2.ANDINI AYODIA FITRI - Elektroforesis kelompok 17

  Kelompok 17 Nama kelompok:1.HASINA

  2.ANDINI AYODIA FITRI

  A. Teori Elektroforesis

  

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit

  menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asamamino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al,2010)

  

Elektroforesis merupakan pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul dalammedium

  konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit dimasukkan ke dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik diterapkan. campuran analit mengandungmolekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkanmobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda.sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010) Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996)

  1. Ukuran molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.

  2. Konsentrasi gel

  Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

  3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

  4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulseperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

  5. Kekuatan voltase

• Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid
• Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
• Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).

  6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996). Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsippergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).

  

Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel- partikel

  bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397). Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing- masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7). Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein Elektroforesis dapat dibagi menjadi tiga yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler.

  

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk

  memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi secara luas pada akhir tahun 1940. untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal. Karakteristik elektroforesis kapiler yaitu : Menggunakan pipa kapiler pada pemisahan elektroforesis. Memanfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi, lebih dari 5 V/cm. Menggunakan detektor berteknologi modern, sebagaimana yang ada pada kromatogram. Efisiensinya kadangkala sama dengan kromatografi gas kapiler, namun juga bisa lebih besar. Membutuhkan waktu beberapa menit untuk mengamati sampel. Mudah diotomatiskan untuk menganalisis dalam segi kuantitatif, dan mudah digunakan. Terbatas dalam mengkomsumsi (melibatkan) sejumlah reagent. Metode ini lebih aplikatif untuk menyeleksi dalam ukuran luas, dibandingkan dengan teknik separasi lainnya. Salah satu keuntungan utama dari CE adalah dibutuhkan peralatan yang sederhana. CE terdiri dari satu daya tegangan tinggi, penyangga reservoir, sebuah kapiler, dan sebuah detektor. Pengaturan dasar dapat diuraikan dengn peningkatan fitur seperti sampel, peralatan injeksi ganda, mengontrol suhu kapiler, pengaturan penyediaan daya, detektr ganda, dan kumpulan fraksi. Berbagai model elektroforesis kapiler dapat dilakukan menggunakan instrumen CE. Dasar dari perbedaan model pemisahan dapat dikarenakan bahwa elektroforesis kapiler telah dikembangkan dari suatu kombinasi elektroforesis dan teknik kromatografi. Istilah umumnya ini dapat dianggap sebagai pemisahan elektroforesis dari sejumlah senyawa di dalam tabung sempit. Walaupun sebagian besar aplikasi telah dilakukan menggunakan cairan sebagai media pemisah, teknik elektroforesis kapiler dimana kapiler berisi elektroforesis gel, lapisan kromatografi.

  Elektroforesis Kertas

  Elektroforesis kertas menjadi fase pertama dari perkembangan elektroforesis. Kisah teknik pemisahan ini berawal dari ilmuan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saatitu, tepatnyatahun 1952, Markham dan

  

Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat

  antara (intermediate) posfatsiklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-

  

monoposfatdan3′-monoposfat.Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat

  memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saringWhatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudahterhidrolisisditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik di alirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.Aruslistrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah.

  Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama pada ion-ion kompleks.

  Keunggulan elektroforesis kertas :  Proses migrasi lebih cepat  Pemisahan spot menjadi lebih kecil  Mudah dilarutkan dalam pelarut jumlah sedikit Kekurangan elektroforesis kertas :  Adanya gugus OH-yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah.

  Keunggulan elektroforesis kertas :  Proses migrasi lebih cepat  Pemisahan spot menjadi lebih kecil  Mudah dilarutkan dalam pelarut jumlah sedikit Kekurangan elektroforesis kertas :  Adanya gugus OH-yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah.

  Elektroforesis Gel atau Gel Kanji

  Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar dibandingkan pada elektroforesis kertas. Tahun 1955,Smithies mendemonstrasikan gel yang terbuat dari larutan kanji. Elektroforesis gel adalah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul, menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida (polikrilamida) sebagai gel media atau medium pendukung. Medium pendukung tersebut untuk mencegah terjadinya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel agarosa dan gel polikramid masing-masing memiliki krakteristik yang berbeda.