Uji daya antioksidan menggunakan radikal 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil dan penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis (Citrus sinensis (L.) Osbeck).

UJI DAYA ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK

TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS (Citrus sinensis (L.) Osbeck)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh : Augustinus Teti NIM : 098114121

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

i

UJI DAYA ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL 1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK

TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS (Citrus sinensis (L.) Osbeck)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh : Augustinus Teti NIM : 098114121

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

“When you walk through a storm keep your head up high and don’t be

afraid of the dark. At the end of the storm is a golden sky and the sweet

silver song of lark. Walk on through the wind, walk on through the rain,

tho’ your dream be tossed and blown. Walk

on, walk on with hope in your

heart.

And you’ll never walk alone.”

-Oscar H.-

-

“It’s fine to talk and it’s even okay to have

fun, but when we’re doing something, do it

properly”

Skripsi ini aku persembahkan kepada:

Tuhan Yesus

Bapak, Ibu dan keluarga dari keduanya

Sahabat-sahabatku

Almamaterku

Dan Semua orang yang telah mendukungku

vii PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan atas semua berkat dan penyertaan-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI DAYA

ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN RADIKAL

1,1-DIFENIL-2-PIKRILHIDRAZIL DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOL KULIT JERUK MANIS (Citrus sinensis (L.) Osbeck)” ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farnasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati atas segala bantuan yang telah diberikan, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan bantuan dan bimbingan selama rancangan, pengusulan skripsi, saat dilakukan penelitian dan selama penulisan skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian.

3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt., sebagai Dosen Penguji atas pengarahan, kritik, saran yang membangun dan kesediaannya menguji skripsi ini.

viii

4. Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. sebagai Dosen Penguji sekaligus Dosen Pembimbing Akademik atas pengarahan, kritik, saran yang membangun dan kesediaannya menguji skripsi ini.

5. Segenap laboran Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia (Mas Wagiran) dan Kimia Analisis Instrumental (Mas Bimo) atas segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.

6. Wisnu dan Ozy sebagai teman seperjuangan, atas segala kritik, saran, bantuan selama mengerjakan skripsi ini, baik selama di laboratorium maupun pada saat penyusunan naskah.

7. Danu, Kael, Felix, Julio, Nindy dan Nio “Kodrat” sebagai tim antioksidan 2009 atas segala bantuan dan masukan yang sangat berarti dalam penyusunan skripsi ini.

8. Victor, Agnes, Novia, Ina, Topan, Leo, Jo, Netty dan Jimmy atas segala canda tawa, bantuan, dan kenangan tidak terlupakan selama bekerja di laboratorium.

9. Tri “Tejo” Pamulatsih (seksi konsumsi) atas segala bantuan, dukungan, serta pemberi informasi penting di saat mendesak.

10. Tabita Ribka Alvianita, atas pinjaman laptopnya selama pelaksanaan ujian. 11. Yansen Nama Hada, atas bantuannya sebagai perkap selama persiapan ujian. 12. Haris, Arvi, dan Laras atas keikhlasannya memberikan waktu ujian mereka

untuk dipakai.

13. Chelsea F.C., my best football team, atas segala tontonan menarik dan penghilang kejenuhan selama masa pengerjaan skripsi.

ix

14.Krisna House beserta seluruh penghuninya, atas segala kekonyolan,canda tawa dan kebersamaan yang tidak terlupakan.

15.Febrin Nessy Triana, The Special One, yang merupakan sumber inspirasi, atas segala kesabaran dalam membimbing, mengajarkan, mengarahkan, selama proses pengerjaan skripsi ini, dimulai dari pengerjaan di laboratorium sampai selesai penyusunan naskah, dan akhirnya bisa melaksanakan ujian bersama. Terima kasih telah memberi warna dalam hidup.

16.Teman-teman Farmasi 2009, atas kebersamaan yang tidak terlupakan selama empat tahun.

17.Semua pihak yang tidak bisa saya sebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis. Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, Juli 2013

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ... v

HALAMAN PERSEMBAHAN ... vi

PRAKATA ... viii

DAFTAR ISI ... x

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR GAMBAR ... xv

DAFTAR LAMPIRAN ... xvii

INTISARI ... xviii

ABSTRACT ... xix

BAB I PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Permasalahan ... 3

2. Keaslian penelitian ... 3

3. Manfaat penelitian ... 3

B. Tujuan penelitian ... 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ... 5

A. Jeruk Manis ... 5

1. Morfologi tumbuhan ... 5

2. Klasifikasi tumbuhan ... 5

xi

B. Radikal Bebas dan Antioksidan ... 7

1. Radikal bebas ... 7

2. Defenisi antioksidan ... 7

3. Mekanisme antioksidan ... 8

4. Penggolongan antioksidan ... 8

5. Manfaat antioksidan ... 10

C. Metode DPPH ... 10

D. Ekstraksi ... 11

E. Spektrofotometri ... 13

F. Validasi Metode Analisis ... 14

G. Landasan Teori ... 16

H. Hipotesis ... 17

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 18

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 18

B. Variabel Penelitian ... 18

C. Defenisi Operasional ... 18

D. Bahan Penelitian ... 18

E. Alat Penelitian ... 19

F. Tata Cara Penelitian ... 19

1. Pemilihan dan pengumpulan sampel ... 19

2. Pembuatan simplisia ... 19

3. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia ... 20

4. Uji pendahuluan ... 20

5. Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak ... 21

6. Penetapan aktivitas antioksidan ... 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24

xii

B. Hasil Pengumpulan Bahan ... 24

C. Hasil Ekstraksi Sampel ... 25

D. Hasil Uji Pendahuluan ... 28

1. Uji fenolik ... 28

2. Uji aktivitas antioksidan ... 29

E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ... 30

1. Penentuan OT penetapan kandungan fenolik total ... 30

2. Penetapan maksimum penetapan kandungan fenolik total ... 31

F. Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total ... 32

1. Presisi penetapan kandungan fenolik total ... 32

2. Linearitas penetapan kandungan fenolik total ... 33

3. Spesifitas penetapan kandungan fenolik total ... 33

G. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total ... 34

H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ... 37

1. Penentuan maksimum metode uji aktivitas antioksidan ... 38

2. Penentuan OT metode uji aktivitas antioksidan ... 39

I. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan ... 40

1. Presisi metode uji aktivitas antioksidan ... 42

2. Linearitas metode uji aktivitas antioksidan ... 44

3. Spesifitas metode uji aktivitas antioksidan ... 45

J. Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan Dengan Radikal DPPH .... 46

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 50

A. Kesimpulan ... 50

B. Saran ... 50

xiii

LAMPIRAN ... 55 BIOGRAFI PENULIS ... 74

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH

(Armala, 2009) ... 11

Tabel II. Rentang kesalahan yang diperbolehkan (Harmita, 2004) ... 15

Tabel III. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004) ... 16

Tabel IV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter ... 33

Tabel V. Hasil pengukuran seri baku asam galat ... 36

Tabel VI. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ... 36

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar rutin ... 43

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ... 43

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH ... 44

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan metode DPPH ... 45

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ... 47

Tabel XII. Penggolongan Tingkat Kekuatan Antioksidan Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Kulit Jeruk Manis ... 49

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Buah jeruk manis ... 6

Gambar 2. Struktur rutin ... 10

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asam galat] + reagen fenol Folin-Ciocalteu, B =,larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis] + reagen fenol Folin-Ciocalteu, C = kontrol negatif [blanko reagen fenol Folin-Ciocalteu]) ... 29

Gambar 4. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol positif [rutin], B = kontrol negatif [blanko DPPH], C = larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis] + DPPH) ... 30

Gambar 5. Kurva penentuan OT penetapan kandungan fenolik ... 31

Gambar 6. Kurva persamaan regresi linear penetapan kadar fenolik total ... 32

Gambar 7. Reaksi asam galat dengan molibdenum, komponen dari reagen Folin-Ciocalteu (Nunes, et al., 2012) ... 35

Gambar 8. Struktur asam galat ... 35

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH ... 38

Gambar 10. Grafik penentuan OT larutan rutin ... 39

Gambar 11. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat ... 40

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin ... 41

xvi

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan

fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit jeruk manis ... 42 Gambar 14. Hasil uji normalitas data rutin ... 48 Gambar 15. Hasil uji normalitas data fraksi etil asetat ekstrak etanol

kulit jeruk manis ... 48 Gambar 16. Hasil uji T tidak berpasangan ... 49

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar buah jeruk manis dari Purwokerto, Jawa

Tengah... 56 Lampiran 2. Bobot fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis ... 56 Lampiran 3. Data penimbangan penetapan kandungan fenolik total .... 57 Lampiran 4. Optimasi penetapan kandungan fenolik total ... 58 Lampiran 5. Penetapan Kandungan fenolik total ... 60 Lampiran 6. Data penimbangan uji aktivitas antioksidan ... 62 Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi larutan DPPH, larutan

pembanding rutin, dan larutan uji ... 63 Lampiran 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ... 64 Lampiran 9. Uji akitivitas antioksidan dengan menggunakan radikal

DPPH ... 67 Lampiran 10. Perhitungan nilai IC50 rutin dan Fraksi etil asetat ekstrak

etanol kulit jeruk manis ... 69 Lampiran 11. Scanning pengkoreksi ... 70

xviii

INTISARI

Antioksidan merupakan senyawa yang menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat. Kulit jeruk manis diketahui memiliki senyawa fenolik. Senyawa tersebut beraktivitas antioksidan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH memiliki maksimum di 515 nm. Ketika elektronnya berpasangan oleh keberadaan senyawa antioksidan, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.

Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu dan dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi air). Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan dengan warna biru. Larutan tersebut memiliki maksimum di 750 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis mempunyai aktivitas antioksidan lemah dengan nilai IC50 sebesar 292,09 ± 0,379 g/mL. Kandungan fenolik total sebesar 25,81 ± 0,314 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.

Kata kunci : fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis, Citrus sinensis (L.) Osbeck, antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total

xix ABSTRACT

Antioxidants are compounds that inhibit oxidation reactions by binding to free radicals. As a result, the cell damage by free radicals can be inhibited. Sweet orange peel phenolic compounds known to possess. This study was conducted to determine the antioxidant activity and total phenolic content of ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel. Radical antioxidant activity assays using 1,1-diphenyl-2-pikrilhidrazil (DPPH) and expressed by the value Inhibition Concentration 50 (IC50). The existence of active antioxidant compounds DPPH solution will change color from purple to yellow. DPPH has a maximum at 515 nm. When the electron pairs by the presence of antioxidant compounds, the absorbance decreases corresponding stoichiometric number of electrons captured. Total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method and expressed by the value of the mass of gallic acid equivalents (mg gallic acid equivalents per g fraction of water). Phenolic compounds will be oxidized by the Folin-Ciocalteu phenol reagent under alkaline conditions, forming a blue solution. The solution has a maximum at 750 nm.

The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel has a weak antioxidant activity with IC50 values of 292,09 ± 0.379 µg/mL. Total phenolic content of 25.81 ± 0.314 mg gallic acid equivalents per g of ethyl acetate fraction.

Keywords : ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel, Citrus sinensis (L.) Osbeck, antioxidants, DPPH, total phenolic content

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Tanpa disadari, dalam tubuh manusia terbentuk radikal bebas secara terus menerus, baik melalui proses metabolisme sel normal maupun akibat respon terhadap pengaruh dari luar tubuh, seperti paparan polusi lingkungan, ultraviolet, dan asap rokok. Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan elektron, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul sekitarnya misalnya protein, asam lemak tak jenuh, dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker (Salganik, 2001; Winarsi, 2007). Selain itu radikal bebas dalam tubuh dapat memicu munculnya berbagai penyakit degeneratif, seperti kardiovaskuler, penuaan dini (Palmer dan Kitchin, 2010), dan osteoporosis akibat dari perusakan sel secara oksidatif (Winarsi, 2007).

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan dan merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat

dihambat (Winarsi, 2007). Penambahan antioksidan ke dalam formulasi makanan juga efektif mengurangi oksidasi lemak yang menyebabkan ketengikan, toksisitas, dan destruksi biomolekul makanan (Decker, 1998).

Saat ini antioksidan alami lebih diminati dibandingkan antioksidan sintetik karena dianggap lebih aman. Antioksidan sintetik seperti BHT (butylatedhidroxy toluene) dan BHA (butylated hidroxy anisole) telah diragukan keamanannya karena memiliki efek samping yang besar dan dapat menyebabkan kerusakan hati. Hal ini menyebabkan antioksidan alami menjadi alternatif yang sangat dibutuhkan oleh masyarakat saat ini (Rohdiana, 2001; Sunarni, 2005).

Buah jeruk manis mengandung betakaroten dan bioflavonoid yang dapat memperkuat dinding pembuluh darah kapiler, sedangkan kulit jeruk manis banyak mengandung pektin yang dapat membantu menurunkan kadar kolesterol jahat (LDL) dan meningkatkan kolesterol baik (HDL) (Anonim, 2011).

Untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari kulit jeruk manis dipilih metode DPPH. Metode DPPH memberikan informasi reaktivitas senyawa yang diuji dengan suatu radikal stabil. DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm dengan warna violet gelap (Sunarni, 2005). Metode ini sederhana untuk dikerjakan, mudah, cepat dan peka. Aktivitas antioksidan dari suatu senyawa dapat diketahui dari penurunan absorbansi DPPH yang terjadi akibat penambahan senyawa tersebut (Zuhra, et al., 2008).

Pada penelitian kali ini peneliti ingin mengetahui apakah kulit jeruk manis (Citrus sinensis (L.) Osbeck) memiliki daya antioksidan serta seberapa besarkah daya antioksidan yang dimiliki oleh kulit jeruk tersebut.

1. Permasalahan

a. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis?

b. Berapakah nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50?

2. Keaslian penelitian

Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan oleh penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai seberapa besar daya antioksidan serta penetapan kadar fenolik total ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan fraksi etil asetat.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan pada perkembangan ilmu pengetahuan dalam bidang farmasi, khususnya tentang aktivitas antioksidan yang dimiliki kulit jeruk manis, sehingga dapat menjadi acuan untuk penelitian selanjutnya.

b. Manfaat metodologis. Penelitian ini dapat dijadikan acuan metode uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dan penentuan kadar fenolik total pada suatu bahan tumbuhan.

c. Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bagi penelitian lebih lanjut maupun masyarakat luas

mengenai potensi kulit jeruk manis sebagai salah satu sumber antioksidan alami.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum. Tujuan umum penelitian ini adalah menguji aktivitas antioksidan menggunakan radikal bebas DPPH dan menetapkan kadar fenolik total menggunakan metode Folin-Ciocalteu dari fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.

2. Tujuan khusus.

a) Mengetahui kadar fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat. b) Mengetahui nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak

etanol kulit jeruk manis dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan nilai IC50.

5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Jeruk Manis

1. Morfologi tumbuhan

Tanaman jeruk manis mempunyai batang yang dapat mencapai ketinggian 6 meter, bercabang banyak, tajuk daun bundar, dan umumnya berbuah satu kali dalam satu tahun. Daunnya bertangkai, tangkai daunnya bersayap, dan berbau sedap.

Bunga jeruk manis berukuran agak besar yang mempunyai kelopak bunga membentuk cawan, tangkai bunganya berwarna putih atau kuning dengan daun bunga sebanyak lima helai, dan mempunyai 20-30 benang sari.

Buah jeruk manis berbentuk bulat atau hampir bulat, berukuran agak besar, bertangkai kuat, kulit buah berwarna hijau sampai kuning dan mengkilat (Rukmana, 2003).

2. Klasifikasi tumbuhan

Jeruk manis dalam bahasa Ingris dikenal dengan nama sweet orange. Jeruk manis diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Sub-kingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida

Sub-kelas : Rosidae Ordo : Sapindales Famili : Rutaceae Genus : Citrus L.

Spesies : Citrus sinensis (L.)Osbeck

(USDA, 2013).

Gambar 1. Buah jeruk manis 3. Habitat dan penyebaran

Jeruk manis merupakan tanaman asli melayu tetapi sekarang penyebarannya sangat luas hampir disemua daerah tropis dan subtropis di dunia. Temperatur optimum antara 25-300C namun ada yang masih dapat tumbuh normal pada 380C. Kelembaban optimum untuk pertumbuhan tanaman ini sekitar 70-80% (Rukmana, 2003).

Pada tahun 1920, jeruk manis dikembangkan secara komersial di Amerika. Sentrum produsen jeruk meluas ke Kalifornia, Florida, Spanyol, Israel,

dan negara-negara lainnya. Di Indonesia, tanaman jeruk manis ditanam di berbagai daerah, seperti Jawa Barat, Jawa Tengah, dan Sumatera Utara (Rukmana, 2003).

B. Radikal bebas dan Antioksidan

1. Radikal bebas

Radikal bebas adalah atom atau molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan (unpaired electron). Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari molekul-molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda (polyunsaturated fat) pada membran sel sehingga dinding sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker (Winarsi, 2007).

2. Definisi antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya kerusakan sel dapat dihambat (Winarsi, 2007).

Kebanyakan antioksidan (misalnya tokoferol) digunakan sebagai pengawet dalam berbagai produk (misalnya dalam lemak, minyak dan produk makanan untuk menunda ketengikan dan perubahan-perubahan yang tidak diinginkan, dalam karet untuk menunda oksidasi). Pengertian antioksidan yang lebih relevan secara biologis ialah senyawa alami atau sintetik yang ditambahkan ke dalam produk untuk mencegah atau menunda kerusakan yang disebabkan oleh udara (Huang, Ou, dan Prior, 2005).

3. Mekanisme antioksidan

Secara garis besar, mekanisme penangkapan radikal bebas dapat dibedakan menjadi dua macam, yaitu secara enzimatik dan non-enzimatik. Enzim yang dapat berperan sebagai antioksidan adalah superoksida dismutase, katalase, glutation peroksidase, dan glutation reduktase (Winarsi, 2007).

Secara non-enzimatik, senyawa antioksidan bekerja melalui empat cara, yaitu sebagai berikut:

a. Penangkap radikal bebas, misalnya vitamin C dan vitamin E, b. Pengkelat logam transisi, misalnya EDTA,

c. Inhibitor enzim oksidatif, misalnya aspirin dan ibuprofen, dan

d. Kofaktor enzim antioksidan, misalnya selenium sebagai kofaktor glutation peroksidase (Huang, et al., 2005).

4. Penggolongan antioksidan

Menurut sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua macam, yaitu antioksidan sintetik dan alami (Gulcin, Uguz, Oktay, Beydemir, dan Kufrevioglu, 2004).

a. Antioksidan sintetik

Antioksidan sintetik merupakan antioksidan yang dibuat melalui sintesis secara kimia, contohnya: tert-Butylhydroquinone (tBHQ), butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), dan propil galat (PG) (Gulcin, et al., 2004). tBHQ dan BHA telah lama digunakan untuk mencegah oksidasi dari produk makanan sehingga dapat menstabilkan produk tersebut (nutrisi, rasa, maupun warna). Dalam konsentrasi yang tinggi, tBHQ dapat menyebabkan kanker (Gharavi, Haggarty, dan El-Kadi, 2007).

b. Antioksidan alami

Antioksidan alami merupakan antioksidan yang diproduksi langsung oleh tanaman maupun tubuh, contohnya: senyawa polifenol, flavonoid, tanin, enzim katalase, glutation peroksidase, dan superoksid dismutase. Glutation peroksidase bekerja dengan cara mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2, sedangkan superoksid dismutase bekerja dengan cara mengkatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi H2O2 (Percival, 1998; Gulcin, etal., 2004; Winarsi, 2007 ).

Contoh lain senyawa antioksidan alami adalah rutin (Gambar 2). Senyawa ini bekerja jika moietas gula diketahui melebihi aktivitas flavonoid. Antioksidan ini diduga dapat mencegah serangan lipid membran. Rutin menunjukkan kerjanya sebagai inhibitor peroksidasi lipid yang bergantung pada Fe (Winarsi, 2007).

Gambar 2. Struktur rutin 5. Manfaat antioksidan

Antioksidan bermanfaat dalam mencegah kerusakan oksidatif yang disebabkan radikal bebas dan ROS sehingga mencegah terjadinya berbagai macam penyakit seperti penyakit kardiovaskuler, jantung koroner (Ames, 1983; Mbata, 2010), kanker (Salganik, 2001) serta penuaan dini (Palmer dan Kitchin, 2010). Penambahan antioksidan ke dalam formulasi makanan, juga efektif mengurangi oksidasi lemak yang menyebabkan ketengikan, toksisitas, dan destruksi biomolekul yang ada dalam makanan (Decker, 1998).

C. Metode DPPH

Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan adalah dengan menggunakan radikal bebas DPPH (Shivaprasad, et al., 2005). Tujuannya adalah mengetahui parameter konsentrasi yang memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50). Hal ini dapat dicapai dengan cara menginterpretasikan data eksperimental dari metode tersebut (Molyneux, 2004). DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat

mendonorkan atom hidrogen, dapat berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan komponen tertentu dalam suatu ekstrak (Dinis, Maderia, dan Almeida, 1994).

DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009).

Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, van Beek, Linssen, de Groot, dan Evstatieva, 2002; Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2010).

Menurut Armala (2009), tingkat kekuatan antioksidan senyawa uji menggunakan metode DPPH dapat digolongkan menurut nilai IC50 (Tabel I).

Tabel I. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH (Armala, 2009) Intensitas Nilai IC50

Sangat kuat < 50 µg/mL Kuat 50-100 µg/mL Sedang 101-150 µg/mL Lemah > 150 µg/mL

D. Ekstraksi

Penyarian atau ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari sehingga zat aktif larut dalam cairan penyari. Pada umumnya penyarian akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari semakin luas (Harborne, 1987).

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai, selanjutnya pelarut diuapkan sampai semua atau hampir semua pelarut menguap (Departemen Kesehatan, 1995).

Dalam memilih cairan penyari, seseorang harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan penyari yang baik harus memenuhi kriteria berikut ini.

(1) Murah dan mudah diperoleh, (2) stabil secara fisika dan kimia, (3) selektif,

(4) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan (5) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku

(Departemen Kesehatan, 1986). Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan zat dari bahan yang akan disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi : infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Departemen Kesehatan, 1986).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari sehingga cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif di dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan pendesakan larutan terpekat dari dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Setelah proses maserasi, dapat dilanjutkan dengan teknik remaserasi. Pada

teknik ini, cairan dibagi menjadi dua kemudian seluruh serbuk simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah diendaptuangkan dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Departemen Kesehatan, 1986).

E. Spektrofotometri

Spektrofotometri adalah salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik (Mulja dan Suharman, 1995).

Senyawa yang mempunyai gugus kromofor apabila mengalami interaksi dengan radiasi elektromagnetik pada daerah UV-Vis (200-800 nm) maka akan menghasilkan transisi elektromagnetik dan spektra absorbansi. Spektra absorbansi tersebut dapat digunakan untuk analisis kuantitatif dikarenakan jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap sebanding dengan jumlah molekul penyerapnya. Spektrum UV mempunyai absorbansi antara 100 400 nm, sedangkan spektrum visibel atau tampak mempunyai absorbansi antara 400-800 nm (Fessenden dan Fesenden, 1995).

Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa intensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap berbanding lurus dengan tebal dan konsentrasi larutan.

A= ε bc

Harga ε adalah karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam pelarut tertentu dan pada panjang gelombang tertentu. Pada persamaan menunjukkan

bahwa penentuan absorbansi akan menghasilkan konsentrasi jika ε dan b diketahui (Sastrohamidjojo, 2001).

F. Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Paramater-parameter validasi metode analisis yang diperlukan untuk menilai kesahihan metode analisis antara lain meliputi akurasi, presisi, linearitas, dan spesifisitas. Akurasi metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) baku yang ditambahkan. Kriteria akurasi sangat bergantung kepada konsentrasi baku dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode. Akurasi ditentukan dengan % recovery (Harmita, 2004).

Tabel II. Rentang kesalahan yang diperbolehkan (Harmita, 2004) Analit pada matrik

sampel

Rata-rata yang diperoleh (%)

100 98-102

>10 98-102

>1 97-103

>0,1 95-105

0,01 90-107

0,001 90-107

0,000.1 (1 ppm) 80-110 0,000.01 (100 ppb) 80-110 0,000.001 (10 ppb) 60-115 0,000.000.1 (1 ppb) 40-120

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004).

Presisi dinyatakan dalam standar deviasi atau koefisien variasi. Tabel berikut merupakan syarat presisi yang dapat diterima berdasarkan kadar analit.

Tabel III. Rentang CV yang masih dapat diterima (Harmita, 2004) Analit pada matrik

sampel (%)

KV (%)

>1 2,5

0,001 5

0,000.1 (1 ppm) 16 0,0000.000.1 (1 ppb) 32

Linieritas pada suatu metode analisis dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel. Persyaratan data linieritas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003).

Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel yang mungkin ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).

G. Landasan Teori

Buah jeruk manis mengandung betakaroten dan bioflavonoid yang dapat memperkuat dinding pembuluh darah kapiler dan dapat berfungsi sebagai antioksidan. Antioksidan berguna untuk menangkal radikal bebas dengan cara memberikan pasangan elektron bebas untuk menetralkan radikal bebas sehingga

menjadi tidak reaktif. Antioksidan alami lebih aman digunakan dibandingkan antioksidan sintesis.

Metode pengujian antioksidan yang umum digunakan terutama untuk senyawa dari bahan alam adalah metode DPPH. Metode ini menggunakan sumber radikal bebas berupa senyawa 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH). Metode ini memiliki kelebihan yaitu mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman.

Kandungan fenolik total dapat ditentukan dengan reagen Folin-Ciocalteu. Adanya senyawa fenolik dalam sampel uji akan mereduksi reagen fosfomolibdat-fosfotungstat menjadi produk berwarna biru. Intensitas warna biru yang dihasilkan sebanding dengan kandungan fenolik yang terdapat dalam sampel.

H. Hipotesis

Fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis mempunyai aktivitas antioksidan yang ditunjukkan oleh besarnya nilai IC50 melalui pengujian menggunakan metode DPPH dan kandungan fenolik total dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat.

18

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental dengan tahapan penelitian sebagai berikut :

a. Pemilihan dan pengumpulan sampel b. Pembuatan simplisia

c. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia d. Penetapan aktivitas antioksidan

e. Penetapan kadar fenolik total dalam ekstrak

B. Variabel Penelitian

Variabel bebas : konsentrasi ekstrak sampel Variabel tergantung : IC50

C. Definisi Operasional

Ekstrak kulit jeruk manis adalah ekstrak kental yang diperoleh dari hasil proses maserasi dengan menggunakan pelarut etanol.

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit jeruk yang dipesan dari Purwokerto, Jawa Tengah. Bahan kimia pro analitik (E. Merck)

berupa metanol dan natrium karbonat. Bahan pro analitik (Sigma) berupa DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), rutin, asam galat, dan pereaksi Folin-Ciocalteu. Bahan kualitas teknis (Brataco Chemica), yaitu wash bensin dan etil asetat.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas (Pyrex-Germany dan Iwaki), corong pisah, corong buchner, ayakan, vortex (Junke & Kunkel), waterbath (Labo-tech, Heraeus), maserator, vacuum rotary evaporator (Buchii rotavapor) dan spektrofotometer uv-visibel (Shimadzu mini 1240).

F. Tata Cara Penelitian

1. Pemilihan dan pengumpulan sampel

Pengumpulan sampel kulit jeruk diambil langsung di perkebunannya di daerah Purwokerto, Jawa Tengah dengan memilih jeruk dengan usia tertentu yang merupakan usia konsumsi dari buah jeruk tersebut.

2. Pembuatan simplisia

Kulit jeruk dicuci bersih, ditiriskan dan diiris tipis. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 50-55o C selama 24 jam. Simplisia kering ditandai dengan kulit jeruk yang telah menjadi rapuh kemudian diserbuk kasar dengan menggunakan mesin penyerbuk dan dilewatkan ayakan 40 mesh.

3. Ekstraksi dan fraksinasi simplisia

Sebanyak 30 g serbuk simplisia kulit jeruk dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah dengan etanol sampai terendam sempurna dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama tiga hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan menggunakan kertas saring kasar dengan bantuan corong Buchner dan pompa vakum. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol kembali selama tiga hari. Kemudian filtrat dicampur dengan filtrat terdahulu. Keseluruhan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak etanol kental kulit jeruk.

Ekstrak etanol kental kulit jeruk dilarutkan dalam 100 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan wash bensin dengan perbandingan larutan ekstrak : wash bensin (1:1 v/v), dihasilkan fraksi air dan wash bensin. Kemudian fraksi air diekstraksi kembali menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kering etil asetat. Parameter kekeringan ekstrak adalah ketika sudah didapatkan bobot tetap yaitu dengan cara ekstrak hasil evaporasi dipanaskan di atas waterbath hingga bobotnya tidak berubah lagi. Ekstrak ini yang digunakan untuk analisis selanjutnya.

4. Uji pendahuluan

a) Uji fenolik. Sejumlah 0,5 ml larutan uji 305 g/mL dan larutan pembanding asam galat ditambahkan 2,5 ml pereaksi Folin

Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:1 v/v) ke dalam tabung reaksi. Diamkan selama 2 menit. Tambahkan 7,5 ml larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna larutan tersebut.

b) Uji aktivitas antioksidan. Sebanyak 1 ml larutan stok DPPH dimasukkan ke dalam tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing masing dengan 1 ml metanol p.a, larutan pembanding rutin 50 g/mL dan larutan uji 305 g/mL. Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan 3 ml metanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex 20 detik. Diamkan selama 30 menit. Kemudian amati warna pada larutan tersebut.

5. Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak

a) Pembuatan larutan asam galat. Dibuat larutan asam galat dengan

konsentrasi 1.000 g/mL dalam aquades : metanol p.a (1:1). Diambil

sebanyak 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; dan 1,50 ml. Larutan tersebut kemudian ditambahkan aquades : metanol p.a (1:1) ad sampai 10 ml, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 25; 50; 75; 100; dan 150 µg/mL.

b) Pembuatan kurva baku asam galat. Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat konsentrasi 25; 50; 75; 100; dan 150 µg/mL ditambahkan dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 ml natrium karbonat 1 M. Baca absorbansi pada panjang gelombang 750 nm terhadap blangko yang terdiri dari aquades : etanol (1:1), reagen Folin-ciocalteu, dan larutan natrium karbonat 1 M.

c) Validasi metode penetapan kandungan fenolik total. Hasil pengujian kemudian divalidasi berdasarkan parameter presisi (% CV), linearitas (nilai r), serta spesifitas (spektra kontrol).

d) Estimasi kandungan fenolik total larutan uji. Larutan uji diambil 0,5 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat).

6. Penetapan aktivitas antioksidan

a) Pembutan larutan DPPH 0,4 mM. Sebanyak 3,94 mg serbuk DPPH dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml, lalu ditambahkan metanol hingga batas tanda. Dihomogenkan dengan bantuan vortex untuk melarutkan DPPH. Larutan harus selalu dibuat baru.

b) Pembuatan larutan rutin 0,250 mg/ml. Sebanyak 2,5 mg rutin dimasukkan dalam labu takar 10 ml, masukkan metanol hingga batas tanda. Ambil sejumlah larutan stok rutin masukkan dalam labu takar, tambahkan metanol hingga batas tanda hingga diperoleh konsentrasi larutan pembanding 12,25; 19,25; 26,25; 33,25; dan 40,25 g/mL.

c) Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan. Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang kemudian ditambahkan metanol sampai 25,0 ml. Dari larutan tersebut diambil 1,60; 2,32; 3,05; 3,77; dan 4,50 ml kemudian ditambahkan metanol sampai 10,0 ml sehingga diperoleh larutan uji dengan konsentrasi 160; 232,5; 305; 377,5; dan 450 mg/ml.

d) Penentuan panjang gelombang serapan maksimum. Pada tiga buah labu ukur 10 ml, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 ml larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 20 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. e) Penentuan operating time. Sebanyak 2,0 ml larutan DPPH 0,4 mM

dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml, tambahkan larutan stok rutin 2 ml kemudian tambahkan metanol hingga batas tanda. Larutan dihomogenkan dengan cara divortex. Setelah itu baca absorbansinya

pada maksimum tiap 5 menit selama 1 jam. Tentukan operating time

reaksi.

f) Penentuan aktivitas antioksidan. 2,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 ml kemudian ditambahkan 2,0 ml larutan uji atau pembanding yang telah diketahui konsentrasinya. Tambahkan metanol hingga batas tanda. Larutan divortex dan didiamkan selama operating time. Baca absorbansinya pada maksimum. Aktivitas antioksidan dihitung dengan rumus:

% aktivitas antioksidan =

24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Determinasi merupakan syarat pertama dan langkah awal yang dilakukan dalam suatu penelitian dengan menggunakan tanaman. Determinasi tanaman ini bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian serta untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel untuk analisis fitokimia. Berdasarkan hasil determinasi tanaman jeruk manis yang dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, telah dibuktikan bahwa tanaman yang digunakan untuk penelitian adalah Citrus sinensis (L.)Osbeck.

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah jeruk manis diperoleh dari daerah Purwokerto, Jawa tengah pada bulan September 2012. Pengambilan bahan berasal dari satu tempat, hal ini untuk menghindari variasi kandungan senyawa aktif tanaman. Buah jeruk manis yang digunakan adalah buah yang sedang dalam usia matang berwarna hijau kekuningan. Buah jeruk manis dipetik pada pagi hari agar senyawa fenolik yang terdapat pada tanaman belum termetabolisme menjadi bentuk metabolit sekunder lain. Gambar buah jeruk manis disajikan pada lampiran 1.

C. Hasil Ekstraksi Sampel

Ekstraksi bertujuan menarik kandungan kimia yang diinginkan dari sampel dengan menggunakan pelarut tertentu dimana komponen yang diinginkan dapat larut di dalamnya. Sampel yang digunakan dalam proses ekstraksi adalah kulit jeruk manis.

Preparasi kulit jeruk manis yang digunakan dalam proses ekstraksi ini diawali dengan pengeringan terhadap kulit jeruk manis yang diperoleh. Proses pengeringan dilakukan menggunakan oven pada suhu 500 C selama 24 jam. Kemudian, kulit jeruk manis yang sudah kering diblender untuk memperluas permukaan serbuk yang bersentuhan dengan cairan penyari dan mengurangi ketebalan lapisan kulit sehingga mempermudah proses ekstraksi dan memudahkan penembusan oleh pelarut/cairan penyari.

Untuk mengekstraksi senyawa fenolik dalam bahan tumbuhan dapat dilakukan dengan pelarut polar seperti etanol, metanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air (Markham, 1988). Alasan tidak digunakan pelarut aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan air adalah senyawa fenolik lebih larut dalam campuran larutan alkohol dengan air daripada pelarut polar lainnya (Bruneton, 1999). Pelarut metanol tidak digunakan karena memiliki efek toksik yang lebih tinggi daripada etanol (Armala, 2009). Pelarut n-butanol tidak digunakan karena n-butanol lebih non polar serta struktur dari n-butanol lebih besar sehingga n-butanol kurang begitu bisa masuk ke dalam sel-sel kulit jeruk manis daripada etanol.

Proses maserasi dilakukan dengan penyari etanol dan menggunakan bantuan alat shaker. Metode maserasi dipilih karena memiliki kelebihan dibanding metode lainnya. Selain sederhana dan mudah dilakukan, metode ini tidak membutuhkan panas sehingga stabilitas senyawa fenolik yang terekstrasi dari sampel dapat terjaga. Alat shaker digunakan bertujuan untuk membantu proses maserasi yang lebih efektif karena dengan alat tersebut penyari lebih dapat kontak langsung ke dalam sel-sel daripada jika didiamkan saja. Maserasi dilakukan selama tiga hari, dan setelah itu cairan penyari dipisahkan dari ampasnya menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring dan dengan bantuan pompa vakum untuk mempercepat dan memaksimalkan hasil penyaringan. Ampas hasil penyarian kemudian diremaserasi menggunakan etanol. Remaserasi ini bertujuan untuk memaksimalkan hasil penyarian. Senyawa-senyawa yang kemungkinan belum tersari karena sudah jenuhnya penyari dapat tersari pada proses remaserai ini sehingga akan dihasilkan lebih banyak senyawa-senyawa yang tersari dari sampel.

Ekstrak etanol yang diperoleh diuapkan pelarutnya menggunakan alat vacuum rotary evaporator sampai hampir semua etanol menguap. Prinsip alat ini yaitu penguapan dengan pengurangan tekanan. Jika tekanan uap suatu cairan sama dengan tekanan atmosfer di sekelilingnya maka cairan tersebut akan mendidih, sehingga dengan adanya pengurangan tekanan pada alat di bawah tekanan atmosfer akan menyebabkan cairan mendidih di bawah titik didih normalnya.

Ekstrak kental etanol kulit jeruk manis yang didapat kemudian dilarutkan dengan air hangat, karena jika digunakan air dingin akan lebih susah melarutkan

ekstrak etanol. Selanjutnya dipartisi menggunakan pelarut washbensin, sehingga fraksi air berada di bagian bawah dan fraksi washbensin berada di bagian atas. Hal tersebut dikarenakan berat jenis air (0,996) lebih besar daripada berat jenis washbensin (0,730) (Departemen Kesehatan, 1995). Proses partisi atau ekstraksi cair-cair ekstrak etanol ini dilakukan sebanyak tiga kali agar lebih efektif sampai lapisan washbensin terlihat bening yang menandakan tidak ada lagi senyawa fenolik yang tertarik ke dalam washbensin. Partisi ini dilakukan dengan perbandingan pelarut air : washbensin 1:1 (v/v). Bagian yang polar akan cenderung larut dalam air sedangkan bagian yang non polar akan larut dalam washbensin. Dalam fraksi washbensin akan diperoleh senyawa-senyawa kimia yang tidak diinginkan seperti lipid dan klorofil sehingga fraksi ini tidak diperlukan untuk proses penelitian tahap selanjutnya.

Fraksi air hasil partisi dengan washbensin kemudian dilakukan partisi atau ekstraksi cair-cair kembali dengan pelarut etil asetat dengan perbandingan pelarut 1:1 (v/v). Pada partisi air-etil asetat ini fraksi air akan berada pada bagian bawah dan fraksi etil asetat berada pada bagian atas karena BJ air (0,996) lebih besar dibandingkan BJ etil asetat (0,898). Proses partisi ini juga dilakukan secara berulang sampai lapisan atau bagian etil asetat terlihat bening. Fraksi air dan fraksi etil asetat yang diperoleh dipisahkan dan fraksi etil asetat selanjutnya diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator kemudian dipanaskan di dalam oven hingga kental atau sampai bobot tetap sehingga didapatkan fraksi kental etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Fraksi etil asetat inilah yang

akan digunakan untuk uji aktivitas antioksidan dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya.

Pada penelitian ini digunakan fraksi etil asetat karena peneliti ingin melihat aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik yang berada pada fraksi etil asetat. Senyawa fenolik dapat berbentuk glikosida yang bersifat polar dan dalam bentuk aglikon yang lebih non polar, sehingga ada kemungkinan senyawa fenolik dapat larut dalam air maupun etil asetat. Penyimpanan fraksi ini dilakukan dengan menggunakan cawan porselen yang ditutup dengan allumunium foil kemudian ditempatkan dalam eksikator untuk menjaga kestabilan senyawa dalam fraksi dari pengaruh cahaya maupun kelembapan lingkungan.

D. Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji fenolik

Uji ini memakai prinsip reaksi oksidasi-reduksi pada suasana basa. Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif adanya kandungan senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Dalam suasana basa akibat penambahan natrium karbonat, senyawa fenolik akan berubah menjadi ion fenolat yang bersifat lebih reaktif terhadap adanya pereaksi Ciocalteu. Ion fenolat tersebut dioksidasi oleh asam dalam pereaksi fenol Folin-Ciocalteu (asam fosfomolibdat-fosfotungstat) sehingga akan terbentuk larutan dengan warna biru. Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna biru (gambar 3). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol kuit jeruk manis mengandung senyawa fenolik.

Gambar 3. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = kontrol positif [asam galat] + reagen Folin-Ciocalteu, B =,larutan uji [fraksi etil asetat ekstrak

etanol kulit jeruk manis] + reagen Folin-Ciocalteu, C = kontrol negatif [blanko reagen Folin-Ciocalteu])

2. Uji aktivitas antioksidan

Uji ini menggunakan reaksi antara radikal DPPH dengan senyawa antioksidan. Tujuan uji ini adalah untuk mengetahui secara kualitatif aktivitas antioksidan dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, dan Mohammad, 2009). Pengujian menunjukkan hasil positif dengan larutan uji berwarna kuning (gambar 4). Hal ini menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis memiliki aktivitas antioksidan.

Gambar 4. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol positif [rutin], B = kontrol negatif [blanko DPPH], C = larutan uji [fraksi

etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis] + DPPH) E. Hasil Optimasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total (1) Penentuan OT penetapan kandungan fenolik total

Tujuan penentuan OT adalah untuk menetapkan rentang waktu dimana reaksi antara asam galat dengan pereaksi Folin-Ciocalteu telah berlangsung secara sempurna.

Gambar 5. Kurva penentuan OT penetapan kandungan fenolik

Hasil (gambar 5) menunjukkan bahwa dari menit ke-30 sampai 60, absorbansi senyawa molybdenum blue yang terbentuk telah stabil. Hal ini menunjukkan bahwa reaksi dalam metode Folin-Ciocalteu telah sempurna sejak menit ke-30.

(2) Penentuan maksimum penetapan kandungan fenolik total

Dari hasil spektra, senyawa berwarna biru tersebut memiliki maksimum pada 750 nm (lampiran 4). Hal ini sesuai dengan penelitian-penelitian yang menyatakan bahwa maksimum senyawa berwarna biru hasil metode Folin- Ciocalteu berada pada rentang 750-765 nm (Gansch, Weber, dan Lee, 2009; Veeru, et al., 2009).

F.Hasil Validasi Metode Penetapan Kandungan Fenolik Total Untuk mengetahui validitas metode uji aktivitas antioksidan dilakukan analisis presisi, linearitas, dan spesifisitas terhadap replikasi kandungan fenolik total. Tiga persamaan regresi linear antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi telah dibuat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan yang paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linear yang paling baik didapatkan dari replikasi tiga dengan y = 0,005x – 0,051 dan 0,999 sebagai nilai r. Persamaan tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi terukur asam galat. Hasil %CV dapat dihitung jika konsentrasi tersebut telah didapatkan.

Gambar 6. Kurva persamaan regresi linear penetapan kadar fenolik total (1) Presisi penetapan kandungan fenolik total

Penilaian presisi berdasarkan pada nilai %CV dari data hubungan antara seri konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang dihasilkan. Dari data pada

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

0 20 40 60 80 100 120 140 160

A b so rb a n si Konsentrasi (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linear

asam galat

y = 0,005x - 0,051 r = 0,999

tabel IV, %CV yang dihasilkan berada dalam rentang 0,3435% - 4,3575%. Persyaratan %CV tersebut untuk asam galat sebagai bahan p.a. terpenuhi. Rentang %CV yang baik harus ≤ 5% (Harmita, 2004). Metode ini memiliki presisi yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

Tabel IV. Hasil presisi asam galat dari beberapa parameter Konsentrasi

asam galat

rerata

absorbansi SD % CV Seri 1 52,22 2,2756 4,3575 Seri 2 76,11 2,5051 3,2914 Seri 3 96,54 4,0628 4,2083 Seri 4 124,51 0,4277 0,3435 Seri 5 149,20 0,7709 0,5167

n = 5

(2) Linearitas penetapan kandungan fenolik total

Hasil nilai koefisien korelasi (r) persamaan regresi linear penetapan kandungan fenolik total yang paling bagus adalah pada replikasi tiga, yaitu 0,999. Persyaratan linearitas yang baik jika nilai r > 0,999 terpenuhi. Metode ini memiliki linearitas yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

(3) Spesifitas penetapan kandungan fenolik total

Dari hasil spektra (lampiran 11), untuk larutan asam galat maupun larutan uji tidak menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap absorbansi senyawa berwarna biru yang terukur. Oleh karena itu, metode ini memiliki spesifisitas yang baik.

G. Hasil Estimasi Kandungan Fenolik Total

Penetapan kandungan fenolik total dilakukan untuk mengetahui hubungan antara aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat kulit jeruk manis. Senyawa fenolik merupakan golongan terbesar dalam perannya sebagai antioksidan. Maka jumlah atau kandungan fenolik total pada suatu tumbuhan sangat menentukan atau berpengaruh pada aktivitas antioksidannya.

Pada penetapan kandungan fenolik total ini menggunakan metode Follin-Ciocalteu. Metode ini memakai reagen fenol asam fosfomolibdat-fosfotungstat atau reagen Follin-Ciocalteu. Prinsip reaksi Follin-Ciocalteu ini adalah reaksi reduksi oksidasi. Senyawa fenolik akan teroksidasi membentuk keton sedangkan kompleks fosfomolibdat-fosfotungstat yang berasal dari pereaksi Follin-Ciocalteu akan mengalami reduksi menjadi kompleks molybdenum blue yang berwarna biru. Penambahan natrium karbonat dimaksudkan agar reaksi berada pada suasana basa karena pada suasana basa fenolik akan menjadi ion fenolat yang lebih mudah teroksidasi sehingga akan lebih mudah dan cepat bereaksi dengan pereaksi Follin-Ciocalteu.

Gambar 7. Reaksi asam galat dengan molibdenum, komponen dari reagen Folin-Ciocalteu (Nunes, et al., 2012)

Untuk dapat membuat kurva baku penentuan kandungan fenolik total digunakan senyawa baku, yaitu asam galat. Asam galat digunakan sebagai pembanding karena merupakan suatu senyawa fenolik dan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat, ketersediaannya juga melimpah di alam dan juga tersedia dalam kemurnian yang tinggi dengan harga relatif murah dibanding standar lain.

Tabel V. Hasil pengukuran seri baku asam galat Replikasi

Konsentrasi Teoritis (µg/mL)

Absorbansi Persamaan regresi linear

I

50 0,226

y = 0,0052x – 0,0372 r = 0,9956

75 0,373

100 0,453

125 0,62

150 0,756

II

50,5 0,245

y = 0,0049x – 0,0018 r = 0,9972

75,75 0,361

101 0,463

126,25 0,62

151,5 0,75

III

50 0,222

y = 0,0054x – 0,051 r = 0,9996

75 0,346

100 0,495

125 0,624

150 0,758

Tabel VI. Hasil penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis

Replikasi Konsentrasi

(µg/mL) Absorbansi

Kandungan fenolat (µg/mL) Kandungan fenolat total (mg ekivalen asam

galat per g fraksi)

Rata-rata (mg ekivalen asam galat per g fraksi

SD

1 305 0,800 157,59 25,83

25,81 0,314

2 306 0,799 157,41 25,72

3 305 0,799 157,41 25,89

Kandungan fenolik total ditentukan menggunakan persamaan regresi linear antara konsentrasi asam galat dengan absorbansi yang didapat setelah direaksikan dengan pereaksi Follin-Ciocalteu. Tabel V menunjukkan bahwa pada replikasi tiga memiliki persamaan regresi linear yang paling baik dengan nilai y = 0,0054x – 0,051 dan r = 0,9996. Berdasarkan perhitungan menggunakan persamaan tersebut didapatkan hasil kandungan fenolik total rata-rata sebesar

25,81 ± 0,314 mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis (Tabel VI).

H. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Metode DPPH merupakan metode yang mudah, cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak tanaman (Koleva, et al., 2002; Prakash, et al., 2010). DPPH merupakan radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen. Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH mempunyai maksimum pada 517 nm (Dehpour, et al., 2009). Oleh karena itu, peneliti melakukan scanning maksimum pada pelarut, fraksi etil asetat, dan rutin pada daerah 400-600 nm (Lampiran 11). Hal ini dilakukan dengan tujuan memastikan bahwa tidak ada gangguan pengukuran pada daerah maksimum DPPH yang dapat menyebabkan hasil pengukuran absorbansi dari DPPH menjadi tidak akurat. Hasil tersebut tidak menunjukkan adanya gangguan pada daerah maksimum DPPH. Setelah dipastikan tidak terdapat gangguan maka metode DPPH dapat dilaksanakan untuk menguji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Untuk menguji aktivitas antioksidan perlu dilakukan terlebih dahulu proses optimasi metode DPPH. Proses optimasi tersebut berupa penentuan OT dan scanning maksimum DPPH.

(1) Penentuan maksimum metode uji aktivitas antioksidan

Tujuan penentuan maksimum adalah untuk menetapkan panjang gelombang DPPH yang digunakan dalam penelitian ini. Pengukuran absorbansi perlu dilakukan pada maksimum karena pada maksimum, dengan hanya sedikit perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar sehingga didapatkan sensitivitas analisis yang maksimum.

Selain itu, kurva pada maksimum relatif datar sehingga adanya sedikit pergeseran panjang gelombang karena variasi instrumental, absorbansi tetap stabil.

Gambar 9. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH

Penentuan maksimum dilakukan dengan scanning terhadap tiga seri konsentrasi larutan DPPH pada panjang gelombang visibel dari 400 nm sampai 600 nm. DPPH bisa terukur pada daerah visibel karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom (gambar 8), sedangkan dengan adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH memberikan serapan kuat pada 517 nm yang menyebabkan larutan DPPH berwarna ungu. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh

keberadaan penangkap radikal bebas, maka absorbansinya menurun dan larutan menjadi berwarna kuning. Pemilihan rentang panjang gelombang 400-600 nm didasarkan pada warna DPPH berupa ungu dan maksimum-nya pada 517 nm. Dari ketiga seri larutan DPPH tersebut, diperoleh maksimum, yaitu pada 515 nm.

(2) Penentuan OT metode uji aktivitas antioksidan

Tujuan penentuan OT adalah untuk menetapkan rentang waktu dimana larutan pembanding dan uji sudah mereduksi radikal DPPH dengan sempurna sehingga diperoleh nilai absorbansi yang stabil. Jika nilai absorbansi stabil maka pengukuran bisa reprodusibel dan meminimalkan kesalahan analisis. Penentuan

OT dilakukan dengan mengukur absorbansi DPPH pada maksimum DPPH yang

telah diukur sebelumnya, yaitu 515 nm setiap 5 menit selama 60 menit pada larutan pembanding dan uji.

Gambar 11. Grafik penentuan OT fraksi etil asetat

Hasil penentuan OT terlihat pada gambar 10 dan 11, yaitu pada menit ke-5 sampai ke-60 baik pada larutan pembanding maupun uji, absorbansi DPPH memberikan nilai yang semakin stabil, hal ini menunjukkan bahwa reaksi antara DPPH dengan senyawa antioksidan dalam larutan pembanding dan uji semakin sempurna dan akhirnya berhenti. Dari gambar 10 dan 11, dapat dinyatakan bahwa OT pada larutan pembanding (rutin) selama 55 menit, sedangkan pada larutan uji (fraksi etil asetat) selama 45 menit.

I. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Validasi metode analisis adalah suatu penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan (Harmita, 2004).

Untuk mengetahui validitas metode uji aktivitas antioksidan dilakukan analisis presisi, linearitas, dan spesifisitas terhadap replikasi uji aktivitas antioksidan rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.

Tiga persamaan regresi linear antara konsentrasi rutin dan fraksi etil asetat dengan %IC telah dibuat. Dari ketiga persamaan tersebut dipilih persamaan yang paling linear yang ditunjukkan oleh nilai r nya. Persamaan regresi linear yang paling baik untuk rutin diperoleh dari replikasi tiga (y = 1,7697x + 5,8873; dengan 0,996 sebagai nilai r), sedangkan untuk fraksi etil asetat diperoleh dari replikasi dua (y = 0,167x + 1,194; dengan 0,996 sebagai nilai r). Persamaan tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi terukur baik untuk rutin maupun larutan uji. Hasil %CV dapat dihitung jika konsentrasi tersebut telah didapatkan. Gambar 12 dan 13 menunjukkan kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.

Gambar 12. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan rutin

y = 1,769x + 5,887 r = 0,996

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00

0 10 20 30 40 50

A x is T it le Axis Title

Kurva persamaan regresi linear

aktivitas antioksidan rutin

Gambar 13. Kurva persamaan regresi linear aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik kulit jeruk manis

Dari gambar 12 dan 13, tampak bahwa ada korelasi antara konsentrasi rutin dan fraksi etil asetat dengan %IC yang ditunjukkan dari koefisien korelasi grafik (nilai r) yang mendekati nilai satu. Koefisien korelasi tersebut bernilai positif yang menunjukkan bahwa hubungan antara konsentrasi baik rutin maupun fraksi etil asetat dengan %IC yang dihasilkan sebanding. Semakin besar konsentrasi dari rutin maupun fraksi etil asetat maka semakin besar %IC yang dihasilkan, begitu juga sebaliknya.

(1) Presisi metode uji aktivitas antioksidan

Presisi suatu metode analisis dinyatakan dalam persentase Coefficient of Variation (CV).

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0 100 200 300 400 500

%

IC

Konsentrasi (µg/mL)

Kurva persamaan regresi linear

aktivitas antioksidan fraksi etil asetat

y = 0,167x + 1,194 r = 0,996

Tabel VII. Hasil presisi aktivitas antioksidan standar rutin Konsentrasi (µg/mL) Rata-rata konsentrasi (µg/mL)

SD % CV

12,25 11,64 0,425 3,651

19,25 19,57 0,739 3,778

26,25 27,63 0,525 1,899

33,25 34,18 0,697 2,038

40,25 39,49 0,151 0,383

Nilai %CV untuk larutan pembanding rutin pada tabel diatas berada pada rentang 0,383% - 3,778%. Nilai presisi yang masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri konsentrasi larutan pembanding rutin telah memenuhi nilai presisi yang baik.

Tabel VIII. Hasil presisi aktivitas antioksidan fraksi etil asetat Konsentrasi

(µg/mL)

Rata-rata konsentrasi

(µg/mL)

SD % CV

160 164,803 0,516 0,313

232,5 233,176 0,504 0,216

305 292,33 0,207 0,071

377,5 395,38 0,518 0,131

450 446,6 0,744 0,166

Nilai %CV untuk larutan uji pada tabel diatas berada pada rentang 0,071% - 0,313%. Nilai presisi yang masih dapat diterima adalah ≤ 5% (Harmita, 2004). Pada semua seri konsentrasi larutan uji diketahui telah memenuhi nilai presisi yang baik. Dari hasil tersebut, dapat dikatakan bahwa metode DPPH yang digunakan memiliki presisi yang baik.

(2) Linearitas metode uji aktivitas antioksidan

Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r) yang dihasilkan dari suatu persamaan regresi linier. Linearitasnya dikatakan semakin baik apabila nilai r semakin mendekati satu. Nilai koefisien korelasi (r) untuk larutan pembanding rutin untuk replikasi I = 0,9957; replikasi II = 0,9953; dan replikasi III = 0,99649 (Tabel VI). Data linearitas dapat diterima jika memenuhi nilai r > 0,995 (Chan, Lam, Herman, Lee, 2005). Dari hasil tersebut, persamaan kurva baku untuk ketiga replikasi larutan pembanding rutin telah memenuhi persyaratan lineraitas yang baik.

Tabel IX. Hasil aktivitas antioksidan rutin dengan metode DPPH

Replikasi

Konsentrasi

(µg/mL) % IC Persamaan regresi linier

11,53 26,30

18,77 39,12

I 27,29 54,20 y = 1,5296x + 14,693

34,92 67,69 r = 0,9957

39,66 76,08

12,11 27,31

20,23 41,69

II 28,23 55,85 y = 1,7238x + 7,8707

34,09 66,22 r = 0,9953

39,45 75,70

11,27 25,84

19,72 40,79

III 27,36 54,35 y = 1,7697x + 5,8873

33,54 65,24 r = 0,99649

Tabel X. Hasil aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan metode DPPH

Replikasi Konsentrasi (µg/mL) % IC Persamaan regresi linier

160 28,90

y = 0,166x + 1,581 r = 0,995

232,5 40,38

I 305 49,94

377,5 67,04

450 76,04

160 28,57

y = 0,167x + 1,194 r = 0,996

232,5 40,04

II 305 50,05

377,5 67,37

450 75,70

160 28,68

y = 0,167x + 1,377 r = 0,995

232,5 40,15

III 305 50,05

377,5 67,26

450 75,59

Hasil dari persamaan regresi linier hasil dari tiga replikasi fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis yang ditunjukan pada tabel X, didapatkan persamaan regresi linear berturut-turut adalah replikasi satu r = 0,995; r = 0,996, dan r = 0,995. Tiga hasil ini masih memenuhi nilai koefisien korelasi linearitas minimal menurut Chan, et al. (2005), yaitu r > 0,995. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan metode ini memiliki linearitas yang baik untuk menganalisis fraksi etil asetat ekstrak kulit jeruk manis.

(3) Spesifitas metode uji aktivitas antioksidan

Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel (Harmita, 2004). Dalam metode analisis ini yang menggunakan spektrofotometri visibel pada pengukuran rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol sampel uji, spesifikasi metode dapat dilihat dengan tidak

adanya serapan dari sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yang digunakan, yaitu 515 nm. Dari hasil spektra terlihat bahwa larutan rutin, larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dan pelarut metanol tidak menunjukkan adanya gangguan berarti terhadap absorbansi DPPH hasil reaksi (Lampiran 11). Dengan demikian dapat dikatakan metode ini memilki spesifitas yang baik.

Dari hasil validasi metode analisis yang dilakukan menunjukkan bahwa metode penangkapan radikal bebas DPPH oleh rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis sebagai antioksidan terbukti sudah baik dalam, presisi, spesifisitas dan linearitas sehingga hasil yang diperoleh dapat dipercaya.

J.Hasil Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH Aktivitas antioksidan dari suatu bahan uji dinyatakan dengan IC50. Nilai tersebut diperoleh dari suatu persamaan regresi linear yang menyatakan hubungan antara konsentrasi bahan uji dengan %IC. Semakin kecil nilai IC50, maka semakin besar aktivitas antioksidan suatu bahan uji. Tujuan dari uji ini adalah memperoleh nilai IC50 fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Nilai tersebut kemudian dibandingkan dengan nilai IC50 rutin.

Tabel XI. Hasil perhitungan IC50 rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanol

kulit jeruk manis Bahan Uji

IC50 (µg/mL) Rata-rata (µg/mL)

SD % CV

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Rutin 23,08 24,31 24,93 24,11 0,939 0,882 Fraksi etil

asetat 291,68 292,25 292,34 292,09 0,379 0,001

Pada tabel XI, rata-rata nilai IC50 rutin sebesar 24,11 ± 0,939 ( g/mL), sedangkan larutan uji sebesar 292,09± 0,379 ( g/mL). Untuk melihat signifikansi antara nilai IC50 rutin dengan larutan uji maka data nilai aktivitas antioksidan diuji secara statisik. Pengujian dilakukan dengan menggunakan software R 2.14.1. Langkah pertama dilakukan uji Shapiro-Wilk karena sampel yang digunakan < 50 (Dahlan, 2012). Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah data yang didapatkan terdistribusi normal atau tidak. Hipotesis null (Ho) adalah data %IC terdistribusi normal sedangkan Hipotesis alternatif adalah data %IC tidak terdistribusi normal. Dari hasil perhitungan Shapiro-Wilk diperoleh nilai signifikansi (p) untuk IC50 rutin sebesar 0,6361 (Gambar 14) dan larutan uji sebesar 0,2529 (Gambar 15). Nilai signifikansi yang diperoleh untuk rutin dan fraksi etil asetat lebih besar dari nilai signifikansi 0,05 (taraf kepercayaan 95%), oleh karena itu Hnull diterima. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan data IC50 rutin dan fraksi etil asetat terdistribusi normal.

Gambar 14. Hasil uji normalitas data rutin

Gambar 15. Hasil uji normalitas data fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis

Dari hasil analisis data yang secara statistik diketahui terdistribusi normal, maka langkah selanjutnya melakukan uji parametrik, yaitu uji T tidak berpasangan. Hipotesis null (Hnull) adalah nilai IC50 rutin tidak lebih kecil daripada fraksi etil asetat dan hipotesis alternatif yang digunakan adalah nilai IC50 rutin lebih kecil dari pada fraksi etil asetat. Hasil pengujian statistik diperoleh nilai signifikansi sebesar 0,00143 antara rutin dan fraksi etil asetat (Gambar 16). Dari hasil yang diperoleh jika dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05 maka Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih kecil daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Dari hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 rutin lebih kecil daripada fraksi etil asetat.

Gambar 16. Hasil uji T tidak berpasangan

Dari hasil nilai IC50 tersebut diketahui bahwa rutin memiliki aktivitas antioksidan lebih besar dibandingkan dengan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Bila didasarkan pada tingkat kekuatan aktivitas antioksidan menurut Aryanto (2006), rutin memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat (IC50 < 50 µg/mL), sedangkan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis memiliki aktivitas antioksidan yang tergolong lemah (IC50 > 150 µg/mL).

Tabel XII. Penggolongan Tingkat Kekuatan Antioksidan Rutin dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Kulit Jeruk Manis

Intensitas Nilai IC50 Rutin Fraksi etil asetat ekstrak etanol

Sangat kuat <50 µg/mL √ -

Kuat 50-100 µg/mL - -

Sedang 101-150 µg/mL - -

50 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Kadar fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis yang dinyatakan dengan massa ekivalen asam galat sebesar 25,81 ± 0,314 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.

2. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis dengan menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dengan IC50tergolong kecil yaitu sebesar 292,09 ± 0,379 g/mL.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penetapan parameter kualitas ekstrak etanol kulit jeruk manis.

2. Perlu dilakukan uji korelasi antara aktivitas antioksidan dengan kadar fenolat total dari kulit jeruk manis.

3. Perlu dilakukan tahap lebih lanjut yaitu isolasi dan elusidasi struktur untuk mengetahui senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan dalam fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis.

DAFTAR PUSTAKA

Ames, B.N., 1983, Dietary Carcinogens and Anticarcinogens, Science, 221(4617), 1256-1264.

Armala, M. M., 2009, Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir (Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Anonim, 2011, Jeruk Manis, http://repository.usu.ac.id//bitstream/123456789/4/ Chapter%20II.pdf, diakses tanggal 2 Juli 2013.

Backer, C.A., and Van Den Brink JR, R.C.B., 1968, Flora of Java (Spermatophytes Only), Vol. I, N.V.P. Noordhoff-Groningen-The Netherlands, Netherlands.

Bruneton, J., 1999, Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes Medicinales, diterjemahkan oleh Hatton, C.K., Lavoisier Publishing, Paris, pp. 229. Dahlan, M.S., 2012, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, Salemba Medika,

Jakarta, pp. 37, 42-49.

Decker, E., 1998, Strategies for Manipulating the Prooxidative Antioxidative Balance of Foods to Maximize Oxidative Stability, Trends Food Sci. Technol., 9, 241-248.

Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., dan Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its Essential Oil Composition, Grasas Aceites, 60(4), 405-412.

Departemen Kesehatan, 1986, Sediaan Galenik, Jilid 2, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 11-12.

Departemen Kesehatan, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta,pp. 7, 1061.

Dinis, T.C., Maderia, V.M., dan Almeida, L.M., 1994, Action of Phenolic Derivates (Acetoaminophen, Salycilate and 5-Aminosalycilate) as Inhibitors of Membrane Lipid Peroxidation and as Peroxyl Radical Scavengers, Archiv. of Biochem. and Bioph., 315, 161–169.

Fessenden, R.J., dan Fessenden J.S., 1995, Kimia Organik, Edisi Ketiga, 119-220, diterjemahkan oleh Pujaatmaka, A.H., Penerbit Erlangga, Jakarta.

Gansch, H., Weber, C.A., dan Lee, C.Y., 2009, Antioxidant Capacity and Phenolic Phytochemicals in Black Raspberries, New York Fruit Quarterly, 17(1), 20.

Gharavi, N., Haggarty, S., dan El-Kadi, A.O.S., 2007, Chemoprotective and Carcinogenic Effects of tert-Butylhydroquinone and Its Metabolites, Curr. Drug Metabol., 8, 1-7.

Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., dan Kufrevioglu, O.I., 2004, Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.), Turk. J. Agric. For., 28, 25-33.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penentuan Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Ed. 2, diterjemahkan oleh Padmawinata K. dan Sudiro I., hal. 47-109, Penerbit ITB, Bandung.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungan, Departemen FMIPA UI, Depok, pp. 5-13.

Huang, D., Ou, B., dan Prior, R.L., 2005, The Chemistry Behind Antioxidant Capacity Assays, J. Agric. Food Chem., 53, 1841-1856.

Koleva, I.I., van Beek, T.A., Linssen, J.P.H., de Groot, A., dan Evstatieva, L.N., 2002, Screening of Plant Extracts For Antioxidant Activity: A Comparative Study on Three Testing Methods, Phytochem. Analys., 13, 8-17.

Malkinson, A.M., 1999, Lung Tumor Promotion by BHT, Crisp Data Base National Institutes Of Health, http://www.feingold.org/malkinson.html, diakses tanggal 30 Mei 2013.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh Padmawinata, K., hal. 15, Penerbit ITB, Bandung.

Mbata, T.I., 2010, Antioxidant Nutrients: Beneficial or Harmful, Intern. Journl. of Fd. Saf. V, 7, 29-33.

Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2), 211-219.

Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya.

Mulja, M., Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip dan Cara Berlaboratorium yang baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, Vol. III, 71-76.

b. Scanning metanol : air (1 : 1 v/v)

d. Scanning asam galat

e. Scanning fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul Uji Aktivitas Antioksidan dan Menggunakan Radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Kulit Jeruk Manis (Citrus sinensis

(L.) Osbeck) memiliki nama lengkap Augustinus Teti. Dilahirkan di Bedono, Ambarawa pada tanggal 18 Agustus 1991 dari pasangan Bapak Fransiskus Solanus Teti dan Ibu Francisca Romana Turwiyasih. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK St. Maria Goretty Kupang pada tahun 1996 hingga 1997 lalu melanjutkan pendidikan dasar di SD Katolik Don Bosco 4 Kupang pada tahun 1997 hinga 2003. Penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP Negeri 2 Kupang pada tahun 2003 hingga 2006 dan SMA Negeri 1 Kupang pada tahun 2006 hingga 2009. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2009 hingga 2013. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan baik di dalam fakultas maupun universitas antara lain Panitia Titrasi (2010), Panitia Pharmacy Performance Even Cup (2010), Panitia Pelepasan Wisuda (2011 dan 2012), serta Panitia.Temu Alumni Akbar Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta (2012). Penulis pernah mengikuti kompetisi

xviii INTISARI

Antioksidan merupakan senyawa yang menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas. Akibatnya, kerusakan sel oleh radikal bebas dapat dihambat. Kulit jeruk manis diketahui memiliki senyawa fenolik. Senyawa tersebut beraktivitas antioksidan. Penelitian ini dilakukan untuk menentukan aktivitas antioksidan serta kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan radikal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan dinyatakan dengan nilai Inhibition Concentration 50 (IC50). Keberadaan senyawa beraktivitas antioksidan akan mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning. DPPH memiliki maksimum di 515 nm. Ketika elektronnya berpasangan oleh keberadaan senyawa antioksidan, maka absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil.

Kandungan fenolik total ditentukan dengan metode Folin-Ciocalteu dan dinyatakan dengan nilai massa ekuivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi air). Senyawa fenolik akan dioksidasi oleh pereaksi fenol Folin-Ciocalteu dalam suasana basa sehingga terbentuk larutan dengan warna biru. Larutan tersebut memiliki maksimum di 750 nm.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis mempunyai aktivitas antioksidan lemah dengan nilai IC50 sebesar

292,09 ± 0,379 g/mL. Kandungan fenolik total sebesar 25,81 ± 0,314 mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.

Kata kunci : fraksi etil asetat ekstrak etanol kulit jeruk manis, Citrus sinensis (L.) Osbeck, antioksidan, DPPH, kandungan fenolik total

xix ABSTRACT

Antioxidants are compounds that inhibit oxidation reactions by binding to free radicals. As a result, the cell damage by free radicals can be inhibited. Sweet orange peel phenolic compounds known to possess. This study was conducted to determine the antioxidant activity and total phenolic content of ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel. Radical antioxidant activity assays using 1,1-diphenyl-2-pikrilhidrazil (DPPH) and expressed by the value Inhibition Concentration 50 (IC50). The existence of active antioxidant compounds

DPPH solution will change color from purple to yellow. DPPH has a maximum at 515 nm. When the electron pairs by the presence of antioxidant compounds, the absorbance decreases corresponding stoichiometric number of electrons captured. Total phenolic content was determined by Folin-Ciocalteu method and expressed by the value of the mass of gallic acid equivalents (mg gallic acid equivalents per g fraction of water). Phenolic compounds will be oxidized by the Folin-Ciocalteu phenol reagent under alkaline conditions, forming a blue solution. The solution has a maximum at 750 nm.

The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel has a weak antioxidant activity with IC50 values of 292,09 ±

0.379 µg/mL. Total phenolic content of 25.81 ± 0.314 mg gallic acid equivalents per g of ethyl acetate fraction.

Keywords : ethyl acetate fraction of ethanol extract of sweet orange peel, Citrus sinensis (L.) Osbeck, antioxidants, DPPH, total phenolic content