Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etik asetat sari buah apel bludru (Diospyros blancoi A. DC.).

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN

FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT SARI BUAH APEL BLUDRU (Diospyros blancoi A. DC.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Johanes Baptista Yunio Rahmawan NIM : 098114086

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN

FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT SARI BUAH APEL BLUDRU (Diospyros blancoi A. DC.)

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Johanes Baptista Yunio Rahmawan NIM : 098114086

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Sumeh, ngrepepeh, loma,

seneng-seneng dinggo nggoleki sing disenengi”

Kerto Wiharjo (alm.)

“Memperbaiki masa lalu bukanlah kemajuan,

mengambil langkah pasti kedepan,

itulah kemajuan”

(Kahlil Gibran)

Kupersembahkan Skripsi ini untuk :

Tuhan Yesus Kristus, Sang Terang yang telah membimbing hidupku hingga saat ini.

Ibu dan Ayah yang telah mengajarkan nilai-nilai kehidupan.

Keluarga besar Eyang Mpu Kromo Sentono, kerabat Singo Yudho Terimakasih atas dukungannya baik moril maupun materil.

vii PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT SARI BUAH APEL BLUDRU (Diospyros blancoi A. DC.)” ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan utnuk memperoleh gelar Sarjana Strata 1 Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).

Penulis banyak mengalami kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan laporan ini. Tetapi dengan adanya bantuan dari berbagai pihak, akhirnya penulis dapat menyelesaikan laporan akhir ini. Oleh karena itu dengan segala kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada:

1. Ipang Djunarko,M.Sc.,Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Yohanes Dwiatmaka,M.Si., selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi, saat dilakukan penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian. 3. Prof.Dr.C.J. Soegihardjo,Apt., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus

memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis.

4. Jeffry Julianus, M.Si., selaku Dosen Penguji yang menguji sekaligus memberi arahan, kritik, dan saran yang membangun bagi penulis.

viii

5. Keluarga (Ibu, Ayah, kakak tercinta) dan keluarga besar Eyang Mpu Kromo Sentono atas kasih sayang dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis, baik itu secara moral maupun materil.

6. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Mas Wagiran) dan Farmasi Fisika (Om Agung) atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia dan Farmasi Fisika.

7. Yulio Nur Aji Surya dan Theresia Nindyati, tim DPPH yang kompak, saling mengisi kekurangan dan memperjuangkan tujuan. Tanpa kalian skripsi ini tidak akan selesai.

8. Teman-teman FST 2009, atas kerjasama, doa, semangat, kritik, saran, kegilaan, canda tawa, segala kritik dan masukannya.

9. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat disebut satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, Juli 2013

ix DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………. ii

HALAMAN PENGESAHAN……… iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA………. iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA... v

HALAMAN PERSEMBAHAN...……. vi

PRAKATA………. vii

DAFTAR ISI……….. ix

DAFTAR TABEL……….. xiii

DAFTAR GAMBAR……….. xiv

DAFTAR LAMPIRAN………... xvi

INTISARI……….... xvii

ABSTRACT……….... xiii

BAB I PENGANTAR………. 1

A. Latar Belakang……… 1

B. Permasalahan………... 3

C. Keaslian penelitian………... 3

D. Manfaat penelitian………... 4

E. Tujuan umum dan khusus ... 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……….. 5

A. Tanaman Apel Beludru……… 5

x

2. Nama ain…..………... 5

3. Gambaran umum apel beludru……….. 5

4. Penyebaran tanaman………... 6

5. Kandungan kimia apel beludru ………. 6

B. Senyawa Fenolik………... 7

C. Metode Folin-Ciocalteu……….... 9

D. Radikal Bebas ….……..……… 10

E. Antioksidan . ... 11

F. Metode DPPH ……….. 12

G. Ekstraksi ………... 13

H. Spektrofotometri ……… .………. 14

I. Landasan Teori ………. 15

J. Hipotesis ………... 16

BAB III METODE PENELITIAN………... 17

A. Jenis dan Rancangan Penelitian………. 17

B. Variabel……….. 17

1. Variabel bebas………... 17

2. Variabel tergantung……… 17

3. Variabel pengacau terkendali……… . 17

4. Variabel pengacau tak terkendali……….. . 17

C. Definisi Operasional... 17

D. Bahan dan Alat Penelitian ... 18

xi

2. Alat penelitian ... 18

E. Tatacara Penelitian ... 19

1. Determinasi tanaman ... 19

2. Pengumpulan bahan ... 19

3. Preparasi buah apel beludru ... . 19

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji ... 20

5. Uji pendahuluan ... 21

6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ... 22

7. Penetapan kandungan fenolik total ... 23

8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ... 23

9. Uji aktivitas antioksidan ... 24

10. Analisis hasil ... 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 26

A. Hasil Determinasi Tanaman ... 26

B. Hasil Pengumpulan Bahan ... 26

C. Hasil Preparasi Sampel ... 28

1. Hasil pembuatan sari buah ... 28

2. Hasil fraksinasi sari buah ... 29

D. Hasil Uji Pendahuluan ... 31

1. Uji pendahuluan senyawa fenolik. .………..……..….….………… 31

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan ……… 32

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total..…..……..……..……... 33

xii

2. Penentuan panjang gelombang maksimum………... 34

F. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total…....…....…... 35

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan…...…...…... 38

1. Penentuan panjang gelombang maksimum………...……... 38

2. Penentuan Operat Time………..…... 40

H. Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH……… 41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN………. 51

A. Kesimpulan……… 51

B. Saran……….. 51

DAFTAR PUSTAKA……… 52

LAMPIRAN……… 57

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman Tebel I. Hasil Scanning panjang gelombang maksimum asam galat

yang direaksikan dengan folin ciocalteu... 35 Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang

direaksikan dengan folin-ciocalteu ... 36 Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru ... 37 Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang maksimum pada berbagai

konsentrasi ... 39 Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode DPPH. 45 Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel

beludru dengan metode DPPH ... 46 Tabel VII. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat

sari buah apel beludru ... 47 Tabel XIV. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Struktur kuersetin (Apak dkk., 2007) ……... 7 Gambar 2. Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid

(Shandar et al., 2011) ………. 8 Gambar 3. Struktur asam galat

(Kalita, Kar dan Handique)……… 9 Gambar 4. Senyawa fenolik dalam suasana basa

(Sambada, 2011)….…...…...…...….…...…..….….….…. 10 Gambar 5. Reaksi senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu

(Sambada, 2011)….…...…...…...….…...…..….….….…. 10 Gambar 6. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl

(Molyneux, 2004)….…...…...…...….…...…..….….….…. 13

Gambar 7. Uji pendahuluan keberadaan senyawa

fenolik………... 32 Gambar 8. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan...…... 33 Gambar 9. Grafik penentuan OT asam galat... 34 Gambar 10. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total... 37 Gambar 11. Grafik penentuan OT kuersetin...………... 40 Gambar 12. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat... 41 Gambar 13. Reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa

antioksidan(Nisizawa, 2005)... 43 Gambar 14. Konsentrasi kuersetin Vs % IC…... 46 Gambar 15. Konsentrasi fraksi etil asetat Vs % IC... 47

xv

Gambar 16. Histogram rerata IC50 dari kuersetin dan fraksi etil asetat dengan

interval kepercayaan 95%... 49

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman apel beludru

(Diospyros blancoi A. DC.)... 57

Lampiran 2. Gambar tanaman apel beludru yang diambil di kompleks Universitas Sanata Dharma ... 58

Lampiran 3 Perhitungan rendemen ... 59

Lampiran 4. Data penimbangan untuk pengujian aktivitas Antioksidan ... 60

Lampiran 5. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji ... 62

Lampiran 6. Scanning pengkoreksi ... 66

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ... 69

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH ... 75

Lampiran 9. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru ... 78

Lampiran 10. Penimbangan uji kandungan fenolik total ... 79

Lampiran 11. Scanning kontrol asam galat ... 80

Lampiran 12. Optimasi penentuan kandungan fenolik total ... 80

Lampiran 13. Penentuan kandungan fenolik total ... 85

xvii INTISARI

Antioksidan berperan dalam menghambat oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya kerusakan sel yang berujung pada penyakit degeneratif dapat dihambat. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.). Sebelumnya telah diketahui tanaman lain yang bergenus

Diospyros memiliki kandungan senyawa fenolik berupa kuersetin.

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan secara kuantitatif maupun kualitatif menggunakan radikal 1,1 difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas

antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. Penentuan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteu dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat. Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh Folin-Ciocalteu dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan dengan warna biru.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat sari buah apel beludru mempunyai aktivitas antioksidan sangat kuat dengan nilai IC50 sebesar

(30.0 ± 0,09) µg/mL. Kandungan fenolik total sebesar (393.5 ± 0.35) mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.

Kata kunci: Antioksidan, buah apel beludru (Diospyros blancoi A. DC), fraksi etil asetat, DPPH, kandungan fenolik total

xviii ABSTRACT

Antioxidant plays a role in inhibiting oxidation by binding to free radicals. As a result, the cell damage that leads to degenerative diseases can be inhibited. This research was conducted to determine the antioxidant activity and total phenolic content of ethyl acetate fraction of velvet aple (Diospyros blancoi A. DC.) juice. Previously known that other plants from genus Diospyros contain phenolic compounds such as quercetin.

Antioxidant activity test performed quantitatively and qualitatively using radical 1,1-diphenyl-2 pikrilhidrazil (DPPH) and expressed as the value Inhibition Concentration 50 (IC50). The existence of active antioxidant compounds will change DPPH color from purple to yellow. Determination of total phenolic using Folin-Ciocalteu method expressed as equivalent mass of gallic acid. Phenolic compounds will be oxidized by the Folin-Ciocalteu under alkaline conditions, forming a blue solution.

The results showed that the ethyl acetate fraction of velvet apple juice has very strong antioxidant activity with IC50 of (30.0 ± 0.09) mg / mL. Total phenolic content of (393.5 ± 0.35) mg gallic acid equivalents per gram of ethyl acetate fraction.

Keywords: antioxidant, velvet apple (Diospyros blancoi A. DC), ethyl acetate fraction, DPPH, total phenolic content

1 BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya sehingga bersifat reaktif (Clarkson and Thompson, 2000). Untuk mencapai kestabilan radikal bebas mencari pasangan elektron dari molekul disekitarnya (Frei, 1994; Trevor, 1995; Prakash, 2001). Berbagai kemungkinan dapat terjadi akibat radikal bebas seperti gangguan fungsi sel, kerusakan struktur sel, molekul termodifikasi yang tidak dikenali sistem imun, dan bahkan mutasi. Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA (Winarsi, 2007).

Menurut Suhartono (2002) antioksidan adalah senyawa kimia yang dapat menyumbangkan elektron, sehingga suatu radikal bebas dapat diredam. Secara alami tubuh memiliki antioksidan endogen seperti enzim SOD (scperoxyde dismctase), glutation, dan katalase yang dapat menetralkan radikal bebas, namun jumlahnya terbatas sehingga membutuhkan suplai antioksidan dari luar tubuh (Frei, 1994; Trevor, 1995; Prakash, 2001).

Antioksidan dapat berasal dari bahan alam maupun sintetis. Efek samping antioksidan sintetik yang belum diketahui menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang dibutuhkan (Sunarni, 2005). Oleh sebab itu eksplorasi sumber antioksidan alam yang berasal dari tumbuhan semakin berkembang.

Senyawa-senyawa polifenol mampu menghambat autooksidasi melalui mekanisme radikal scavenging dengan menyumbangkan satu elektron yang tidak

berpasangan pada radikal bebas (Pokorny, Yanishlieva, and Gordon, 2001). Penelitian yang dilakukan oleh Lee, Jiang, Juan, Lin, and Hou (2006) menunjukkan bahwa Diospyros blancoi A. DC. mengandung konstituen fenolik lebih dari 30 mg ekivalen asam galat per gram ekstrak tanaman. Sehingga tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari apel bludru khususnya pada bagian buah (frcctcs).

Apel bludru umumnya digunakan penduduk Asia Tenggara untuk masalah jantung, hipertensi, diabetes, gigitan ular dan serangga, serta digunakan untuk diare (Das, Hamid, Bulubul, Sultana, and Islam, 2010). Kuersetin yang merupakan salah satu anggota flavonoid ditemukan pada tanaman yang masih satu genus dengan apel bludru (Diospyros blancoi) yaitu American Persimmon

(Diospyros virginiana L ) (Duke, 2001), sehingga diperkirakan apel bludru juga memiliki kandungan flavonoid.

Digunakan pelarut air karena senyawa fenolik merupakan metabolit sekunder yang mempunyai cincin aromatik yang terikat dengan satu atau lebih substituen gugus hidroksil (-OH) sehingga pada umumnya larut dalam pelarut polar (Markham, 1988). Fraksi etil asetat digunakan dalam penelitian karena merupakan pelarutyang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk proses pemurnian (Robinson, 1995).

Penentuan aktivitas antioksidan dalam penelitian ini menggunakan metode DPPH. Radikal DPPH memiliki kemampuan untuk direduksi atau distabilisasi oleh antioksidan diukur dengan menentukan penurunan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm. Oleh karena itu DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) biasa

digunakan untuk mengkaji kapasitas penangkapan radikal (Duh et al., 1999). Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal (Sunarni, 2005). Pada penelitian ini juga dilakukan penentuan kandungan fenolik total dengan metode Folin-Ciocalteau sebagai standar penentuan kandungan fenolik total setara massa ekivalen asam galat pada uji aktivitas antioksidan (Aqil et al., 2006).

B. Permasalahan

1. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel bludru yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat ?

2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel bludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50 ?

C. Keaslian Penelitian

Uji aktivitas antioksidan tanaman apel bludru pernah dilakukan oleh Das,

et al. (2010) menggunakan daun, buah, dan kulit batang apel bludru yang diperoleh dari Departemen Botani Universitas Dhaka. Kemudian dalam keadaan kering diekstrak dengan metanol 97% selama 7 hari. Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH serta ditetapkan kandungan fenolik totalnya menggunakan spektrofotometri UV-VIS.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah bahwa dalam penelitian ini menggunakan fraksi etil asetat buah apel bludru dari tanaman apel bludru yang berada disekitar Kampus III Universitas Sanata Dharma

Paingan, Sleman, Yogakarta dan dalam keadaan segar diolah untuk mendapatkan fraksi etil asetat dari sari buah apel bludru. Kemudian diuji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya dengan meggunakan metode Folin-Ciocalteu.

D. Manfaat penelitian

1. Manfaat teoritis: penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel bludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

2. Manfaat praktis: penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas antioksidan buah apel bludru sehingga bisa dimanfaatkan untuk pemeliharaan kesehatan manusia untuk menangkal radikal bebas.

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum: menetapkan kandungan fenolik total meggunakan metode Folin-Ciocalteu dan menguji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH fraksi etil asetat sari buah apel beludru.

2. Tujuan khusus:

a. Mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru yang dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.

b.Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat sari buah apel bludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

5 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Apel Beludru 1. Klasifikasi tumbuhan

Tanaman apel beludru menurut USDA (United States of Department Agriculture) diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Dilleniidae Order : Ebenales Family : Ebenaceae Genus : Diospyros L.

Species : Diospyrosblancoi A. DC.

2. Nama lain

Sinonim : Diopyros discolor

Indonesia : Buah mentega, bisbul Inggris : Velvet apple, mabolo

Melayu : Bcah mentega

Filipina : Mabolo, kamagong (Morton, 1987).

3. Gambaran umum apel beludru

Menurut IPNI (International Plant Names Index) A. DC. merupakan singkatandariAlphonse Louis Pierre Pyramus de Candolle.

Tanaman buah mentega ini berbentuk pohon atau perdu. Tinggi tanaman rata-rata 8-33 m, diameter batang 80 cm dan berakar tunggang. Daunnya tunggal, berseling, bentuk lonjong, ujung daun runcing, tangkai pendek dan warna daun hijau gelap. Panjang daun 15-22,8 cm dan lebar daun 5-9 cm dengan pinggir daun rata. Daunnya berukuran besar, oleh karena itu tanaman ini dapat digunakan sebagai pohon pelindung dan penahan angin. Bunga terletak di ketiak daun, berkelamin tunggal atau hermafrodit, bunga jantan umumnya majemuk sedangkan bunga betina soliter. Buah berbentuk oval antara 5-19 cm (Morton, 1987).

4. Penyebaran Tanaman

Apel beludru berasal dari Kepulauan Filipina yang umumnya terletak dikawasan hutan ketinggian rendah dan menengah. Tanaman ini bisa ditemui dari pulau Luzon hingga pulau paling selatan Filipina, yaitu pulau Sulu. Apel beludru umumnya dibudidayakan untuk diambil buahnya, selebihnya hanya sebagai pohon naungan dipinggir jalan. Selanjutnya, pada tahun 1881 tanaman ini juga ditemukan didaerah Jawa dan Melaya, Kebun Raya Singapura, bahkan tanaman ini banyak digunakan sebagai tanaman hias di India. Pada perkembangan selanjutnya tanaman ini menyebar di berbagai daerah Amerika seperti Miami, Karibia, Jamaika, dan Kuba (Morton, 1987).

5. Kandungan kimia apel bludru

Hasil penelitian yang dilakukan Howlader, Rahman, Khalipa, Ahmed, and Rahman (2012) menunjukkan bahwa Diospyros blancoi memiliki konstituen

kimia seperti flavonoid, alkaloid, tanin, gula, dan gum. seperti Dalam penelitian yang

memiliki kandungan fenolik

ekstrak tanaman. Dalam penelitian yang dilakukan Duke (2011) ditemukan adanya kandungan kuersetin pada tanaman yang masih bergenus sama

Diospyros virginiana

Gambar

Berdasarkan teori

bahwa spesies tumbuhan yang termasuk dalam genus yang sama dari suatu famili tumbuhan tertentu akan mengandung senyawa

senyawa kimia dengan kerangk

berbeda tergantung dari ekosistem dan tantangan alam yang dihadapi oleh spesies.

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman digunakan dan merupakan golongan

antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil ( Marxen, Vanselow, Lippemeier, Hitze, Ruser, and Hansen, 2007)

memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg ekivalen asam galat per gram Dalam penelitian yang dilakukan Duke (2011) ditemukan adanya kandungan kuersetin pada tanaman yang masih bergenus sama

Diospyros virginiana L.

Gambar 1. Struktur kuersetin (Apak dkk., 2007)

Berdasarkan teori kemotaksonomi, Venkataraman (1976)

bahwa spesies tumbuhan yang termasuk dalam genus yang sama dari suatu famili tumbuhan tertentu akan mengandung senyawa-senyawa kimia yang sama atau senyawa kimia dengan kerangka struktur yang sama, hanya saja intensitasnya bisa berbeda tergantung dari ekosistem dan tantangan alam yang dihadapi oleh spesies.

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman digunakan dan merupakan golongan mayoritas senyawa yang bertindak sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil ( Marxen, Vanselow, Lippemeier,

Hansen, 2007).

lebih dari 30 mg ekivalen asam galat per gram Dalam penelitian yang dilakukan Duke (2011) ditemukan adanya kandungan kuersetin pada tanaman yang masih bergenus sama, yaitu

, Venkataraman (1976) mengemukakan bahwa spesies tumbuhan yang termasuk dalam genus yang sama dari suatu famili senyawa kimia yang sama atau hanya saja intensitasnya bisa berbeda tergantung dari ekosistem dan tantangan alam yang dihadapi oleh spesies.

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman mayoritas senyawa yang bertindak sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil ( Marxen, Vanselow, Lippemeier,

Flavonoid berbeda dalam penyusunan gugus hidroksil, metoksi dan bagian gugus glikosida dan dalam konjugasi antara cincin A dan B. Variasi dalam cincin C merupakan pembagian dalam subkelas. Dilihat dari struktur molekular mereka, maka dapat dibagi dari delapan kelas (Sandhar, Kumar, Prasher, Tiwari, Shalhan,

and Sharma, 2011).

Flavone Flavonones Flavonol Isoflavone

Anthocyanidin Catechin Dihydroflavonol Chalcone

Gambar 2. Struktur kimia dari beberapa tipe flavonoid (Sandhar et al., 2011).

Reaksi yang terjadi pada fenol dapat melalui gugus hidroksilnya atau dengan menggantikan atom hidrogen pada cincin aromatiknya. Sifat lainnya yang menarik ia1ah fenol mampu mengkompleks protein sehingga beberapa enzim dapat dihambat. Sifat ini menguntungkan proses ekstraksi, karena dapat diharapkan selarna ekstraksi tidak terjadi reaksi enzimatik. Tetapi, fenol peka

terhadap oksidasi dan ini bisa menyebabkan perubahan fenol se1arna ekstraksi (Simpson, 1985).

Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat kolorometri dengan metode Folin

reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat

adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki serapan kuat pada panjang gelombang 765 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel (Waterhouse, 2002).

Metode Folin dengan standar asam gala

Gambar 3. S

Metode kolorimetri yang biasa digunakan adalah

satu metode yang memiliki reaksi oksidasi yang cepat dengan fenol dengan menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat terhadap oksidasi dan ini bisa menyebabkan perubahan fenol se1arna ekstraksi

Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat

kolorometri dengan metode Folin-Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya reduksi kimia reagen fenol yaitu campuran asam fosfomolibdat-fosfotungstat oleh adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki kuat pada panjang gelombang 765 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel

C. Metode Folin-Ciocalteu

in-Ciocalteu merupakan metode pengukuran kadar dengan standar asam galat (Nely, 2007).

. Struktur asam galat (Kalita, Kar dan Handique, 2011) Metode kolorimetri yang biasa digunakan adalah Folin

satu metode yang memiliki reaksi oksidasi yang cepat dengan fenol dengan menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat terhadap oksidasi dan ini bisa menyebabkan perubahan fenol se1arna ekstraksi

Kandungan fenolik total dalam suatu sampel dapat diukur secara Ciocalteu. Prinsip metode ini adalah adanya fosfotungstat oleh adanya senyawa fenolik, sehingga dihasilkan produk berwarna biru yang memiliki kuat pada panjang gelombang 765 nm. Intensitas serapan pada panjang gelombang tersebut proporsional dengan jumlah senyawa fenolik dalam sampel

iocalteu merupakan metode pengukuran kadar polifenol

Handique, 2011).

olin Ciocalteu, salah satu metode yang memiliki reaksi oksidasi yang cepat dengan fenol dengan menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat

signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011). kandungan fenolik total dilakukan dengan cara memberikan Ciocalteu dan reaksi yang terjadi adalah oksidasi

pereaksi fenol

Folin-molibdotungstat menghasilkan gelombang 745-750 nm (Ronald

Gambar 4. Senyawa fenolik dalam suasana basa (Sambada, 2011)

Gambar 5. Reaksi senyawa fenolik dengan pereaksi Folin

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya

memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan. signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011).

ik total dilakukan dengan cara memberikan

yang terjadi adalah oksidasi dari ion fenolat senyawa uji -Ciocalteu, dimana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen menghasilkan produk dengan warna biru sekitar panjang 750 nm (Ronald et al., 2005).

. Senyawa fenolik dalam suasana basa (Sambada, 2011)

. Reaksi senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu (Sambada, 2011).

D. Radikal Bebas

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak berpasangan pada orbital terluarnya (Clarkson and Thompson, 2000).

memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan. signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011). Estimasi ik total dilakukan dengan cara memberikan reagen Folin dari ion fenolat senyawa uji oleh imana oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen warna biru sekitar panjang

. Senyawa fenolik dalam suasana basa (Sambada, 2011).

Ciocalteu

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron tidak (Clarkson and Thompson, 2000). Untuk memperoleh pasangan elektron senyawa ini sangat reaktif dan merusak jaringan.

Radikal bebas yang terbentuk cenderung untuk mengadakan reaksi berantai yang bila terjadi dalam tubuh dapat menimbulkan kerusakan-kerusakan yang serius (Percival, 1998). Untuk mencapai kestabilan atom atau molekul, radikal bebas akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan elektron. Reaksi seperti ini berlangsung terus menerus dalam tubuh dan bila tidak dihentikan maka akan menimbulkan penyakit seperti kanker, jantung, katarak, penuaan dini, serta penyakit degeneratif lainnya (Andayani, Lisawati, dan Maemunah, 2008).

E. Antioksidan

Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994). Antioksidan merupakan suatu senyawa yang berperan dalam menghambat oksidasi yang diperantarai oksigen. Senyawa antioksidan memegang peranan penting dalam pertahanan tubuh terhadap penyakit. Hal tersebut disebabkan senyawa antioksidan dapat mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh senyawa radikal bebas (Percival, 1998).

Sistem antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari scperoxide dismctase (SOD), katalase dan glctathione peroxidase. Antioksidan nonenzimatik terdiri dari vitamin E, vitamin A, provitamin A (β-karoten), dan vitamin C.

Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).

Pada saat ini penggunaan bahan pengawet dan antioksidan sintetis tidak direkomendasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) karena diduga dapat menimbulkan penyakit kanker (carcinogen agent). Seperti penggunaan tBHQ pada dosis tinggi menyebabkan kanker otak, hal ini dikarekan terbentuknya radikal semikuinon anion dan ROS yang menyerang sel otak. Begitu pula dengan BHT dan BHA, dalam konsentrasi tinggi dapat menginduksi tumor pada perut dan liver hewan uji. Karena itu, perlu dicari alternatif lain, yaitu bahan pengawet dan antioksidan alami yang bersumber dari bahan alam. Bahan pengawet dan antioksidan alami ini hampir terdapat pada semua tumbuh-tumbuhan dan buah-buahan tersebar di seluruh tanah air Indonesia (Hernani, 2005).

F. Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) (Windono et al., 2001).

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom N di tengah) serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis et al., 1994).

Karena adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka basorbansinya menurun secara stoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour et al., 2009).

Salah satu parameter yang telah diketahui sebagai interpretasi hasil dari metode DPPH yang dilakukan adalah “inhibit concentration 50” atau nilai IC50.

Nilai ini didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang menyebabkan 50% hilangnya aktivitas DPPH. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50

yang dihasilkan, bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka semakin tinggi nilai IC50 yang dihasilkan (Molyneux, 2004).

Gambar 6. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl (Molyneux, 2004)

G. Ekstraksi

Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari semakin luas (Harborne, 1987).

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan ( Dirjen POM, 1995). Untuk mendapatkan senyawa yang khas (zat aktif) dalam suatu tumbuhan, diperlukan metode ekstraksi yang cepat dan teliti. Pemilihan metode ekstraksi tergantung pada sumber bahan alami dan senyawa yang akan diisolasi tersebut (Harborne, 1987).

Dalam memilih penyari, seseorang harus mampu mempertimbangkan banyak faktor. Menurut Depkes (1986) cairan penyari yang baik harus memiliki kriteria berikut ini.

(1) Murah dan mudah diperoleh, (2) Stabil secara fisika dan kimia,

(3) Tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, (4) Selektif

(5) Tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan (6) Diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku

Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan zat dari bahan yang disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi: infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian yang berkesinambungan (Depkes, 1986).

H. Spekrofotometri Visibel

Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang 380-780 nm (Mulja dan Suharman, 1995). Menurut Molyneux (2004), absorbansi DPPH terjadi dengan baik pada daerah cahaya

tampak (visible), oleh sebab itu digunakan spektrofotometri visibel untuk pengukuran absorbansinya.

Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) akan menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul penyerapnya, sehingga spektra absorbansi dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Fessenden dan Fessenden, 1995).

Bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut (Sastromihardjojo, 2001). Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi antara gelombang cahaya (foton) dan atom atau molekul. Proses absorbsi cahaya UV-Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan tingkat energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik yang lebih tinggi.

I. Landasan Teori

Radikal bebas tidak stabil sehingga secara reaktif menyerang molekul alami tubuh maka menimbulkan penyakit degeneratif seperti kanker, jantung, dan penuaan dini. Antioksidan sintetis seperti BHT dan BHA, dapat menginduksi tumor dan kanker oleh karena itu tidak direkomendasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan.

Buah apel bludru mengandung senyawa fenolik yang mempunyai aktivitas antioksidan dengan mereduksi radikal bebas untuk menghambat terjadinya reaksi samping yang merugikan.

Metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) memanfaatkan suatu radikal bebas stabil dengan adanya delokalisasi elektron bebas pada molekul tersebut. Delokalisasi ini menyebabkan munculnya absorpsi pada panjang gelombang 517 nm. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning.

Metode Folin-Ciocalteu menggunakan reagen fenol asam fosfomolibdat-fosfotungstat yang akan mengoksidasi gugus fenolik hidroksil. Selama reaksi belangsung, gugus fenolik-hidroksil bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteu, membentuk kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat berwarna biru. Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk.

J. Hipotesis

1. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki kandungan fenolik dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat.

2. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru mempunyai nilai aktivitas antioksidan dinyatakan dengan IC50.

17 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental rancangan acak sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.

B. Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat sari buah apel bludru. 2. Variabel tergantung berupa % IC.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur buah yang dipanen, dan jumlah (g) buah segar yang digunakan.

4. Variabel pengacau tak terkendali berupa, cuaca atau musim, curah hujan, dan kelembaban ruangan.

C. Definisi Operasional

1. Buah apel bludru adalah daging buah yang sudah masak dari tanaman apel bludru disekitar Universitas Sanata Dharma, Paingan, Sleman, Yogakarta. 2. Sari buah apel beludru adalah hasil dari proses filtrasi berulang buah apel

beludru yang telah diblender dengan aquades.

3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi sari buah apel bludru dengan menggunakan etil asetat, dimana sebelumnya sari buah tersebut telah difraksinasi terlebih dahulu menggunakan washbensin.

4.Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi etil asetat sari buah apel bludru untuk menangkap radikal DPPH.

5. Inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil asetat sari

buah apel bludru yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: buah apel bludru yang berasal dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Bahan kimia kualitas farmasetis berupa akuades (Farmasi Sanata Dharma). Bahan kimia kualitas pro analitik (E.Merck) berupa methanol.

Bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi kuersetin, DPPH , reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kualitas teknis Brataco Chemica, yaitu:

washbensin dan etil asetat.

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (jcnke & kcnkel), spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu), blender, corong, Bcchner, oven, mikropipet 10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacccm rotary evaporator (Jcnke & Kcnkel), waterbath

(labo-tech, Heraceus), tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki).

E. Tatacara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman apel bludru dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States of Department Agriculture NRCS.

2. Pengumpulan bahan

Buah apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pada dasarnya apel beludru adalah tanaman yang berbuah periodik sepanjang taun setiap 3-4 bulan. Pemanenan dilakukan akhir bulan januari 2013 pada buah yang sudah masak dengan warna merah kusam pada pagi hari. Untuk penelitian digunakan buah yang tidak berbiji.

3. Preparasi buah apel bludru

Buah segar apel beludru masak yang telah dikupas dan dibersihkan dengan air mengalir kemudian dipotong sekecil dan setipis mungkin. Diambil 350 gram daging buah segar yang telah dipotong kemudian ditambahkan akuades hingga terendam kemudian haluskan dengan blender. Sari buah merupakan filtrat yang diperoleh melalui penyaringan berulang dengan bantuan pompa vakum. Kemudian residu yang tersisa diperas menggunakan kain kasa. Lalu sari buah yang didapat di ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan perbandingan sari buah : washbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling bawah, sedangkan fase

Dari hasil partisi diperoleh dua fase, yaitu fraksi washbensin dan sari buah. Selanjutnya, sari buah diekstraksi cair-cair kembali menggunakan etil asetat dengan perbandingan sari buah : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan sari buah dan fraksi etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan dengan

vaccm rotary evaporator hingga pelarut etil asetat tidak mengalir. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih lanjut.

4. Pembuatan larutan pembanding dan uji

a. Pembuatan larutan asam galat

Sebanyak 10 mg asam galat dilarutkan dan di ad aquades : metanol p.a (1:1) hingga 10 mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; dan 1,5 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125; dan 150 µg/mL.

b. Pembuatan larutan stok kuersetin

Sebanyak 10 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0 mL.

c. Pembuatan larutan intermediet kuersetin

Diambil sebanyak 1 mL larutan stok kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL hingga didapatkan konsentrasi 100 μg/mL.

d. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5 mL larutan intermediet kuersetin, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga

diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 μg/mL.

e. Pembuatan larutan DPPH

DPPH sebanyak 15,7 mg dilarutkan menggunakan metanol p.a kedalam labu ukur 100 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

f. Pembuatan larutan uji

i. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 10 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10 metanol p.a, kemudian diambil 3 mL dan ditambahkan metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 300,0 µg/mL.

ii. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Larutan stok dibuat dengan 10,0 mg fraksi etil asetat yang dilarutkan dengan metanol p.a dan ad sampai 10,0 mL. Larutan intermediet dibuat dengan 1 mL stok yang di ad sampai 10 mL. Kemudian Diambil sebanyak 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5 mL, lalu ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 15; 20; 25; 30; 35 μg/mL.

5. Uji pendahuluan

a. Uji keberadaan senyawa fenolik

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 300,0 µg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 µg/mL ditambah 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan

selama 10 menit. Tambahkan 2 mL larutan natrium karbonat 1 M setelah itu divortex 30 detik. Kemudian amati warna larutan tersebut.

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL methanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL , dan larutan uji 200 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selamam 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.

6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini ( 2007). a. Penentuan OT

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga untuk fraksi etil asetat dengan konsentrasi 300 μg/mL.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat

1 M. Diamkan selama OT, dilakukan scanning panjang gelombang maksimum dengan spektrofotometer visibel pada 600-800 nm.

7. Penetapan kandungan fenolik total

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 300 μg/mL, lalu dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat). Lakukan 3 kali replikasi.

8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Larutan DPPH sebanyak 0,5; 1,0; 1,5 mL dimasukkan kedalam 3 labu ukur 10 mL. Kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT teoritis. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum yang didapat selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 15,0; 25,0; 35,0 μg/mL.

9. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini (2007).

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji. b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL kemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30

detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.

c. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 9 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin

dan fraksi etil asetat buah apel bludru.

F. Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) IC dihitung dengan rumus :

( ) – ( )

x 100%

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 mengunakan

persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan bermakna antara IC50 larutan

pembanding dan larutan uji.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekivalen asam galat dalam per g fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi linier dengan data kurva baku secara intrapolasi.

26 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Tujuan determinasi tanaman yaitu untuk memastikan kebenaran identitas tanaman yang hendak digunakan dalam analisis fitokimia. Maka dari itu determinasi tanaman merupakan langkah awal yang harus dilakukan dari suatu penelitian dengan menggunakan sampel berupa tanaman. Determinasi tanaman

apel beludru telah dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States of Department Agriculture NRCS.

Pembuktian dikuatkan dengan surat determinasi (lampiran 1) tanaman yang dikeluarkan oleh Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang menyatakan kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah apel beludru diperoleh dari kawasan Kampus III Universitas Sanata Dharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pada dasarnya apel bludru adalah tanaman yang berbuah periodik sepanjang tahun setiap 3-4 bulan. Pemanenan dilakukan akhir bulan januari 2013 dengan kriteria buah yang sudah masak dengan warna merah kusam, dilakukan pada pagi hari, tidak berbiji dan segera dilakukan preparasi lebih lanjut pada buah yang masih segar.

Pemanenan dilakukan pada pagi hari agar kandungan metabolit sekunder yang berfungsi sebagai antioksidan tidak berkurang, hal ini dikarenakan senyawa antioksidan digunakan tanaman untuk melawan radiasi sinar UV didalam tanaman (Andayani, Lisawati dan Maimunah, 2008) serta menjaga metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman tidak diolah menjadi metabolit sekunder lainnya melalui fotosintesis (World Health Organization, 2003). Alasan lain dilakukannya pemanenan buah pada pagi hari yaitu untuk menghindari kesalahan pengambilan buah yang masak berdasarkan warna. Berdasarkan pengamatan peneliti buah apel beludru diselimitu bulu-bulu halus berwarna putih keemasan yang menjadi kemerahan jika terpapar sinar matahari dalam waktu yang lama.

Berdasarkan dekripsi tanaman sesuai Morton (1987) buah apel beludru memiliki empat hingga delapan biji buah, walaupun sering kali didapati buah sama sekali tanpa biji. Untuk menghindari ketidakseragaman tersebut dan sesuai kondisi pengumpulan bahan dimana didapatkan buah yang tidak berbiji, maka dikatakan penelitian ini menggunakan buah apel beludru yang tidak berbiji.

Hasil sari buah yang didapatkan dalam penelitian ini berasal dari buah segar yang langsung diproses sesuai cara kerja yang telah ditetapkan. Hal ini bertujuan untuk menghindari aktivitas polifenol oksidase dari fungi yang dapat mendegradasi senyawa-senyawa polifenol (Evans and Hedger, 2001).

C. Hasil Preparasi Sampel 1. Hasil pembuatan sari buah

Tujuan dilakukan pembuatan sari buah yang bukan merupakan metode ekstraksi secara kimiawi didasarkan pada aplikasi buah apel beludru dalam masyarakat sebagai bahan konsumsi dan bukan ditujukan sebagai sumber senyawa antioksidan. Sehingga penelitian ini berguna untuk melihat aktivitas antioksidan buah apel beludru saat dikonsumsi sebagai sari buah.

Sari buah dibuat melalui proses penghalusan menggunakan blender dan penyaringan yang dibantu pompa vakum. Rangkaian proses ini termasuk metode ekstraksi secara fisis-mekanis karena bertujuan menarik cairan dari padatan (Suyitno, 1989). Awalnya 350 g buah apel bludru segar yang telah dikupas dan dicuci air mengalir dipotong sekecil dan setipis mungkin untuk memudahkan proses penghalusan. Penghalusan dengan blender dilakukan sampai semua bahan berubah menjadi seperti bubur skim dan tidak terdapat bagian yang masih kasar. Ekstraksi fisis-mekanis bergantung pada kehalusan bahan (besar-kecilnya hancuran) dimana semakin kecil ukuran maka luas permukaan untuk setiap satuan berat semakin besar dan cairan yang terekstraksi akan optimal. Faktor lain yang mempengaruhi hasil ekstraksi mekanis adalah kandungan cairan dimana semakin tinggi kandungan cairan maka akan menghasilkan ekstrak yang lebih banyak (Suyitno, 1989). Sehingga sebelum proses penghalusan tersebut, ditambahkan akuades sebanyak 600 mL hingga semua potongan buah segar terendam dan nantinya berguna untuk meningkatkan volume sari buah yang dihasilkan. Kemudian hasil penghalusan bahan disaring dengan bantuan pompa vakum antara

2 - 2,5 jam sampai ampas terlihat padat dan mengeras. Kemudian residu yang tersisa diperas menggunakan kain kasa untuk mendapatkan sisa cairan yang mungkin masih terkandung. Setelah didapat sari buah keruh, selanjutnya dilakukan refiltrasi agar didapat sari buah jernih yang memudahkan proses partisi pada proses selanjutnya. Total sari buah yang didapat dengan penambahan akuades 600 mL adalah 470 mL.

Untuk mengekstraksi senyawa fenolik dalam bahan tumbuhan dapat dilakukan dengan pelarut polar seperti etanol, metanol, n-butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air (Markham, 1988). Sari buah yang didapat diharapkan mengandung senyawa fenolik yang hendak diuji karena digunakan akuades yang juga berperan sebagai pelarut polar.

2. Hasil fraksinasi sari buah

Sari buah apel beludru yang didapat kemudian diekstraksi menggunakan

washbensin untuk menarik senyawa non polar. Indeks polaritas washbensin

adalah 3,8 yang bersifat sangat non polar, sehingga dapat digunakan untuk mengekstraksi senyawa non polar seperti klorofil, vitamin, minyak dan lemak (Snyder 1997).

Penggunaan washbensin untuk menarik senyawa nonpolar dari air sesuai metode ekstraksi cair-cair dimana prinsip pemisahan senyawanya berdasarkan kepolaran dengan dua pelarut yang kepolaranya berbeda. Sari buah yang didapat diekstraksi menggunakan washbensin dengan perbandingan (1:1), sehingga volume total setiap pemisahan dalam corong pisah adalah 200 mL yang terdiri

dari 100 mL sari buah dan 100 mL washbensin. Setelah itu akan terbentuk 2 fase dalam corong pisah yang terdiri dari fase washbensin pada bagian atas dan fase air pada bagian bawah. Berat jenis washbensin (0,730) lebih kecil dibanding air (0,996) (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995), hal ini yang menyebabkan washbensin berada pada bagian atas.

Langkah tersebut dilakukan sebanyak tiga kali. Dilakukan. Ekstraksi cair-cair dilakukan berulang disesuaikan dengan hukum nerst yang prinsipnya ektraksi cair-cair berulang akan lebih efektif dibanding ektraksi tunggal (Bassett,

et al., 1991).

Fase air yang didapat dari proses ekstraksi dengan washbensin kemudian diekstraksi kembali menggunakan etil asetat (1:1) dan dilakukan sebanyak 3 kali. Etil asetat yang berbobot jenis kecil dibandingkan dengan air (0,898 : 0,996) (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995) akan berada pada bagian atas. Ekstraksi menggunakan etil asetat yang bersifat lebih non polar dibanding air ditujukan untuk menarik senyawa aglikon yang hendak diuji. Memang tidak diketahui secara pasti senyawa fenol apa yang terkandung dalam tanaman apel beludru (Diospyros blancoi), sehingga pendakatan yang dilakukan untuk memprediksi kandungan senyawa fenoliknya adalah dengan melihat kandungan metabolit tanaman yang masih satu genus. Menurut Duke (2011)

Diospyros virginiana L mengandung senyawa fenolik kuersetin.

Kuersetin adalah salah satu golongan flavones yang merupakan senyawa aglikon yang bersifat lebih non polar (Andersen and Markham, 2006). Maka dari itu fraksinasi menggunakan etilasetat ditujukan untuk menarik senyawa

flavonoids dengan golongan isoflavones, flavanones, methylated flavones, and flavonols (Andersen and Markham, 2006).

Fraksi etilasetat yang didapat kemudian diuapkan pelarutnya dengan

vacccm rotary evaporator supaya tidak merusak kestabilan senyawa fenolik. Hal ini dikarenakan vaccum rotary evaporator dapat menguapakan suatu pelarut dibawah titik didihnya melalui prinsip titik didih yang akan turun ketika tekanan diturunkan (Dave, 2010). Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar 140 mg dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 0,046%.

D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik

Uji kualitatif senyawa fenolik pada fraksi etil asetat ini memakai prinsip reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Dalam suasana basa yang berasal natrium karbonat, senyawa fenolik akan berubah menjadi ion fenolat. Ion fenolat bersifat lebih reaktif terhadap adanya pereaksi fenol Folin- Ciocalteu. Asam fosfomolibdat-fosfotungstat dalam pereaksi fenol Folin- Ciocalteu akan tereduksi oleh ion fenolat tersebut sehingga akan terbentuk larutan dengan warna biru (Singleton dan Rossi, 1965). Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna biru seperti kontrol positif (gambar 7). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat sari buah apel beludru mengandung senyawa fenolik.

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolik (A = kontrol negatif [Folin Ciocalteu dan Na2CO3], B = kontrol positif [Asam Galat + Folin Ciocalteu

dan Na2CO3 ], C= larutan uji [fraksi etil asetat sari buah apel beludru + Folin

Ciocalteu dan Na2CO3], D =Asam Galat, E =Fraksi etil asetat sari buah apel bludru) 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji pendahulan ini bertujuan untuk megetahui secara kualitatif apakah fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki aktivitas antioksidan atau tidak. Uji ini berdasarkan reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu ruangan dan berwarna violet dalam metanol. Radikal yang bereaksi dengan antioksidan tersebut dapat merusak rantai yang bertanggung jawab sebagai warna ungu dan menjadi warna kuning (Badarinath et al., 2010)

Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna kuning seperti kontrol positif (gambar 8). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki aktivitas antioksidan.

E D

Gambar 8. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif [blanko DPPH], B =kontrol positif [kuersetin + DPPH], C = larutan uji [fraksi etil asetat sari

buah + DPPH], D =kuersetin, E=Fraksi etil asetat sari buah apel beludru)

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total 1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan operating time dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan rentang waktu dimana reaksi antara baku pembanding (asam galat) dan larutan uji (fraksi etil asetat sari buah) terhadap reagen (Folin Ciocalteu) yang diberikan telah optimum. Penentuan operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari baku pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Estimasi waktu yang dilihat adalah dalam waktu tiga puluh menit (asam galat) dan 60 menit (fraksi etil asetat) dengan selang waktu lima menit. Panjang gelombang maksimum yang dipakai adalah panjang gelombang yang telah didapatkan dalam penetapan lamda maks teoritis, yaitu 750 nm.

E D

B C

Gambar 9. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 3)

Dari hasil yang ditunjukan dengan grafik (gambar 5) OT yang didapatkan untuk pengukuran asam galat adalah 20 menit. Serta hasil OT yang didapatkan untuk pengukuran fraksi etil asetat adalah 40 – 50 menit (Lampiran, 12b).

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Panjang gelombang maksimum dimaksudkan untuk mendapatkan serapan maksimum dari hasil reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu. Pengukuran pada panjang gelombang maksimum akan menimbulkan perbedaan respon yang besar untuk setiap beda konsentrasi. Dalam penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 50; 100; dan 150 µg/mL. Hal ini bertujuan untuk merepresentasikan panjang gelombang maksimum dari setiap konsentrasi.

Panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 751,0 nm.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 10 20 30 40

Ab so rb an si Waktu (menit)

Penentuan Operating time Asam Galat

50,50 µg/mL 101 µg/mL 151,50 µg/mL

Tabel I. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin Ciocalteu

Konsentrasi larutan

Asam galat hasilλ maksimum scanning(nm) yang digunakan λ maksimum

λ maksimum teoritis

150 µg/mL 751,0

751,0 ₇₅₀

100 µg/mL 751,0

50 µg/mL 751,0

Untuk memastikan tidak adanya gangguan pembacaan absorban maka dilakukan scanning pada larutan pembanding asam galat (Lampiran 11) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6e) pada panjang gelombang maksimum 751 nm dan hasilnya menunjukkan tidak adanya serapan. Artinya tidak terdapat kontaminan atau senyawa lain terukur pada panjang gelombang tersebut sehingga dapat mengganggu pengukuran karena adanya interferensi atau overlapping.

F. Estimasi Kandungan Fenolik Total

Senyawa yang berperan utama dalam aktivitas antioksidan adalah senyawa fenolik. Senyawa fenolik banyak terdistribusi dalam tanaman, maka perlu dilakukan perhitungan kandungan fenolik total yang mungkin tedapat pada fraksi etil asetat sari buah apel beludru tersebut. Prinsip metode kolorimetri Folin Ciocalteu adalah reaksi oksidasi yang cepat dari fenol dengan menggunakan alkali (biasanya sodium karbonat), dimana nilai yang didapat signifikan dengan konsentrasi ion fenolat (Cicco dan Latanzio, 2011).

Kompleks biru yang terbentuk terjadi dengan reaksi oksidasi reduksi dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana oksidasi

dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat dengan produk warna biru sekitar panjang gelombang 745-750 nm (Ronald,et al., 2005).

Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion fenolik yang teroksidasi oleh kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat, juga semakin pekatnya warna biru yang terbentuk juga menandakan semakin banyak kompleks fosfotungstat-fosfomolibdat yang tereduksi (Singleton and Rossi, 1985).

Pembuatan kurva kalibrasi asam galat dilakukan sebanyak tiga kali dan untuk menentukan kandungan fenolik total digunakan persamaan dengan nilai r terbaik.

Tabel II. Hasil pengukuran absorbansi seri baku asam galat yang direaksikan dengan folin-ciocalteu

Asam galat

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

(µg/mL) Absorbansi terukur Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi terukur Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi terukur

51,0 0,231 51,0 0,242 50,50 0,221

76,5 0,354 76,5 0,363 75,75 0,346

102,0 0,485 102,0 0,489 101,00 0,481

127,5 0,632 127,5 0,637 126,25 0,626

153,0 0,767 153,0 0,769 151,50 0,760

y =5,2941.10-3_{x – 0,0462}

r= 0,9995 y = 5,2078.10

-3_{x -0,0312}

r = 0,9993 y = 5,3782.10

-3 _{x – 0,0564}

Gambar 10. Kurva kalibrasi asam galat dalam penetapan fenolik total Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel

beludru

Replikasi _{(mg ekivalen)} fenolik total rata-rata ± SD _(%) CV I 393,12

393,52 ± 0,35

II 393,75 0,0877

III 393,68

Dari ketiga persamaan yang telah didapatkan (Tabel II)dipilih persamaan yang memiliki nilai r terbaik. Persamaan regresi linear yang paling baik diperoleh dari replikasi III dengan y = 5,3782.10-3 _{x – 0,0564 dan R sebesar 0,9997. Nilai r}

yang semakin baik menunjukkan koefisien korelasi yang baik dimana akan membentuk garis lurus. Hal tersebut menunjukkan kesebandingan antara penambahan konsentrasi asam galat dan penambahan absorbansi. Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi linear y = 5,3782.10-3 x – 0,0564, maka didapatkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat sari buah apel beludru sebesar (393,5 ± 0,35) mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.

y = 5,378.10-3_{x - 0,0564}

r= 0,9997 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 50 100 150

Ab

so

rb

an

si

Konsentrasi Asam Galat (µg/mL) Konsentrasi Asam Galat Vs Absorbansi

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum DPPH sehingga dengan sedikit perubahan konsentrasi DPPH akan menyebabkan perubahan absorbansi yang besar dan sensitivitas penelitian menjadi maksimum. Pengukuran yang dilakukan pada panjang gelombang maksimum juga ditujukan untuk mendapatkan linearitas seri konsentrasi yang dibuat. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom.

Sedangakan dengan adanya elektron tak berpasangan pada DPPH, akan menimbulkan warna violet. Secara teoritis DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm (Dehpour et al., 2009) dan menurut Molyneux (2004) panjang gelombang untuk pengukuran DPPH berkisar antara 515 nm-520 nm. Berdasarkan pengujian, panjang gelombang maksimum yang dihasilkan adalah 516,0 nm berbeda dengan panjang gelombang maksimum teoritis yaitu 517 nm. Perbedaan ini masih memenuhi kriteria yang tercantum dalam Farmakope Indonesia edisi IV (1995) dimana batas pergeseran maksimum adalah 2 nm. Perbedaan λ max tersebut disebabkan perbedaan instrumen pengukuran yang digunakan.

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada 3 konsentrasi, yaitu 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Hal ini bertujuan agar merepresentasikan panjang gelombang maksimum yang sama walaupun konsentrasinya berbeda-beda. Absorbansi sampel dihitung dengan acto zero menggunakan metanol karena

berperan sebagai pelarut. Panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga konsentrasi tersebut adalah 516,0 ; 515,5 ; 516,0 nm. Panjang gelombang maksimum ditetapkan dengan rerata hasil ketiga panjang gelombang yang didapatkan yaitu 515,8 nm yang kemudian dibulatkan menjadi 516 nm.

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi larutan

DPPH hasilλ maksimum scanning yang digunakan λ maksimum λ maksimum teoritis

0,02 mM 516.0

516.0 517

0,04 mM 515.5

0,06 mM 516.0

Untuk membuktikan ada atau tidaknya gangguan dari konstituen lain maka dilakukan scanning pada pelarut (metanol), standar kuersetin, dan fraksi etil asetat sari buah apel beludru dengan panjang gelombang antara 400 – 600 nm.

Hasil scanning pada Pelarut (Lampiran 6a), larutan pembanding kuersetin (Lampiran 6c) dan larutan uji fraksi etil asetat (Lampiran 6d) pada panjang gelombang 516 nm tidak terdapat serapan. Artinya tidak terdapat kontaminan atau senyawa lain yang terukur pada panjang gelombang tersebut yang dapat mengganggu pembacaan DPPH karena adanya interferensi atau

2. Penentuan operating Time

Penentuan OT berguna untuk menentukankan rentang waktu saat larutan pembanding dan larutan uji mereduksi radikal DPPH dengan sempurna sehingga diperoleh absorbansi yang stabil. Penentuan operating time didasarkan pada waktu saat absorbansi pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antara selang waktu yang diujikan. Nilai absorbansi yang stabil akan membuat pengukuran menjadi reprodusibel dan meminimalkan kesalahan analisis. Penentuan OT dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH pada λ maksimum yang dihasilkan yaitu 516 nm, setiap 5 menit selama 60 menit pada larutan pembanding dan larutan uji dengan kosentrasi rendah, tengah, dan tinggi.

Gambar 11. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 3)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 10 20 30 40 50 60

Ab

so

rb

an

si

Waktu (menit)

Penentuan Operating time

Kuersetin

4,95 µg/mL 9,90 µg/mL 14,85 µg/mL

dikupas dan dibersihkan denganair mengalir kemudian dipotong sekecil dan setipis mungkin. Diambil 350 gramdaging buah segar yang telah dipotong kemudian ditambahkan akuades hinggaterendam selanjutnyadihaluskan dengan blender. Sari buah merupakan filtrat yangdiperoleh melalui penyaringan berulang dengan bantuan pompa vakum. Sari buah yang didapat diekstraksi cair-cair menggunakan

wash benzinedengan perbandingan (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna.Langkah ini dilakukan sebanyak 3 kali.Fraksi wash benzinedisingkirkan, selanjutnya sari buah diekstraksi cair-cair m e n g g u n a k a n e t i l a s e t a t denganperbandingan 1:1 (v/v) sehingga didapatkan sari buah dan fraksietil asetat. Fraksi etil asetat dipekatkan dengan vacuum rotaryevaporator hingga pelarut etil asetat tidak mengalir, lalu dikeringkan dalam oven

o

pada 50 C sampai bobot tetap, selanjutnya disebut fraksi etil asetat buah apel beludru.

2.4. Uji kandungan fenolat

2.4.1. Pembuatan larutan baku asam galat

Asam galat dilarutkan dalam campuran akuades:metanol (1:1) dan dibuat seri pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50; 75; 100; 125;dan 150 μg/mL.

2.4.2. Pembuatan larutan uji untuk penentuan kandungan fenolat total

Dibuat larutan uji fraksi etil asetat sari buah apel beludrudalam metanol, dengan konsentrasi 300 μg/mL.

2.4.3. Uji pendahuluan keberadaan senyawa fenolat

Sejumlah 0,5 mL larutan uji 300,0

μg/mL dan larutan pembanding asamgalat 150,0 μg/mL masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telahdiencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Larutan didiamkan selama 10menit, lalu ditambahkan 2 mL larutan natrium karbonat 1 M, kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30detik. Perubahan warna larutan menjadi biru menunjukkan keberadaan golongan senyawa fenolat.

2.4.4. Penetapan kandungan fenolat total

1) Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 75, 100, 125, dan 150 μg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1M. Setelah OT,

absorbansinya dibaca pada λmaksyaitu 751 nm terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.

2) Estimasi kandungan fenolat total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 300 μg/mL, lalu dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolat total dinyatakan sebagai miligram ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat, dilakukan 3 kali replikasi.

2.5. Uji aktivitas antioksidan

2.5.1. Pembuatan larutan pembanding kuersetin

Kuersetin dilarutkan dalam metanol dan dibuat seri pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi larutan kuersetin sebesar 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 μg/mL.

2.5.2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Dibuat seri larutan uji fraksi etil asetat dalam metanol, dengan konsentrasi 15, 20, 25, 30, dan 35 μg/mL.

2.5.3. Pembuatan larutan DPPH

DPPH sebanyak 15,7 mg dilarutkan menggunakan metanol dalam labu ukur 100,0 mL sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

2.5.4. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Ke dalam tiga buah tabung reaksi masing-masing dimasukkan sebanyak 1 mL larutan DPPH.Selanjutnya masing-masing ditambah dengan 1 mL metanol, larutanpembanding kuersetin 37,5 μg/mL, dan larutan uji 200

μg/mL. Selanjutnyalarutan ditambah dengan 3 m L m e t a n o l . K e m u d i a n l a r u t a n dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Perubahan warna larutan menjadi kekuningan menunjukkan adanya aktivitas antioksidan.

2.5.5. Uji aktivitas antioksidan

Uji aktivitas antioksidan ditentukan d e n g a n m e n g g u n a k a n metodespektrofotometri sesuai dengan penelitian Nusarini (2007).

1) Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol hingga tanda b a t a s . K e m u d i a n l a r u t a n d i b a c a absorbansinya pada saat OT (35 menit) dan panjang gelombangserapan maksimum yaitu 516 nm. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali.

2) Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan larutan uji

Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mLkemudian ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai s e r i k o n s e n t r a s i y a n g t e l a h d i b u a t . Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan metanol hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik dandiamkan selama

OT (30 menit). Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometervisibel pada panjang gelombang serapan maksimum hasil optimasi, yaitu 516 nm. Pengujian dilakukandengan 3 kali replikasi.

3) Estimasi aktivitas antioksidan

Data hasil pengukuran absorbansi larutan uji (fraksi etil asetat sari buah apel beludrudan senyawa pembanding larutan rutin)digunakan untuk menghitung nilai %IC dan IC .50

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%IC) dihitung dengan rumus :

Nilai aktivitas antioksidan yang

dinyatakan denganIC50 ditentukan dengan

persamaan garis regresi linear antara

konsentrasi larutan uji (sumbu x) dengan % IC (sumbu Y).

3. Hasil dan Pembahasan 3.1. Penyiapan bahan penelitian

Determinasi menjadi langkah awal penelitian untuk mendapatkan kepastian mengenai kebenaran tanaman yang hendak digunakan. Determinasi tanaman dalam penelitian inidilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi UniversitasSanata Dharma menurut Morton (1987) dan United States of Department AgricultureNRCS. Berdasarkan hasil degterminasi tersebut diketahui bahwa tanaman yang digunakan adalah Diospyros blancoi A. DC yang umum dikenal dengan nama apel beludru.

Buah dari tanaman apel beludru untuk penelitian ini diperoleh dari lingkungan Kampus III Universitas SanataDharma Paingan, Sleman, Yogakarta. Pemanenan buah yang sudah masak dilakukan akhirbulan Januari 2013 dengan kriteria warna merahkusam, tidak berbiji, utuh, segar.Buah sesegera mungkin dikupas dan daging buahnya dihaluskan. Menurut Evans and Hedger (2001) enzim polifenol oksidase cepat mendegradasi senyawa-senyawa polifenol. Untuk meminimalkan kerusakan, maka sari buah yang didapatkan segera diekstrasi cair-cair dengan wash benzine

kemudian fraksi air diekstraski dengan etil asetat.

Ekstraksi menggunakan washbenzine

digunakan untuk menarik senyawa non polar seperti klorofil, vitamin, minyak dan lemak

(Snyder 1997). Kelompok senyawa-senyawa t e r s e b u t k u r a n g d i k e n a l a k t i v i t a s antioksidannya, sehingga perlu disingkirkan. Fase air yang didapat dari proses ekstraksi dengan washbenzine kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat. Ekstraksi dengan etil asetat ditujukan untuk menarik senyawa a g l i k o n t e r m a s u k d a r i g o l o n g a n polifenol.Hasil ekstraksi cai-cair ini akan menghasilkan fraksi etilasetat yang banyak mengandung golongan fenolat, sehingga aktivitas antioksidannya diharapkan cukup tinggi. Fraksi etil asetat yang diperoleh kemudian diuapkan pelarutnya dengan

vacuumrotary evaporator supaya tidak merusak kestabilan senyawa fenolat. Setelah dikeringkan dalam oven sampai bobot tetap, rendemen fraksi etil asetat yang didapat sebesar 0,046%.

3. 2. Uji senyawa fenolat

Langkah awal adalah uji kualitatif senyawa fenolat pada fraksi etil asetat.Uji ini menggunakan prinsipreaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Dalam suasana basa, senyawa fenolat akan berubah menjadi ion fenolat. Menurut Singleton dan Rossi (1965)ion fenolat bersifatlebih reaktif terhadap adanya pereaksi fenol Folin- Ciocalteu. Asam fosfomolibdatfosfotungstat dalam pereaksi fenol Folin- Ciocalteu akan tereduksi oleh ion fenolattersebut sehingga akan terbentuk larutan dengan warna biru. Pengujian (Gambar 1) menunjukkan hasil positif bahwa fraksi etil asetat sari buah apel beludrumengandung senyawa fenolat.

sebagai ekivalen asam galat. Berdasarkan persamaan kurva baku asam galat yang

-3

diperoleh (y = 5,3782.10 x – 0,0564 dan R= 0,9997) maka kandungan fenolat total dalam fraksi etil asetat sari buah apel beludru dapat ditentukan (Tabel I).

Berdasarkan hasil perhitungan didapatkan hasil kandungan fenolat total rata-rata pada sampel sebesar 393,52 ± 0,35 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat sari buah apel beludru. Kandungan fenolat total

i n i b e r h u b u n g a n d e n g a n d a y a antioksidannya. Namun demikian tidak selalu kenaikan kandungan fenolik total diikuti naiknya aktivitas antioksidan. Jenis senyawa fenolat yang ada juga sangat menentukan aktivitasnya. Oleh karena itu masih diperlukan tahap penelitian lanjutan yaitu menentukan senyawa yang paling berperan dalam aktivitas antioksidan dalam fraksi etil asetat sari buah apel beludru ini.

3.3. Uji aktivitas antioksidan

Senyawa DPPH banyak digunakan untuk uji aktivitas antioksidan. Senyawa radikal DPPH cukup stabil pada suhu ruangan dan berwarnaviolet dalam metanol. Antioksidan a k a n m u d a h m e r u s a k r a n t a i y a n g bertanggung jawab sebagai warna ungu dan menjadi warnakuning (Badarinath et al., 2010).

Senyawa DPPH memiliki elektron yang tidak berpasangan sehingga bersifat radikal. Ketika elektronnya menjadi berpasangan karena bereaksi dengan suatu antioksidan ( p e n a n g k a p r a d i k a l b e b a s ) , m a k a absorbansinya menurun secarastoikiometri sesuai jumlah elektron yang diambil ( G a m b a r 2 ) . K e b e r a d a a n senyawaantioksidan dapat mengubah warna l a r u t a n D P P H d a r i u n g u m e n j a d i kuning(Dehpour, Ebrahimzadeh, Nabavi,

and Nabavi, 2009). Sifat inilah yang

Replikasi Fenolik total

(mg ekivalen) Rata-rata ± sd CV (%)

I 393,12

393,52 ±0,35 0,0877

II 393,75

III 393,68

Gambar 1. Hasil uji pendahuluan keberadaan

senyawa fenolat (A = kontrol negatif [Folin Ciocalteu danNa CO ], B = kontrol positif [asam 2 3 galat + Folin Ciocalteu dan Na CO ], C= larutan uji 2 3

[fraksietil asetat sari buah apel beludru + Folin Ciocalteu dan Na CO ], D =asam galat, E =fraksi 2 3

etilasetat sari buah apel beludru)

Tabel I. Hasil perhitungan kandungan fenolat total

digunakan sebagai dasar penggunaan radikal DPPH sebagai bahan uji aktivitas antioksidan.

Penelitian ini menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna kuningseperti kontrol positif (larutan kuersetin). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat sari buah apelbeludru memiliki aktivitas antioksidan (Gambar 3).

Parameter aktivitas antioksidan dengan metodepenangkapan radikal DPPH ini adalah nilaiIC yakni konsentrasi senyawa 50 uji yangdibutuhkan untuk mengurangi jumlah radikal DPPH sebesar 50%. Nilai IC 50 diperoleh daripersamaan regresi linier yang m e n y a t a k a n h u b u n g a n a n t a r a konsentrasisenyawa uji dengan persen aktivitas antioksidan. Semakin kecil nilai IC senyawauji, maka semakin poten 50 senyawa uji tersebut sebagai antioksidan.

Dari hasil penelitian ini diperoleh bahwa bahan uji fraksi etil asetat sari buah

apel beludru memiliki daya antioksidan yang sangat kuat (IC = 29,920,09 µg/mL), 50 walaupun tidak sekuatkuersetin (IC = 50 10,800,31 µg/mL).Hal ini disebabkan karena fraksi etil asetat buah apel beludru masih merupakan campuran berbagai senyawa fenolat yang tidak semuanya memiliki aktivitas antioksidan yang kuat, sementara kuersetin merupakan senyawa murni. Berdasarkan nilai IC yang cukup rendah 50 (aktivitas sangat kuat) ini, maka fraksi etil asetat cukup potensial digunakan sebagai salah satu alternatif sumber senyawa antioksidan.

4. Kesimpulan dan Saran 4.1. Kesimpulan

1. Kandungan fenolat total fraksi etil asetat sari buah apel beludru sebesar 393,5 ± 0,35 mgekivalen asam galat per gram fraksi.

2. Fraksi etil asetat sari buah apel beludru memiliki daya antioksidan sangat kuat denga nilai IC sebesar30,0 ± 0,09 50 μg/mL.

4.2. Saran

Perlu dilakukan identifikasi senyawa yang paling potensial sebagai antioksidan dalam fraksi etil asetat sari buah apel beludru.

Daftar Pustaka

Aqil, F., Ahmad,I., and Mehmood, Z., 2006, Antioxidant and Free Radical Scavenging Properties of Twelve Traditionally Used Indian Medical Plants, Turk J Biol, 30,177-183

Badarinath, A.V., Mallikarjuna, K., , Chetty, C., Sudhana, M., Ramkanth, S., Rajan, T.V.S, and Gnanaprakash, K., 2010, A Review on In-vitro Antioxidant Methods: Comparisons, Correlations

Gambar3. Hasil uji pendahuluan aktivitas

antioksidan (A= kontrol negatif [blanko DPPH], B=kontrolpositif [kuersetin + DPPH], C= larutan uji

[fraksi etil asetat sari buah + DPPH], D=kuersetin,E=fraksi etil asetat sari buah apel

and Considerations, Int. J. Pharm. Tech. Research, Vol.2, No.2, pp. 1276-1285.

Clarkson, P.M., and Thomson, H.S. 2000. Antioxidants: What role do they play in physical activity and health, Am. J. Clin. Nutr. 729 (Suppl): 637.

Dehpour AA, Ebrahimzadeh MA, Nabavi SF, and Nabavi SM (2009), Antioxidant activity of methanol extract of Ferula assafoetida and its essential oil composition, Grasas Aceites, 60(4): 405-412.

Duh, P., Tu,Y. and Yen,G., 1999, Antioxidant activity of water extract of Harng Iyur (Chrysanthemum morifolium Ramat), Lebensm Wiss U Technol 32: 269-277.

Duke, J.A., 2001, Handbook of Phytochemical Constituents of Grass Herbs and Other Economic Plants, CRC Press, Washington D.C., pp.235 Evans, C.S., and Hedger, J.N., 2001, Degradation of

Plant Cell Wall Polymers, in Gadd, G.M., (Ed.), Fungi in Bioremediation, Cambridge University Press, United Kingdom, 18.

Lee, M.H., Jiang, C.B., Juan, S.h., Lin, R.D. and Hou, W.C. 2006. Screening of medicinal plant extracts for antioxidant activity, Life Science, 73: 167-179. Morton, J., 1987, Fruit of Warm Climate, Mabolo,

Miami, FL, pp. 418-419.

Nusarini, N.M.R., 2007, Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak metanolik Herba Ketul ( Bidens pilosa L.), Skripsi, 15-20, Fakultas Farmasi

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Pokorny, J., Yanishlieva, N., and Gordon, M., 2001, Antioxidant in Food, Practical Aplication, Wood publishing Limite, Cambridge, England, pp. 22-123.

Prakash, A., 2001, “ Antioxidant Activity “ Medallion Laboratories : Analithycal Progress Vol 19 No : 2. 1 – 4.

Singleton,V.L. and Rossi, J.A., 1965,Colorimetry of To t a l P h e n o l i c s w i t h P h o s p h o m o l y b d i c -phosphotungstic Acid Reagents, Am. J. Enol. Vitic.16:144-58.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, nd Practical HPLC Method Development, 2 ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 67-68, 6. Sunarni, T., 2005, Aktivitas Antioksidan Penangkap

Radikal Bebas Beberapa kecambah Dari Biji Tanaman Familia Papilionaceae, 53-61, Jurnal Farmasi Indonesia 2 ( 2 ) , Jakarta.

United States of Department Agriculture (USDA) NRSC, Plant database: Diospyros blancoi A. DC., http://plants.usda.gov/java/nameSearch, diakses tanggal 31 Mei 2013.

Winarsi, H., 2007,Antioksidan Alami Dan Radikal, edisi I, Kanisius, Yogyakarta, p.17.

World Health Organization, 2003, WHO Guidelines on Good Agricultural and Collection Practices (GACP) for Medicinal Plants, Government of the Grand Duchy of Luxembourg, pp. 11-15.