAR GAMBAR
ix
DAFTAR LAMPIRAN
ix
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
METODE
2
Waktu dan Tempat
2
Prosedur Penelitian
2
HASIL
3
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
3
Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA
5
Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
6
PEMBAHASAN
7
SIMPULAN DAN SARAN
9
Simpulan
9
Saran
9
DAFTAR PUSTAKA
10
LAMPIRAN
12
RIWAYAT HIDUP
14
DAFTAR TABEL
1 Hasil seleksi bakteri penambat nitrogen bebas pada media
Congo Red Agar (CRA)
2 Hasil pertumbuhan lima isolat bakteri terpilih pada media NfB
3 Hasil uji biokimia/fisiologi isolat A13.1
4
5
7
DAFTAR GAMBAR
1 Warna media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB) sebelum
dan setelah dilakukan isolasi
2 Isolat A13.1 pada media seleksi CRA dan hasil pewarnaan Gram
3 Pertumbuhan isolat A13.1 dan produksi IAA yang dihasilkannya
4
5
6
DAFTAR LAMPIRAN
1 Sampel tanah asal perkebunan kelapa sawit kawasan Hutan Taman
Nasional Bukit Dua Belas Jambi yang berhasil diseleksi pada media
CRA
2 Nilai absorbansi dan nilai log sel selama 7 hari inkubasi
3 Nilai absorbansi (OD 520 nm) isolat A13.1 dalam analisis IAA
4 Produksi IAA (ppm) selama 7 hari inkubasi
12
12
12
13
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Nitrogen merupakan kebutuhan pokok bagi seluruh organisme sebab
unsur nitrogen diperlukan dalam sintesis molekul-molekul protein yang
kompleks dan berpengaruh terhadap pertumbuhan dan reproduksi organisme.
Oleh karena itu, nitrogen juga merupakan unsur hara yang penting bagi tanaman
karena merupakan salah satu unsur pupuk yang diperlukan dalam jumlah paling
banyak, sehingga bila kekurangan atau jumlah unsur tersebut tidak cukup maka
tanaman tidak dapat tumbuh dengan normal (Sanchez 1993). Penggunaan pupuk
kimia yang berlebihan dapat menyebabkan terjadinya penurunan kualitas di
lahan pertanian (Las et al. 2006). Salah satu solusi yang dapat diterapkan, yakni
dengan menggunakan pupuk hayati.
Indole-3-acetic acid (IAA) yang dikenal dengan nama hormon auksin
berfungsi mengendalikan beberapa mekanisme fisiologi tumbuhan, seperti proses
pembelahan sel dan diferensiasi jaringan tumbuhan. Hormon auksin yang
dihasilkan oleh tumbuhan disebut IAA endogen, sedangkan IAA eksogen
merupakan hormon yang dihasilkan oleh organisme selain tumbuhan (Haq dan
Dahot 2007). IAA eksogen yang dihasilkan oleh jenis mikrob tertentu merupakan
salah satu faktor untuk meningkatkan pertumbuhan tanaman (Alexander 1977).
Mikrob yang terdapat di dalam tanah memainkan peranan penting dalam
produktivitas tanaman, terutama dalam proses penambatan nitrogen bebas di
alam dan sintesis zat pemacu tumbuh seperti IAA (Tilak et al. 2005). Beberapa
bakteri yang diketahui mampu menambat nitrogen dan mensintesis Indole-3acetic acid (IAA) yaitu Azotobacter, Azospirillum, dan Pseudomonas. Produksi
IAA antarspesies sangat bervariasi serta dipengaruhi oleh kondisi lingkungan,
tingkat pertumbuhan, dan ketersediaan substrat seperti asam amino
(Frankenberger dan Arshad 1995).
Aplikasi bakteri penambat nitrogen bebas dan penghasil IAA belum
dilakukan secara maksimal padahal Indonesia merupakan negara
megabiodiversitas dengan keanekaragaman hayati yang melimpah di seluruh
wilayahnya. Kendala yang masih muncul yaitu masih kurang tersedianya biakan
mikrob unggul. Oleh karena itu, diperlukan upaya bioprospeksi agar dapat
melindungi serta memberdayakan sumberdaya genetik dan hayati yang ada
(Riyadi 2008). Salah satu contoh upaya bioprospeksi yang dapat dilakukan ialah
mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat nitrogen yang hidup bebas dan
penghasil IAA asal Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi. TNBD
Jambi merupakan salah satu daerah yang mengalami deforestasi karena adanya
konversi lahan dari hutan hujan tropis menjadi perkebunan kelapa sawit dan karet.
Penelitian Purnamasari (2013) menyebutkan bahwa terdapat 40 isolat bakteri
selulolitik yang berhasil diisolasi dari sampel tanah perkebunan di sekitar kawasan
TNBD Jambi. Sedangkan publikasi mengenai mikrob penambat nitrogen yang
hidup bebas serta dapat mensintesis IAA di daerah TNBD Jambi belum ada,
sehingga eksplorasi di daerah tersebut sangat menarik untuk dilakukan.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menyeleksi bakteri penambat
nitrogen yang hidup bebas dan penghasil Indole-3-acetic acid (IAA) asal sampel
tanah dari Jambi Indonesia.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2013-Juni 2014 bertempat
di rumah kaca dan Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA IPB.
Prosedur Penelitian
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Sebanyak 17 sampel tanah asal rhizosfer kelapa sawit masing-masing
diencerkan dari 10-1 hingga 10-4 menggunakan larutan garam fisiologis 0,85%.
Sebanyak 0,1 mL suspensi tanah tersebut diletakkan pada media semisolid NfB
(Nitrogen Free Bromthymol Blue) dan diinkubasi selama 7 hari. Komposisi media
NfB (dalam 1 liter) adalah sebagai berikut: asam malat 5,0 g, K2HPO4 0,5 g,
MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCl2.2H2O 0,02 g, indikator bromthymol blue
0,5% dalam KOH 0,2 M 2 mL, larutan vitamin B 1 mL, dan larutan hara mikro 2
mL dengan komposisi sebagai berikut CuSO4.5H2O 40 mg, ZnSO4.7H2O 0,12 g,
H2BO3 1,4 g, Na2MO4.2H2O 1,0 g, MnSO4.H2O 1,175 g, FeEDTA 1,64% 4 mL,
KOH 4,5 g. pH disesuaikan menjadi 6,8 dan ditambahkan 1,75 g agar-agar (Okon
et al.1977). Isolat yang didapatkan dari hasil isolasi kemudian diseleksi
menggunakan media CRA (Congo Red Agar).
Media CRA (dalam 1 liter), terdiri atas: asam malat 5,0 g, K2HPO4 0,5 g,
MgSO4.7H2O 0,2 g, NaCl 0,1 g, CaCl2.2H2O 0,02 g, indikator merah kongo
0,25% dalam akuades 10 mL, ekstrak khamir 0,05 g, dan larutan hara mikro 2 mL
dengan komposisi sebagai berikut CuSO4.5H2O 40 mg, ZnSO4.7H2O 0,12 g,
H2BO3 1,4 g, Na2MO4.2H2O 1,0 g, dan MnSO4.H2O 1,175 g, FeEDTA 1,64% 4
mL, KOH 4,5 g. pH disesuaikan menjadi 6,8 dan ditambahkan 15 g agar-agar
(Caceres 1982).
Karakter morfologi diidentifikasi dengan mengacu pada Holt et al. (1994).
Karakter morfologi yang diamati meliputi bentuk koloni, warna koloni, elevasi,
tepian, bentuk sel bakteri, dan pewarnaan Gram.
Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA
Isolat terpilih pada media seleksi CRA selanjutnya dibiakkan di dalam
media NfB pada suhu 30 oC sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm. Setiap 24
jam dilakukan pengambilan kultur untuk dilakukan pengukuran absorbansi pada
panjang gelombang 520 nm yang berlangsung sampai dengan 7 hari.
3
Analisis IAA dilakukan dengan metode kolorimetri menggunakan reagen
Salkowski (Gordon dan Weber 1950). Sebanyak 50 mL media cair NfB ditambah
dengan 1,0 mM triptofan (Trp). Media tersebut diinokulasi dengan 1 mL kultur
bakteri dalam media cair NfB yang telah berumur 24 jam. Kemudian diinkubasi
selama 7 hari pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 120 rpm. Kandungan
IAA di dalam media dihitung setiap 24 jam selama 7 hari berdasarkan kurva
standar IAA dengan perlakuan berupa media ditambah dengan Trp dan yang tidak
ditambah dengan Trp.
Kandungan IAA pada media kultur diuji dengan mengambil 1,5 mL kultur
ke dalam tabung mikro, kemudian kultur tersebut disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 10.000 g. Sebanyak 1 ml supernatan direaksikan dengan 4 mL
reagen Salkowski (150 mL H2SO4 pekat; 7,5 mL FeCl3.6H2O 0,5 M; dan 250 mL
akuades steril), diinkubasi selama 15 menit tanpa paparan cahaya, kemudian
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm menggunakan
spektrofotometer Genesys. Kandungan IAA di dalam media dapat diketahui
dengan menggunakan kurva standar pengukuran IAA dengan konsentrasi 0-50
ppm.
Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Ciri fisiologi diamati menggunakan KIT API 20 NE bioMérieux®sa yang
merupakan sebuah sistem yang terstandarisasi untuk mengidentifikasi bakteri
gram negatif yang bersifat nonenterik. Bakteri yang akan diuji menggunakan alat
KIT API 20 NE bioMérieux®sa ini akan melalui 8 uji konvensional, 12 uji
asimilasi, serta sebuah basis data sehingga dapat diidentifikasi jenis bakteri yang
diujikan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Isolasi dan Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Sebanyak 36 isolat didapatkan dari proses isolasi 17 sampel tanah asal
rhizosfer kelapa sawit menggunakan media NfB. Isolat yang diduga memiliki
kemampuan menambat nitrogen bebas menunjukkan perubahan warna media dari
hijau menjadi biru dan membentuk pelikel berwarna putih pada permukaan media
(Gambar 1). Isolat-isolat tersebut kemudian diseleksi pada media CRA.
4
Gambar 1
Warna media semisolid Nitrogen Free Bromthymol Blue (NfB)
sebelum dilakukan isolasi (a) dan warna media semisolid setelah
dilakukan isolasi pada hari ke-7 serta pelikel putih yang terbentuk
pada permukaan media (tanda panah) (b)
Sepuluh isolat terpilih dari hasil seleksi pada media CRA diidentifikasi
secara morfologi. Bentuk kesepuluh isolat tersebut ialah bundar dengan warna
merah muda hingga merah, memiliki tepian licin beraturan atau tidak beraturan,
serta elevasi yang cembung (Tabel 1).
Tabel 1 Hasil seleksi bakteri penambat nitrogen bebas pada media Congo Red
Agar (CRA)
No
Kode Isolat
1
A4.1
Bentuk
Bundar
2
A6.0
Bundar
3
A6.1
Bundar
4
A12.0
Bundar
5
A12.1
Bundar
6
A13.1
Bundar
7
N1.0
Bundar
8
N2.1
Bundar
9
N6.1
Bundar
10
N7.1
Bundar
Ciri Koloni
Warna
Tepian
Merah
Licin,
muda
tidak
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
muda
tidak
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
(Jingga) beraturan
Merah
Licin,
muda
tidak
beraturan
Merah
Licin,
tidak
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Merah
Licin,
muda
beraturan
Elevasi
Cembung
Ciri Sel
Bentuk
Gram
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Bulat
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Cembung
Batang
Negatif
Hasil pewarnaan Gram menunjukkan bahwa dari sepuluh isolat, sembilan
di antaranya memiliki bentuk sel batang (basil) dan satu isolat yaitu isolat A12.0
memiliki bentuk sel bulat (kokus). Sepuluh isolat terpilih tersebut termasuk ke
dalam Gram negatif yaitu ditandai dengan warna sel yang merah setelah diberi
5
perlakuan pewarnaan Gram. Morfologi salah satu isolat terpilih, yaitu isolat A13.1
dapat dilihat pada gambar 2.
1 mm
1 µm
a
b
Gambar 2 Isolat A13.1 pada media CRA (a) dan hasil pewarnaan Gram isolat
A13.1 pada perbesaran 1000x (b)
Penapisan Isolat Bakteri untuk Produksi IAA
Sebanyak 5 dari 10 isolat terpilih, yaitu A6.0, A12.1, A13.1, N2.1, dan
N7.1 diuji kemampuan pertumbuhannya dalam media NfB selama masa inkubasi
24 jam. Pemilihan 5 isolat tersebut berdasarkan kemiripan morfologi dengan
kelompok bakteri penambat nitrogen dari genus Azospirillum. Isolat A13.1
memiliki nilai log sel tertinggi sebesar 10,924 pada waktu inkubasi 24 jam (Tabel
2).
Tabel 2 Hasil pertumbuhan lima isolat bakteri terpilih pada media NfB
Isolat
Nilai Log Sel
A6.0
10,082
Produksi IAA
(ppm)*
60
A13.1
10,924
33,88
N2.1
10,093
N6.1
10,892
N7.1
10,886
20
20
50
*Keterangan : Produksi IAA dihitung setelah masa inkubasi 5 hari
Kelima isolat menghasilkan IAA eksogen masing-masing pada waktu
inkubasi 120 jam pertumbuhannya, namun berdasarkan hasil penentuan kurva
standar, isolat A13.1 menunjukkan nilai log sel tertinggi sehingga dipilih untuk
diuji lebih lanjut pertumbuhannya pada media NfB. Kurva tumbuh diperlukan
untuk mengetahui fase pertumbuhan dari isolat A13.1 tersebut. Penghitungan
jumlah sel dilakukan setiap 24 jam selama 7 hari. Hasil kurva tumbuh
menunjukkan bahwa isolat A13.1 memiliki jumlah sel hingga 108 pada akhir fase
log. Isolat A13.1 mengalami fase log dari hari ke-2 hingga hari ke-3, kemudian
memasuki fase stasioner pada hari ke-3 hingga ke-5. Pertumbuhan isolat A13.1
pada medium produksi pH 6,8, suhu 30 oC menunjukkan bahwa pada hari ke-3
terjadi kenaikan angka rapat optis yang diukur pada panjang gelombang 520 nm
(Gambar 3). Nilai log sel dari isolat A13.1 tertinggi pada waktu inkubasi 120 jam
(hari ke-5) sebesar 8,448.
6
Gambar 3 Pertumbuhan isolat A13.1 (
dengan penambahan Trp (
(
)
) , produksi IAA pada media
), dan tanpa penambahan Trp
Proses seleksi selanjutnya yaitu menentukan kurva produksi sintesis IAA
eksogen oleh isolat A13.1. Pengukuran IAA dilakukan selama 7 hari dengan
menggunakan reagen Salkowski dengan pengukuran kurva standar IAA setiap
harinya. Nilai absorbansi tersebut diinterpolasikan pada persamaan garis dari
kurva standar IAA sehingga diperoleh konsentrasi antara 5 hingga 33,88 ppm
pada media dengan penambahan Trp. Sedangkan konsentrasi 0,041 hingga 0,93
ppm diperoleh pada perlakuan media tanpa penambahan Trp. Perlakuan dengan
menggunakan penambahan Trp menunjukkan sintesis IAA meningkat dari hari
pertama dan optimum pada hari ke-5 (Gambar 3).
Identifikasi Bakteri Penambat Nitrogen Bebas
Identifikasi secara fisiologi dilakukan menggunakan alat KIT API 20 NE
bioMérieux®sa. Kit API 20 NE terdiri atas 20 microtubes mengandung substrat
yang diinokulasi dengan larutan saline bacterial suspension. Selama masa
inkubasi 24 dan 48 jam, hasil reaksi metabolisme menghasilkan perubahan warna.
Reaksi yang berlangsung dibaca sesuai dengan Reading Table dan identifikasi
diperoleh dengan mengacu pada Indeks Analytical Profile pada perangkat lunak.
Berdasarkan identifikasi menggunakan alat KIT API 20 NE
bioMérieux®sa, isolat A13.1 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas luteola
sebesar 99%. Kesamaan ini meliputi bakteri yang termasuk ke dalam Gram
negatif, sel berbentuk batang, koloni berukuran 0,5-1,0 x1,5-5,0 μm. Ketika diuji
dengan KIT API 20 NE memberikan hasil oksidase negatif dan dapat
menggunakan asam malat sebagai sumber karbon (Tabel 3) serta suhu optimum
pertumbuhan pada 30-37oC.
7
Tabel 3 Hasil uji biokimia/fisiologi isolat A13.1
Reaksi pada KIT API 20 NE
Hasil reaksi
Reduksi nitrat ke nitrit (NO3)
Produksi indol (TRP)
Kemampuan fermentasi (GLU)
Arginine dihydrolase (ADH)
Urease (URE)
Hidrolisis β-glucosidase (ESC)
Hidrolisis protease (GEL)
β-glucosidase (PNG)
Asimilasi glukosa (GLU)
Asimilasi arabinosa (ARA)
Asimilasi mannosa (MNE)
Asimilasi mannitol (MAN)
Asimilasi N-Asetil-Glukosamin (NAG)
Asimilasi maltosa (MAL)
Asimilasi potassium glukonat (GNT)
Asimilasi capric acid (CAP)
Asimilasi adipic acid (ADI)
Asimilasi malat (MLT)
Asimilasi trisodium sitrat (CIT)
Asimilasi phenylacetic acid (PAC)
Cytochrome oxidase (OX)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Keterangan:
(+) = hasil positif, (-) = hasil negatif
Pembahasan
Isolasi bakteri yang dilakukan pada 17 sampel tanah rhizosfer di Jambi di
dalam media NfB bertujuan mengetahui kemampuan bakteri dalam proses
penambatan nitrogen bebas. Media NfB tidak mengandung unsur nitrogen pada
komposisi bahannya sehingga isolat yang dapat ditumbuhkan dalam media
tersebut ialah isolat yang mampu memfiksasi nitrogen bebas. Sebanyak 17 sampel
tanah yang diinokulasi ke dalam media semisolid NfB menghasilkan isolat-isolat
terpilih. Pemilihan isolat berdasarkan pada kemampuan dalam penambatan
nitrogen bebas. Adanya pelikel putih yang tumbuh di permukaan media
menunjukkan keberhasilan dari isolat yang memiliki kemampuan dapat menambat
nitrogen bebas (Kumar dan Pannerselvam 2013). Selain itu, bakteri yang diduga
dapat menambat nitrogen bebas juga memiliki kemampuan untuk mengubah pH
media menjadi lebih basa. Hal ini ditandai dengan perubahan warna media yang
semula berwarna hijau menjadi berwana kebiruan.
Isolat-isolat bakteri yang terpilih selanjutnya diseleksi menggunakan
media CRA (Congo Red Agar). Media CRA merupakan media modifikasi dari
NfB sehingga komposisi bahan yang menyusun media CRA sama dengan NfB.
Namun media CRA menggunakan indikator berupa merah kongo dan terdapat
ekstrak khamir. Penggunaan merah kongo sebagai indikator berperan dalam
membedakan serta memisahkan genus Rhizobium dari bakteri penambat nitrogen
bebas, seperti genus Azospirillum (Caceres 1982). Ekstrak khamir berfungsi
sebagai pemacu tumbuh sel di fase awal karena ekstrak khamir memiliki
8
kemampuan menyediakan faktor pertumbuhan, seperti asam malat yang
digunakan oleh bakteri dalam proses metabolisme serta menjaga pH media agar
tetap netral, yaitu 6,8-7,0 (Kung et al. 1996).
Hasil identifikasi secara fisiologi menggunakan alat KIT API 20 NE
bioMérieux®sa menunjukkan bahwa isolat A13.1 memilliki 99% kesamaan
dengan spesies Pseudomonas luteola. Isolat P. luteola memiliki karakteristik
sebagai PGPR (Planth Growth Promoting Bacteria), yaitu meningkatkan
pertumbuhan tanaman karena memproduksi fitohormon seperti auksin (Deshwal
et al. 2013). Ali dan Sabri (2010) menyatakan bahwa anggota dari genus
Pseudomonas sp. merupakan salah satu contoh dari bakteri tanah (rhizobakteria)
yang mampu menghasilkan IAA. Selain itu, Stieglmeier et al. (2009) melaporkan
bahwa P. luteola berhasil diisolasi dalam medium tanpa N sehingga diketahui
bahwa P. luteola merupakan bakteri penambat nitrogen bebas. Isolat ini termasuk
ke dalam kelompok Proteobacteria, yaitu kelompok dari Bacteria yang
anggotanya terdiri atas bakteri Gram negatif. Berdasarkan identifikasi 16S rRNA,
secara filogenetik filum Proteobacteria dibagi ke dalam 5 kelas, yaitu
Alphaproteobacteria,
Betaproteobacteria,
Gammaproteobacteria,
Deltaproteobacteria, dan Epsilonproteobacteria. Isolat A13.1 termasuk ke dalam
kelas Gammaproteobacteria. Isolat ini termasuk ke dalam kelas yang sama
dengan bakteri penambat nitrogen dari genus Azotobacter (Madigan et al. 2006).
Kurva tumbuh isolat A13.1 (Gambar 3) menunjukkan bahwa isolat A13.1
tersebut digolongkan sebagai bakteri yang tumbuh lambat karena pencapaian fase
log dari bakteri tersebut baru terjadi pada hari ke-3. Hal ini sesuai dengan
pernyataan bahwa bakteri yang hidup di rhizosfer umumnya merupakan bakteri
yang tumbuh lambat karena ketersediaan nutrisi yang terbatas (Rao 1994). Kurva
pertumbuhan bakteri juga berhubungan dengan kurva konsentrasi IAA yang
dihasilkan oleh isolat A13.1 (Gambar 3). IAA disintesis optimum sejak akhir fase
log dan mencapai konsentrasi tertinggi di akhir fase stasioner.
Produksi IAA pada media pertumbuhan isolat A13.1 didukung oleh
triptofan sebagai prekusor. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Zakharova
et al. (1999), Trp merupakan prekursor yang paling efisien digunakan bakteri.
IAA dapat disintesis dengan berbagai lintasan dan senyawa intermediet yang
berbeda. Menurut berbagai jalur sintesis IAA digunakan oleh prokariot, suatu
galur bakteri dapat menggunakan lebih dari satu jalur sintesis IAA. Jalur-jalur ini
dikelompokkan berdasarkan jenis senyawa antaranya, yaitu jalur indol asetamida
(IAM), asam indol-3-piruvat (IPA), triptamin (TAM), dan indol-3-asetonitril
(IAN) (Patten dan Glick 1996).
Jalur indol asetamida (IAM) merupakan jalur yang umum digunakan bakteri
dalam mensintesis IAA. Triptofan diubah menjadi indol asetamida oleh enzim
triptofan-2-monooksigenase. Gen yang terkait IAM telah terdeteksi pada berbagai
spesies Pseudomonas. Bakteri Pseudomonas luteola menggunakan triptofan
sebagai prekusor dalam proses produksi IAA melalui jalur indol asetamida (IAM).
Selain Pseudomonas luteola, bakteri-bakteri rhizosfer seperti Agrobacterium
tumefaciens, Rhizobium, dan Bradyrhizobium juga menggunakan jalur indol
asetamida (IAM) (Spaepen et al. 2007).
Produksi IAA diukur dengan metode kolorimetri yang mengindikasikan
adanya IAA dari tingkatan kepekatan warna yang terbentuk karena adanya cincin
indol (Lindow et al. 1998). Cincin indol terbentuk setelah supernatan isolat A13.1
9
direaksikan dengan reagen Salkowski. Salkowski merupakan reagen pewarna
yang dapat digunakan untuk menguji senyawa indol dan turunannya. Reagen
Salkowski akan mengoksidasi senyawa indol dan turunannya. Indol ialah senyawa
organik golongan aromatik yang memiliki struktur bisiklik yang terdiri atas cincin
benzena (Joule dan Mills 2000). IAA merupakan salah satu contoh senyawa yang
memiliki gugus indol sehingga akan memberikan konsentrasi warna merah muda.
Kepekatan warna berbanding lurus dengan peningkatan jumlah IAA yang
dihasilkan (Ehmann 1977).
Data mengenai kurva tumbuh serta konsentrasi IAA yang diperoleh dalam
penelitian dapat digunakan sebagai data awal sebelum isolat digunakan sebagai
formulasi pupuk hayati. Oleh karena itu, diperlukan pengujian lebih lanjut dari
isolat A13.1 dalam kemampuannya menambat nitrogen bebas. Kemampuan
penambatan jumlah nitrogen bebas dapat dilihat dari kemampuan isolat A13.1
dalam mereduksi asetilen dengan menggunakan metode Asetilene Reduction
Assay sehingga dapat diketahui keefektifan penggunaan isolat A13.1 dalam
pembuatan formulasi pupuk hayati. Proses identifikasi lebih lanjut dengan teknik
molekuler juga diperlukan agar isolat A13.1 dapat diidentifikasi sampai tingkat
spesies.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Bakteri penambat nitrogen yang hidup bebas dan dapat menghasilkan
Indole-3-Acetic Acid (IAA) dari Taman Nasional Bukit Dua Belas (TNBD) Jambi
berhasil diisolasi. Isolat terpilih yaitu isolat A13.1 yang merupakan bakteri Gram
negatif serta menunjukkan kemiripan dengan Pseudomonas luteola sebesar 99%.
Isolat A13.1 optimum mensintesis IAA pada hari ke-5, yaitu pada fase
pertumbuhan stasioner.
Saran
Penelitian ini merupakan penelitian pendahuluan sehingga diperlukan
pengujian lebih lanjut pada isolat-isolat terpilih lainnya. Selain itu, identifikasi
molekuler menggunakan 16S rRNA juga diperlukan agar diketahui secara pasti
spesies bakteri yang akan digunakan untuk proses aplikasi di lapangan.
10
DAFTAR PUSTAKA
Alexander M. 1977. Introduction to Soil Microbiology. Ed ke-2. New York (US):
J Willey.
Ali B, Sabri AN. 2010. Rhizobacterial potential to alter auxin content and growth
of Vignata radiata (L.). World J Microbiol Biotech. 26(8):1397-1384.
Caceres EAR. 1982. Improved medium for isolation of Azospirillum spp. Appl
Environ Microbiol. 44(4):990-991.
Deshwal VK, Singh SB, Kumar P, Chubey A. 2013. Rhizobia unique plant
growth promoting rhizobacteria. Int J Life Sci. 2(2):53-55.
Ehmann A. 1977. The van urk-salkowski reagent- a sensitive and specific
chromogenic reagent for silica gel thin-layer chromatographic detection and
identification on indole derivatives. J Chrom. 132(1977):267-276.
Frankenberger M, Arshad WT. 1995. Phytohormones in Soils: Microbial
Production and Function. New York (US): Marcel Dekker Inc.
Gordon SA, Weber RP. 1950. Colorimetric estimation of indolacetic acid. Plant
Physiol. 26(1):192-195.
Haq I, Dahot MU. 2007. Micropropagation efficiency in banana (Musa spp.)
under different immersion systems. Pak J Biol Sci. 10(5):726-733.
Holt JG, Krig NR, Sneath P, Staley J, William S. 1994. Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology. Ed ke-9. Pennsylvania (US): Lipincott
Williams and Wilkins Company.
Joule JA, Mills K. 2000. Heterocyclic Chemistry. Oxford(UK): Blackwell Science
Kumar S, Pannerselvam A. 2013. Studies on Azospirillum isolated from the soils
of Thiruvarur Dt., Tamilnadu, India. Adv Appl Sci Res. 4(1):86-93.
Kung LJR, Kreck RST, Tung AO, Hession. 1996. Effect of a life yeast culture and
enzymes on in vitro ruminal fermentation and milk production of dairy
cow. J Dairy Sci. 80(5):2045-2051.
Las I, Setiyanto AP, Subagyono K. 2006. Isu dan pengelolaan lingkungan dalam
revitalisasi pertanian. J Litbang Pertan. 25(3): 1-8.
Lindow SE, Desurmont C, Elkins R, McGourty G, Clark E, Brandl MT. 1998.
Occurrence of indole-3-acetic acid producing bacteria on pear trees and
their association with fruit russet. Bacteriology 88(11):1151-1157.
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2006. Brock: Biology of
Microorganisms. 12th Ed. San Fransisco (US): Pearson Education Inc.
Okon Y, Albrecht SL, Burris RH. 1977. Methods for growing Spirillum lipoferum
and for counting it in pure culture and in association with plants. Appl
Environ Microbiol. 33 (1):85-88.
Patten CL, Glick BR. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can J
Microbiol. 42(2):207-220.
Purnamasari D. 2013. Isolasi dan seleksi bakteri selulolitik penghambat
pertumbuhan cendawan pada tanaman kelapa sawit [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Rao NS. 1994. Mikrobiologi Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Susilo H,
penerjemah. Jakarta (ID): UI Press. Terjemahan dari: Soil Microorganisms
and Plant Growth. Ed ke-2.
11
Riyadi I. 2008. Potensi pengelolaan bioprospeksi terhadap pertumbuhan ekonomi
Indonesia. J Litbang Pertan. 27(2):69-73.
Sanchez PA. 1993. Sifat dan Pengelolaan Tanah Tropika. Bandung (ID) : ITB
Press.
Spaepen S, Jos V, Roseline R. 2007. Indole-3-acetic acid in microbial and
microorganism plant signaling. FEMS Microbiol Rev. 31:425–448
Stieglmeier M, Wirth R, Kminek G, Moisl-Eichinger C. 2009. Cultivation of
anaerobic and facultatively anaerobic bacteria from spacecraft-assosiated
clean rooms. Appl Environ Microbiol. 75(11): 3484-3491.
Tilak KVBR, Ranganayaki N, Pal KK, Saxena AK, Nautiyal CS. 2005. Diversity
of plant growth and soil health supporting bacteria. Curr Sci. 89(1):136150.
Zakharova E, Schcherbakov A, Brudnik V, Skripko N, Bulkhin N, Ignatov V.
1999. Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense.
Insight from quantum chemistry. Eur J Biochem. 259(2):572-576.
12
LAMPIRAN
Lampiran 1 Sampel tanah asal perkebunan kelapa sawit kawasan Hutan Taman
Nasional Bukit Dua Belas, Jambi yang berhasil diseleksi pada media
CRA
Plot
1
2
4
CRC Plot
B03
B03
B03
B02
B02
B02
BR4
BR4
No.
N1
N2
A4
A6
N6
N7
A12
A13
Sub plot
DE45
HI23
JJ45
B02
JJ67
FG07
BC23
BO43
Kode
1261
1253
1310
1306
1305
637
660
Lampiran 2 Nilai absorbansi dan nilai log sel selama 7 hari inkubasi
Waktu Inkubasi
(Hari ke-)
0
1
2
3
4
5
6
7
Nilai Absorbansi
OD520nm
0,296
0,595
0,607
0,868
0,872
0,881
0,718
0,684
Log Sel
0
2,612
2,857
8,18
8,265
8,448
5,122
4,427
Lampiran 3 Nilai absorbansi (OD 520 nm) isolat A13.1 dalam analisis IAA
Waktu Inkubasi
(Hari ke-)
0
1
2
3
4
5
6
7
(+) Trp
(-) Trp
0,023
0,133
0,189
0,409
0,590
0,643
0,634
0,608
0,001
0,022
0,031
0,041
0,047
0,072
0,015
0,015
13
Lampiran 4 Produksi IAA (ppm) selama 7 hari inkubasi
Waktu Inkubasi
(Hari ke-)
0
1
2
3
4
5
6
7
(+) Trp
(-) Trp
0
5
6,93
7,36
32
33,88
30,63
20,07
0
0
0
0,041
0
0,29
0
0,93
14
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Purbalingga pada tanggal 17 Mei 1992 dari ayah
Abdul Azis dan ibu Tumidjah. Penulis merupakan anak keempat dari empat
bersaudara. Tahun 2010 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Purwokerto. Pada tahun
yang sama, penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi
Masuk IPB (USMI) di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Penulis mendapatkan beasiswa Peningkatan Prestasi
Akademik (PPA) dari DIKTI pada tahun 2011-2014. Pada tahun 2013 penulis
diterima sebagai mahasiswa program sinergi S1-S2 fast-track untuk program studi S2
Mikrobiologi.
Penulis aktif mengikuti beberapa kegiatan dalam masa studi seperti
menjadi peserta kompetisi olimpiade biologi pada OSN Pertamina (2011-2012)
dan ON-MIPA DIKTI tingkat regional III (2012-2013) serta kegiatan Organisasi
Mahasiswa Daerah (OMDA) Banyumas. Penulis juga aktif mengikuti lomba baca
puisi SPIRIT FMIPA IPB (2012-2013) dan IAC (IPB Art Contest). Penulis juga
menjadi anggota divisi Tatib (Tata Tertib) dalam acara Masa Perkenalan Departemen
Biologi “MORFOLOGI” tahun 2012-2013, divisi Tim Khusus Lomba Cepat Tepat
Biologi (LCTB) Pesta Sains Nasional IPB tahun 2012, serta beberapa kepanitiaan
lainnya.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum
Biologi Dasar (2012) dan asisten responsi Sosiologi Umum (2012-2013). Tanggal
3-5 Juli 2012 penulis melaksanakan Studi Lapang di Taman Nasional Gunung
Gede-Pangrango (TNGGP) dengan judul Kekayaan Jenis Pinang di Kebun Raya
Cibodas. Setelah itu, pada bulan Juni hingga Juli 2013, penulis melaksanakan
Praktik Lapangan dengan topik Manajemen dan Proses Eksplorasi, Identifikasi,
serta Perawatan Fosil Hewan Famili Bovidae di Balai Pelestarian Situs Manusia
Purba (BPSMP) Sangiran.