ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7

  TESIS ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7 Oleh: DENNY SATRIA NIM 127014009

  ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7 TESIS Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara Oleh: DENNY SATRIA NIM 127014009

LEMBAR PERSETUJUAN TESIS ELUSIDASI STRUKTUR SENYAWA AKTIF KUDA LAUT (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7 Oleh: DENNY SATRIA NIM 127014009

  Medan, Maret 2014 Menyetujui: Komisi Pembimbing, Komisi Penguji, Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.

  NIP 194908111976031001 NIP 195103261978022001 Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt.

  NIP 196602091992031003 NIP 195108161980031002 Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt. NIP 194908111976031001 Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed. NIP 196602091992031003

  Mengetahui: Disahkan Oleh: Ketua Program Studi, Dekan, Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.

  NIP 195409091982011001 NIP 195311281983031002

  Nama Mahasiswa : Denny Satria Nomor Induk Mahasiswa : 127014009 Program Studi : Magister Farmasi Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7.

  Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Rabu tanggal dua belas bulan Februari tahun dua ribu empat belas.

  Mengesahkan: Tim Penguji Tesis Ketua Tim Penguji Tesis : Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt.

  Anggota Tim Penguji : Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M. Biomed.

  Prof. Dr. Rosidah, M. Si., Apt. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt. Saya yang bertanda tangan dibawah ini: Nama Mahasiswa : Denny Satria Nomor Induk Mahasiswa : 127014009 Program Studi : Magister Farmasi Judul Tesis : Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut

  (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7

  Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut. Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan sehat.

  Medan, Maret 2014 Yang membuat pernyataan, Denny Satria NIM 127014009 Puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa yang telah melimpahkan rahmat, karunia, dan RidhoNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7”. Tesis ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister farmasi pada Fakultas Farmasi Universita Sumatera Utara. Shalawat dan salam kepada Rasulullah SAW. Selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini penulis telah banyak mendapatkan bantuan dan dorongan dari berbagai pihak, baik moril maupun materil. Untuk itu penulis ingin menghaturkan penghargaan dan terima kasih yang tiada terhingga kepada:

  1. Rektor Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K)., atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan Program Magister.

  2. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr.

  Sumadio Hadisahputra, Apt., yang telah menyediakan fasilitas dan kesempatan bagi penulis menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.

  3. Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, Bapak Prof. Dr. Karsono, Apt., yang telah menyediakan fasilitas bagi penulis selama menjadi mahasiswa Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi.

  Bapak Dr. M. Pandapotan Nasution, MPS., Apt., selaku Pembimbing I yang tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberikan dorongan dan semangat dengan penuh kesabaran sehingga penulis terpacu untuk menyelesaikan penelitian dan penyelesaian tesis ini.

  5. Bapak Prof. Dr. Syafruddin Ilyas, M.Biomed., selaku Pembimbing II yang tiada hentinya membimbing, mengarahkan, memberi saran dan dorongan dengan penuh kesabaran selama penulis menjalani penelitian dan penyelesaian tesis ini.

  6. Ibu Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., dan bapak Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt., sebagai penguji.

  7. Ibu Dra. Suwarti Aris, M.Si., Apt., Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta staf.

  8. Bapak Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., S.U., Ph.D., Sp.Park., Kepala Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.

  9. Bapak Prof. Dr. rer. nat. Effendy De Lux Putra, S.U., Apt., Kepala Laboratorium Penelitian beserta staf.

  10. Bapak dan Ibu Staff Pengajar Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah mendidik penulis selama perkuliahan.

  Penulis juga tidak lupa mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang tulus kepada orang tua, Ayahanda dan Ibunda tercinta Syamsul Bahri dan Ade Irma Syuryani, dan kakak tersayang Rahmawati atas doa dan dukungan baik moril maupun materil, serta adik-adik tersayang, Alwan Husein, Fauzi dan Alfalah atas doa, dorongan dan semangat dalam penyelesaian tesis ini. Kepada kakak dan S.Farm., Apt., Mainal Furqan, S.Si., Apt., dan Fitri Yanti, S.Farm., Apt., Ramses Alfredo, S.Farm., Apt, Hendra, Adhli, Faisal, Nevi terima kasih atas motivasinya dan semua pihak yang selalu memberi semangat, saran, dan nasehat.

  Penulis menyadari bahwa tesis ini masih banyak kekurangannya, oleh karena itu sangat diharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari semua pihak guna perbaikan tesis ini. Akhir kata penulis berharap semoga tesis ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi.

  Medan, Maret 2014 Penulis, Denny Satria NIM 127014009

  (Hippocampus trimaculatus Leach.) TERHADAP SEL MCF-7 ABSTRAK

  Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik, yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut yang terbesar di dunia. Kuda laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) adalah sejenis ikan laut dan termasuk kedalam familia Syngnathidae dan banyak digunakan sebagai obat kuat, penguat saraf dan pengobatan kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui aktivitas serta mekanisme isolat yang diperoleh dari fraksi n- heksana kuda laut terhadap sel MCF-7.

  Ekstraksi kuda laut dilakukan dengan cara maserasi dan fraksinasi ekstrak etanol dengan ekstraksi cair-cair (ECC). Fraksinasi terhadap fraksi paling aktif dilakukan dengan kromatografi cair vakum (KCV) menggunakan fase gerak

  n -heksana: etilasetat secara landaian, kemudian dilanjutkan dengan kromatografi

  kolom dengan fase gerak n-heksana: etilasetat secara landaian. Penentuan struktur isolat dilakukan dengan spektrofotometri UV dan IR, spektrometri massa dan NMR. Pengujian aktivitas sitotoksisitas dilakukan terhadap fraksi dan isolat terhadap sel MCF-7 dengan metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromida]. Pengujian penghambatan terhadap siklus sel menggunakan flow cytometer dan dilakukan imunositokimia terhadap ekspresi siklin D 1 dan kaspase 9 terhadap sel MCF-7.

  Pengolahan data untuk penentuan nilai IC

  50 menggunakan analisis probit

  pada program SPSS 19. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa fraksi KL I

  IC 122.391,863 µg/ml, KL II IC 45,392 µg/ml, KL III IC 144,774 µg/ml,

  50

  50

  50 KL IV IC 50 285,723 µg/ml, KLV IC 50 214,890 µg/ml dan doksorubisin 7,875

  µg/ml. Hasil pengujian sitotoksisitas larutan uji dari isolat dari fraksi KCV KL II terhadap sel MCF-7 memberikan nilai IC

  50 22,082 µg/ml terhadap sel MCF-7.

  1

  13 Isolat dikarakterisasi dengan spektroskopi UV, FT-IR, HRMS, H-NMR,

  C- NMR, DEPT, NMR-2D (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC). Dari hasil karakterisasi menggunakan Spektrofotometer UV diperoleh spektrum dengan puncak absorpsi maksimum pada panjang gelombang 205,8 nm dan spektrum

• 1

  infra merah menunjukkan adanya gugus OH pada bilangan gelombang 3387 cm ,

• CH alifatis (pada CH

  3 ) pada 2939,52 cm , C=C pada 1589,34 cm , CH 2 pada

• 1 -1 -1

  1

  1450,47 cm , CH pada 1373,32 cm , C-O pada 1049,28 cm ; spektrum

  H-

  3

  mempunyai 27 atom karbon yang terdiri dari 5 CH

  3 , 11 CH 2 , 8 CH dan 3 atom

  karbon kuarterner dengan gugus fungsi siklis, alkil, hidroksi dan ena non konjugasi dan spektrum HRMS menunjukkan berat molekul 386,3543 (C

  27 H

  46 O,

  berat molekul perhitungan 386,3551). Berdasarkan hasil karakterisasi isolat dapat disimpulkan bahwa isolat KL 1 adalah cholest-5-en- 3β-ol (kolesterol). Isolat menunjukkan peningkatan pada fase sub G1 pada siklus sel, menghambat ekspresi siklin D 1 dan meningkatkan ekspresi kaspase 9 pada imunositokimia terhadap sel MCF-7.

  Kata kunci : kuda laut, isolasi, sitotoksisitas, sel MCF-7, metode MTT.

  

SEA HORSE (Hippocampus trimaculatus Leach.) ON MCF-7 CELL LINE

ABSTRACT

  Indonesia is a part of Indopasifik region, which is one of the centers of diversity of marine life and biggest in the world . Sea horse (Hippocampus

  trimaculatus Leach.) is kind of sea fish and include in Syngnathidae family, much

  have been used as afrodisiac, nerve tonic and breast cancer treatment. This research have a purpose to isolation and know the activity and the mechanism isolate from n-hexane fraction sea horse on MCF-7 cell line.

  Sea horse extraction carried out with maceration and fractination with liquid-liquid extraction (LLE). Fractionation to the most active fraction with vaccume liquid chromatography (VLC) using gradient eluent n-hexane: ethylacetate, continue with column chromatography using gradient eluent n- hexane: ethylacetate. structure determination of isolate using UV and IR spectrophotometer, mass spectrometer and NMR. Cytotoxicity activity assay of fractions and isolate of sea horse on MCF-7 cell using MTT method [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide]. Inhibition examination of cell cycle using flowcytometer and immunocytochemistry of cyclin D 1 and caspase 9 expression on MCF-7 cell line.

  Data processing for determination of IC values using probit analysis in

  50 SPSS 19. The result of cytotoxicity assay show KL I fraction IC 122391.863

  50

  µg/ml, KL II IC

  50 45.392 µg/ml, KL III IC 50 144.774 µg/ml, KL IV IC 50 285.723

  µg/ml, KL V IC

  50 214.890 µg/ml and doxorubicin 7.875 µg/ml. The result of

  cytotoxicity assay isolate from KL II fraction show IC

  50 22.082 µg/ml on MCF-7

  1

  cell line. Isolate characterized with UV and IR spectrophotometer, HRMS and

  H-

  the characterization result using UV spectrophotometer obtainable spectrum with maximum absorbstion peak at wave length 205.8 nm and from infra red spectrum

• 1

  show OH group at wave number 3387 cm , -CH aliphatic (on CH

  3 ) at 2939.52

• 1 -1 -1 -1

  cm , C=C at 1589.34 cm , CH at 1450.47 cm , CH at 1373.32 cm , C-O at

  2

  3

• 1

  1

  13

  1049.28 cm ; spectrum H-NMR, C-NMR, DEPT, (COSY, NOESY, HMBC dan HSQC) shows isolate have 27 carbon consisting of 5 CH

  3 , 11 CH 2 , 8 CH and

  3 quartener carbon with functional group cyclics, alkyl, hydroxyl and ena non conjugated and HRMS spectrum show molecular weight 386.3543 (C

  27 H

  46 O,

  molecular weight calculation 386,3551). Based on the result of characterization of isolate it can be concluded isolate KL 1 is cholest-5-en- 3β-ol (cholesterol). Isolate can increase at sub G1 phase on cell cycle, inhibition cyclin D 1 expression and increase caspase 9 expression at immunocytochemistry on MCF-7 cell line.

  Keywords: Sea horse, isolation, cytotoxicity, MCF-7 cell line, MTT method

  Halaman JUDUL ................................................................................................. i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................. iii PENGESAHAN TESIS ....................................................................... iv SURAT PERNYATAAN .................................................................... v KATA PENGANTAR ......................................................................... vi ABSTRAK ........................................................................................... ix ABSTRACT ......................................................................................... x DAFTAR ISI ........................................................................................ xi DAFTAR TABEL ................................................................................ xvii DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xviii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xxii BAB I PENDAHULUAN ....................................................................

  1 1.1 Latar Belakang ..................................................................

  1 1.2 Perumusan Masalah ..........................................................

  4 1.3 Hipotesis ...........................................................................

  5 1.4 Tujuan Penelitian ...............................................................

  5 1.5 Manfaat Penelitian .............................................................

  5 1.6 Kerangka Pikir Penelitian ..................................................

  6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA .........................................................

  7 2.1 Uraian Hewan ....................................................................

  7 2.1.1 Habitat ......................................................................

  7

  2.1.3 Morfologi Hewan .....................................................

  8 2.1.4 Kandungan Kimia .....................................................

  8 2.1.5 Kegunaan (khasiat) kuda laut ...................................

  9 2.2 Kanker ...............................................................................

  9 2.2.1 Karsinogenesis ..........................................................

  12 2.2.2 Kanker payudara .......................................................

  15 2.2.3 Sel MCF-7 .................................................................

  19 2.2.4 P-glikoprotein ...........................................................

  20 2.2.5 Siklus sel ...................................................................

  23 2.2.6 Doksorubisin .............................................................

  26 2.2.7 Uji sitotoksik menggunakan metode MTT ...............

  28 2.2.8 Flow cytometry .........................................................

  29 2.3 Ekstraksi ............................................................................

  31 2.3.1 Ekstraksi cair-cair .....................................................

  36 2.4 Kromatografi ......................................................................

  37 2.4.1 Kromatografi lapis tipis ............................................

  37 2.4.2 Kromatografi lapis tipis preparatif ...........................

  39 2.4.3 Kromatografi lapis tipis dua arah ..............................

  40 2.4.4 Kromatografi kolom ..................................................

  41 2.4.5 Kromatografi cair vakum ...........................................

  41 2.5 Spektrofotometri Ultraviolet ..............................................

  42 2.6 Spektrofotometri Inframerah .............................................

  43 2.7 Spektrometri Massa ...........................................................

  44

  Resonance )..........................................................................

  45 BAB III METODE PENELITIAN ......................................................

  46 3.1 Alat dan Bahan ...................................................................

  46 3.1.1 Alat ...........................................................................

  46 3.1.2 Bahan ........................................................................

  47 3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel ..............................

  47 3.2.1 Pengambilan sampel .................................................

  47 3.2.2 Identifikasi hewan kuda laut .....................................

  47 3.2.3 Pembuatan sampel ....................................................

  48 3.3 Pembuatan Ekstrak ............................................................

  48 3.3.1 Pembuatan fraksi-fraksi dari ekstrak etanol .............

  48 3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan...................................................

  49 3.5 Pembuatan Media ..............................................................

  49

  3.5.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) .....................................................................

  49 3.5.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK) ...................

  50 3.6 Penumbuhan Sel MCF-7 ....................................................

  50 3.6.1 Penumbuhan sel .........................................................

  50 3.6.2 Subkultur sel .............................................................

  51 3.6.3 Panen sel MCF-7 ......................................................

  51 3.6.4 Penghitungan sel ........................................................

  51 3.7 Pembuatan Larutan Uji ......................................................

  52 3.7.1 Pembuatan seri konsentrasi larutan uji .....................

  52

  3.8.1 Uji Sitotoksik ............................................................

  53 3.8.2 Penghambatan pada Siklus sel (Cell Cycle) ..............

  53 3.8.3 Selectivity Index ........................................................

  54

  3.8.4 Analisis Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia .........................................................

  55 3.9 Analisis Hasil ......................................................................

  56 3.10 Analisis Fraksi n-heksana dan Kloroform secara KLT ....

  56

  3.11 Fraksinasi Fraksi n-heksana dan Kloroform dengan KCV (Kromatografi Cair Vakum) ..................................

  57 3.12 Analisis KLT Hasil KCV ................................................

  57

  3.13 Isolasi Senyawa Hasil Fraksinasi secara Kromatografi Kolom ...............................................................................

  57

  3.14 Analisis Eluat (hasil fraksinasi kolom) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .....................................

  58 3.15 Uji Kemurnian Isolat .......................................................

  58 3.16 Karakterisasi Isolat ..........................................................

  59 3.16.1 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri UV ...

  59 3.16.2 Karakterisasi Isolat secara Spektrofotometri IR .....

  59 3.16.3 Karakterisasi Isolat secara Spektrometri Massa .....

  60

  3.16.4 Karakterisasi Isolat dengan Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) ..............................

  60 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................

  61 4.1 Hasil Identifikasi Hewan ...................................................

  61 4.2 Hasil Ekstraksi ...................................................................

  61

  4.3 Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi n-heksana, Fraksi KCV dan Isolat Kuda Laut terhadap Sel MCF-7 .........................

  61

  Vero dan Selectivity Index (SI) ...........................................

  1 H-

  78 4.16 Spektrum NMR Proton ....................................................

  86

  4.17 Spektrum DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ) .....................................................

  91 4.18 Spektrum Massa (HRMS) ...............................................

  93

  4.19 Spektrum HSQC (

  13 Connectivity ) ...................................................................

  4.14 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan Spektrofotometer Infra Merah .........................................

  95 C Heteronuclear Single Quantum

  4.20 Spektrum HMBC (

  1 H-

  13 Connectivity ) ...................................................................

  99 C Heteronuclear Multiple Bond

  4.21 Spektrum COSY (

  1 H-

  76 4.15 Spektrum NMR Karbon-13 .............................................

  75

  63

  4.8 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi Cair Vakum (KCV) ...........................................................

  4.5 Hasil Uji Penghambatan Siklus Sel dengan Flowcytometer ....................................................................

  64

  4.6 Hasil Analisi Ekspresi kaspase 9 dan siklin D1 dengan Imunositokimia ...................................................................

  67

  4.7 Hasil Analisis Fraksi n-heksana dengan Cara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ..............................

  70

  71

  4.13 Hasil Karakterisasi Isolat KL I dengan Spektrofotometer Sinar Ultra Violet ...............................

  4.9 Hasil Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi Kolom ................................................................................

  72

  4.10 Hasil Analisi KLT dari Hasil Pemisahan dengan Kolom Kromatografi ...................................................................

  73 4.11 Hasil Analisi KLT Isolat ..................................................

  74

  4.12 Hasil Pemeriksaan Kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis Dua Arah ......................................................

  74

  1 H Homonuclear Correlation

  1

  1

  4.22 Spektrum NOESY (

  H- H Nuclear Overhouser Effect

  Spectroscopy ) .................................................................. 103

  BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................. 108

  5.1 Kesimpulan ........................................................................ 108

  5.2 Saran .................................................................................. 108 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................... 109 LAMPIRAN ........................................................................................ 118

  Halaman Tabel 4.1 Persentase akumulasi pada tiap fase dalam siklus sel .........

  64 Tabel 4.2 Harga Rf hasil KLT fraksi n-heksana kuda laut ..................

  70 Tabel 4.3 Interpretasi spektrum IR isolat terhadap serapan dan bilangan gelombang ............................................................

  76 Tabel 4.4 Korelasi frekuensi C-O dengan stereokimia ........................

  77 Tabel 4.5 Data pergeseran kimia spektrum

  13 KL I .....................................................................................

  79 C-NMR dari isolat

Tabel 4.6 Perbandingan data

  13 literatur ...............................................................................

  85 C-NMR hasil penelitian dan data

Tabel 4.7 Data karbon CH

  2 , CH dan CH 3 dari isolat KL I .................

  92 Tabel 4.8 Data

  13 Tabel 4.9 Perhitungan berat molekul isolat KL I berdasarkan berat C-NMR dan DEPT isolat KL I ................................

  93 atom penyusunnya ..............................................................

  94

  Halaman Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ...............................

  68 Gambar 4.4 Kromatogram hasil analisis fraksi n-heksana dengan KLT .............................................................................

  76 Gambar 4.11 Orientasi gugus OH yang mempunyai orientasi β-ekuatorial ..................................................................

  75 Gambar 4.10 Spektrum infra merah isolat KL I .................................

  75 Gambar 4.9 Spektrum ultraviolet isolat KL I ...................................

  74 Gambar 4.8 Kromatogram KLT dua arah isolat KL I ......................

  73 Gambar 4.7 Kromatogram uji kemurnian dengan empat jenis fase gerak yang berbeda ......................................................

  72 Gambar 4.6 Bagan kerja fraksinasi dengan kolom kromatografi ....

  70 Gambar 4.5 Bagan kerja KCV dan kromatografi kolom ..................

  67 Gambar 4.3 Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 pada sel MCF-7 yang diberi doksorubisin dan isolat KL I .....................

  6 Gambar 2.1 Morfologi hewan kuda laut ..........................................

  41 Gambar 4.2 Histogram siklus sel MCF-7 yang menunjukkan sedikit sel yang mengalami agregat (double cell) ditunjukkan oleh tanda panah .......................................

  28 Gambar 4.1 Hasil flow cytometer sel MCF-7 dengan pemberian doksorubisin dan isolat KL I .......................................

  25 Gambar 2.7 Reduksi MTT menjadi formazan ..................................

  22 Gambar 2.6 Checkpoints siklus sel ..................................................

  18 Gambar 2.5 Mekanisme pemompaan oleh Pgp ...............................

  15 Gambar 2.4 Kanker payudara ..........................................................

  14 Gambar 2.3 Metastasis sel kanker melalui pembuluh limfoid ........

  8 Gambar 2.2 Multitahap karsinogenesis ...........................................

  78

Gambar 4.12 Spektrum

  87

  84 C-NMR isolat KL I

Gambar 4.21 Spektrum dari pelarut CDCl

  

3

Gambar 4.22 Spektrum (77,0002 ppm) .............

  85

  1 Gambar 4.23 Spektrum H-NMR isolat KL I ....................................

  86

  1 Gambar 4.24 Spektrum H-NMR isolat KL I (1,0264 ppm) .............

  1 gugus metil ...................................................................

Gambar 4.20 Spektrum

  87 H-NMR isolat KL I yang menunjukkan

Gambar 4.25 Spektrum

  1 (metin) ..........................................................................

  88 H-NMR isolat KL I cirri atom C-3 Gambar 4.26 Orientasi gugus OH pada atom C-3..............................

  88 Gambar 4.27 Kedudukan gugus OH pada atom C menempati posisi β-ekuatorial .......................................................

  90 Gambar 4.28 Spektrum

  1 Gambar 4.29 Spektrum DEPT dari isolat KL I .................................

  91 H-NMR cirri atom C-6 ..............................

  13 (50,1360 – 56,7684 ppm) .............................................

  84 C-NMR isolat KL I

  13 Gambar 4.13 Spektrum C-NMR isolat KL I ..................................

Gambar 4.16 Spektrum

  79

  13 (71,8205 - 121,7245 ppm) ............................................

  80 C-NMR isolat KL I

Gambar 4.14 Spektrum

  13 Gambar 4.15 Spektrum C-NMR isolat KL I (42,3222 ppm) ..........

  80

  13 (11,8559 – 19,3919 ppm) .............................................

  81 C-NMR isolat KL I

  13 (21,0842 – 24,2902 ppm) ............................................

  13 (39,5164 – 42,3222 ppm) ............................................

  81 C-NMR isolat KL I

Gambar 4.17 Spektrum

  13 (28,0107 – 31,9074 ppm) ...........................................

  82 C-NMR isolat KL I

Gambar 4.18 Spektrum

  13 (35,7823 – 37,2509 ppm) ............................................

  83 C-NMR isolat KL I

Gambar 4.19 Spektrum

  90

  (11,8585 – 42,2971 ppm) .............................................

Gambar 4.41 Interaksi antara atom H-22 dengan C-21, C-24, C-20 dengan C-21 dan C-24 dan C-17 dengan C-21 ........... 100Gambar 4.47 Spektrum NOESY isolat KL I (H-9; H-7, H-9; H-12,Gambar 4.46 Spektrum NOESY isolat KL I ...................................... 104Gambar 4.45 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; dan H-2; H-4) ...... 103

  H-6; H-7........................................................................ 102

Gambar 4.44 Spektrum COSY isolat KL I (H-3; H-2; H-4 danGambar 4.43 Interaksi proton dan karbon ......................................... 101Gambar 4.42 Interaksi antara H-24 dengan C-26, C-27, H-26 dengan C-27 dan H-25 dengan C-26 dan C-27 ........... 101

  99 Gambar 4.40 Interaksi antara H-12 dengan C-14 dan C-17 .............. 100

  92 Gambar 4.31 Spektrum DEPT isolat KL I (50,1378- 121,7262 ppm) .............................................

  99 Gambar 4.39 Interaksi antara H-1 dengan C-5 dan C-9 ....................

  97 Gambar 4.38 Spektrum HMBC isolat KL I ......................................

  97 Gambar 4.37 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-7;H-7, C-24; H-24, C-9; H-9, C-17; H-17, C-1; H-1 dan C-12;H-12 .....................................................................

  96 Gambar 4.36 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-18; H-18, C-21; H-21 dan C-19; H-19) .......................................

  96 Gambar 4.35 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-4; H-4) .......

  95 Gambar 4.34 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-21; H-21, C-19; H-19 dan C-26; H-26) .......................................

  94 Gambar 4.33 Spektrum HSQC senyawa isolat KL I (C-3; H-3 dan C-6; H-6) ......................................................................

  93 Gambar 4.32 Spektrum massa (HRMS) dari isolat KL I ...................

  H-11; H-19, H-15; H-12 dan H-15; H-16 .................... 104

  NOE ............................................................................. 105

Gambar 4.49 Senyawa cholest-5en- 3β-ol (kolesterol) ......................

  105

Gambar 4.50 Kedudukan atom H pada atom C-3 ............................. 106Gambar 4.51 Pembuktian bahwa gugus OH tidak berkedudukan α ..

  106

Gambar 4.52 Pola pemecahan anak puncak jika gugus OH berkedudukan α ...........................................................

  107

  Halaman Lampiran 1 Hasil identifikasi hewan kuda laut .............................. 118 Lampiran 2 Simplisia kuda laut ...................................................... 119 Lampiran 3 Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol ........................ 120 Lampiran 4 Bagan fraksinasi ekstrak etanol kuda laut ................... 121 Lampiran 5 Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7...................... 122 Lampiran 6 Perhitungan persen sel hidup sel Vero ........................ 125 Lampiran 7 Perhitungan IC

  50 Lampiran 8 Bagan pembuatan media RPMI ................................... 135

  dengan analisa probit SPSS 19 ........ 126 Lampiran 9 Bagan pembuatan media kultur lengkap ..................... 136 Lampiran 10 Bagan penumbuhan sel MCF-7 .................................... 137 Lampiran 11 Bagan panel sel MCF-7 ............................................... 138 Lampiran 12 Bagan penghitungan sel ............................................... 139 Lampiran 13 Bagan pembuatan larutan uji ....................................... 139 Lampiran 14 Bagan pengujian sitotoksik .......................................... 140 Lampiran 15 Bagan pengujian penghambatan pada siklus sel ......... 141 Lampiran 16 Bagan analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia ................................................ 142 Lampiran 17 Spektrum HRMS isolat KL I ....................................... 143 Lampiran 18 Sel MCF-7 dibawah mikroskop ................................... 145 Lampiran 19 Kristal formazan dan sel Vero dibawah mikroskop .... 146 Lampiran 20 Mikroskop inverted, elisa reader, flowcytometer,

  laminar

  air flow dan inkubator CO

  2

  ............................ 147