Elusidasi Struktur Senyawa Aktif Kuda Laut (Hippocampus trimaculatus Leach.) Terhadap Sel MCF-7
Lampiran 1. Hasil identifikasi hewan kuda laut ( Hippocampus trimaculatus Leach.)
Lampiran 2. Gambar simplisia kuda laut ( Hippocampus trimaculatus Leach.)
Lampiran 3. Bagan kerja pembuatan ekstrak etanol
Ditambahkan etanol 96%, biarkan selama 3 hari Disaring Dicuci kembali dengan etanol 96% Dicuci kembali dengan etanol 96% Dipekatkan dengan rotary evaporator
Dikeringkan dengan freeze dryer 250 g serbuk simplisia kuda laut
Ampas Maserat Maserat Ampas Maserat Ampas Ekstrak etanol
Lampiran 4. Bagan fraksinasi ekstrak etanol kuda laut
Ekstrak etanol Dilarutkan dalam etanol 96% sampai larut
Dimasukkan kedalam corong pisah
Ditambahkan 40 ml aquadest Ditambahkan 100 ml n-heksana Dikocok Dilakukan penambahan n-heksana dan pengocokan sampai memberikan hasil negatif dengan pereaksi Liebermann BurchardLapisan n- Lapisan Air Diambil lapisan n-heksana dengan cara dialirkan Diuapkan dengan penguap vakum putar pada suhu ± 50 C
Fraksi n- h k
Lampiran 5. Perhitungan persen sel hidup sel MCF-7
a. Kontrol sel dan kontrol media Absorbansi kontrol sel Rata-rata absorbansi kontrol sel
Absorbansi kontrol media Rata-rata absorbansi kontrol media Absorbansi kontrol sel dikurangi kontrol media
0,977 0,805 0,117 0,122 0,683 0,751 0,108
0,686 0,140
b. Fraksi n-heksana kuda laut Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 31,25 0,582 0,545 0,565 67,35 61,93 64,86 64,71 62,5 0,547 0,521 0,576 62,23 58,42 66,47 62,37 125,0 0,367 0,385 0,513 35,87 38,51 57,25 43,88 250,0 0,166 0,155 0,163 6,44 4,83 6,00 5,76 500,0 0,145 0,137 0,146 3,37 2,20 3,51 3,03
c. Fraksi KL I Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 15,625 0,586 0,678 0,551 67,94 81,41 62,81 70,72 31,25 0,609 0,547 0,619 71,30 62,23 72,77 68,77
62,5 0,636 0,546 0,554 75,26 62,08 63,25 66,86 125,0 0,597 0,560 0,551 69,55 64,13 62,81 65,50 250,0 0,581 0,567 0,549 67,20 65,15 62,52 64,96 d. Fraksi KL II Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 31,25 0,564 0,501 0,513 68,21 57,78 59,98 61,92 62,5 0,422 0,488 0,384 44,70 55,63 38,41 46,25 125,0 0,222 0,197 0,191 11,59 7,45 6,46 8,50 250,0 0,155 0,162 0,170 0,50 1,66 2,98 1,72 500,0 0,158 0,158 0,159 0,99 0,99 1,16 1,05
e. Fraksi KL III Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 15,625 0,535 0,647 0,586 60,47 76,87 68,23 68,52 31,25 0,538 0,513 0,708 60,91 57,25 85,80 67,99
62,5 0,517 0,505 0,524 57,83 56,08 58,86 57,59 125,0 0,458 0,463 0,486 49,19 49,93 53,29 50,80 250,0 0,403 0,436 0,420 41,14 45,97 43,63 43,58
f. Fraksi KL IV Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 15,625 0,570 0,540 0,746 65,59 61,20 91,36 72,72 31,25 0,596 0,546 0,546 69,40 62,08 62,08 64,52
62,5 0,546 0,536 0,544 62,08 60,61 61,79 61,49 125,0 0,505 0,488 0,479 56,08 53,59 52,27 53,98 250,0 0,468 0,472 0,490 50,66 51,24 53,88 51,93 g. Fraksi KL V Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 15,625 0,763 0,753 0,629 93,85 92,39 74,23 86,82 31,25 0,676 0,581 0,792 81,11 67,20 98,10 82,14
62,5 0,692 0,659 0,602 83,46 78,62 70,28 77,45 125,0 0,564 0,524 0,557 64,71 58,86 63,69 62,42 250,0 0,409 0,388 0,453 42,02 38,95 48,46 43,14
h. Isolat KL I Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 15,625 0,413 0,516 0,488 42,61 57,69 53,59 51,30 31,25 0,429 0,449 0,449 44,95 47,88 47,88 46,90
62,5 0,442 0,438 0,427 46,85 46,27 44,66 45,93 125,0 0,399 0,384 0,368 40,56 38,36 36,02 38,31 250,0 0,343 0,337 0,316 32,36 31,48 28,40 30,75 i. Doksorubisin
Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup % sel hidup rata-rata 15,625 0,355 0,388 0,361 34,11 38,95 34,99 36,02
31,25 0,369 0,367 0,365 36,16 35,87 35,58 35,87 62,5 0,362 0,374 0,365 35,14 36,90 35,58 35,87 125,0 0,373 0,355 0,344 36,75 34,11 32,50 34,45 250,0 0,349 0,356 0,344 33,24 34,26 32,50 33,33
Lampiran 6. Perhitungan persen sel hidup sel Vero
a. Kontrol sel dan kontrol media Absorbansi kontrol sel Rata-rata absorbansi kontrol sel
Absorbansi kontrol media Rata-rata absorbansi kontrol media Absorbansi kontrol sel dikurangi kontrol media
0,703 0,705 0,088 0,080 0,625 0,766 0,076
0,646 0,076
b. Isolat KL I Kadar (µg/ml) Absorbansi % sel hidup
% sel hidup rata-rata 15,625 0,651 0,726 0,609 91,36 103,36 84,64 93,12 31,25 0,653 0,660 0,646 91,68 92,80 90,56 91,68
62,5 0,588 0,602 0,609 81,25 83,52 84,64 83,15 125,0 0,608 0,553 0,602 84,48 75,68 83,52 81,23 250,0 0,438 0,643 0,671 57,28 90,08 94,56 80,64
Lampiran 7. Perhitungan IC
50 a.
Fraksi n-heksana dengan analisa probit SPSS 19 Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)
b
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper
Bound PR OB
IT
a
.010 952.126 272.666 1.317E12 2.979 2.436 12.120 .020 697.414 226.755 6.200E10 2.843 2.356 10.792 .030 572.411 201.021 8.948E9 2.758 2.303 9.952 .040 493.375 183.158 2.091E9 2.693 2.263 9.320 .050 437.206 169.469 6.423E8 2.641 2.229 8.808 .060 394.465 158.351 2.356E8 2.596 2.200 8.372 .070 360.441 148.966 9.793E7 2.557 2.173 7.991 .080 332.475 140.824 4.469E7 2.522 2.149 7.650 .090 308.930 133.609 2.193E7 2.490 2.126 7.341 .100 288.733 127.111 1.140E7 2.460 2.104 7.057 .150 218.234 101.252 776709.383 2.339 2.005 5.890 .200 174.702 81.095 95692.442 2.242 1.909 4.981 .250 144.346 63.144 16852.342 2.159 1.800 4.227 .300 121.608 45.821 3899.809 2.085 1.661 3.591 .350 103.749 29.026 1178.345 2.016 1.463 3.071 .400 89.233 14.848 479.749 1.951 1.172 2.681 .450 77.125 5.973 261.362 1.887 .776 2.417
.500 66.815 1.992 175.924 1.825 .299 2.245
.550 57.882 .587 133.971 1.763 -.231 2.127 .600 50.028 .158 109.101 1.699 -.801 2.038 .650 43.029 .039 92.135 1.634 -1.409 1.964 .700 36.709 .009 79.306 1.565 -2.062 1.899 .750 30.927 .002 68.815 1.490 -2.775 1.838 .800 25.553 .000 59.664 1.407 -3.576 1.776 .850 20.456 .000 51.182 1.311 -4.515 1.709 .900 15.461 .000 42.729 1.189 -5.703 1.631 .910 14.450 .000 40.967 1.160 -5.990 1.612 .920 13.427 .000 39.154 1.128 -6.302 1.593 .930 12.385 .000 37.273 1.093 -6.646 1.571 .940 11.317 .000 35.301 1.054 -7.030 1.548 .950 10.211 .000 33.201 1.009 -7.469 1.521 .960 9.048 .000 30.918 .957 -7.984 1.490 .970 7.799 .000 28.353 .892 -8.618 1.453 .980 6.401 .000 25.306 .806 -9.462 1.403 .990 4.689 .000 21.210 .671 -10.792 1.327 b.
Fraksi KL I Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)
a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper
Bound P R O B
I T .010 6.797E21 . . 21.832 . .
.020 7.417E19 . . 19.870 . . .030 4.220E18 . . 18.625 . . .040 4.885E17 . . 17.689 . . .050 8.454E16 . . 16.927 . . .060 1.900E16 . . 16.279 . . .070 5.131E15 . . 15.710 . . .080 1.589E15 . . 15.201 . . .090 5.473E14 . . 14.738 . . .100 2.052E14 . . 14.312 . . .150 3.530E12 . . 12.548 . . .200 1.398E11 . . 11.146 . . .250 8.762E9 . . 9.943 . . .300 7.282E8 . . 8.862 . . .350 7.265E7 . . 7.861 . . .400 8152529.739 . . 6.911 . . .450 982283.455 . . 5.992 . .
.500 122391.863 . . 5.088 . .
.550 15249.944 . . 4.183 . . .600 1837.438 . . 3.264 . . .650 206.203 . . 2.314 . . .700 20.570 . . 1.313 . . .750 1.710 . . .233 . . .800 .107 . . -.970 . . .850 .004 . . -2.372 . . .900 .000 . . -4.137 . . .910 .000 . . -4.563 . . .920 .000 . . -5.026 . . .930 .000 . . -5.535 . . .940 .000 . . -6.103 . . .950 .000 . . -6.752 . . .960 .000 . . -7.513 . . .970 .000 . . -8.450 . . .980 .000 . . -9.695 . . .990 .000 . . -11.657 . .
a. Logarithm base = 10. c.
Fraksi KL II Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi fraksi
95% Confidence Limits for log(konsentrasi fraksi)
b
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper
Bound P R O B
I T
a
.010 5.678 .433 13.681 .754 -.364 1.136 .020 7.244 .705 16.171 .860 -.152 1.209 .030 8.455 .959 17.992 .927 -.018 1.255 .040 9.497 1.210 19.504 .978 .083 1.290 .050 10.439 1.460 20.834 1.019 .164 1.319 .060 11.314 1.713 22.041 1.054 .234 1.343 .070 12.141 1.971 23.163 1.084 .295 1.365 .080 12.933 2.234 24.220 1.112 .349 1.384 .090 13.699 2.503 25.227 1.137 .398 1.402 .100 14.443 2.779 26.195 1.160 .444 1.418 .150 17.979 4.276 30.672 1.255 .631 1.487 .200 21.398 6.005 34.870 1.330 .779 1.542 .250 24.844 8.013 39.039 1.395 .904 1.591 .300 28.410 10.351 43.340 1.453 1.015 1.637 .350 32.170 13.075 47.917 1.507 1.116 1.680 .400 36.196 16.251 52.930 1.559 1.211 1.724 .450 40.571 19.951 58.585 1.608 1.300 1.768
.500 45.392 24.254 65.171 1.657 1.385 1.814
.550 50.786 29.234 73.116 1.706 1.466 1.864 .600 56.923 34.961 83.081 1.755 1.544 1.920 .650 64.048 41.492 96.112 1.807 1.618 1.983 .700 72.523 48.894 113.909 1.860 1.689 2.057 .750 82.932 57.306 139.369 1.919 1.758 2.144 .800 96.290 67.078 177.875 1.984 1.827 2.250 .850 114.599 79.039 241.022 2.059 1.898 2.382 .900 142.660 95.260 360.298 2.154 1.979 2.557 .910 150.410 99.425 397.950 2.177 1.997 2.600 .920 159.307 104.077 443.668 2.202 2.017 2.647 .930 169.699 109.354 500.429 2.230 2.039 2.699 .940 182.108 115.464 572.944 2.260 2.062 2.758 .950 197.373 122.734 669.198 2.295 2.089 2.826 .960 216.949 131.717 804.019 2.336 2.120 2.905 .970 243.695 143.476 1008.881 2.387 2.157 3.004 .980 284.423 160.460 1366.652 2.454 2.205 3.136 .990 362.870 190.811 2211.862 2.560 2.281 3.345 d.
Fraksi KL III Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)
a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound P R O B
I T .010 1770195.049 67750.371 1.285E10 6.248 4.831 10.109 .020 587586.801 31825.851 1.642E9 5.769 4.503 9.215 .030 291873.180 19698.763 4.452E8 5.465 4.294 8.649 .040 172424.401 13728.135 1.668E8 5.237 4.138 8.222 .050 112370.924 10232.151 7.511E7 5.051 4.010 7.876 .060 78052.307 7966.296 3.808E7 4.892 3.901 7.581 .070 56704.234 6395.604 2.099E7 4.754 3.806 7.322 .080 42595.456 5253.307 1.232E7 4.629 3.720 7.091 .090 32836.802 4392.100 7588291.504 4.516 3.643 6.880 .100 25842.941 3724.325 4857880.474 4.412 3.571 6.686 .150 9586.848 1878.870 767527.781 3.982 3.274 5.885 .200 4359.093 1088.210 177509.868 3.639 3.037 5.249 .250 2216.923 679.257 50687.043 3.346 2.832 4.705 .300 1207.947 443.263 16505.958 3.082 2.647 4.218 .350 688.158 296.911 5866.574 2.838 2.473 3.768 .400 403.473 201.310 2216.689 2.606 2.304 3.346 .450 240.699 136.155 877.623 2.381 2.134 2.943
.500 144.774 89.794 363.865 2.161 1.953 2.561
.550 87.078 55.040 162.315 1.940 1.741 2.210 .600 51.948 28.866 82.874 1.716 1.460 1.918 .650 30.457 12.562 48.787 1.484 1.099 1.688 .700 17.351 4.756 30.680 1.239 .677 1.487 .750 9.454 1.597 19.410 .976 .203 1.288 .800 4.808 .464 11.910 .682 -.333 1.076 .850 2.186 .108 6.826 .340 -.965 .834 .900 .811 .017 3.419 -.091 -1.763 .534 .910 .638 .011 2.896 -.195 -1.956 .462 .920 .492 .007 2.419 -.308 -2.166 .384 .930 .370 .004 1.985 -.432 -2.397 .298 .940 .269 .002 1.592 -.571 -2.655 .202 .950 .187 .001 1.238 -.729 -2.950 .093 .960 .122 .001 .922 -.915 -3.296 -.035 .970 .072 .000 .642 -1.144 -3.722 -.193 .980 .036 .000 .397 -1.448 -4.288 -.401 .990 .012 .000 .186 -1.927 -5.181 -.730 a. Logarithm base = 10. e.
Fraksi KL IV Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak 95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)
a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound P R O B
I T .010 5.738E7 323390.660 7.120E16 7.759 5.510 16.852 .020 1.372E7 132243.855 1.918E15 7.137 5.121 15.283 .030 5535130.481 74961.900 1.936E14 6.743 4.875 14.287 .040 2796106.475 48898.038 3.451E13 6.447 4.689 13.538 .050 1604403.152 34537.594 8.487E12 6.205 4.538 12.929 .060 999954.428 25686.810 2.572E12 6.000 4.410 12.410 .070 660606.851 19811.554 9.032E11 5.820 4.297 11.956 .080 455765.338 15699.341 3.539E11 5.659 4.196 11.549 .090 325188.159 12704.273 1.509E11 5.512 4.104 11.179 .100 238332.427 10454.099 6.890E10 5.377 4.019 10.838 .150 65833.585 4658.398 2.683E9 4.818 3.668 9.429 .200 23680.024 2445.520 2.038E8 4.374 3.388 8.309 .250 9849.487 1403.733 2.237E7 3.993 3.147 7.350 .300 4480.145 850.206 3085958.996 3.651 2.930 6.489 .350 2159.064 532.077 494237.288 3.334 2.726 5.694 .400 1080.036 338.918 87469.924 3.033 2.530 4.942 .450 552.566 216.662 16558.098 2.742 2.336 4.219
.500 285.723 136.338 3292.745 2.456 2.135 3.518
.550 147.743 80.798 695.273 2.170 1.907 2.842 .600 75.588 38.824 175.106 1.878 1.589 2.243 .650 37.812 11.238 68.192 1.578 1.051 1.834 .700 18.222 2.121 36.217 1.261 .327 1.559 .750 8.289 .311 20.603 .918 -.507 1.314 .800 3.448 .035 11.473 .538 -1.453 1.060 .850 1.240 .003 5.921 .093 -2.565 .772 .900 .343 .000 2.610 -.465 -3.970 .417 .910 .251 .000 2.144 -.600 -4.310 .331 .920 .179 .000 1.732 -.747 -4.679 .239 .930 .124 .000 1.370 -.908 -5.085 .137 .940 .082 .000 1.055 -1.088 -5.539 .023 .950 .051 .000 .784 -1.293 -6.057 -.106 .960 .029 .000 .553 -1.535 -6.665 -.257 .970 .015 .000 .360 -1.831 -7.414 -.444 .980 .006 .000 .204 -2.225 -8.409 -.691 .990 .001 .000 .083 -2.847 -9.978 -1.080 a. Logarithm base = 10. f.
Fraksi KL V Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak
95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)
a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper
Bound P R O B
I T .010 19813.245 6330.245 132554.255 4.297 3.801 5.122 .020 11660.829 4137.960 65322.852 4.067 3.617 4.815 .030 8330.255 3158.917 41704.094 3.921 3.500 4.620 .040 6468.070 2577.929 29760.427 3.811 3.411 4.474 .050 5264.933 2184.858 22619.857 3.721 3.339 4.354 .060 4418.907 1897.708 17910.806 3.645 3.278 4.253 .070 3789.739 1677.027 14596.999 3.579 3.225 4.164 .080 3302.802 1501.196 12154.525 3.519 3.176 4.085 .090 2914.495 1357.258 10290.588 3.465 3.133 4.012 .100 2597.541 1236.920 8829.083 3.415 3.092 3.946 .150 1612.670 841.561 4686.016 3.208 2.925 3.671 .200 1104.116 618.970 2835.568 3.043 2.792 3.453 .250 797.742 475.021 1844.899 2.902 2.677 3.266 .300 595.803 374.044 1255.726 2.775 2.573 3.099 .350 454.613 299.284 880.509 2.658 2.476 2.945 .400 351.708 241.746 629.920 2.546 2.383 2.799 .450 274.375 196.126 456.743 2.438 2.293 2.660
.500 214.890 159.074 334.061 2.332 2.202 2.524
.550 168.301 128.345 245.620 2.226 2.108 2.390 .600 131.295 102.368 181.151 2.118 2.010 2.258 .650 101.576 80.029 133.902 2.007 1.903 2.127 .700 77.505 60.614 99.188 1.889 1.783 1.996 .750 57.885 43.854 73.478 1.763 1.642 1.866 .800 41.823 29.821 53.954 1.621 1.475 1.732 .850 28.634 18.603 38.494 1.457 1.270 1.585 .900 17.777 10.084 25.643 1.250 1.004 1.409 .910 15.844 8.682 23.289 1.200 .939 1.367 .920 13.981 7.374 20.987 1.146 .868 1.322 .930 12.185 6.159 18.729 1.086 .790 1.273 .940 10.450 5.035 16.502 1.019 .702 1.218 .950 8.771 3.998 14.292 .943 .602 1.155 .960 7.139 3.047 12.079 .854 .484 1.082 .970 5.543 2.181 9.830 .744 .339 .993 .980 3.960 1.396 7.483 .598 .145 .874 .990 2.331 .690 4.875 .367 -.161 .688 a. Logarithm base = 10. g.
Isolat KL I Confidence Limits a
95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak 95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak) Probability Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound
P .010 .000 .000 .013 -4.197 -14.197 -1.886 R
.020 .000 .000 .033 -3.548 -12.465 -1.485 O B .030 .001 .000 .059 -3.136 -11.366 -1.231
I .040 .001 .000 .091 -2.826 -10.539 -1.039
T .050 .003 .000 .131 -2.574 -9.866 -.884 .060 .004 .000 .177 -2.359 -9.294 -.751 .070 .007 .000 .232 -2.171 -8.793 -.635 .080 .010 .000 .295 -2.003 -8.343 -.530 .090 .014 .000 .367 -1.849 -7.935 -.436 .100 .020 .000 .449 -1.708 -7.559 -.348 .150 .075 .000 1.033 -1.124 -6.003 .014 .200 .219 .000 2.010 -.660 -4.768 .303 .250 .546 .000 3.569 -.262 -3.709 .553 .300 1.245 .002 6.000 .095 -2.760 .778 .350 2.669 .013 9.766 .426 -1.883 .990 .400 5.503 .088 15.661 .741 -1.056 1.195 .450 11.085 .545 25.225 1.045 -.264 1.402
.500 22.082 3.125 42.339 1.344 .495 1.627
.550 43.989 15.248 83.509 1.643 1.183 1.922 .600 88.605 47.166 269.478 1.947 1.674 2.431 .650 182.721 93.785 1461.405 2.262 1.972 3.165 .700 391.782 164.168 10232.391 2.593 2.215 4.010 .750 892.322 284.922 88115.565 2.951 2.455 4.945 .800 2231.461 514.422 991601.740 3.349 2.711 5.996 .850 6495.101 1011.017 1.688E7 3.813 3.005 7.227 .900 24911.489 2344.222 6.030E8 4.396 3.370 8.780 .910 34467.390 2869.677 1.431E9 4.537 3.458 9.156 .920 49045.053 3573.837 3.662E9 4.691 3.553 9.564 .930 72282.359 4547.815 1.029E10 4.859 3.658 10.013 .940 111467.993 5950.778 3.264E10 5.047 3.775 10.514 .950 182683.614 8083.788 1.218E11 5.262 3.908 11.086 .960 326413.071 11581.565 5.724E11 5.514 4.064 11.758 .970 666274.267 18011.606 3.838E12 5.824 4.256 12.584 .980 1720251.00 32378.085 4.818E13 6.236 4.510 13.683
8 .990 7671112.03 81521.065 2.600E15 6.885 4.911 15.415
5 a. Logarithm base = 10. h.
Doksorubisin MCF-7 Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak 95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)
a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound P R O B
I T .010 2.828E47 . . 47.451 . .
.020 9.912E41 . . 41.996 . . .030 3.427E38 . . 38.535 . . .040 8.535E35 . . 35.931 . . .050 6.505E33 . . 33.813 . . .060 1.025E32 . . 32.011 . . .070 2.691E30 . . 30.430 . . .080 1.034E29 . . 29.015 . . .090 5.341E27 . . 27.728 . . .100 3.490E26 . . 26.543 . . .150 4.340E21 . . 21.637 . . .200 5.481E17 . . 17.739 . . .250 2.479E14 . . 14.394 . . .300 2.458E11 . . 11.391 . . .350 4.049E8 . . 8.607 . . .400 925247.536 . . 5.966 . . .450 2576.282 . . 3.411 . .
.500 7.875 . . .896 . .
.550 .024 . . -1.619 . . .600 .000 . . -4.174 . . .650 .000 . . -6.815 . . .700 .000 . . -9.598 . . .750 .000 . . -12.602 . . .800 .000 . . -15.946 . . .850 .000 . . -19.845 . . .900 .000 . . -24.750 . . .910 .000 . . -25.935 . . .920 .000 . . -27.222 . . .930 .000 . . -28.637 . . .940 .000 . . -30.218 . . .950 .000 . . -32.021 . . .960 .000 . . -34.139 . . .970 .000 . . -36.742 . . .980 .000 . . -40.204 . . .990 .000 . . -45.659 . .
a. Logarithm base = 10. i.
Isolat KL I sel vero Confidence Limits
Probability 95% Confidence Limits for konsentrasi 95% Confidence Limits for log(konsentrasi)
a
Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound P R O B
I T .010 538453.695 45319.128 1.423E8 5.731 4.656 8.153 .020 257163.808 26554.543 4.268E7 5.410 4.424 7.630 .030 160910.599 18913.632 1.989E7 5.207 4.277 7.299 .040 113085.090 14651.132 1.120E7 5.053 4.166 7.049 .050 84880.084 11902.128 7018195.841 4.929 4.076 6.846 .060 66489.339 9972.011 4716025.394 4.823 3.999 6.674 .070 53673.954 8538.547 3328280.376 4.730 3.931 6.522 .080 44310.184 7430.464 2436233.711 4.647 3.871 6.387 .090 37220.472 6547.797 1834444.710 4.571 3.816 6.264 .100 31701.510 5828.057 1412870.810 4.501 3.766 6.150 .150 16311.554 3597.010 479501.753 4.212 3.556 5.681 .200 9619.167 2449.485 203279.346 3.983 3.389 5.308 .250 6114.611 1760.478 97418.131 3.786 3.246 4.989 .300 4070.657 1307.706 50357.458 3.610 3.117 4.702 .350 2792.040 992.018 27343.213 3.446 2.997 4.437 .400 1952.296 762.526 15331.794 3.291 2.882 4.186 .450 1381.076 590.463 8770.176 3.140 2.771 3.943
.500 982.365 458.371 5069.258 2.992 2.661 3.705
.550 698.760 355.051 2936.511 2.844 2.550 3.468 .600 494.311 272.982 1691.771 2.694 2.436 3.228 .650 345.640 206.895 962.065 2.539 2.316 2.983 .700 237.073 152.905 536.203 2.375 2.184 2.729 .750 157.825 107.922 291.705 2.198 2.033 2.465 .800 100.325 69.375 156.298 2.001 1.841 2.194 .850 59.163 36.757 85.163 1.772 1.565 1.930 .900 30.441 14.108 46.476 1.483 1.149 1.667 .910 25.928 11.038 40.721 1.414 1.043 1.610 .920 21.779 8.427 35.392 1.338 .926 1.549 .930 17.980 6.244 30.428 1.255 .795 1.483 .940 14.514 4.454 25.774 1.162 .649 1.411 .950 11.369 3.022 21.386 1.056 .480 1.330 .960 8.534 1.911 17.220 .931 .281 1.236 .970 5.997 1.085 13.229 .778 .035 1.122 .980 3.753 .510 9.347 .574 -.293 .971 .990 1.792 .154 5.430 .253 -.812 .735 a. Logarithm base = 10.
Lampiran 8. Bagan pembuatan media RPMI
RPMI 2 g Hepes 2 g NaHCO
3 Dimasukkan kedalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabidest steril Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N) Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l
Larutan media Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan Ditampung dalam botol steril Diberi identitas pada botol media
o
Disimpan pada suhu 2 – 8 C Media RPMI
Lampiran 9. Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK)
Fetal Bovine Penisilin- Fungizone RPMI ad
Serum (FBS) Streptomisin (amphoterici 100%
(10%) (2%) n B) (0,5%) %)
Dicampur Diberi identitas pada botol MK
o
Disimpan pada suhu 2 – 8 C Media Kultur Lengkap (MK)
Lampiran 10. Bagan penumbuhan sel MCF-7
Sel MCF-7 dalam Diambil diambil dari freezer Diambil beberapa tetes
Konikel Dimasukkan kedalam konikel yg berisi RPMI Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit Dibuang supernatan
Ditambahkan 4 ml MK RPMI
Di resuspensi hingga homogen
Flask Dimasukkan ke dalam flask Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask Dihomogenkan Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO
2 Sel MCF-7
Lampiran 11. Bagan panen sel MCF-7
Sel MCF-7, alat, dan bahan Dipersiapkan dan dikondisikan Diamati apakah sel telah konfluen 80% Dibuang MK dari flask dengan mikropipet Sel yang l k Dicuci sel 2x dengan PBS
Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25% Diinkubasi dalam inkubator CO
2 selama 5 menit
Ditambahkan 4 ml MK Di resuspensi dengan mikropipet Diamati sel dibawah mikroskop inverted Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol Ditransfer sel kedalam tabung konikel Panen Sel
MCF 7
Lampiran 12. Bagan penghitungan sel
Kultur Sel MCF-7
Diambil 10µl panenan sel
Dipipetkan kedalam hemositometer Dihitung jumlah sel dibawah mikroskopJumlah Sel
Lampiran 13. Bagan pembuatan larutan uji
Fraksi n- Fraksi KL I-V Isolat KL I Doksorubisin heksana
Ditimbang masing-masing bahan Dimasukkan kedalam polytube Dilarutkan dalam 1000 µl DMSO
Di vortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml dan 15,625 µg/ml Larutan UjiLampiran 14. Bagan pengujian sitotoksik
Sel MCF-7 Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan
4
kepadatan 1 x 10 Diinkubasi selama 24 jam Dibuang medium Ditambahkan medium baru Ditambahkan larutan uji Diinkubasi selama 24 jam Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam Dicuci dengan PBS Ditambahkan 100 µl MK dan 10 µl MTT (5 mg/ml) Diinkubasi selama 4-6 jam Ditambahkan SDS (sebagai stopper) Dibungkus dengan aluminium foil Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan ELISA reader pada
λ 595 nm Absorbansi Dihitung % sel hidup Dihitung IC
50 dengan analisa probit menggunakan
SPSS 19
IC
50
Lampiran 15. Bagan pengujian penghambatan pada siklus sel
Sel MCF-
7
6
dimasukkan 1x10 sel per sumuran (6 sumuran) diinkubasi selama 24 jam diberikan seri larutan isolat dan doksorubisin diinkubasi selama 24 jam dikumpulkan sel yang mengapung dan melekat dengan memberikan tripsin 0,025% dipindahkan ke konikel dicuci dengan 1 ml PBS sebanyak 2 kali dipindahkan kedalam konikel yang sama disentrifuse dan lapisan supernatant dibuang
Endapan difiksasi dengan etanol 70% dalam PBS
o
pada suhu -20 C selama 2 jam dicuci dengan PBS dingin 1 ml sebanyak 2 kali dan diresuspensi di sentrifuse 3000 rpm selama 3 menit dan lapisan supernatant dibuang
Endapan ditambahkan larutan RNase/PI dan diresuspensi sampai homogen dan diinkubasi 10 menit dianalisa dengan flowcytometer
% siklus sel
Lampiran 16. Bagan analisis ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1 dengan Imunositokimia
Dimasukkan 5x10
4
telah diberi coverslip pada bagian dasarnya sel tiap sumuran yang diinkubasi selama 24 jam diberi larutan isolat dan doksorubisin diinkubasi selama 24 jam dan dicuci PBS ditambahkan methanol dingin dan diinkubasi dalam freezer -4
o
dibuang metanol dengan mikropipet C selama 10 menit diangkat dari plate 24 sumuran dan diletakkan pada objek glass dicuci dengan akuades 500 µL sebanyak 3 kali ditambahkan larutan H
2 O
2
menit dan dibuang H 3% dibiarkan 10
2 O 2 pada objek glass
ditambahkan prediluted blocking serum diamkan 10 menit kemudian dibuang ditambahkan antibodi kaspase 9 dan siklin D1 inkubasi 1 jam dan cuci dengan PBS ditetesi antibodi sekunder inkubasi 10 menit dicuci dengan PBS dan tetesi streptavidin-
HRP
dicuci dengan PBS dan tambahkan 3,3’- DAB dan inkubasi 5 menit (sampai warna coklat) dicuci dengan PBS dan tambahkan larutan Mayer-Haematoksilin dan inkubasi 5 menit dicuci dengan akuades dan alkohol 70% dibersihkan dan diberikan xylol dan keringkan dan ditetesi entelan amati dibawah mikroskop Sel MCF- coversli
Ekspresi kaspase 9 dan siklin D 1
Lampiran 17. Spektrum HRMS isolat KL I a.
Surat pengantar hasil analisa HRMS isolat KL I b.
Spektrum massa isolat KL I
Lampiran 18. Sel MCF-7 di bawah mikroskop
Keterangan: a. Sel MCF-7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10)
b. Sel MCF-7 setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10) b a
Lampiran 19. Kristal formazan dan sel vero di bawah mikroskop
a
b
Keterangan: a. Kristal Formazan (perbesaran 10 x 10)b. Sel vero (perbesaran 10x10) a
Lampiran 20. Mikroskop inverted, elisa reader, flowcytometer, laminar air
flow dan inkubator CO
2 Keterangan : Elisa reader Keterangan : Mikroskop inverted
Keterangan : Inkubator CO
2 Keterangan: Flowcytometer Keterangan: Laminar Air Flow