Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etilasetat ekstrak metanolik daun apel beludru (Diospyros blancoi A.DC.).

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOLIK DAUN APEL BELUDRU

(Diospyros blancoi A. DC.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Yulio Nur Aji Surya

NIM: 098114082

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN

KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOLIK DAUN APEL BELUDRU

(Diospyros blancoi A. DC.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Yulio Nur Aji Surya

NIM: 098114082

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2013

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan

perundang-undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 10 Juli 2013

Penulis

Yulio Nur Aji Surya

LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Yulio Nur Aji Surya Nomor Mahasiswa : 098114082

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya berjudul:

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL (DPPH) DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK METANOLIK DAUN APEL BELUDRU (Diospyros blancoi A. DC.)

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Dengan demikian peryataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 10 Juli 2013 Yang menyatakan

(Yulio Nur Aji Surya)

HALAMAN PERSEMBAHAN

Hidup itu memilih..

Bebas memilih mau bermalas-malasan atau bersemangat..

Pilihan diambil setiap hari..

Setiap hari memilih pilihan yang sama maka menjadi kebiasaan..

Kebiasaan ada yang baik dan buruk..

Setiap keputusan akan menentukan akibat..

Akibat yang terjadi adalah nasib..

Sederhana, nasib bisa dipilih dengan cara memilih kebiasaan..

(Yulio Nur Aji Surya)

Kupe rse m b a hka n skripsi ini untuk :

Ke dua o ra ng tua ku (Ba pa k Nurha di da n Ib u De wi Surya ni) Ke dua ka ka kku (Le o Sa trio da n Yo ha nna Dya h)

Sa ha b a t, te m a n da n Alm a m a te rku

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis

dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik Daun Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelarSarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari

bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan

dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan

terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan

kesediaannya menguji skripsi ini.

3. Jeffry Julianus, M.Si. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan

kesediaannya menguji skripsi ini.

4. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

6. Melisa Silvia yang selalu memberikan dukungan dan semangat kepada

penulis.

7. Tim skripsi (J.B Baptista Yunio R. dan Theressia Nindyati K.) terimakasih

atas kerjasama yang telah dilewati bersama dalam penelitian ini.

8. Teman-teman Farmasi angkatan 2009 yang telah memberikan dukungan

dalam penyelesaian skripsi.

9. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat

disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan

jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis

mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini.

Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.

Yogyakarta, Juli 2013

Penulis

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING... ii

HALAMAN PENGESAHAN... iii

PERYATAAN KEASLIAN PENULIS... iv

LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA... v

HALAMAN PERSEMBAHAN... vi

PRAKATA... vii

DAFTAR ISI... ix

DAFTAR TABEL... xiii

DAFTAR GAMBAR... xiv

DAFTAR LAMPIRAN... xv

INTISARI... xvi

ABSTRACT... xvii

BAB I PENGANTAR... 1

A. Latar Belakang... 1

1. Permasalahan... 2

2. Keaslian penelitian... 3

3. Manfaat penelitian... 4

4. Tujuan penelitian... 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA... 6

A. Apel Beludru... 6

1. Klasifikasi tanaman ... 6

2. Sinonim... 6

3. Nama lain... 7

4. Deskipsi tanaman apel beludru... 7

5. Kandungan kimia apel beludru... 8

B. Senyawa Fenolik... 9

C. Radikal Bebas... 10

D. Antioksidan... 10

E. Metode DPPH... 12

F. Ekstraksi... 13

G. Spektrofotometri Visibel... 14

H. Landasan Teori... 15

I. Hipotesis... 17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN... 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian... 18

B. Variabel... 18

C. Definisi Operasional... 18

D. Bahan dan Alat Penelitian... 19

1. Bahan penelitian... 19

2. Alat penelitian... 20

E. Tatacara Penelitian... 20

1. Determinasi tanaman... 20

2. Pembuatan dan penyiapan bahan... 20

3. Ekstraksi... 22

4. Pembuatan fraksi etil asetat... 22

5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji... 23

6. Uji pendahuluan... 25

7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total... 25

8. Penetapan kandungan fenolik total... 26

9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan... 27

10. Uji aktivitas antioksidan... 28

F. Analisis Hasil... 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 30

A. Hasil Determinasi Tanaman... 30

B. Hasil Pengumpulan Bahan... 30

C. Hasil Preparasi Sampel... 32

1. Hasil ekstraksi sampel... 33

2. Hasil fraksinasi ekstrak... 35

D. Hasil Uji Pendahuluan... 37

1. Uji pendahuluan senyawaan fenolik... 37

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan... 39

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total... 40

1. Penentuan operating time (OT)... 40

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)... 42

F. Estimasi Kandungan Fenolik Total... 43

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan... 46

1. Penentuan panjang gelombang maksimum... 46

2. Penentuan operating time (OT)... 47

H. Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH... 49

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 58

A. Kesimpulan... 58

B. Saran... 58

DAFTAR PUSTAKA... 59

LAMPIRAN... 63

BIOGRAFI PENULIS... 87

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan... 12

Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam

galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu... 42

Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat

ekstrak metanolik daun apel beludru... 45

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum

pada berbagai konsentrasi... 47

Tabel V. Hasil aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode

DPPH... 51

Tabel VI. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak

metanolik daun apel beludru dengan metode DPPH... 53

Tabel VII. Hasil perhitungan IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat... 54

Tabel VIII. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan kuersetin dan

fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru... 56

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Reaksi radikal Diphenylpicryl hydrazyl dengan

antioksidan... 13

Gambar 2. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = larutan blanko [air:metanol + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; B = kontrol positif [asam galat + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; C = larutan uji + Folin Ciocalteu + Na2CO3; D = larutan asam galat; E = larutan uji)... 39

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = larutan DPPH; B = larutan kuersetin + DPPH; C = larutan uji + DPPH; D = larutan kuersetin; E = larutan uji)... 40

Gambar 4. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 3)... 41

Gambar 5. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat... 42

Gambar 6. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total... 44

Gambar 7. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 3)... 48

Gambar 8. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat (Replikasi 2)... 48

Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin... 52

Gambar 10. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat... 54

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman apel beludru

(Diospyros blancoi A. DC.)... 63

Lampiran 2. Gambar tanaman apel beludru yang diambil di kompleks Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo... 64

Lampiran 3. Perhitungan rendemen fraksi etil asetat... 65

Lampiran 4. Penimbangan uji kandungan fenolik total... 66

Lampiran 5. Optimasi penentuan kandungan fenolik total... 67

Lampiran 6. Penentuan kandungan fenolik total... 70

Lampiran 7. Data penimbangan uji aktivitas antioksidan... 73

Lampiran 8. Data perhitungan konsentrasi DPPH, larutan pembanding, dan larutan uji... 74

Lampiran 9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan... 77

Lampiran 10. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal DPPH... 82

Lampiran 11. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru... 85

Lampiran 12. Uji statistik... 86

INTISARI

Penyakit degeneratif salah satunya disebabkan oleh adanya radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan sel. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan alami dari tumbuhan. Tanaman apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) merupakan salah satu tanaman yang diketahui memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg ekuivalen asam galat per g ekstrak tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kandungan fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru.

Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan massa ekuivalen asam galat per massa fraksi (mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru). Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Prinsip metode DPPH adalah penurunan intensitas absorbansi larutan DPPH sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan yang dinyatakan dalam IC50.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru mempunyai kandungan fenolik total sebesar 933,5±6,62 mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru dan nilai IC50 sebesar 13,9±0,25 μg/mL. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

ekstrak metanolik daun apel beludru masuk dalam kategori sangat kuat.

Kata kunci : antioksidan, daun apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.), fraksi etil asetat, DPPH, kandungan fenolik total

ABSTRACT

One of the causes of degenerative disease is due to free radicals which causes the cell abnormality. Flavonoids are polyphenolic compound which is known as pure vegetal antioxidant. Velvet apple (Diospyros blancoi A. DC.) is one of the plants which is known to contain phenolic content more than 30 mg gallic acid equivalent per g of plant extracts. This research aims to determine the total phenolic content and antioxidant activity from ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf.

Determination of total phenolic content performed by Folin-Ciocalteu method that is declared with gallic acid equivalent mass per mass fraction (mg gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of methanolic leaf extract of velvet apple). Determination of antioxidant activity by DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). The principle of the method is the reduction of DPPH, the intensity of the absorbance is proportional to the increase in the concentration of antioxidant compounds expressed in IC50.

The results showed that the ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf contain a total phenolic content of 933.5±6.62 mg gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf and IC50 values is 13,9±0.25 mg/mL. The antioxidant activity of ethyl acetate

fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf is in intense category.

Keywords: Antioxidant, velvet apple’s leaf (Diospyros blancoi A. DC.), ethyl

acetate fraction, DPPH, total phenolic content

BAB I PENGANTAR

A.Latar Belakang

Penyakit degeneratif dapat disebabkan oleh beberapa hal, salah satunya

adalah karena adanya radikal bebas. Spesies oksigen reaktif adalah jenis radikal

bebas yang merupakan sumber oksidan utama dalam tubuh manusia. Peningkatan

spesies oksigen reaktif akan mengakibatkan kerusakan dari sel. Spesies oksigen

reaktif dapat bersumber dari dalam tubuh akibat dari proses metabolisme sel

normal manusia atau dari luar tubuh seperti asap rokok dan sumber lainnya

(Danusantoso, 2003).

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menangkal radikal bebas.

Dengan kata lain antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi

oksidasi dengan mengikat radikal bebas yang mengakibatkan kerusakan sel (Kim,

Lee, Lee and Lee, 2002).

Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang telah diketahui memiliki

aktivitas sebagai antioksidan alami yang berasal dari tumbuhan (Majewska,

Skrzycki, Podsiad and Czeczot, 2011). Penelitian mengenai kandungan fenolik

total pada tanaman apel beludru pernah dilakukan oleh Lee, Jiang, Juan, Lin and

Hou (2006). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak tanaman apel beludru

memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg ekuivalen asam galat per gram

ekstrak tanaman. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas

antioksidan dari tanaman apel beludru khususnya pada bagian daun (folium).

Howlader, Rahman, Khalipha, Ahmed and Rahman (2012) menyebutkan dalam

ekstrak metanolik daun apel beludru terdapat kandungan alkaloid, tanin, gula,

getah dan flavonoid. Flavonoid jenis kuersetin ditemukan pada tanaman yang

masih satu genus dengan apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.), yaitu pada

Diospyros virginiana L. (Duke, 2001). Menurut Muharni (2010) profil kandungan

kimia suatu spesies tumbuhan dalam satu genus umumnya akan menunjukkan

kandungan kimia yang mirip, maka dalam tanaman apel beludru dimungkinkan

juga terdapat senyawa flavonoid yang mirip.

Penentuan kandungan fenolik total pada penelitian ini menggunakan

metode Folin-Ciocalteau. Menurut Aqil, Ahmad and Mehmood (2006) metode ini

umum digunakan sebagai standar penentuan kandungan fenolik total setara massa

ekuivalen asam galat pada uji aktivitas antioksidan sumber tumbuhan. Penentuan

aktivitas antioksidan pada penelitian ini dilakukan dengan metode DPPH

menggunakan spektrofotometer UV-VIS. Antioksidan memiliki kemampuan

untuk mereduksi atau menstabilisasi radikal DPPH yang dapat diukur dari

penurunan absorbansi DPPH pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas

antioksidan diketahui melalui nilai IC50 yang merupakan konsentrasi untuk

menurunkan aktivitas DPPH sebesar 50% yang ditunjukkan dengan pengurangan

intensitas warna larutan (Molyneux, 2004).

B. Permasalahan

1. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun

2. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun

apel beludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan

dengan IC50 ?

C. Keaslian Penelitian

Penelitian tentang uji aktivitas antioksidan tanaman apel beludru pernah

dilakukan oleh Das, Hamid, Bulbul, Sultana and Islam (2010) dengan judul “In

Vitro Antioxidant Activity of Different Parts of the Plant (Diospyros discolor)”.

Penelitian ini menggunakan daun, buah, dan kulit batang apel beludru yang

diperoleh dari Departemen Botani Universitas Dhaka. Kemudian dalam keadaan

kering dimaserasi dengan metanol 97% selama tujuh hari. Uji aktivitas

aktioksidan dilakukan dengan metode DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik

totalnya menggunakan spektrofotometer UV-VIS.

Penelitian serupa juga dilakukan oleh Howlader et al. (2012) dengan

judul “Antioxidant and Antidiarrhoeal Potentiality of Diospyros blancoi”.

Penelitian ini menggunakan daun apel beludru yang diperoleh dari distrik Barisal,

Bangladesh. Kemudian dalam keadaan kering diekstrak menggunakan metode

reflux dengan metanol selama tiga jam. Uji aktivitas aktioksidan dilakukan dengan

metode DPPH menggunakan spektrofotometer UV-VIS.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah

penelitian ini menggunakan daun apel beludru dari tanaman apel beludru di

kompleks Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo,

sinar matahari, diekstraksi dan difraksinasi untuk mendapatkan fraksi etil asetat

ekstrak metanolik daun apel beludru. Kemudian ditetapkan kandungan fenolik

total dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dan aktivitas antioksidan dengan metode

DPPH menggunakan instrumen spektrofotometer UV-VIS.

D. Manfaat penelitian

1. Manfaat teoritis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan

tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel

beludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan

IC50.

2. Manfaat praktis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

aktivitas antioksidan daun apel beludru sehingga bisa dimanfaatkan untuk

pemeliharaan kesehatan manusia untuk menangkal radikal bebas.

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum : menetapkan kandungan fenolik total menggunakan metode

Folin-Ciocalteu dan menguji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH

pada fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru.

2. Tujuan khusus :

a. Mengetahui nilai kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik

b. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik

daun apel beludru dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Apel Beludru 1. Klasifikasi tanaman

Menurut United States Department of Agriculture (2013) klasifikasi

tanaman apel beludru, yaitu:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivision : Spermatophyta

Division : Magnoliophyta

Class : Magnoliopsida

Subclass : Dilleniidae

Order : Ebenales

Family : Ebenaceae

Genus : Diospyros L.

Species : Diospyrosblancoi A. DC.

2. Sinonim

Menurut United States Department of Agriculture (2013) sinonim

Diospyrosblancoi A. DC., yaitu:

a. Diospyros discolor Willd.

b. Diospyros philippensis (Desr.) Gurke

3. Nama lain

Menurut Morton (1987) nama lain yang dimiliki apel beludru, yaitu:

Indonesia : Buah mentega, bisbul

Inggris : Velvet apple, mabolo

4. Deskripsi tanaman apel beludru

Anggota dari famili Ebenaceae ini lebih dikagumi sebagai tanaman untuk

hiasan daripada untuk dikonsumsi. Mabolo telah muncul dalam literatur selama

bertahun-tahun dengan nama Diospyros discolor Wild. pada 1968. Dr. Richard

Howard, direktur Arnold Arboretum, Universitas Harvard mengusulkan nama

Diospyros blancoi A. DC., dan sekarang dijadikan sebagai nama botani yang

benar untuk spesies ini. Menurut IPNI (2013), A. DC. merupakan singkatan dari

nama author yang memiliki kepanjangan Alphonse Louis Pierre Pyramus de

Candolle. Buah ini kadang disebut velvet apple (apel beludru), di Malaya disebut

buah mentega (butter fruit), atau buah sakhlat. Mabolo adalah nama lokal buah ini

di Filipina (Morton, 1987).

Bentuk tanaman apel beludru bervariasi dari yang pendek dan tidak

beraturan dengan ranting yang mengarah ke bawah, sampai bentuk yang tinggi

tegak 60-100 kaki (18-33 m), dengan batang berwarna hitam, kokoh dan memiliki

ketebalan sampai 50 in (80 cm). Tanaman ini tumbuh dengan lambat, daun yang

berwarna hijau sepanjang tahun, letak daun saling berlawanan dalam satu ranting,

meruncing pada ujung daun, meruncing atau membulat pada pangkal daun,

tua, halus dan mengkilap pada permukaan daun bagian atas, berambut dan

berwarna keperakan pada permukaan bagian bawah daun. Daun yang masih muda

berwarna hijau pucat atau pink dan berambut halus. Buah seringkali berbuah

secara berkelompok dengan jarak antar buah sangat dekat dalam sisi yang

berlawanan pada ranting. Aroma buah kuat seperti keju bersumber dari kulit buah

apel beludru, ketika kulit buah dikupas, warna daging keputihan, seperti apel yang

terlalu matang. Dapat dimungkinkan terdapat 4-8 biji dalam buah, panjang biji 1,5

in (4 cm) dan lebar 1 in (2,5 cm), namun ada juga buah tanpa biji (Morton, 1987).

Apel beludru berasal dari Filipina yang sekarang banyak dibudidayakan

dan juga untuk ditanam pada sisi jalan raya. Tanaman ini dikenalkan di Jawa dan

Malaya pada 1881, dan juga Kalkuta serta Kebun Botani di Singapura. Di India,

apel beludru berbunga pada Maret dan April dan buah matang pada Juli dan

Agustus, sedangkan di Florida pada bulan Juni sampai September. Namun buah

juga dapat ditemukan pada tanaman sepanjang waktu dalam satu tahun (Morton,

1987).

5. Kandungan kimia apel beludru

Penelitian mengenai kandungan fenolik total pada tanaman apel beludru

pernah dilakukan oleh Lee et al. (2006). Hasil penelitian menunjukkan bahwa

ekstrak tanaman apel beludru memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg

ekuivalen asam galat per gram ekstrak tanaman.

Dalam penelitian Howlader et al. (2012) disebutkan bahwa dalam ekstrak

flavonoid. Flavonoid jenis kuersetin ditemukan dalam tanaman yang masih satu

genus dengan apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.), yaitu pada Diospyros

virginiana L. (Duke, 2001). Menurut Muharni (2010) profil kandungan kimia

suatu spesies tumbuhan dalam satu genus umumnya akan menunjukkan

kandungan kimia yang mirip, maka dalam tanaman apel beludru dimungkinkan

juga terdapat senyawa flavonoid yang mirip.

B. Senyawa Fenolik

Senyawa fenolik merupakan sumber antioksidan alami yang aman

digunakan dan merupakan golongan mayoritas senyawa yang bertindak sebagai

antioksidan. Aktivitas antioksidan dari fenolik didapatkan dengan cara mereduksi

radikal bebas sehingga radikal menjadi stabil (Marxen, Vanselow, Lippemeier,

Hitze, Ruser and Hansen, 2007).

Reaksi yang terjadi pada fenol dapat melalui gugus hidroksilnya atau

dengan menggantikan atom hidrogen pada cincin aromatiknya. Sifat lainnya yang

menarik ialah fenol mampu mengkompleks protein sehingga beberapa enzim

dapat dihambat. Sifat ini menguntungkan proses ekstraksi, karena dapat

diharapkan selama ekstraksi tidak terjadi reaksi enzimatik. Tetapi, fenol peka

terhadap oksidasi dan ini bisa menyebabkan perubahan fenol selama ekstraksi

(Simpson, 1985).

Salah satu yang paling sering digunakan untuk penentuan total polifenol

adalah metode spektrofotometri menggunakan reagen Folin-Ciocalteu. Prinsipnya

molibdenum dan tungsten fosfat untuk membentuk kompleks berwarna biru.

Intensitas berwarna biru kompleks tungsten-molibdenum dengan polifenol diukur

secara spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm (Bajcan, Harangozo,

Hrabovska and Boncikova, 2013). Hasil molar warna biru yang terbentuk

sebanding dengan jumlah ion fenolik yang teroksidasi (Singleton and Rossi,

1985).

Metode Folin-Ciocalteu memiliki kelemahan, yaitu adanya faktor

interferensi dari senyawa selain senyawa fenolik yang dapat bereaksi dengan

reagen Folin-Ciocalteu. Gula pereduksi, amin aromatik, sulfur dioksida, asam

askorbat, asam organik, dan Fe2+ dapat bereaksi dengan molibdenum dan tungsten

fosfat membentuk kompleks berwarna biru (Prior, Wu and Schaich, 2005).

C. Radikal Bebas

Radikal bebas adalah atom, ion atau molekul yang memiliki elektron

yang tidak berpasangan dalam orbit terluarnya. Radikal bebas berbahaya karena

untuk mencari pasangan elektronnya, radikal bebas mengambil satu elektron dari

molekul stabil. Molekul stabil tersebut kemudian menjadi radikal bebas dan

menghasilkan reaksi berantai. Apabila reaksi ini berlangsung dalam tubuh maka

dapat merusak jaringan dan mengacaukan fungsi mereka (Sivanamdham, 2011).

D. Antioksidan

Antioksidan dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam

menghambat oksidasi senyawa tersebut (Halliwell, 1994). Antioksidan merupakan

suatu senyawa yang berperan dalam menghambat oksidasi yang diperantarai

oksigen. Senyawa antioksidan memegang peranan penting dalam pertahanan

tubuh terhadap penyakit. Hal tersebut disebabkan senyawa antioksidan dapat

mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh radikal bebas (Percival, 1998).

Sistem antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok

enzimatik dan bukan enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide

dismutase (SOD), catalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan bukan enzimatik terdiri dari vitamin E, vitamin A, provitamin A (β-karoten), dan vitamin C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan

antioksidan bukan enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).

Pada saat ini penggunaan bahan pengawet dan antioksidan sintetis tidak

direkomendasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM) karena

diduga dapat menimbulkan penyakit kanker (carcinogen agent). Seperti

penggunaan tBHQ pada dosis tinggi menyebabkan kanker otak, hal ini

dikarenakan terbentuknya radikal semikuinon anion dan ROS yang menyerang sel

otak. Begitu pula dengan BHT dan BHA, dalam konsentrasi tinggi dapat

menginduksi tumor pada perut dan liver hewan uji. Menurut Hernani (2005) perlu

dicari alternatif bahan pengawet dan antioksidan alami yang bersumber dari bahan

alam. Bahan pengawet dan antioksidan alami ini hampir terdapat pada semua

tumbuhan dan buah yang tersebar di seluruh tanah air Indonesia.

Menurut Ariyanto cit. Sambada (2011), kekuatan antioksidan senyawa

Tabel I. Penggolongan tingkat kekuatan antioksidan

Intensitas Nilai IC50

Sangat kuat <50 µg/mL Kuat 50-100 µg/mL Sedang 101-150 µg/mL

Lemah >150 µg/mL

E. Metode DPPH

Radikal bebas yang umumnya digunakan sebagai model dalam penelitian

antioksidan atau peredam radikal bebas adalah 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH)

(Windono et al., 2001).

DPPH merupakan radikal bebas yang stabil (dengan atom N di tengah)

serta dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen,

dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam

suatu ekstrak (Dinis, Maderia and Almeida, 1994).

Senyawa yang beraksi sebagai penangkal radikal bebas akan mereduksi

DPPH yang dapat diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari ungu

menjadi kuning. Perubahan warna terjadi ketika elektron ganjil dari radikal DPPH

telah berpasangan dengan hidrogen dari senyawa penangkal radikal bebas yang

akan membentuk DPPH-H tereduksi (Molyneux, 2004). Pengurangan warna

merupakan stokiometri terhadap jumlah dari elektron yang ditangkap (Bondet,

Brand-Williams and Berset, 1997). Menurut Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel and

Mohammad (2009) panjang gelombang yang digunakan untuk pengukuran DPPH

adalah 517 nm.

Salah satu parameter yang telah diketahui sebagai interpretasi hasil dari

IC50. Nilai ini didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang menyebabkan 50%

hilangnya aktivitas DPPH. Nilai aktivitas antioksidan diketahui melalui nilai IC50

yang dihasilkan, bahwa semakin tinggi aktivitas antioksidan suatu senyawa, maka

semakin tinggi nilai IC50 yang dihasilkan (Molyneux, 2004).

+ AH + A·

Gambar 1. Reaksi radikal Diphenylpicryl hydrazyl dengan antioksidan (Molyneux, 2004)

F. Ekstraksi

Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa

zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari.

Pada umumnya penyarian akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang

bersentuhan dengan penyari semakin luas (Harbone, 1987).

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Dirjen POM,

1995). Untuk mendapatkan senyawa yang khas (zat aktif) dalam suatu tumbuhan,

diperlukan metode ekstraksi yang cepat dan teliti. Pemilihan metode ekstraksi

tergantung pada sumber bahan alami dan senyawa yang akan diisolasi tersebut

(Harborne, 1987).

Dalam memilih penyari, seseorang harus mampu mempertimbangkan

(1) Murah dan mudah diperoleh,

(2) stabil secara fisika dan kimia,

(3) tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar,

(4) selektif,

(5) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan

(6) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku (Depkes RI, 1986).

Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan

zat dari bahan yang disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi: infundasi,

maserasi, perkolasi, dan penyarian yang berkesinambungan (Depkes RI, 1986).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk daun dalam cairan penyari. Cairan penyari akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat

aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan

zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka larutan yang terpekat didesak

keluar. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi

antara larutan diluar dan di dalam sel. Maserasi dengan mesin pengaduk yang

berputar terus menerus, waktu proses maserasi dapat dipersingkat menjadi 6

sampai 24 jam (Depkes RI, 1986).

G. Spekrofotometri Visibel

Spektrofotometri visibel adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang

mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik

Molyneux (2004), absorbansi DPPH terjadi dengan baik pada daerah cahaya

tampak (visible), oleh sebab itu digunakan spektrofotometri visibel untuk

pengukuran absorbansinya.

Interaksi antara senyawa yang mempunyai gugus kromofor dengan radiasi

elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) akan menghasilkan transisi

elektromagnetik dan spektra absorbansi elektromagnetik. Jumlah radiasi

elektromagnetik yang diserap akan sebanding dengan jumlah molekul

penyerapnya, sehingga spektra absorbansi dapat digunakan untuk analisis

kuantitatif (Fessenden and Fessenden, 1995).

Bila suatu molekul senyawa organik menyerap sinar UV atau tampak

maka di dalam molekul tersebut terjadi perpindahan (transisi elektron) dari

berbagai jenis tingkat energi orbital dari molekul tersebut (Sastromihardjojo,

2001). Absorbsi cahaya oleh suatu molekul merupakan suatu bentuk interaksi

antara gelombang cahaya (foton) dan atom atau molekul. Proses absorbsi cahaya

UV-Vis berkaitan dengan promosi elektron dari satu orbital molekul dengan

tingkat energi elektronik tertentu ke orbital lain dengan tingkat energi elektronik

yang lebih tinggi.

H. Landasan Teori

Radikal bebas adalah atom, ion atau molekul yang memiliki elektron yang

tidak berpasangan dalam orbit terluarnya. Radikal bebas berbahaya karena untuk

mencari pasangan elektronnya, radikal bebas mengambil satu elektron dari

menghasilkan reaksi berantai. Apabila reaksi berlangsung di tubuh maka dapat

merusak jaringan dan mengacaukan fungsi mereka. Antioksidan sintetis seperti

penggunaan tBHQ, BHT dan BHA, dalam konsentrasi tinggi dapat menginduksi

tumor dan kanker oleh karena itu, tidak direkomendasikan oleh Badan Pengawas

Obat dan Makanan (BPOM).

Penelitian yang dilakukan oleh Lee et al. (2006) menunjukkan bahwa

ekstrak tanaman apel beludru memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg

ekuivalen asam galat per gram ekstrak tanaman. Kandungan fenolik diketahui

dapat menjadi antioksidan dengan cara mereduksi radikal bebas sehingga radikal

menjadi stabil.

Metode DPPH adalah suatu metode kolorimetri yang efektif dan cepat

untuk memperkirakan aktivitas antiradikal dalam uji antioksidan. Molekul

1,1-difenil-2-pikrihidrazil (DPPH) merupakan suatu radikal bebas yang stabil dengan

adanya delokalisasi elektron bebas pada molekul tersebut. Delokalisasi ini

menyebabkan peningkatan warna violet, yang ditunjukkan dengan pita absorpsi

pada panjang gelombang 517 nm. Keberadaan senyawa antioksidan dapat

mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning.

Metode Folin-Ciocalteu dapat mengukur senyawa fenolik dalam suatu

sampel. Prinsipnya berdasarkan pada oksidasi senyawa fenolik dalam medium

alkali dengan molibdenum dan tungsten fosfat untuk membentuk kompleks

berwarna biru. Intensitas berwarna biru kompleks tungsten-molibdenum dengan

molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion fenolik yang

teroksidasi.

I. Hipotesis

Hipotesis dalam penelitian ini, yaitu:

1. Fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru mempunyai

kandungan fenolik yang dinyatakan dalam mg ekuivalen asam galat.

2. Fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru mempunyai aktivitas

BAB III

METODE PENELITIAN

A.Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental rancangan acak

sederhana karena subjek uji diberi perlakuan.

B.Variabel

1. Variabel bebas berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel

beludru.

2. Variabel tergantung berupa aktivitas antioksidan (%IC) fraksi etil asetat

ekstrak metanolik daun apel beludru.

3. Variabel pengacau terkendali berupa tempat tumbuh tanaman, waktu

pemanenan, umur daun yang dipanen, cara panen, dan jumlah (g) serbuk daun

yang digunakan.

4. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim, curah hujan, dan

kelembaban.

C. Definisi Operasional

1. Daun apel beludru adalah daun (folium) dari tanaman apel beludru yang

dipanen dari kompleks Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan,

Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta.

2. Ekstrak metanolik adalah ekstrak daun apel beludru yang diperoleh dari hasil

maserasi dengan campuran metanol:air (9:1) dan (1:1) kemudian dipekatkan

sampai semua metanol dapat teruapkan.

3. Fraksi etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak metanolik dengan washbensin

(1:1) kemudian fase air difraksinasi kembali dengan etil asetat (1:1). Fraksi

etil asetat dikeringkan dalam oven selama 24 jam.

4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan fraksi etil asetat untuk menangkap radikal DPPH.

5. Persen inhibition concentration 50 (IC50) adalah nilai konsentrasi fraksi etil

asetat yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: daun apel beludru

(Diospyros blancoi A. DC.) yang dipanen dari tanaman apel beludru di kompleks

Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman,

Yogyakarta; akuades (Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma). Bahan kimia kualitas pro analitik (E.Merck)

meliputi metanol. Bahan kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi

kuersetin, DPPH, reagen Folin-Ciocalteu, asam galat. Bahan kualitas teknis

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa spektrofotometer

UV-VIS (Shimadzu), vortex (junke & kunkel), corong Buchner, oven, mikropipet

10-1000 µL; 1-10 mL (Acura 825, Socorex), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP

160P), vacuum rotary evaporator (Junke & Kunkel), tabung reaksi bertutup dan

alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan

Iwaki).

E. Tatacara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman apel beludru dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan

acuan dari web USDA (2013) dan Morton (1987).

2. Pembuatan dan penyiapan bahan

a. Pengumpulan bahan

Tanaman apel beludru diperoleh dari kompleks Kampus III Universitas

Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta. Pengumpulan pada

musim penghujan bulan Januari tahun 2013. Pemanenan dilakukan pagi hari

pukul 07.00 saat tanaman sedang berbuah dengan bahan yang dipakai adalah daun

dewasa, yaitu daun yang berwarna hijau tua, berada pada ruas ketiga sampai

b. Sortasi basah

Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah,

kerikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (ranting dan bunga),

bagian dari tanaman lain (tangkai, daun, bunga dan biji inang), bahan yang rusak

dan lain-lain.

c. Pencucian

Daun apel beludru dicuci dengan cara dialiri air sumur sambil

dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian ini dilakukan sebanyak

tiga kali.

d. Perajangan

Daun apel beludru dirajang dengan ukuran seragam, kurang lebih

panjang daun menjadi 1 cm.

e. Pengeringan

Daun apel beludru yang masih basah dikeringanginkan pada udara

terbuka dan terlindung dari sinar matahari. Cara pengeringan adalah bahan

dihamparkan di atas kertas koran diatur agar tidak terlalu menumpuk. Posisi daun

harus sering dibalik sehingga pengeringan dapat merata. Akhir pengeringan

ditandai dengan mudah dipatahkannya daun apel beludru.

f. Sortasi kering

Daun apel beludru yang sudah kering (ditandai dengan mudah hancur

ketika diremas) dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, kerikil,

g. Penyerbukan

Daun apel beludru dibuat menjadi serbuk dengan bantuan alat penyerbuk,

kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40.

h. Pengepakan dan penyimpanan

Serbuk daun apel beludru kemudian dibungkus dengan menggunakan

wadah kedap udara. Penyimpanan dilakukan di suhu ruangan.

3. Ekstraksi

Daun apel beludru yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 50,0 g

dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah pelarut pertama yaitu

metanol:air (9:1) sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran

dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui

penyaringan dengan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Ampas

penyaringan dimaserasi dengan pelarut kedua, yaitu metanol:air (1:1) secukupnya

selama satu hari kemudian disaring. Filtrat hasil maserasi pelarut pertama dan

kedua digabungkan, lalu filtrat diuapkan pelarutnya hingga volumenya menjadi

sepertiga dari volume awal. Diperoleh ekstrak metanolik daun apel beludru.

4. Pembuatan fraksi etil asetat

Ekstrak metanolik daun apel beludru di ekstraksi cair-cair menggunakan

washbensin dengan perbandingan larutan ekstrak : washbensin (1:1 v/v),

kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada paling

Hasil fraksinasi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi washbensin dan fraksi

air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat

dengan perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan

fraksi air dan fraksi etil asetat. Setelah dipisahkan, fraksi etil asetat diuapkan

dengan vacum rotary evaporator dan dimasukkan dalam cawan porselin yang

sebelumnya telah ditimbang. Cawan berisi fraksi kental dimasukkan dalam oven

hingga 24 jam. Fraksi kering yang didapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.

5. Pembuatan larutan pembanding, DPPH dan uji

a. Pembuatan larutan baku asam galat

Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL

akuades : metanol p.a (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat

sebesar 1000,0 µg/mL. Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 dan 1,5 mL

larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai

10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 50; 75; 100;

125; dan 150 µg/mL.

b. Pembuatan larutan DPPH

Sebanyak 0,0158 g DPPH dilarutkan dengan metanol p.a sampai 100 mL

sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut

ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.

c. Pembuatan larutan stok dan intermediet kuersetin

Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0

1,0 mL larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL,

sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. d. Pembuatan larutan pembanding

Diambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin

konsentrasi 100,0 μg/mL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0;

12,5; dan 15,0 μg/mL. e. Pembuatan larutan uji

1). Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total

Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0

mL metanol p.a sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 µg/mL.

Kemudian larutan tersebut diambil 1,0 mL dan ditambahkan 10,0 mL metanol

p.a sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 µg/mL.

2). Larutan uji untuk aktivitas antioksidan

Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan ditambahkan metanol

p.a sampai 10,0 mL sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet

dengan mengambil 1,0 mL stok larutan uji dan ditambahkan metanol p.a sampai

10,0 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. Diambil sebanyak 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75 mL larutan tersebut, kemudian

ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan

6. Uji pendahuluan

a. Uji keberadaan senyawa fenolik

Larutan uji dengan konsentrasi 200,0 μg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v)

ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat

1 M ditambahkan sebanyak 2,0 mL, kemudian amati warna larutan tersebut.

Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air:metanol (1:1) + pereaksi, fraksi

etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Larutan DPPH diambil sebanyak 1,0 mL dimasukan ke dalam

masing-masing tiga tabung reaksi. Larutan DPPH ditambahkan masing-masing-masing-masing dengan

1,0 mL metanol p.a, larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL, dan larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3,0 mL metanol p.a. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah 30

menit, diamati warna pada larutan tersebut. Bandingkan juga dengan warna

larutan fraksi etil asetat dan kuersetin tanpa ditambahkan DPPH.

7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total

a. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel

pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Dilakukan demikian juga

untuk larutan uji 100 μg/mL dengan waktu pengamatan selama 60 menit. b. Penentuan panjang gelombang maksimum

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL ditambahkan dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat

1 M. Diamkan selama operating time, dibaca panjang gelombang pada absorbansi

maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800

nm.

8. Penetapan kandungan fenolik total

a. Pembuatan kurva baku asam galat

Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL ditambah dengan 5,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan

akuades (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium

karbonat 1 M. Setelah operating time, absorbansinya dibaca pada panjang

gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a

(1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Pengerjaan

dilakukan tiga kali.

b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji

Diambil 0,5 mL larutan uji 100 μg/mL, lalu dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total

dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Dilakukan tiga

kali replikasi.

9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5

mL larutan DPPH. Larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga

tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,060.

Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Diamkan

selama operating time, lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan

maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600

nm.

b. Penentuan operating time (OT)

Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing

tiga labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2,0 mL larutan

pembanding kuersetin 5,0; 10,0 dan 15,0 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut

kemudian digojok dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca

absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 516

nm selama 1 jam. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 7,5; 12,5; 17,5

10. Uji aktivitas antioksidan

a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)

Pada labu ukur 10 mL, dimasukkan sebanyak 2,0 mL larutan DPPH.

Ditambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut dibaca

absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum. Pengerjaan

dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai kontrol untuk

menguji larutan pembanding dan uji.

b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji

Larutan DPPH sebanyak 2,0 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL

kemudian ditambah dengan 2,0 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri

konsentrasi yang telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah dengan

metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian digojok dengan vortex

selama 30 detik dan didiamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.

c. Estimasi aktivitas antioksidan

Hasil dari prosedur 10a dan 10b, dihitung nilai %IC dan IC50 untuk

kuersetin dan fraksi etil asetat.

F. Analisis Hasil

Aktivitas penangkapan radikal DPPH (%) dihitung dengan rumus :

Absorbansi larutan kontrol – Absorbansi larutan pembanding atau larutan uji

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan

persamaan regresi linier dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun

pembanding, sedangkan sumbu y adalah %IC. Lalu dianalisis secara statistik

untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan antara rerata IC50 larutan

pembanding dan larutan uji. Uji secara statistik dilakukan menggunakan program

R versi 2.14.1.

Uji kandungan fenolik total menghasilkan nilai mg ekuivalen asam galat

dalam per gram fraksi etil asetat. Nilai tersebut didapatkan dari analisis regresi

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui dan

memastikan kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian.

Kebenaran identitas tanaman tersebut digunakan untuk menghindari adanya

kemungkinan kesalahan dalam pengambilan sampel pada analisis fitokimia.

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan dari web USDA

(2013)dan Morton (1987).

Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah

Diospyros blancoi A. DC. atau dikenal dengan nama apel beludru. Hal ini

dibuktikan dengan surat determinasi (lampiran 1) yang dikeluarkan oleh

Laboratorium Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma

Yogyakarta.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Daun apel beludru diperoleh dari pohon apel beludru yang berada di

kompleks Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo,

Sleman, Yogyakarta. Pengambilan bahan berasal dari satu tempat, hal ini

bertujuan untuk menghindari variasi kandungan senyawa tanaman yang

disebabkan oleh perbedaan faktor edafik.

Daun apel beludru dipanen dengan kriteria-kriteria berikut ini, yaitu

dipetik pada bulan Januari saat musim penghujan, diambil pada pagi hari pukul

07.00 saat tanaman sedang berbuah dan daun yang dipetik adalah daun dewasa.

Daun yang dipetik merupakan daun dewasa yang tidak terlalu muda dan tidak

terlalu tua, yaitu daun dipetik pada ruas ketiga sampai ketujuh pada tiap cabang

ranting pohon. Hal ini dikarenakan daun yang terlalu muda memiliki kandungan

metabolit sekunder yang belum sempurna, sedangkan pada daun yang terlalu tua

atau yang sudah berwarna kekuningan kandungan kimianya banyak yang sudah

berkurang, sehingga pada daun dewasa diharapkan memiliki kandungan metabolit

sekunder yang maksimal. Pemanenan dilakukan pada pagi hari untuk memperoleh

kandungan metabolit sekunder yang maksimal. Menurut Samanta, Das, and Das

(2011) senyawa flavonoid yang terkandung dalam tanaman merupakan sistem

pertahanan pada tanaman untuk menyerap radiasi UV sehingga kandungan

flavonoid pada tanaman dapat mengalami pengurangan jika diambil pada siang

hari.

Pemanenan daun untuk mendapatkan kandungan metabolit sekunder

yang maksimal sebaiknya dilakukan pada musim kemarau saat tanaman mulai

berbunga dan belum berbuah, dikarenakan setelah berbuah metabolit sekunder

akan terkumpul pada buah. Pemanenan sebaiknya juga dilakukan saat pagi hari

dua jam setelah matahari mulai terbit agar diperoleh metabolit sekunder yang

maksimal, dikarenakan pada saat siang hari metabolit sekunder tumbuhan dapat

C. Hasil Preparasi Sampel

Preparasi sampel dilakukan untuk mendapatkan fraksi etil asetat ekstrak

metanolik daun apel beludru yang diduga dalam fraksi tersebut mengandung

senyawa fenolik. Pada tahap pasca pemanenan, daun apel beludru yang diperoleh

disortasi basah dengan cara memisahkan kotoran atau bahan asing lainnya yang

terikut saat pengumpulan, misalnya kerikil dan bagian tanaman yang tidak

diinginkan. Kemudian daun apel beludru dicuci dengan air mengalir untuk

membersihkan dari pengotor-pengotor seperti debu yang tidak dapat dipisahkan

dengan sortasi basah. Setelah bersih daun dirajang dengan ukuran seragam, yaitu

1 cm untuk mempercepat proses pengeringan. Daun kemudian dikering-anginkan

pada udara terbuka yang terlindung dari cahaya matahari agar komponen senyawa

kimia yang terdapat dalam daun tidak mengalami kerusakan akibat terpapar sinar

matahari secara langsung. Pengeringan dihentikan ketika daun sudah kering

dengan tanda rapuh dan mudah dipatahkan yang membutuhkan waktu selama satu

minggu. Kemudian dilakukan sortasi kering untuk memisahkan daun dari

pengotor yang tercampur pada saat proses pengeringan. Daun yang telah kering

diserbuk menggunakan mesin penyerbuk untuk memperbesar luas permukaan

serbuk daun yang akan kontak dengan cairan penyari sehingga serbuk dapat

terbasahi secara merata dan dapat menyari senyawa kimia dari serbuk secara

optimal. Serbuk lalu diayak menggunakan ayakan nomor mesh 40 untuk

1. Hasil ekstraksi sampel

Ekstraksi sampel dilakukan dengan tujuan untuk menyari

senyawa-senyawa dari daun apel beludru yang kemungkinan berperan sebagai antioksidan

dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Daun apel beludru yang diekstraksi

yaitu daun yang telah dikeringkan dan diserbukkan. Menurut Andersen and

Markham (2006) jika daun yang digunakan merupakan daun segar maka senyawa

flavonoid yang terkandung di sampel dapat terdegradasi oleh adanya aktivitas

enzim dalam tanaman tersebut.

Terdapat beberapa metode ekstraksi seperti infundasi, perkolasi, maserasi

dan penyarian yang berkesinambungan. Ektraksi dilakukan dengan metode

maserasi karena proses ekstraksi yang tidak melibatkan pemanasan sehingga

perubahan-perubahan senyawa kimia dapat dihindari. Selain itu, proses maserasi

sangat menguntungkan untuk isolasi senyawa bahan alam karena dengan

perendaman bahan tumbuhan dapat menyebabkan pemecahan dinding sel dan

membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga

metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dengan pelarut

organik dan ekstraksi senyawa akan maksimal.

Dalam memilih cairan penyari atau pelarut tentu mempertimbangkan

beberapa hal, yang paling utama yaitu kemampuan pelarut dalam menyari

senyawa yang diinginkan. Cairan penyari yang digunakan adalah campuran

metanol dan air. Penelitian yang dilakukan oleh Sultana, Anwar and Ashraf

(2009) menunjukkan campuran kedua pelarut ini dapat menyari senyawa-senyawa

lebih maksimal jika dibandingkan hanya menggunakan salah satu jenis pelarut

saja. Metanol merupakan pelarut universal sehingga dapat melarutkan senyawa

yang cenderung polar atau non polar. Metanol memiliki viskositas yang lebih

rendah jika dibandingkan dengan etanol, sehingga dapat lebih mudah menembus

dinding sel tanaman dan menyari senyawa dalam sel tanaman.

Maserasi dilakukan selama satu hari menggunakan cairan penyari

pertama, yaitu metanol:air (9:1) kemudian dimaserasi kembali dengan cairan

penyari kedua yaitu metanol:air (1:1) selama satu hari (Mursyidi, 1990). Hal ini

bertujuan agar senyawa metabolit sekunder dalam tanaman dapat tersari secara

maksimal karena senyawa dalam tanaman bermacam-macam dan memiliki

kepolaran yang bervariasi. Cairan penyari pertama bersifat kurang polar dibanding

cairan penyari kedua, maka maserasi dengan cairan penyari pertama bertujuan

menyari senyawa yang cenderung kurang polar dan maserasi dengan cairan

penyari kedua bertujuan menyari senyawa yang cenderung lebih polar. Cairan

penyari yaitu metanol:air akan menembus dinding sel dan masuk kedalam rongga

sel yang mengandung senyawa kimia, senyawa kimia itu akan larut dalam cairan

penyari dan cairan penyari yang sudah pekat dengan senyawa kimia akan

berdifusi keluar sel dan proses ini akan berulang terus sampai terjadi

keseimbangan antara konsentrasi senyawa di dalam dan diluar sel.

Maserasi dilakukan dengan bantuan shaker untuk membantu proses

maserasi. Dengan bantuan energi mekanik, yaitu penggojogan dapat

mengoptimalkan kontak pelarut dengan serbuk sehingga semua bagian serbuk

Adanya pengendapan akan mengurangi daya untuk menyari senyawa pada serbuk,

hal ini karena kontak partikel dengan pelarut semakin kecil. Penggojogan juga

berfungsi untuk membantu proses difusi senyawa tanaman.

Setelah proses maserasi selesai, hasil maserasi disaring menggunakan

kertas saring dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Hal ini

bertujuan untuk mempercepat proses penyaringan dan filtrat dapat diperoleh

dengan volume maksimal. Setelah itu, semua filtrat hasil penyaringan

dicampurkan dan komponen cairan penyari yaitu metanol diuapkan menggunakan

alat vaccum rotary evaporator. Alat ini berperan menguapkan pelarut dan

mengkondensikannya kembali sehingga pelarut yang telah menguap dapat

diperoleh kembali dalam keadaan terpisah dari larutan sebelumnya. Dengan

adanya pompa vakum akan membuat tekanan dalam labu alas bulat menjadi turun,

kemudian ketika dipanaskan dalam heating bath pelarut dapat menguap di bawah

titik didihnya. Alat ini mampu menguapkan pelarut dibawah titik didih sehingga

zat yang terkandung di dalam pelarut tidak rusak oleh suhu tinggi. Proses

penguapan dilakukan sampai volume filtrat menjadi sepertiga bagian dari volume

awal. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan metanol dalam filtrat. Ekstrak ini

yang akan digunakan untuk proses fraksinasi. Hasil ekstrak yang didapat yaitu

sebanyak 250 mL.

2. Hasil fraksinasi ekstrak

Setelah didapat ekstrak metanolik, maka dilakukan ekstraksi cair-cair

diinginkan seperti klorofil dan lipid. Sejumlah ekstrak volume tertentu dicampur

dengan washbensin dengan perbandingan volume yang sama. Prinsip pemisahan

dengan ekstraksi cair-cair adalah pemisahan senyawa berdasarkan kepolaran suatu senyawa dengan dua pelarut yang berbeda kepolarannya. Senyawa non polar seperti

klorofil dan lipid akan terlarut dalam washbensin yang juga bersifat non polar

karena prinsip “like dissolve like”, sedangkan senyawa yang lebih polar akan

tetap terlarut dalam air. Cairan washbensin berada pada lapisan atas dan air berada

dibagian bawah, disebabkan bobot jenis washbensin yang lebih ringan daripada

air. Ekstraksi dilakukan dengan cara kedua pelarut dicampurkan dalam corong

pisah, digojog dan dipisahkan. Langkah ini dilakukan sebanyak lima kali, sampai

pada fase atas, yaitu washbensin sudah bening atau tidak ada lagi senyawa non

polar seperti klorofil yang terlarut di dalamnya.

Fraksi air yang didapat kemudian diekstraksi cair-cair lagi menggunakan

etil asetat, dengan cara yang sama seperti ekstraksi cair-cair dengan washbensin.

Senyawa flavonoid yang merupakan senyawa fenolik dapat berbentuk glikosida

maupun aglikonnya. Dalam bentuk glikosida atau berikatan dengan gugus gula

senyawa flavonoid akan lebih bersifat polar sedangkan dalam bentuk aglikon

maka akan bersifat kurang polar. Senyawa flavonoid yang ada pada ekstrak

metanolik pun demikian, sehingga ketika diekstraksi menggunakan etil asetat

maka senyawa flavonoid dalam bentuk aglikon akan terlarut dalam etil asetat dan

senyawa flavonoid dalam bentuk glikosida akan terlarut dalam air. Ketika kedua

pelarut dicampurkan maka fase etil asetat akan berada pada lapisan atas karena

Kuersetin yang ditemukan pada tanaman yang masih satu genus dengan

Diospyros blancoi A. DC., yaitu Diospyros virginiana L. adalah salah satu

flavonoid golongan flavonol yang merupakan senyawa aglikon yang bersifat lebih

non polar. Dalam penelitian ini digunakan fraksi etil asetat dikarenakan senyawa

yang diduga terdapat pada daun apel beludru berupa aglikon flavonoid yang

berperan sebagai antioksidan. Menurut Andersen and Markham (2006) jika

menggunakan etil asetat sebagai pelarut, maka dapat lebih menspesifikan

penyarian pada senyawa flavonoid yang kurang polar dengan golonganisoflavon,

flavanon, flavon termetilasi dan flavonol.

Ekstraksi cair-cair menggunakan etil asetat dilakukan sebanyak lima kali.

Fraksi etil asetat yang didapat kemudian diuapkan pelarutnya dengan bantuan alat

vacuum rotary evaporator dan dimasukkan dalam cawan porselen yang

sebelumnya telah ditimbang. Fraksi etil asetat dikeringkan dalam oven sampai 24

jam, lalu setelah kering dibungkus dengan plastik dan ditutup dengan alumunium

foil supaya tidak terpapar udara dan sinar UV yang dapat mendegradasi senyawa

yang terkandung. Fraksi etil asetat yang sudah dibungkus dimasukkan dalam

desikator agar tidak terpapar lembab. Bobot fraksi etil asetat yang didapat sebesar

1,9608 g dan rendemen fraksi etil asetat yang didapat adalah 3,92 %.

D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan senyawa fenolik

Uji pendahaluan senyawa fenolik dilakukan untuk mengetahui secara

dilakukan dengan mencampurkan senyawa uji dengan reagen Folin-Ciocalteu

yang diamati perubahan warnanya. Prinsip uji ini adalah reaksi oksidasi reduksi

dari ion fenolat senyawa uji dengan pereaksi fenol Folin-Ciocalteu. Dimana

oksidasi dari senyawa fenol oleh reagen molibdotungstat menghasilkan suatu

produk yang berwarna biru disekitar panjang gelombang 745-750 nm (Molyneux,

2004). Pengujian fraksi etil asetat ekstrak daun apel beludru menunjukkan warna

biru setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat yang

menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun apel beludru memiliki kandungan

senyawa fenolik. Hasil perubahan warna yang terjadi dibandingkan dengan

larutan blanko (air:metanol + Folin-Ciocalteu + natrium karbonat), kontrol positif

(asam galat + Folin-Ciocalteu + natrium karbonat), larutan asam galat dan fraksi

etil asetat tanpa direaksikan dengan Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat.

Larutan kuersetin dan fraksi etil asetat tanpa Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat

tidak menunjukkan warna biru, maka perubahan warna yang terjadi ketika

senyawa yang mengandung gugus fenol bereaksi dengan Folin-Ciocalteu dan

natrium karbonat merupakan warna yang terbentuk hanya dari hasil reaksi yang

Gambar 2. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = larutan blanko [air:metanol + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; B = kontrol positif [asam galat + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; C = larutan uji + Folin Ciocalteu + Na2CO3; D = larutan asam galat; E = larutan uji)

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan

Uji pendahaluan aktivitas antioksidan dilakukan untuk mengetahui secara

kualitatif aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat daun apel beludru. Uji

dilakukan dengan mencampurkan senyawa uji dengan DPPH yang diamati

perubahan warnanya. Menurut Molyneux (2004) senyawa yang beraksi sebagai

penangkal radikal bebas akan mereduksi DPPH yang dapat diamati dengan

adanya perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning ketika elektron ganjil

dari radikal DPPH telah berpasangan dengan hidrogen dari senyawa penangkal

radikal bebas yang akan membentuk DPPH-H tereduksi. Pengujian fraksi etil

asetat ekstrak daun apel beludru menunjukkan warna kuning setelah direaksikan

dengan DPPH yang menunjukkan bahwa fraksi etil asetat daun apel beludru

memiliki aktivitas sebagai antioksidan. Hasil perubahan warna yang terjadi

dibandingkan dengan larutan kuersetin yang dicampurkan DPPH, larutan DPPH

tanpa senyawa antioksidan, larutan kuersetin dan fraksi etil asetat tanpa

C

direaksikan dengan DPPH. Larutan kuersetin dan fraksi etil asetat tanpa DPPH

tidak menunjukkan warna ungu, maka perubahan warna yang terjadi ketika

senyawa antioksidan direaksikan dengan DPPH merupakan warna dari DPPH

saja.

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = larutan DPPH; B = larutan kuersetin + DPPH; C = larutan uji + DPPH; D = larutan kuersetin;

E = larutan uji)

E. Hasil Optimasi Metode Uji Fenolik Total

Dalam beberapa penelitian didapatkan korelasi yang positif antara

kandungan fenolik dengan aktivitas antioksidan, yaitu semakin tinggi kandungan

fenolik maka makin kuat aktivitas antioksidan (Das et al., 2010; Stankovic, 2010).

Oleh karena itu, perlu ditetapkan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak

metanolik daun apel beludru agar dapat diketahui apakah besarnya aktivitas

antioksidan sebanding dengan semakin banyaknya kandungan fenolik total.

1. Penentuan operating time (OT)

Penentuan OT pada penetapan fenolik total bertujuan untuk mendapatkan

waktu ketika reaksi antara larutan pembanding (asam galat) atau larutan uji (fraksi

C

B _D

etil asetat) dengan pereaksi Folin-Ciocalteu telah berlangsung sempurna.

Penentuan operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari larutan

pembanding dan larutan uji terhadap reagen mulai stabil atau selisih absorbansi

mulai kecil antar selang waktu yang diujikan. Pengukuran OT pada asam galat

dilakukan selama tiga puluh menit dengan waktu pengamatan setiap lima menit,

sedangkan pada senyawa uji dilakukan selama satu jam.

Operating time dilakukan dengan menggunakan panjang gelombang

teoritis, yaitu 750 nm (Bajcan et al., 2013) dan waktu mulai dihitung setelah

reagen dicampurkan.

Gambar 4. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 3)

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 10 20 30 40

A

b

so

rb

a

n

si

Waktu (menit)

Penentuan

operating time

asam galat

50,5 µg/mL 101 µg/mL 151,5 µg/mL

Gambar 5. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat

Dari hasil yang ditunjukan dengan grafik (gambar 4) OT yang didapatkan

dari asam galat adalah 20 menit. Penentuan OT asam galat cukup diwakilkan oleh

data dari replikasi tiga karena pada kedua replikasi lain juga menunjukkan

absorbansi mulai stabil pada menit yang sama, yaitu menit ke-20. Operating time

yang didapat dari fraksi etil asetat adalah 40 menit (gambar 5).

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan untuk

mendapatkan daerah serapan maksimum dari hasil reaksi yang terjadi antara

senyawa fenol dengan reagen Folin-Ciocalteu pada suasana basa. Pengujian ini

perlu dilakukan untuk menentukan panjang gelombang yang akan dipakai dalam

pengukuran absorbansi uji fenolik total senyawa uji. Pengukuran absorbansi

dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang

maksimum sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi

0,37 0,38 0,39 0,4 0,41 0,42 0,43 0,44 0,45 0,46 0,47

0 20 40 60 80

A b so rb a n si Waktu (menit)

Penentuan

operating time

fraksi etil asetat

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

yang besar sehingga akan didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. Dalam

penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga konsentrasi, yaitu

pada konsentrasi tinggi, tengah dan rendah, yaitu 50; 100; dan 150 µg/mL. Hal ini

bertujuan agar dapat merepresentasikan panjang gelombang maksimum dari

konsentrasi yang berbeda. Panjang gelombang yang didapatkan dari ketiga

konsentrasi tersebut adalah 751 nm (Tabel II) oleh karena itu, dalam pengukuran

kandungan fenolik total digunakan panjang gelombang tersebut.

Tabel II. Hasil scanning panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu

Konsentrasi larutan asam galat

λ maksimum hasil scanning

λ maksimum yang digunakan untuk

pengukuran

λ maksimum teoritis

150 µg/mL 751

751 750 100 µg/mL 751

50 µg/mL 751

F. Estimasi Kandungan Fenolik Total

Menurut Bajcan et al. (2013) salah satu yang paling sering digunakan

untuk penentuan total polifenol adalah metode spektrofotometri menggunakan

reagen Folin-Ciocalteu. Prinsipnya berdasarkan pada oksidasi senyawa fenolik

dalam medium alkali dengan molibdenum dan tungsten fosfat untuk membentuk

kompleks berwarna biru. Intensitas berwarna biru kompleks tungsten-molibdenum

dengan polifenol diukur secara spektrofotometri pada panjang gelombang 750 nm.

Hasil molar warna biru yang terbentuk sebanding dengan jumlah ion fenolik yang

teroksidasi (Singleton and Rossi, 1985).

Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai ekuivalen asam galat.

dipilih karena tersedianya asam galat dalam kemurnian yang tinggi dan stabil serta

harganya yang relatif lebih murah dibandingkan dengan senyawa standar yang

lain. Menurut Prior et al. (2005), asam galat merupakan senyawa yang disarankan

oleh Singleton and Rossi sebagai standar untuk penetapan fenolik total agar

pembacaan hasil pengukuran fenolik total dari penelitian yang berbeda dapat

dibandingkan secara rasional.

Gambar 6. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (Replikasi 3)

Dari ketiga replikasi yang dilakukan didapatkan masing-masing

persamaan dan kemudian digunakan persamaan yang paling linier yang

ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linier yang paling baik diperoleh

dari replikasi tiga (Gambar 6) dengan y = 0,0054x – 0,0564 dan r sebesar 0,9997.

Penentuan kandungan fenolik total sampel menggunakan persamaan pada

replikasi tiga dikarenakan nilai r yang paling baik, artinya bertambahnya

absorbansi yang dihasilkan proporsional dengan penambahan konsentrasi asam

galat yang ditambahkan.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 50 100 150 200

A b so rb a n si Konsentrasi (µg/mL)

Kurva Baku Asam Galat

y = 0,0054x – 0,0564 r = 0,9997

Tabel III. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru

Replikasi fenolik total (mg ekuivalen)

rata-rata (mg)

SD

(mg) I 926,6 II 934,1 933,5 6,62 III 939,8

Berdasarkan perhitungan intrapolasi persamaan regresi linier y = 0,0054x

– 0,0564; maka didapatkan rerata kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak

metanolik daun apel beludru sebesar 933,5 ± 6,62 mg ekuivalen asam galat per g

fraksi etil asetat (Tabel III).

Berdasarkan hasil uji penetapan fenolik total, fraksi etil asetat daun apel

beludru memiliki kandungan fenolik total sebesar 933,5 ± 6,62 mg ekuivalen

asam galat. Kandungan fenolik senyawa uji besar dikarenakan dalam 1000 mg

fraksi etil asetat terdapat 933,5 ± 6,62 mg senyawa fenolik atau lebih dari 90%

senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat apel beludru merupakan

senyawa fenolik.

Metode Folin-Ciocalteu secara luas digunakan untuk menentukan

kandungan fenolik total, tetapi sebenarnya senyawa yang dapat bereaksi dengan

reagen Folin-Ciocalteu bukan hanya senyawa fenolik saja. Senyawa lain seperti

gula pereduksi, asam askorbat dan protein dapat mereduksi molibdenum dan

tungsten fosfat membentuk kompleks berwarna biru. Oleh karena itu, metode

penetapan fenolik total menggunakan reagen Folin-Ciocalteu tidak spesifik

G. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ( λ maks)

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dilakukan untuk

mendapatkan daerah serapan maksimum dari DPPH. Pengujian ini perlu

dilakukan untuk menentukan panjang gelombang yang akan dipakai dalam

pengukuran aktivitas antioksidan. Pengukuran absorbansi DPPH dilakukan pada

panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang maksimum

sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar

sehingga akan didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. DPPH dapat

memberikan absorbansi karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada

struktur kimianya. Adanya delokalikasi elektron pada DPPH akan menghasilkan

warna violet.

Secara teoritis penelitian menunjukkan panjang gelombang maksimum

pengukuran DPPH, yaitu 517 nm (Dehpour et al., 2009). Namun pemakaian

panjang gelombang yang digunakan dalam pengukuran tergantung pada panjang

gelombang saat dihasilkannya absorbansi maksimum pada instrumen yang sedang

digunakan. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga

konsentrasi DPPH yang berbeda, yaitu konsentrasi 0,020; 0,040 dan 0,060 mM.

Tujuannya agar dapat merepresentasikan panjang gelombang DPPH pada

konsentrasi yang berbeda sehingga menunjukkan kepekaan yang sama pada

berbagai tingkat konsentrasi. Dari hasil pengukuran (Tabel IV) ditentukan panjang

gelombang maksimum yang digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan.

kemudian dibulatkan sehingga ditentukan panjang gelombang yang dipakai untuk

pengukuran aktivitas antioksidan, yaitu 516 nm.

Tabel IV. Hasil scanning panjang gelombang serapan maksimum pada berbagai konsentrasi

Konsentrasi larutan DPPH

λ maksimum hasil scanning (nm)

λ maksimum yang digunakan untuk pengukuran (nm)

λ maksimum teoritis (nm)

0,02 mM 516

516 517 0,04 mM 515,5

0,06 mM 516

2. Penentuan operating time

Penentuan operating time perlu dilakukan untuk memperoleh rentang

waktu dimana antara larutan pembanding (kuersetin) dan larutan uji (fraksi etil

asetat) sudah mereduksi radikal bebas (DPPH) dengan sempurna, sehingga

diperoleh absorbansi yang stabil. Dengan diperoleh nilai absorbansi yang stabil

maka kesalahan analisis dapat diminimalkan.

Penentuan operating time didasarkan dari waktu dimana absorbansi dari

larutan pembanding dan larutan uji terhadap DPPH mulai stabil atau selisih

absorbansi mulai kecil antar selang waktu yang diujikan. Waktu dihitung setelah

DPPH dicampurkan dengan larutan uji atau pembanding, kemudian tiap lima

menit dicatat absorbansi DPPH selama satu jam pengukuran. Pengukuran

Gambar 7. Grafik penentuan OT kuersetin (Replikasi 3)

Gambar 8. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat (Replikasi 2)

Berdasarkan grafik (Gambar 7) hasil pengukuran replikasi tiga

menunjukkan bahwa absorbansi yang diperoleh kuersetin mulai stabil atau

menunjukkan selisih absorbansi yang kecil pada rentang 30-40 menit, maka

pengukuran larutan pembanding akan memberikan hasil yang reprodusibel bila

diukur antara 30-40 menit. Kemudian ditentukan bahwa OT kuersetin adalah 30

menit, untuk efisiensi waktu pengukuran. Penentuan OT menggunakan replikasi

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

0 20 40 60 80

A b so rb a n si Waktu (menit)

Penentuan

operating time

kuersetin

4,95 µg/mL 9,9 µg/mL 14,85 µg/mL 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

0 20 40 60 80

A b so rb a n si Waktu (menit)

Penentuan

operating time

fraksi etil asetat

7,5 µg/mL 12,5 µg/mL 17,5 µg/mL

Konsentrasi 17,68 µg/mL

%IC =0,873−0.325

0,873 � 100 % = 62,77%

Replikasi

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi kontrol

Absorbansi

larutan uji % IC

Persamaan regresi linier

7,5 0,646 25,58

10 0,566 34,79

II _12,5 0,868 0,456 47,47 y = 3,9124x – 3,489

15 0,393 54,72 r = 9972

17,5 0,308 64,52

Replikasi

Konsentrasi (µg/mL)

Absorbansi kontrol

Absorbansi

larutan uji % IC

Persamaan regresi linier

7,43 0,675 23,38

9,9 0,589 33,14

III 12,38 0,881 0,481 45,40 y = 4,2910x – 9,1399

14,85 0,407 53,80 r = 9988

Lampiran 11. Perhitungan nilai IC50 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak

metanolik daun apel beludru a. Kuersetin

Replikasi I

Persamaan regresi linier: y = 5,2365x – 7,786

( y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50

50 = 5,2365x – 7,786 x = 50−7,786

5,2365 = ��,��µ�/��

Replikasi Persamaan IC50 (µg/mL)

II y = 5,3620x – 8,5773 10,92 III y = 5,5988x – 8,5157 10,45

b. Fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru

Replikasi I

Persamaan regresi linier: y = 3,7742x – 3,3781

( y = aktivitas antioksidan, x = kadar fraksi dalam µg/mL) IC50 adalah nilai x saat y = 50

50 = 3,7742x – 3,3781 x = 50+3,3781

3,7742 = ��,��µ�/��

Replikasi Persamaan IC50 (µg/mL)

II y = 3,9124x – 3,489 13,67

Lampiran 12. Uji Statistik

Uji statistik dalam mengolah data menggunakan program R 2.14.1

a. Uji Normalitas (Shapiro-Wilk test)

b. Uji Variansi (Uji F-Dua Variansi)

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil (DPPH) dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik Daun Apel Beludru (Diospyros blancoi A. DC.)” memiliki nama lengkap Yulio Nur Aji Surya. Dilahirkan di kota Yogyakarta, 22 Juli 1991 dari pasangan Nurhadi dan Dewi Suryani. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Tarakanita Yogyakarta pada tahun 1995 hingga 1997 lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Tarakanita Yogyakarta pada tahun 1997 hingga 2003. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMPN 1 Depok, Yogyakarta pada tahun 2003 hingga 2006 dan SMA Kolese De Brito Yogyakarta pada tahun 2006 hingga 2009. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain: dalam kegiatan UKF Basket (2009-2013); panitia Pelepasan Wisuda (2009); panitia Pharmacy Performance and Event Cup (2010); panitia Titrasi (2010 dan 2011) dan pengurus ISMAFARSI (2011).

INTISARI

Penyakit degeneratif salah satunya disebabkan oleh adanya radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan sel. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan alami dari tumbuhan. Tanaman apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.) merupakan salah satu tanaman yang diketahui memiliki kandungan fenolik lebih dari 30 mg ekuivalen asam galat per g ekstrak tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kandungan fenolik total dan mengetahui aktivitas antioksidan pada fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru.

Penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dengan massa ekuivalen asam galat per massa fraksi (mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru). Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Prinsip metode DPPH adalah penurunan intensitas absorbansi larutan DPPH sebanding dengan kenaikan konsentrasi senyawa antioksidan yang dinyatakan dalam IC50.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru mempunyai kandungan fenolik total sebesar 933,5±6,62 mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru dan nilai IC50 sebesar 13,9±0,25 μg/mL. Aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru masuk dalam kategori sangat kuat.

Kata kunci : antioksidan, daun apel beludru (Diospyros blancoi A. DC.), fraksi etil asetat, DPPH, kandungan fenolik total

ABSTRACT

One of the causes of degenerative disease is due to free radicals which causes the cell abnormality. Flavonoids are polyphenolic compound which is known as pure vegetal antioxidant. Velvet apple (Diospyros blancoi A. DC.) is one of the plants which is known to contain phenolic content more than 30 mg gallic acid equivalent per g of plant extracts. This research aims to determine the total phenolic content and antioxidant activity from ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf.

Determination of total phenolic content performed by Folin-Ciocalteu method that is declared with gallic acid equivalent mass per mass fraction (mg gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of methanolic leaf extract of velvet apple). Determination of antioxidant activity by DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl). The principle of the method is the reduction of DPPH, the intensity of the absorbance is proportional to the increase in the concentration of antioxidant compounds expressed in IC50.

The results showed that the ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf contain a total phenolic content of 933.5±6.62 mg gallic acid equivalent per g of ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf and IC50 values is 13,9±0.25 mg/mL. The antioxidant activity of ethyl acetate fraction of methanolic extract of velvet apple’s leaf is in intense category.

Keywords: Antioxidant, velvet apple’s leaf (Diospyros blancoi A. DC.), ethyl

acetate fraction, DPPH, total phenolic content