Desain dan sintesis senyawa 2-(4`-hidroksi-3`-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang berpotensi sebagai senyawa antikanker dengan menghambat protein NF-kB menggunakan metode solid phase reaction.

xix INTISARI

Senyawa analog kurkumin dalam bentuk enon dan dienon aromatis diketahui memiliki aktivitas sebagai inhibitor NF-κB. Dalam penelitian ini akan disintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang merupakan analog kurkumin dan diperkirakan mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental deskriptif non-analitik yang dilakukan berdasarkan kondensasi aldol silang dengan mereaksikan 4 mmol sikloheksana-1,3-dion dan 4 mmol 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida menggunakan metode solid phase reaction. Analisis senyawa hasil sintesis dilakukan dengan uji kualitatif: pemeriksaan organoleptis, kelarutan, titik lebur, KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak n-heksan:etil asetat (3:2), kromatografi gas, dan elusidasi struktur dengan spektroskopi massa dan inframerah. Sedangkan uji kuantitatif dilakukan dengan perhitungan rendemen.

Berdasarkan hasil perhitungan secara komputasional, diketahui bahwa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion mempunyai aktivitas yang lebih baik dibandingkan kurkumin dengan skor PLANTSPLP sebesar -60.8375. Senyawa hasil sintesis berupa serbuk kering berwarna kuning, bau khas, dan rendemen sebesar 13,340%; 13,311%; dan 13,166%, dengan profil kelarutan larut dalam NaOH 3N. Hasil uji KLT menunjukkan adanya senyawa baru dengan Rf 0,230. Kromatografi gas menunjukkan kemurnian senyawa hasil sintesis sebesar 34,96% dengan jarak lebur sebesar 181,97–193,04oC. Hasil elusidasi struktur dengan spektroskopi massa dan inframerah memperkuat bukti bahwa senyawa hasil sintesis adalah 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion. Kata kunci : 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion,

solid phase reaction, inhibitor NF-κB, reaksi kondensasi aldol silang

xx ABSTRACT

Analog of curcumin in forms of enone and dienone aromatic is known for their activity as an NF-κB inhibitor. In this study, will be synthesize 2-(4’ -hydroxy-3’-methoxybenzylidene) cyclohexane-1,3-dione as an analog that predicted has an activity as an NF-κB inhibitor.

It was a non-experimental descriptive non-analytical research which conducted based on the crossed aldol condensation reaction by reacting 4 mmole of cyclohexane-1,3-dione and 4 mmole of 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde with pottasium hydroxide as the catalyst using solid phase reaction method. This research applied qualitative and quantitative tests. The qualitative tests consisted of organoleptic, solubility, melting point, TLC (with silica gel GF254 as stationary phase and n-hexane:ethyl acetate (3:2) as mobile phase), and structure elucidation with infrared and mass spectroscopy. Quantitative test involved the calculation of the yield.

Based on computational analysis, 2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzylidene) cyclohexane-1,3-dione showed a better interaction with NF-κB protein with PLANTSPLP score was -60.8375. The outcome of the reaction was yellow colored powder and specified smell (odor). The yield values were 13.340%; 13.311%; and 13.166%. Its soluble in sodium hydroxide 3N. TLC test shown the existence of new chemical substance with Rf value of 0.230. Gas chromatography showed 34.96% purity. The melting point range were 181.97–193.04o_{C. The results of structure} elucidation by infrared and mass spectroscopy tests indicated the compound was 2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzilidene) cyclohexane-1,3-dione.

Key words : 2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzilidene) cyclohexane-1,3-dione, solid phase reaction, NF-κB inhibitor, crossed aldol condensation reaction

DESAIN DAN SINTESIS SENYAWA 2-(4’-HIDROKSI-3’-METOKSIBENZILIDENA) SIKLOHEKSANA-1,3-DION YANG BERPOTENSI SEBAGAI SENYAWA

ANTIKANKER DENGAN MENGHAMBAT PROTEIN NF-κB _MENGGUNAKAN

METODE SOLID PHASE REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Kenny Ryan Limanto NIM : 098114006

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya kecilku ini kupersembahkan untuk:

Mama dan Papa yang selalu mendukung, mendoakan, dan memberikan yang terbaik untukku; Venny dan Denny, adikku tersayang yang selalu mewarnai hidupku; Bu Sinarsih, Bu Yetty, dan Pak Jeffry yang telah mengajariku untuk mencintai kimia; serta Monica yang selalu memberikan semangat dan dukungan untuk setiap langkahku..

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas limpahan kasih dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “DESAIN

DAN SINTESIS SENYAWA 2-(4’-HIDROKSI-3’

-METOKSIBENZILIDENA) SIKLOHEKSANA-1,3-DION YANG

BERPOTENSI SEBAGAI SENYAWA ANTIKANKER DENGAN

MENGHAMBAT PROTEIN NF-κB _{MENGGUNAKAN METODE} SOLID

PHASE REACTION”. Skripsi ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen pembimbing yang tak pernah henti memberikan arahan, dukungan, dan saran dalam penelitian serta penyusunan skripsi ini.

3. Dra. M. M. Yetty Tjandrawati, M.Si., selaku dosen penguji atas masukan dan saran selama proses penelitian.

4. Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji atas masukan kritik dan saran selama proses penelitian.

5. Rini Dwi Astuti, M.Si., Apt., selaku kepala laboratorium Farmasi atas ijin yang diberikan kepada penulis dalam penggunaan laboratorium.

6. Bu Phebe Hendra dan Bu Christine Patramurti, atas masukan kritik dan saran dalam penyusunan proposal dan proses penelitian.

7. Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Bimo, Mas Wagiran, Pak Musrifin, serta segenap laboran Fakultas Farmasi yang telah membantu selama proses pengerjaan penelitian di laboratorium.

8. Monica, atas doa, dukungan, semangat, perjuangan yang tiada henti diberikan kepada penulis selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini.

9. Venny, atas dukungannya selama proses pengerjaan di laboratorium.

10. Ci Melly, atas dukungan, semangat, perjuangan, dan bantuan yang telah diberikan selama kuliah ini.

11. Wanda, Rachel, Putra, Jenny, Dina, Jimmy, Leo, Topan, Gunggek, Ina, Deny, Nety, Mikhael, Danu, Aldo, serta teman-teman lainnya yang tak dapat penulis sebutkan satu per satu, atas kebersamaannya selama ini. We are only as strong as we are united, as weak as we are divided..!!

12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah membantu dalam proses penyusunan skripsi ini.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini mengingat keterbatasan dan kemampuan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi pembaca dan mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

vŝii

ix DAFTAR ISI

halaman

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... xiii

DAFTAR GAMBAR ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xvii

INTISARI ... xix

ABSTRACT _{... xx}

BAB I PENDAHULUAN ... 1

A.Latar Belakang ... 1

1. Rumusan masalah ... 3

2. Keaslian penelitian... 3

3. Manfaat penelitian ... 4

x

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA... 6

A.Kanker ... 6

B.Penapisan Virtual Berbasis Struktur ... 8

C.Sintesis Senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana- 1,3-dion ... 10

D.Metode Pemurnian dan Pemeriksaan Kemurnian Senyawa Hasil Sintesis ... 14

1. Rekristalisasi ... 14

2. Pemeriksaan organoleptis ... 15

3. Kelarutan... 16

4. Pemeriksaan titik lebur ... 17

5. Kromatografi lapis tipis ... 17

E. Elusidasi Struktur ... 19

1. Spektrofotometri inframerah (IR) ... 19

2. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) ... 20

F. Landasan Teori ... 21

G.Hipotesis ... 22

BAB III METODE PENELITIAN... 23

A.Jenis dan Rancangan Penelitian ... 23

B.Definisi Operasional ... 23

C.Bahan Penelitian ... 24

D.Alat Penelitian ... 24

xi

1. Validasi dasar protokol PLANTS ... 25

2. Docking senyawa uji terhadap protein NF-κB ... 26

3. Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion .. 26

4. Analisis senyawa hasil sintesis ... 27

F. Analisis Hasil ... 30

1. Perhitungan nilai RMSD ... 30

2. Perhitungan rendemen ... 30

3. Analisis pendahuluan ... 30

4. Pemeriksaan kemurnian dari senyawa hasil sintesis ... 30

5. Elusidasi struktur ... 31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 32

A.Desain Senyawa Inhibitor NF-κB ... 32

B.Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion ... 39

C.Analisis Pendahuluan ... 45

1. Pemeriksaan organoleptis ... 45

2. Pemeriksaan kelarutan ... 46

3. Pemeriksaan titik lebur ... 47

4. Pemeriksaan kemurnian dengan kromatografi lapis tipis (KLT) ... 48

5. Kromatografi gas ... 52

D.Elusidasi Struktur Senyawa Hasil Sintesis ... 53

1. Elusidasi struktur senyawa hasil sintesis dengan spektroskopi massa .... 53

2. Elusidasi struktur senyawa hasil sintesis dengan spektrofotometri inframerah ... 56

xii

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 62

A.Kesimpulan ... 62

B.Saran ... 62

DAFTAR PUSTAKA ... 63

LAMPIRAN ... 67

xiii

DAFTAR TABEL

halaman

Tabel I. Istilah kelarutan zat menurut Farmakope Indonesia IV ... 16

Tabel II. Skor dari pose terbaik untuk setiap konformasi senyawa hasil docking ... 35

Tabel III. Skor PLANTSPLP hasil perhitungan dengan PLANTS ... 38

Tabel IV. Perbandingan sifat fisik senyawa hasil sintesis dan starting material ... 45

Tabel V. Perbandingan kelarutan senyawa hasil sintesis dan starting material ... 47

Tabel VI. Titik lebur senyawa hasil sintesis dan starting material ... 48

Tabel VII. Nilai Rf senyawa hasil sintesis dan starting material ... 50

Tabel VIII. Nilai Rf senyawa hasil replikasi ... 51

Tabel IX. Perbedaan hasil interpretasi spektra inframerah senyawa hasil sintesis dengan starting material ... 60

xiv

DAFTAR GAMBAR

halaman Gambar 1. Peranan NF-κB dalam memicu terjadinya kanker ... 6 Gambar 2. Analisis diskoneksi untuk senyawa 2-(4’-hidroksi-3’

-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion ... 12 Gambar 3. Struktur tiga dimensi protein NF-κB... 32 Gambar 4. Struktur 4-fluoro-2-{[4-(piridin-4-il)-1,3-thiazol-2-il]amino)

fenol (0WA) ... 33 Gambar 5. Konfigurasi plantsconfig yang digunakan dalam

proses docking ... 33 Gambar 6. Tumpang-tindih pose senyawa referensi yang diperoleh dari

struktur kristal protein NF-κB (atom karbon berwarna biru) dan pose senyawa hasil docking (atom karbon berwarna

ungu) ... 36 Gambar 7. Visualisasi interaksi kurkumin dengan protein NF-κB

menggunakan PyMol ... 37 Gambar 8. Visualisasi interaksi senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-

metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dengan protein

NF-κB menggunakan PyMol ... 38 Gambar 9. Struktur sikloheksana-1,3-dion yang mempunyai dua gugus

karbonil dan enam hidrogen alfa ... 39 Gambar 10. Struktur 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang mempunyai

xv

Gambar 11. Reaksi pembentukan dan stabilisasi ion enolat yang

terbentuk ... 40 Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan 2-(4’-hidroksi-3’

-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion ... 42 Gambar 13. Kromofor dan auksokrom dari senyawa 2-(4’-hidroksi-3’

-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion ... 42 Gambar 14. Pembentukan garam dari senyawa hasil sintesis akibat

keberadaan kalium hidroksida (KOH) dan penambahan HCl yang mengembalikan bentuk garam senyawa target menjadi bentuk molekulnya ... 44 Gambar 15. Proses stabilisasi resonansi dari elektrofil yang terbentuk

pada senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida ... 45 Gambar 16. Penampakan lempeng KLT di bawah sinar UV pada panjang

gelombang 254 nm ... 49 Gambar 17. Kromatogram hasil elusi untuk replikasi senyawa hasil

sintesis ... 51 Gambar 18. Kromatogram GC dari senyawa hasil sintesis ... 52 Gambar 19. Spektra massa senyawa hasil sintesis pada peak nomor empat

dengan waktu retensi 26,384 menit ... 53 Gambar 20. Spektra massa senyawa hasil sintesis pada peak nomor satu

dengan waktu retensi 10,254 menit ... 55 Gambar 21. Spektra massa senyawa hasil sintesis pada peak nomor dua

xvi

Gambar 22. Spektra inframerah senyawa hasil sintesis (pellet KBr) ... 56 Gambar 23. Resonansi yang terjadi pada senyawa hasil sintesis antara

gugus karbonil dan ikatan rangkap pada alkena ... 57 Gambar 24. Bentuk tautomerisasi dari sikloheksana-1,3-dion ... 58 Gambar 25. Spektra inframerah sikloheksana-1,3-dion (pellet KBr) ... 58 Gambar 26. Spektra inframerah 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida

(pellet KBr) ... 59 Gambar 27. Hasil overlay (tumpang-tindih) spektra inframerah starting

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

halaman Lampiran 1. Data Penimbangan Starting Material dan Perhitungan

Massa Senyawa Hasil Sintesis Secara Teoritis ... 67

Lampiran 2. Data Penimbangan Crude Product dan Perhitungan Rendemen Senyawa Hasil Sintesis ... 69

Lampiran 3. Dokumentasi Proses Sintesis Senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion ... 70

Lampiran 4. Perhitungan Indeks Polaritas Fase Gerak ... 72

Lampiran 5. Perhitungan Nilai Rf Senyawa Hasil Sintesis ... 73

Lampiran 6. Perhitungan Nilai Rf Senyawa Hasil Replikasi ... 74

Lampiran 7. Kondisi Alat Kromatografi Gas – Spektrometer Massa (GC-MS) ... 75

Lampiran 8. Kromatogram GC Senyawa Hasil Sintesis ... 76

Lampiran 9. Spektra Massa Senyawa Target ... 77

Lampiran 10. Usulan Mekanisme Fragmentasi Dari Senyawa Target ... 78

Lampiran 11. Usulan Mekanisme Fragmentasi Dari Senyawa Target (lanjutan)... 79

Lampiran 12. Spektra Inframerah Senyawa Hasil Sintesis (pellet KBr) ... 80

Lampiran 13. Spektra Inframerah Sikloheksana-1,3-dion (pellet KBr)... 81

Lampiran 14. Spektra Inframerah 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida (pellet KBr) ... 82

xviii

Lampiran 16. Data Uji Titik Lebur Sikloheksana-1,3-dion ... 84 Lampiran 17. Data Uji Titik Lebur 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida ... 85

xix INTISARI

Senyawa analog kurkumin dalam bentuk enon dan dienon aromatis diketahui memiliki aktivitas sebagai inhibitor NF-κB. Dalam penelitian ini akan disintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang merupakan analog kurkumin dan diperkirakan mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental deskriptif non-analitik yang dilakukan berdasarkan kondensasi aldol silang dengan mereaksikan 4 mmol sikloheksana-1,3-dion dan 4 mmol 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida menggunakan metode solid phase reaction. Analisis senyawa hasil sintesis dilakukan dengan uji kualitatif: pemeriksaan organoleptis, kelarutan, titik lebur, KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak n-heksan:etil asetat (3:2), kromatografi gas, dan elusidasi struktur dengan spektroskopi massa dan inframerah. Sedangkan uji kuantitatif dilakukan dengan perhitungan rendemen.

Berdasarkan hasil perhitungan secara komputasional, diketahui bahwa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion mempunyai aktivitas yang lebih baik dibandingkan kurkumin dengan skor PLANTSPLP sebesar -60.8375. Senyawa hasil sintesis berupa serbuk kering berwarna kuning, bau khas, dan rendemen sebesar 13,340%; 13,311%; dan 13,166%, dengan profil kelarutan larut dalam NaOH 3N. Hasil uji KLT menunjukkan adanya senyawa baru dengan Rf 0,230. Kromatografi gas menunjukkan kemurnian senyawa hasil sintesis sebesar 34,96% dengan jarak lebur sebesar 181,97–193,04oC. Hasil elusidasi struktur dengan spektroskopi massa dan inframerah memperkuat bukti bahwa senyawa hasil sintesis adalah 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion. Kata kunci : 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion,

solid phase reaction, inhibitor NF-κB, reaksi kondensasi aldol silang

xx ABSTRACT

Analog of curcumin in forms of enone and dienone aromatic is known for their activity as an NF-κB inhibitor. In this study, will be synthesize 2-(4’ -hydroxy-3’-methoxybenzylidene) cyclohexane-1,3-dione as an analog that predicted has an activity as an NF-κB inhibitor.

It was a non-experimental descriptive non-analytical research which conducted based on the crossed aldol condensation reaction by reacting 4 mmole of cyclohexane-1,3-dione and 4 mmole of 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde with pottasium hydroxide as the catalyst using solid phase reaction method. This research applied qualitative and quantitative tests. The qualitative tests consisted of organoleptic, solubility, melting point, TLC (with silica gel GF254 as stationary phase and n-hexane:ethyl acetate (3:2) as mobile phase), and structure elucidation with infrared and mass spectroscopy. Quantitative test involved the calculation of the yield.

Based on computational analysis, 2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzylidene) cyclohexane-1,3-dione showed a better interaction with NF-κB protein with PLANTSPLP score was -60.8375. The outcome of the reaction was yellow colored powder and specified smell (odor). The yield values were 13.340%; 13.311%; and 13.166%. Its soluble in sodium hydroxide 3N. TLC test shown the existence of new chemical substance with Rf value of 0.230. Gas chromatography showed 34.96% purity. The melting point range were 181.97–193.04o_{C. The results of structure} elucidation by infrared and mass spectroscopy tests indicated the compound was 2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzilidene) cyclohexane-1,3-dione.

Key words : 2-(4’-hydroxy-3’-methoxybenzilidene) cyclohexane-1,3-dione, solid phase reaction, NF-κB inhibitor, crossed aldol condensation reaction

1 BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penyakit kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di dunia, terutama di negara berkembang. WHO melaporkan sekitar 7,6 juta (13%) orang meninggal akibat kanker pada tahun 2008. Apabila tidak dilakukan penanganan lebih lanjut terhadap penyakit ini, WHO memperkirakan bahwa kematian akibat kanker akan terus meningkat hingga 13,1 juta orang pada tahun 2030 (Anonim, 2012). Kanker yang merupakan akibat dari adanya abnormalitas pembelahan (proliferasi) sel yang dapat menginvasi jaringan lain dan menyebar ke organ lainnya, bahkan dapat menimbulkan kematian. Pada sel tumor, proliferasi yang sangat cepat disebabkan oleh adanya over-ekspresi dari protein NF-κB (Lee, Jeon, Kim, dan Song, 2007).

Oleh karena itu, pada penelitian ini akan disintesis senyawa 2-(4’

-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang merupakan senyawa analog kurkumin. Senyawa analog kurkumin yang akan disintesis merupakan senyawa golongan enon, dimana diketahui bahwa senyawa enon analog kurkumin dapat menghambat ekspresi protein NF-κB (Weber et al., 2006). Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, diketahui bahwa gugusan α,β-unsaturated karbonil pada senyawa kurkumin dapat mendeaktivasi protein NF-κB yang menyebabkan sel kanker tidak dapat melakukan proliferasi dan akan mati. Terjadinya kematian pada sel kanker diperantarai oleh adanya reaksi antara gugusan α,β-unsaturated karbonil

dan residu sistein pada protein NF-κB yang menyebabkan protein NF-κB menjadi inaktif (Surh, 2008).

Senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang merupakan senyawa golongan α,β-unsaturated karbonil dapat dihasilkan dengan reaksi kondensasi aldol silang antara senyawa keton dan aldehida dengan adanya katalis basa kuat. Oleh karena itu senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dapat disintesis dengan mereaksikan sikloheksana-1,3-dion (senyawa keton dengan hidrogen alfa) dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida (senyawa aldehida yang tidak mempunyai hidrogen alfa) dengan menggunakan katalis basa kuat berupa kalium hidroksida (KOH) (Bhagat, Sharma dan Chakraborti, 2006).

Penggunaan katalis basa KOH dimaksudkan untuk meningkatkan kecepatan reaksi kondensasi dikarenakan basa KOH akan lebih cepat mengambil Hα dari sikloheksana-1,3-dion sehingga ion enolat sikloheksana-1,3-dion akan lebih cepat dan lebih banyak terbentuk. Dengan semakin cepat dan banyak ion enolat sikloheksana-1,3-dion yang dihasilkan maka akan semakin mudah bereaksi dengan C karbonil 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida sehingga rendemen senyawa 2-(4’ -hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang dihasilkan akan semakin banyak.

Sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dilakukan dengan menggunakan metode solid phase reaction yang diperkenalkan oleh Palleros pada tahun 2004. Metode ini seringkali disebut sebagai

dengan menggunakan pelarut dalam jumlah yang tidak banyak, sehingga jumlah bahan berbahaya atau limbah yang dihasilkan dapat diminimalisir. Penggunaan metode solid phase reaction pada sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion diharapkan memberikan keuntungan, antara lain: pengerjaan proses sintesis yang lebih mudah dan sederhana, rendemen yang besar, reaksi samping dapat diminimalisir dan ramah lingkungan (Palleros, 2004).

1. Rumusan masalah

a. Apakah senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion mempunyai aktivitas sebagai inhibitor NF-κB secara insilico?

b. Apakah senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dapat disintesis dari sikloheksana-1,3-sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida (KOH) menggunakan metode solid phase reaction?

2. Keaslian penelitian

Sejauh penelusuran yang telah dilakukan oleh peneliti, penelitian yang

berjudul “desain dan sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang berpotensi sebagai senyawa antikanker dengan menghambat protein NF-κB menggunakan metode solid phase reaction” belum pernah dilakukan. Senyawa sejenis yang pernah disintesis adalah senyawa 2-benzilidensikloheksana-1,3-dion menggunakan katalis natrium hidroksida (Istyastono, Yuniarti, dan Jumina, 2009), senyawa 2-(4’-klorobenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dengan katalis kalium hidroksida (Christy, 2010) dan

senyawa 2-(4’-hidroksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion menggunakan katalis kalium hidroksida (Setiawati, 2012).

3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis

Memberikan informasi terkait dengan reaksi kondensasi aldol silang pada sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dari sikloheksana-sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida menggunakan metode solid phase reaction.

b. Manfaat metodologi

Memberikan informasi terkait tata cara dan kondisi dari sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dari sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida (KOH) menggunakan metode solid phase reaction.

c. Manfaat praktis

Memberikan informasi mengenai penggunaan metode yang ramah lingkungan (Green Chemistry) untuk melakukan sintesis senyawa 2-(4’ -hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian yang dilakukan ini bertujuan untuk:

1. Membuktikan senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion mempunyai aktivitas sebagai inhibitor NF-κB secara insilico.

2. Menghasilkan senyawa baru, yakni 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang dapat disintesis dari sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida menggunakan metode solid phase reaction.

6 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kanker

Kanker adalah istilah umum untuk pertumbuhan sel yang tidak normal, yaitu tumbuh sangat cepat, tidak terkontrol dan tidak berirama yang dapat menyusup ke jaringan tubuh normal dan menekan jaringan tubuh normal sehingga mempengaruhi fungsi tubuh. Badan Kesehatan Dunia (WHO) melaporkan bahwa 7,6 juta orang di dunia meninggal akibat kanker pada tahun 2008. Dari data tersebut, diperkirakan bahwa kematian akibat kanker akan terus meningkat hingga 13,1 juta orang pada tahun 2030 (Anonim, 2012). Menurut data Departemen Kesehatan Republik Indonesia tahun 2003, kanker merupakan penyebab kematian nomor enam di Indonesia dan diperkirakan terdapat 100 penderita kanker baru untuk setiap 100.000 penduduk per tahunnya (Anonim, 2003).

Gambar 1. Peranan NF-κB dalam memicu terjadinya kanker (Paul, 2005).

Dewasa ini, penelitian yang ada menunjukkan bahwa faktor transkripsi NF-κB memegang peranan penting dalam mengontrol proliferasi dan kelangsungan hidup sel kanker. Pada sel kanker, NF-κB mengalami mutasi sehingga tetap aktif

walaupun dalam keadaan sudah tidak dibutuhkan. Kondisi NF-κB yang selalu aktif menghasilkan ekspresi gen yang membuat sel selalu membelah dan melindungi sel dari kondisi yang menyebabkan matinya sel oleh peristiwa apoptosis(Escárcega, Fuentes, Garcia, Gatica, dan Zamora, 2007).

Temuan tersebut tentunya memberikan petunjuk penting dalam strategi penemuan obat antikanker baru, dimana target yang dituju adalah dengan menghambat NF-κB (Paul, 2005). Beberapa contoh obat yang diketahui dapat menghambat NF-κBadalah denosumab. Diketahui bahwa penggunaan denosumab dapat menghambat RANKL yang menyebabkan terjadinya inaktivasi dari NF-κB (Hamdy, 2008). Selain denosumab, contoh lainnya adalah disulfiram dan ditiokarbamat. Keduanya diketahui aktif menghambat NF-κB melalui mekanisme inhibisi proteosom (Cvek dan Dvorak, 2007).

Kurkumin merupakan salah satu senyawa alam yang diketahui mempunyai aktivitas antikanker sebagai inhibitor NF-κB (Weber et al., 2006). Dari penelitian yang telah dilakukannya, Weber et al. (2006) menyatakan bahwa adanya gugusan α,β-unsaturated karbonil (enon) pada kurkumin diperkirakan dapat mendeaktivasi NF-κB yang menyebabkan sel kanker tidak dapat melakukan proliferasi dan akan mati. Terjadinya kematian pada sel kanker diperantarai oleh adanya reaksi antara gugusan α,β-unsaturated karbonil dan residu sistein pada NF-κB yang menyebabkan protein NF-κB menjadi inaktif (Surh, 2008).

B. Penapisan Virtual Berbasis Struktur

Penambatan molekul atau molecular docking adalah suatu teknik yang digunakan untuk mempelajari interaksi yang terjadi dari suatu kompleks molekul. Molecular docking dapat digunakan untuk memprediksikan orientasi dari suatu molekul ke molekul yang lain ketika berikatan membentuk kompleks yang stabil. Terdapat dua aspek penting dalam molecular docking, yaitu fungsi scoring dan penggunaan algoritma (Leach, 2001).

Fungsi scoring dapat memperkirakan afinitas ikatan antara makromolekul dengan ligan (molekul kecil yang mempunyai afinitas terhadap makromolekul). Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori, salah satunya seperti teori energi bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam menentukan konformasi (docking pose) yang paling stabil (favourable) dari pembentukan kompleks (Leach, 2001).

Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking, yaitu:

1. docking protein-protein, 2. docking ligan-protein, dan 3. docking ligan-DNA.

Saat ini molecular docking banyak diaplikasikan di dalam pengembangan obat baru untuk memprediksikan orientasi ikatan antara kandidat molekul obat dengan protein target sehingga dapat diketahui afinitas dari molekul obat tersebut. Untuk

melakukan molecular docking, hal pertama yang dibutuhkan adalah struktur tiga dimensi dari ligan (senyawa obat) dan protein target. Struktur tiga dimensi ligan dapat dimodelkan dengan menggunakan teknik molecular modelling, sedangkan struktur tiga dimensi protein target dapat ditentukan secara empiris dengan menggunakan teknik NMR spectroscopy dan X-ray crystallography yang terdapat pada database Protein Data Bank dan secara in silico dengan teknik homology modelling (Larson, 2006).

PLANTS (Protein-Ligand ANT System) merupakan aplikasi molecular docking yang telah di-benchmark secara internal di grup penelitian Kimia Medisinal, Vrije Universiteit Amsterdam dengan GOLD (aplikasi docking berbayar yang rutin dipakai di laboratorium kimia medisinal di Eropa dan USA). Hasil benchmark menunjukkan bahwa PLANTS mempunyai kualitas yang setara dengan GOLD untuk protokol penapisan secara virtual pada protein adrenergik–β2 (ADRB2), bahkan lebih baik dari GOLD untuk protokol penapisan secara virtual untuk nikotinik asetilkolin binding protein (nAchBP) (Istyastono, 2010).

Docking menggunakan PLANTS didasarkan pada algoritma optimasi stokastik yang disebut optimasi koloni semut (ACO=Ant Colony Optimization). ACO terinspirasi dari perilaku semut yang menemukan jalan terpendek antara sarang dan sumber makanan. Semut menggunakan komunikasi secara tidak langsung dalam bentuk jalur feromon yang digunakan untuk menandai jalur antara sarang dan sumber makanan. Dalam kasus docking protein-ligan, digunakan

“koloni semut buatan” untuk menemukan energi minimum dari konformasi ligan pada situs pengikatan. “Semut buatan” ini akan meniru perilaku semut yang akan

menandai konformasi ligan yang mempunyai energi rendah melalui jalur feromon. Informasi jejak feromon buatan kemudian akan diubah dalam pengulangan (iterasi) berikutnya dan digunakan untuk menghasilkan konformasi dengan energi rendah dengan probabilitas yang lebih tinggi (Korb et al., 2006).

Proses penapisan virtual yang berbasiskan struktur dimulai dengan melakukan validasi dasar terhadap protokol yang akan digunakan (Korb et al., 2006). Dalam melakukan validasi tersebut, digunakan RMSD (Root Mean Square Deviation) sebagai parameter yang mengukur kemampuan aplikasi docking untuk menambatkan ulang ligan asli dari struktur kristal yang ada. Suatu protokol dikatakan valid apabila pose hasil docking dibandingkan dengan pose asli dari struktur kristal memberikan nilai RMSD kurang dari dari 2 Å (1 Å = 10-10 m) (Istyastono, 2010).

Kelebihan PLANTS selain gratis adalah sederhana dan mudah (simulasi dilakukan dengan menggunakan single line command). Namun, PLANTS tidak menyediakan fungsi preparasi protein, ligan maupun visualisasi hasil docking. PLANTS juga tidak mempunyai versi Windows, sehingga diperlukan sistem operasi LINUX untuk menjalankan aplikasi PLANTS (Istyastono, 2010).

C. Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

Sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion akan menggunakan metode solid phase reaction (Palleros, 2004). Metode

ini seringkali disebut sebagai aplikasi dari “Green Chemistry”, dimana pengerjaan suatu reaksi kimia dilakukan dengan menggunakan pelarut dalam jumlah yang

tidak banyak, sehingga jumlah bahan berbahaya atau limbah yang dihasilkan dapat diminimalisir. Dengan menggunakan metode solid phase reaction pada sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion, diharapkan metode ini dapat memberikan beberapa keuntungan, antara lain: pengerjaan proses sintesis yang lebih mudah dan sederhana, rendemen yang besar, reaksi samping dapat diminimalisir dan ramah lingkungan. Untuk memperoleh produk hasil reaksi kondensasi aldol silang yang merupakan senyawa kalkon dapat dilakukan dengan mereaksikan starting material dan katalis yang kemudian digerus di dalam mortir. Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan oleh Palleros (2004), diketahui bahwa metode solid phase reaction memberikan rendemen yang lebih banyak dibandingkan metode konvensional, dimana reaksi samping akibat interaksi dengan pelarut dapat diminimalisir (Palleros, 2004).

Sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang merupakan senyawa golongan α,β-unsaturated karbonil dapat dijelaskan dengan metode diskoneksitas (gambar 2). Desain sintesis dengan metode diskoneksitas menunjukkan bahwa senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dapat disintesis menggunakan starting material berupa sikloheksana-1,3-dion sebagai senyawa keton yang mempunyai hidrogen alfa (Hα) dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida sebagai aldehida yang mempunyai atom C karbonil dengan katalis basa kuat. Sikloheksana-1,3-dion atau dihidroresorsinol, mempunyai rumus molekul C6H8O2 dengan berat molekul 112,12 g/mol. Sikloheksana-1,3-dion murni berbentuk serbuk kristalin, mempunyai titik leleh 103-105oC. Senyawa ini larut dalam air dan pelarut lainnya, seperti alkohol,

kloroform, aseton; sedikit larut dalam eter dan petroleum eter (Anonim, 2001). Sedangkan senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang dikenal dengan nama dagangnya, yaitu vanilin mempunyai rumus molekul C8H8O3, mempunyai berat molekul 152,15 g/mol. Vanilin murni berupa kristal jarum berwarna putih atau krem (mengkilat) dengan karakteristik aroma vanila dan rasa manis. Vanilin larut dalam aseton, larutan alkali hidroksida, kloroform, eter, metanol, dan minyak. Vanilin dapat teroksidasi pada kondisi udara yang lembab dan paparan sinar matahari secara langsung. Berat jenis vanilin adalah 1,056 g/mL dengan titik leleh 80-81oC dan titik didih pada 285oC. Vanilin banyak digunakan sebagai bahan aroma makanan dan minuman karena mempunyai bau yang harum. Selain itu, vanilin juga banyak digunakan sebagai pemberi aroma dalam industri parfum. Di bidang kimia analitik, vanilin dapat digunakan sebagai pereaksi (Rowe, Shesky dan Quinn, 2009).

H₃CO

HO

O

O

H₃CO

HO H O

+

O O

2-(4'-hidroksi-3'-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida sikloheksana-1,3-dion



Gambar 2. Analisis diskoneksi untuk senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

Katalis merupakan suatu zat yang dapat mempercepat suatu reaksi kimia, namun zat tersebut, secara kimiawi tidak mengalami perubahan yang permanen. Penambahan katalis dalam suatu reaksi akan memberikan perubahan yang berarti pada energi aktivasinya. Kehadiran suatu katalis dalam suatu reaksi dapat mengubah ataupun mempercepat tahapan reaksi yang ada, atau lazimnya, menyediakan suatu rute alternatif bagi reaksi. Rute alternatif yang diciptakan oleh

katalis mempunyai energi aktivasi yang rendah (Oxtoby, Gillis dan Nachtrieb, 2001).

Energi aktivasi didefinisikan sebagai energi minimum yang harus dilewati agar suatu reaksi kimia tertentu dapat terjadi. Energi aktivasi seringkali dilambangkan sebagai Ea, dengan satuan kilo joule per mol (kJ/mol). Kadangkala agar suatu reaksi kimia dapat berjalan, dibutuhkan energi aktivasi yang besar. Hal ini dapat diatasi dengan penambahan suatu katalis. Dengan adanya katalis, reaksi dapat berlangsung dengan sumber energi yang lebih rendah (Tro, 2011). Dalam suatu reaksi kondensasi aldol, lazimnya katalis yang digunakan merupakan suatu basa, seperti natrium hidroksida (NaOH), kalium hidroksida (KOH) dan litium hidroksida (LiOH.H2O) (Bhagat, Sharma and Chakraborti, 2006).

Dalam penelitian ini, katalis yang digunakan adalah kalium hidroksida (KOH). Kalium hidroksida merupakan suatu basa kuat yang mempunyai rumus molekul KOH dengan berat molekul 56,11 g/mol, berbentuk batang, pellet, atau bongkahan, dengan warna putih, dan bersifat higroskopis. Senyawa tersebut larut dalam satu bagian air, 3 bagian etanol, dan sangat mudah larut dalam etanol mutlak P mendidih (Dirjen POM RI, 1979). KOH merupakan basa yang lebih kuat dibandingkan NaOH dan LiOH. Hal ini dikarenakan kalium (K) mempunyai energi ionisasi yang lebih kecil dibandingkan natrium (Na) dan litium (Li). Semakin kecil energi ionisasinya, maka semakin mudah pula senyawa tersebut untuk membentuk ionnya dan semakin kuat pula basanya. Penggunaan katalis basa KOH yang mempunyai sifat kebasaan lebih kuat dibandingkan NaOH dan LiOH dimaksudkan untuk meningkatkan kecepatan reaksi kondensasi dikarenakan basa KOH akan

lebih cepat mengambil Hα dari sikloheksana-1,3-dion, sehingga ion enolat sikloheksana-1,3-dion akan lebih cepat dan lebih banyak terbentuk. Dengan semakin cepat dan banyak ion enolat sikloheksana-1,3-dion yang dihasilkan, maka akan semakin mudah bereaksi dengan C karbonil pada 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida sehingga rendemen senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang dihasilkan akan semakin banyak.

D. Metode Pemurnian Dan Pemeriksaan Kemurnian Senyawa Hasil Sintesis 1. Rekristalisasi

Rekristalisasi merupakan suatu metode yang tepat untuk pemurnian zat padat. Metode ini didasarkan atas perbedaan antara kelarutan zat yang diinginkan dari kotorannya. Metode yang akan digunakan untuk memurnikan suatu zat harus disesuaikan dengan kondisi atau sifat zat yang akan direkristalisasi (Bresnick, 2004). Berikut ini beberapa metode rekristalisasi: a. Mengkristalkan kembali secara langsung dari cairan pelarut. Metode ini

dilakukan dengan melarutkan zat ke dalam suatu pelarut, kemudian disaring dan dikristalkan kembali dengan pendinginan atau dengan destilasi pelarut tersebut.

b. Mengkristalkan kembali dengan asam atau basa. Prinsip metode ini adalah dengan melakukan pendesakan kristal dengan menetralkan pelarut. Senyawa yang sesuai dengan metode ini adalah senyawa-senyawa yang mempunyai sifat asam atau basa. Senyawa yang bersifat asam (seperti fenol) dilarutkan dalam natrium hidroksida atau amonium hidroksida encer,

kemudian direkristalisasi dengan mengasamkan pelarut, sedangkan untuk senyawa basa (seperti amin) dilarutkan dalam asam klorida atau asam sulfat kemudian direkristalisasi dengan membasakan pelarut.

c. Mengkristalkan kembali secara presipitasi dengan pelarut kedua. Metode ini dilakukan dengan melarutkan material dalam suatu pelarut, kemudian dipilih pelarut kedua yang bercampur sempurna dengan pelarut pertama tetapi senyawa yang dimurnikan tidak atau hampir tidak larut pada pelarut kedua. Penambahan pelarut kedua akan membuat zat yang semula larut pada pelarut pertama menjadi mengendap/mengkristal (Reksohadiprodjo, 1996).

Syarat yang harus dipenuhi oleh sebuah pelarut agar diperoleh hasil yang optimal dalam proses rekristalisasi, antara lain: (1) dapat melarutkan banyak pada suhu tinggi, dapat sedikit larut pada suhu rendah, (2) harus dapat melarutkan pengotor dengan segera pada suhu rendah, (3) dapat menghasilkan bentuk kristal yang baik dari senyawa yang akan dimurnikan, serta mudah dipisahkan (titik didih yang relatif rendah), (4) pelarut yang digunakan dalam proses rekristalisasi tidak boleh bereaksi dengan senyawa yang akan dimurnikan (Reksohadiprodjo, 1996).

2. Pemeriksaan organoleptis

Pemeriksaan organoleptis merupakan salah satu paparan mengenai sifat dari zat yang meliputi wujud, rupa, warna, rasa dan bau. Dengan adanya pemeriksaan organoleptis, maka dapat diketahui ciri-ciri fisik dari senyawa baru. Pemeriksaan ini penting dijadikan sebagai petunjuk awal dalam melakukan

pemeriksaan senyawa hasil sintesis yang dilakukan dengan membandingkan dengan standar dan diharapkan sesuai dengan yang tercantum dalam pemerian standar (Bresnick, 2004).

Pernyataan dalam pemeriksaan organoleptis tidak dapat digunakan sepenuhnya untuk mengenali suatu senyawa baru, namun secara tak langsung pemeriksaan ini dapat memberikan penilaian pendahuluan terhadap mutu zat yang bersangkutan (Dirjen POM RI, 1995).

3. Kelarutan

Pemeriksaan kelarutan senyawa dilakukan untuk mengetahui sifat fisik suatu zat. Selain itu uji kelarutan juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi atau mendeterminasi kemurnian dari senyawa tersebut dengan membandingkannya dengan standar (Jenkins, Knevel dan Digangi, 1965).

Kelarutan tidak hanya dijadikan standar atau uji kemurnian dari suatu zat, tetapi dimaksudkan sebagai informasi dalam penggunaan, pengolahan, dan peracikan bahan. Pernyataan bagian dalam kelarutan berarti 1 gram zat padat atau 1 mL zat cair dalam sejumlah mL pelarut (Anonim, 2001).

Tabel I. Istilah kelarutan zat menurut Farmakope Indonesia IV

Istilah kelarutan

Jumlah bagian pelarut yang diperlukan untuk melarutkan 1

bagian zat

Sangat mudah larut Kurang dari 1

Mudah larut 1 sampai 10

Larut 10 sampai 30

Agak sukar larut 30 sampai 100

Sukar larut 100 sampai 1.000

Sangat sukar larut 1.000 sampai 10.000 Praktis tidak larut Lebih dari 10.000

4. Pemeriksaan titik lebur

Pemeriksaan titik lebur adalah suatu aspek penting yang harus dilakukan dalam penelitian sintesis suatu senyawa. Hal ini penting dilakukan karena pemeriksaan titik lebur senyawa dapat memberikan informasi mengenai kemurnian dari suatu senyawa yang telah disintesis. Rentang titik lebur yang sempit merupakan kriteria kemurnian suatu senyawa. Umumnya suatu senyawa dikatakan murni apabila mempunyai rentang titik lebur yang tidak melebihi 2o_C. Untuk rentangan lebih besar dari harga ini dapat dikatakan senyawa kurang murni (MacKenzie, 1967).

Titik lebur merupakan suatu perisitiwa perubahan fisika akibat adanya suhu, yang menyebabkan padatan mulai berubah menjadi cairan pada tekanan satu atmosfer. Jika suhu dinaikkan, maka akan terjadi penyerapan energi oleh molekul. Bila energi yang diserap cukup besar, maka akan terjadi vibrasi dan rotasi dari molekul tersebut. Apabila suhu dinaikkan lagi, maka molekul akan rusak dan berubah menjadi cairan. Dalam wujud cairan, molekul tetap terikat satu dan lainnya, namun sudah tidak teratur lagi susunannya (Bradstatter, 1971).

5. Kromatografi lapis tipis

Selain kromatografi kertas dan elektroforesis, kromatografi lapis tipis (KLT) juga merupakan salah bentuk bentuk kromatografi planar. Berbeda dengan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau dikemas di dalamnya, pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya merupakan lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang berfungsi sebagai penyangga lapisan tersebut. Meskipun tampak berbeda dengan kromatografi

kolom, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kromatografi lapis tipis merupakan suatu teknik pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). Fase diam pada KLT dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penjerab atau berfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair. Pada penggunaannya, silika gel (asam silika), alumina (aluminium oksida), selulosa, dan kiselgur (tanah diatom) biasa digunakan sebagai fase diamnya. Pemilihan fase gerak pada KLT dapat didasarkan pada pustaka yang ada atau dari hasil percobaan dengan variasi tingkat kepolaran (Harwood dan Moody, 1989).

Pada umumnya, kromatografi lapis tipis secara luas digunakan untuk dua tujuan, pertama sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, dan preparatif; kedua digunakan untuk menentukan kondisi yang sesuai untuk pemisahan pada kromatografi kolom ataupun kromatografi cair kinerja tinggi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kromatografi Lapis Tipis dapat digunakan untuk analisis kualitatif terhadap suatu senyawa. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Nilai Rf (Retardation factor) merupakan nilai diperoleh dengan membandingkan jarak yang ditempuh oleh bercak senyawa yang diidentifikasi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut (jarak pengembang). Dua senyawa dikatakan identik apabila mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama (Ettre, 1993).

E. Elusidasi Struktur

Elusidasi struktur terhadap senyawa hasil sintesis merupakan suatu tahapan analisis yang penting untuk dilakukan. Hal ini dikarenakan struktur dari senyawa hasil sintesis belum dapat diketahui secara pasti. Untuk menentukan strukturnya, dapat digunakan spektroskopi. Berbagai data yang diperoleh dari spektroskopi, jika digabungkan dengan sifat-sifat kimia dan fisika dari suatu senyawa, maka dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan menentukan struktur suatu senyawa.

1. Spektrofotometri inframerah (IR)

Spektrofotometri inframerah merupakan salah satu jenis spektroskopi yang digunakan untuk mengidentifikasi jenis ikatan yang terdapat dalam suatu senyawa. Bila radiasi elektromagnetik yang berkisar antara 400 cm-1 _{dan 4.000} cm-1 (2.500 dan 20.000 nm) dilewatkan pada suatu sampel dan diserap oleh ikatan-ikatan molekul di dalam sampel, maka molekul tersebut dapat mengalami peregangan ataupun penekukan ikatan (Watson, 2009).

Semua ikatan kimia mempunyai panjang gelombang radiasi yang berbeda-beda untuk menghasilkan ikatan yang meregang ataupun menekuk. Bila frekuensi energi elektromagnetik inframerah yang dilewatkan pada suatu molekul sama dengan frekuensi meregang atau menekuk ikatan, maka energi tersebut akan diserap oleh molekul tersebut. Serapan inilah yang kemudian dapat direkam oleh detektor dan diubah menjadi pita serapan pada bilangan gelombang tertentu (Atkins, Jones, dan Loretta, 2010).

2. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS)

Kromatografi gas merupakan suatu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan dan mendeteksi senyawa-senyawa yang mudah menguap dalam suatu campuran. Prinsip pemisahannya didasarkan pada solut-solut yang mudah menguap (dan stabil terhadap panas) bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).

Spektroskopi massa merupakan salah satu jenis spektroskopi yang digunakan untuk menentukan massa dan juga berat molekul suatu senyawa. Untuk mendapatkan informasi yang mungkin mengenai struktur suatu senyawa, dapat dilakukan dengan mengukur massa dari fragmen-fragmen yang terbentuk ketika molekul mengalami pemecahan (Watson, 2009).

Pada saat sebuah molekul organik ditabrak dengan elektron berenergi tinggi, menyebabkan terjadinya pelepasan sebuah elektron dari molekul tersebut, sehingga terbentuk suatu ion molekul. Ion yang dihasilkan tersebut bersifat tak stabil dan akan pecah menjadi fragmen tertentu, baik dalam bentuk radikal bebas maupun ion. Dalam sebuah spektrometri massa yang khas, fragmen yang bermuatan positif ini akan dideteksi dan dilaporkan dalam bentuk spektra massa. Spektra massa adalah alur kelimpahan (jumlah relatif fragmen bermuatan positif berlainan) versus nisbah massa/muatan (m/e atau m/z) dari fragmen-fragmen yang ada (Watson, 2009).

Apabila metode kromatografi gas digabungkan dengan spektroskopi massa (GC-MS), maka akan terjadi pemisahan oleh kromatografi gas terlebih

dahulu yang dilanjutkan proses identifikasi oleh spektroskopi massa. GC-MS merupakan metode yang sangat peka dan spesifik dalam penentuan hampir semua jenis analit, dengan batas deteksi yang rendah, dan memberikan informasi penting berupa spektra massa dari suatu senyawa organik (Tureček dan McLafferty, 1993).

F. Landasan Teori

Kurkumin yang merupakan senyawa golongan enon diketahui mempunyai aktivitas sebagai inhibitor NF-κB. Senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion merupakan salah satu analog kurkumin yang mempunyai gugus enon diperkirakan mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB secara insilico.

Reaksi kondensasi aldol silang merupakan suatu reaksi dimana sebuah aldehid ataupun keton yang sedikitnya mempunyai satu hidrogen alfa dapat mengalami reaksi kondensasi dengan senyawa karbonil lainnya pada suasana basa. Sikloheksana-1,3-dion merupakan senyawaan keton yang mempunyai hidrogen alfa, yang bila direaksikan dengan basa kalium hidroksida (KOH) akan menghasilkan ion enolat. Ion enolat ini akan bertindak sebagai nukleofil yang akan menyerang atom C karbonil pada 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang merupakan senyawaan aldehida dengan muatan positif. Produk akhir dari reaksi tersebut akan menghasilkan senyawa α,β-unsaturated karbonil, yaitu 2-(4’ -hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion.

Reaksi sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dilakukan dengan menggunakan katalis basa kuat (KOH). Penggunaan katalis basa kuat dimaksudkan agar proses pelepasan atom H pada posisi Cα pada sikloheksana-1,3-dion akan berjalan dengan lebih cepat, sehingga ion enolat akan tersedia dalam jumlah yang melimpah. Dengan demikian, rendemen dari senyawa hasil sintesis akan maksimal.

G. Hipotesis

1. Senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion diperkirakan mempunyai aktivitas sebagai inhibitor NF-κB secara insilico. 2. Senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dapat

disintesis dari sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida (KOH) menggunakan metode solid phase reaction.

23 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang berjudul “Desain dan sintesis senyawa 2-(4’ -hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion yang berpotensi sebagai senyawa antikanker dengan menghambat protein NF-κB menggunakan metode solid phase reaction” merupakan penelitian non-eksperimental deskriptif non-analitik karena pada penelitian ini tidak diberikan perlakuan pada subjek uji dan hanya dipaparkan peristiwa yang terjadi sehingga tidak terdapat hubungan sebab akibat di dalamnya.

B. Definisi Operasional

1. PLANTSPLPscore merupakan nilai atau output yang dihasilkan oleh PLANTS

setelah dilakukan proses docking menggunakan protokol yang telah ditentukan. 2. Starting material merupakan bahan awal yang digunakan dalam proses sintesis

2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion. Starting material yang digunakan, yaitu sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida.

3. Katalisator adalah senyawa yang digunakan dalam reaksi untuk mempercepat terjadinya reaksi antara starting material. Katalisator yang digunakan dalam penelitian ini adalah kalium hidroksida (KOH).

4. Molekul target merupakan senyawa hasil sintesis yang diharapkan terbentuk dari hasil reaksi. Molekul target dalam penelitian ini adalah 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion.

5. Rendemen senyawa hasil sintesis merupakan persentase perbandingan antara jumlah senyawa murni yang diperoleh dari hasil sintesis dibandingkan dengan jumlah senyawa yang diperoleh secara teoritis. Dalam penelitian ini, rendemen senyawa hasil sintesis adalah rendemen senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion.

C. Bahan Penelitian

Struktur protein NF-κB (www.rcsb.org; kode PDB: 4G3G (4G3G.pdb)), sikloheksana-1,3-dion (p.a, Aldrich), 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida (p.a., Merck), kalium hidroksida (p.a., Merck), asam klorida, n-heksan (p.a., Merck), etil asetat (p.a., Merck), aquades (Laboratorium Kimia Organik Universitas Sanata Dharma), kloroform (p.a., Merck), etanol (p.a., Merck), dan silika gel GF254 (Merck).

D. Alat Penelitian

Perangkat lunak digunakan berupa PLANTS (www.tcd.uni-konstanz.de/research/plants.php); MarvinSketch 5.11.5 (2012), ChemAxon (www.chemaxon.com); YASARA View 12.8.21 (www.yasara.org); dan PyMol versi 0.99 (Delano Scientific LLC, USA). Docking dilakukan dengan menggunakan

perangkat keras berupa notebook ASUS A43SA-VX071D dengan prosesor Intel Core i5-2430M (2.4 GHz), RAM 4GB, dan sistem operasi Linux Ubuntu 12.04.

Alat-alat yang digunakan untuk yang digunakan untuk melakukan sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion meliputi neraca analitik (Mextler PM 100), hot plate (Herdolph MR 2002), desikator, alat pengukur titik lebur/melting point tester (MP70, Mettler Tolledo), alat-alat gelas, termometer, baskom, kertas saring, chamber kaca, pipa kapiler, lampu UV dengan 254 nm, spektrometer IR (IR Shimadzu Prestige-21), dan kromatografi gas-spektrometer massa (Shimadzu QP 2010S).

E. Tata Cara Penelitian 1. Validasi dasar protokol PLANTS

Preparasi ligan 0WA dilakukan dengan menggunakan MarvinSketch pada pH 7,4. Hasil tersebut kemudian disimpan sebagai ligand_2D.mrv. Dari file ligand_2D.mrv, kemudian dilakukan pencarian berbagai konformasi representatif dari ligan tersebut menggunakan modul “Conformers search” (Calculation > Conformation > Conformers | Klik “Ok”). Hasil tersebut kemudian disimpan sebagai ligand dengan tipe file .mol2.

Preparasi protein NF-κB (4G3G.pdb) dilakukan dengan menggunakan YASARA. Pada file pdb yang diperoleh, hanya rantai A yang digunakan (molekul air dihilangkan). Dari tahap tersebut, kemudian atom hidrogen ditambahkan ke dalam sistem (Edit > Add > hydrogento: all). Ligan asli yang terdapat di dalam struktur kristal dihapus sehingga hanya diperoleh protein saja

yang menyediakan ruang (pocket) untuk proses docking. Hasil tersebut kemudian disimpan sebagai protein dengan tipe file .mol2.

Hasil preparasi ligan dan protein kemudian di-docking menggunakan PLANTS dengan konfigurasi (plantsconfig) yang telah dimodikasi sebelumnya (defaultplantsconfig yang diperoleh dari website PLANTS, http://www.tcd.uni-konstanz.de/plants_download/download/simple_dock.zip). Dalam plantsconfig tersebut, parameter binding site definition diubah menjadi 0,1 Å dari koordinat awal dimana 0WA berinteraksi dengan protein NF-κB. Pose hasil docking yang memberikan skor tertinggi kemudian diperkirakan sebagai perkiraan posisi asli ligan pada struktur protein NF-κB. Dari pose tersebut, kemudian dilakukan perhitungan RMSD menggunakan YASARA.

2. Docking senyawa uji terhadap protein NF-κB

Protokol yang valid tersebut digunakan untuk melakukan docking kurkumin dan turunannya yang terdiri dari demetoksi kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin, serta senyawa yang akan disintesis terhadap protein NF-κB. Dari hasil docking tersebut, diperoleh skor PLANTSPLP yang kemudian dibandingkan satu sama lainnya untuk mengetahui aktivitas dari masing-masing senyawa uji secara insilico.

3. Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

Kristal 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida ditimbang sebanyak 0,608 g (4 mmol) dan sikloheksana-1,3-dion sebanyak 0,448 g (4 mmol) dengan alas kertas menggunakan neraca analitik.

Masing-masing starting material dicampur homogen menggunakan mortir dan stamper, kemudian ke dalam campuran tersebut ditambahkan dengan pellet KOH sebanyak 0,224 g. Campuran tersebut kemudian digerus kurang lebih selama 10 menit. Asam klorida (HCl) 2N sebanyak 10 mL ditambahkan ke dalam campuran tersebut.

Padatan yang terbentuk disaring menggunakan corong Buchner dibantu dengan pompa vakum. Sisa-sisa yang tertinggal pada dinding mortir dikerok hingga bersih. Mortir dan stamper kemudian dibilas lagi menggunakan aquades dan sisa bilasan tersebut disaring. Padatan tersebut dicuci dengan aquades untuk menghilangkan sisa asam dari HCl yang ditambahkan. Serbuk yang diperoleh dikeringkan dalam desikator selama 2 hari. Setelah kering, serbuk ditimbang dan dihitung rendemennya.

4. Analisis senyawa hasil sintesis a. Uji organoleptis

Senyawa hasil sintesis diamati sifat fisiknya yang meliputi bentuk, warna, dan bau, dibandingkan dengan starting material yang digunakan.

b. Uji kelarutan dari senyawa hasil sintesis

Senyawa hasil sintesis sebanyak 10 mg dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan dengan aquades tetes demi tetes, amati kelarutannya. Prosedur ini dilakukan juga pada pelarut etanol 96%, kloroform, n-heksan, etil asetat, larutan natrium hidroksida 3N, dan larutan asam klorida 3N. Untuk selanjutnya kemudian dilakukan uji yang sama pada starting material yang digunakan.

c. Uji titik lebur

Sejumlah kecil senyawa hasil sintesis diisikan ke dalam electrothermal capillary tubes, kemudian dimasukkan dalam alat pengukur titik lebur, amati peleburan kristalnya dan catat suhu waktu pertama kali melebur hingga kristal melebur semua. Hasil pengukuran kemudian dibandingkan dengan hasil pengukuran titik lebur pada starting material yang digunakan.

d. Uji kromatografi lapis tipis (KLT)

Senyawa hasil sintesis dan starting material dilarutkan dalam etanol. Masing-masing senyawa tersebut kemudian ditotolkan sebanyak 10 µL menggunakan mikropipet pada lempeng silika gel GF254. Lempeng silika gel GF254 yang akan digunakan, sebelumnya telah diaktifkan pada suhu 100oC selama 30 menit. Setelah totolan kering, dilakukan proses elusi dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (3:2) dan dikembangkan dengan jarak rambat 10 cm dari titik awal penotolan. Pengamatan bercak dilakukan di bawah sinar UV 254 nm. Setelah diketahui adanya bercak, maka dilakukan perhitungan Rf untuk masing-masing bercak.

e. Elusidasi struktur senyawa hasil sintesis

Elusidasi struktur dari senyawa hasil sintesis dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer inframerah (IR) dan spektrometer massa yang terintegrasi dengan kromatografi gas (GC-MS).

1) Spektroskopi inframerah.

Senyawa hasil sintesis sebanyak ± 0,5-1 mg dicampur dengan ± 10 mg KBr hingga homogen. Campuran tersebut kemudian dikempa dan dibuat menjadi tablet. Cahaya inframerah keluar dari sumber sinar, kemudian dilewatkan pada cuplikan. Cahaya yang dilewatkan tersebut nantinya akan dipecah menjadi frekuensi-frekuensi individunya oleh monokromator. Intensitas relatif dari frekuensi individu tersebut akan terukur pada detektor hingga diperoleh spektra inframerah untuk senyawa bersangkutan.

2) Kromatografi gas-spektroskopi massa (GC-MS)

Sampel yang akan diuji dilarutkan dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO), kemudian dilakukan pemeriksaan dengan metode GC-MS dengan kondisi alat jenis pengionan EI (Electron Impact) 70 eV, suhu injektor 300oC, jenis kolom Rtx-5MS dengan panjang 30 meter, suhu kolom diprogram 100-300o_{C, gas helium sebagai gas pembawa, tekanan} 22 kPa, kecepatan alir fase gerak 0,5 mL/menit dan detektor ionisasi nyala. Cuplikan senyawa hasil sintesis dalam pelarut DMSO diinjeksikan ke dalam injektor pada alat kromatografi gas. Aliran gas pembawa akan membawa cuplikan yang telah diuapkan masuk ke dalam kolom yang dilapisi dengan fase diam berupa dimethylpolycyloxane (wujud cair). Uap cuplikan yang telah keluar dari kolom kapiler kemudian akan masuk ke dalam kamar pengion pada spektrometer massa untuk ditembak dengan seberkas elektron sehingga terfragmentasi. Fragmen-fragmen tersebut

kemudian melewati lempeng pemercepat ion dan didorong dalam medan magnet dan menimbulkan arus pada kolektor yang sebanding dengan kelimpahan relatif dari setiap fragmennya. Hasilnya diperoleh akan keluar dalam bentuk spektra massa dari senyawa bersangkutan.

F. Analisis Hasil 1. Perhitungan nilai RMSD

Perhitungan nilai RMSD diperoleh dengan menggunakan aplikasi YASARA. Protokol dikatakan valid apabila pose hasil docking dibandingkan dengan pose asli dari struktur kristal memberikan nilai RMSD kurang dari dari 2 Å (1 Å = 10-10 m) (Istyastono, 2010).

2. Perhitungan rendemen

Perhitungan rendemen senyawa hasil sintesis dilakukan pada kristal yang telah murni dan telah dikeringkan.

rendemen =_{berat senyawa hasil sintesis secara teoritis x} berat senyawa hasil sintesis % 3. Analisis pendahuluan

Analisis pendahuluan senyawa hasil sintesis didasarkan pada data organoleptis dan data kelarutan hasil pengujian.

4. Pemeriksaan kemurnian dari senyawa hasil sintesis

Untuk pemeriksaan kemurnian senyawa hasil sintesis, data yang digunakan berupa hasil uji titik lebur dan uji kromatografi lapis tipis.

5. Elusidasi struktur

Elusidasi struktur dari senyawa hasil sintesis didasarkan pada data spektra inframerah dan spektra massa.

32 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Desain Senyawa Inhibitor NF-κB

Tahapan yang pertama kali dilakukan adalah melakukan validasi dasar terhadap protokol yang akan digunakan untuk melakukan simulasi penambatan molekul. Struktur kristal protein NF-κB diunduh dari RSCB melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=4G3G dalam format PDB dan disimpan dalam format yang sama untuk input dalam tahap molecular docking. Data PDB menyebutkan bahwa struktur tiga dimensi dari protein NF-κB ditentukan dengan menggunakan metode X-ray crystallography dan dipublikasikan pada tahun 2012. Struktur kristal ini kemudian direferensikan sebagai protein reseptor untuk mendesain obat baru.

Gambar 3. Struktur tiga dimensi protein NF-κB (de Leon-Boenig et al., 2012). File PDB tersebut kemudian dipreparasi menggunakan aplikasi YASARA (Krieger, Koraimann, dan Vriend, 2002) sehingga diperoleh protein dan ligan yang

kemudian akan digunakan dalam proses docking validasi protokol menggunakan parameter RMSD. Selain dibutuhkan protein dan ligan dalam melakukan docking, PLANTS juga membutuhkan configuration file (plantsconfig) untuk dapat dijalankan. Plantsconfig merupakan sekumpulan konfigurasi yang terdiri dari pengaturan scoringfunctionandsearchsettings, input dan outputfile, writesingle mol2 files, serta cluster algorithm yang digunakan untuk mengatur aplikasi PLANTS dalam melakukan docking.

OH

H N

S N

N F

Gambar 4. Struktur 4-fluoro-2-

{[4-(piridin-4-il)-1,3-thiazol-2-il]amino}fenol (0WA)

Gambar 5. Konfigurasi plantsconfig yang digunakan dalam proses docking

Dalam plantsconfig yang digunakan untuk melakukan docking, scoring function di-setting dengan string berupa plp. Scoring function merupakan pendekatan secara matematika yang digunakan memprediksi kekuatan interaksi non-kovalen (juga disebut sebagai afinitas pengikatan) antara dua molekul pada proses docking. String yang digunakan pada scoring function adalah PLP (Piecewise Linear Potential). PLP merupakan scoring function yang menilai interaksi yang ada berdasarkan gaya tarik dan tolak-menolak antara protein dan ligan (Korb, Stützle, dan Exner, 2009). String pada searchspeed digunakan speed1,

dimana pada pengaturannya akan menghasilkan simulasi docking yang mempunyai reliabilitas yang tinggi, namun mempunyai kecepatan pemrosesan yang paling rendah (bila dibandingkan dengan speed4) (Korb dan Exner, 2012). Pada baris selanjutnya, terdapat parameter inputfile. Parameter ini mengatur file yang akan di-docking dengan PLANTS, dimana secara eksklusif PLANTS hanya dapat menjalankan docking dengan file ligan dan protein yang mempunyai eksistensi berupa .mol2 (Korb dan Exner, 2012). Pada parameter ini, keduanya di-setting sesuai dengan file protein dan ligan yang akan di-docking. Untuk parameter output, parameter ini mengatur nama direktori yang akan dibuat oleh PLANTS untuk hasil docking yang telah dilakukan (Korb dan Exner, 2012). Dalam pengerjaannya, parameter ini diisi dengan string berupa results. Pada parameter write single mol2 files, diisi dengan string 0 yang berarti file protein dan ligan hasil docking akan disimpan terpisah sehingga nantinya dapat digunakan dalam perhitungan RMSD (Korb dan Exner, 2012). Pada parameter cluster algorithm yang terdiri dari cluster structure, cluster rmsd, bindingsite center, dan bindingsite radius. Pada cluster structure, string diisi dengan dengan angka sepuluh yang merupakan default. Cluster structure merupakan parameter yang menyatakan jumlah struktur yang akan dihasilkan pada proses docking dengan parameter algoritma yang telah ditetapkan (Korb dan Exner, 2012). Untuk cluster rmsd, parameter tersebut diisikan dengan angka dua sebagai default. Cluster rmsd adalah parameter yang menyatakan ambang batas dari nilai RMSD yang diijinkan dalam proses docking (Korb dan Exner, 2012). Sedangkan bindingsite center dan radius merupakan parameter yang

menyatakan pusat koordinat dan radius dari situs pengikatan (Korb dan Exner, 2012).

Setelah itu, proses docking dilakukan dengan menggunakan plantsconfig yang telah ditetapkan. Hasil docking menunjukkan bahwa dari input konformasi yang di-submit untuk dilakukan simulasi perhitungan, konformasi ke-9 memberikan hasil terbaik dengan skor terendah (tabel II). Hasil tersebut kemudian digunakan untuk menghitung RMSD pose ligan hasil docking yang dibandingkan dengan referensi hasil eksperimen/struktur kristal. Dari perhitungan yang telah dilakukan, diketahui bahwa RMSD antara senyawa hasil docking dan referensinya sebesar 0,1656 Å. Nilai RMSD yang kurang dari 2 Å (1 Å = 10-10 _{m) memberikan} jaminan bahwa protokol dapat digunakan untuk memproduksi pose hasil kristal struktur dari ligan yang berinteraksi dengan protein NF-κB (Istyastono, 2010). Hasil tersebut menunjukkan bahwa protokol tersebut dapat digunakan untuk penapisan secara virtual dalam upaya penemuan senyawa baru inhibitor NF-κB.

Tabel II. Skor dari pose terbaik untuk setiap konformasi senyawa hasil docking

Konformasi Skor PLANTSPLP

1 -84.1304

2 -83.7724

3 -84.3417

4 -80.4493

5 -84.5923

6 -85.0590

7 -78.8340

8 -83.9249

Gambar 6. Tumpang-tindih pose senyawa referensi yang diperoleh dari struktur kristal protein NF-κB (atom karbon berwarna biru) dan pose senyawa hasil

docking (atom karbon berwarna ungu).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Weber et al. (2006), diketahui bahwa kurkumin yang merupakan senyawaan enon dapat menghambat ekspresi dari protein NF-κB. Dari informasi tersebut, kemudian dilakukan docking terhadap kurkumin dan turunannya yang terdiri dari demetoksi kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin dengan menggunakan protokol yang telah divalidasi sebelumnya. Dari hasil visualisasi menggunakan PyMol (gambar 7), terlihat bahwa struktur kurkumin mengalami penekukan saat di-docking ke dalam protein NF-κB. Hal tersebut tentunya dapat dijadikan sebagai dasar dalam melakukan desain senyawa baru analog kurkumin dengan ukuran molekul yang lebih kecil dibandingkan kurkumin. Desain dilakukan dengan tetap mempertahankan sisi aromatis, gugus enon, substituen bagian aromatis dan menghilangkan bagian metilen aktif dari kurkumin. Bangun dasar senyawa yang akan digunakan merupakan suatu struktur enon yang terdiri dari dua gugusan karbonil, yakni 2-benzilidensikloheksana-1,3-dion (Istyastono, Yuniarti, dan Jumina, 2009). Berdasarkan hal tersebut, dapat didesain suatu senyawa baru analog kurkumin, yakni 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion.

Gambar 7. Visualisasi interaksi kurkumin dengan protein NF-κB menggunakan

PyMol

Hasil perhitungan menunjukkan bahwa senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion mempunyai skor PLANTPLP sebesar -60,8375 (tabel III) dan berinteraksi dengan residu sistein (Cys 535) sebagai tempat ikatan antara senyawa target dengan reseptor pada protein NF-κB (gambar 8). Skor PLANTSPLP senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion lebih besar dibandingkan dengan skor PLANTSPLP kurkumin yang telah diketahui mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB (Weber et al., 2006). Oleh karena itu, senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion secara in silico diharapkan mempunyai aktivitas sebagai inhibitor protein NF-κB yang lebih baik dari kurkumin sehingga layak untuk disintesis.

Tabel III. Skor PLANTSPLP hasil perhitungan dengan PLANTS

Struktur Senyawa Skor PLANTSPLP

O

O

HO H3CO

2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

- 60.8375

H3CO

HO

O O

OCH3

OH Kurkumin

- 21.4551

H3CO

HO

O O

OH Demetoksi kurkumin

- 35.4851

HO

O O

OH Bisdemetoksi kurkumin

- 46.7238

Gambar 8. Visualisasi interaksi senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dengan protein NF-κB menggunakan PyMol

B. Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

Sintesis senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dilakukan dengan mereaksikan starting material berupa sikloheksana-1,3-dion dan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan katalis kalium hidroksida (KOH) menggunakan metode solid phase reaction. Sikloheksana-1,3-dion yang merupakan starting material adalah senyawa yang mempunyai dua gugus keton dengan enam hidrogen alfa, sedangkan 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida adalah suatu aldehida yang tidak mempunyai hidrogen alfa. Kedua starting material tersebut dimungkinkan bereaksi melalui reaksi kondensasi aldol silang yang dapat menghasilkan senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion. Reaksi tersebut dapat terjadi karena adanya suatu senyawa karbonil yang mempunyai hidrogen alfa, yakni sikloheksana-1,3-dion dan suatu senyawa karbonil lainnya yang tidak mempunyai hidrogen alfa, yakni 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dengan bantuan katalis basa (KOH).

Gambar 9. Struktur sikloheksana-1,3-dion yang mempunyai dua gugus karbonil dan enam hidrogen alfa

Gambar 10. Struktur 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang mempunyai

gugus karbonil tanpa hidrogen alfa Sikloheksana-1,3-dion mempunyai enam buah hidrogen alfa dengan diapit oleh dua atom karbonil yang menyebabkan molekul tersebut bersifat asam. Hal tersebut memungkinkan dengan adanya suatu basa, maka atom karbon alfa pada

sikloheksana-1,3-dion akan melepaskan atom hidrogennya sehingga terbentuk karbon yang bermuatan negatif atau yang dikenal sebagai karbanion. Dalam penelitian ini, digunakan katalis berupa kalium hidroksida (KOH) yang merupakan basa kuat. Penggunaan kalium hidroksida (KOH) dalam penelitian ini dimaksudkan agar hidrogen alfa yang bersifat asam pada molekul sikloheksana-1,3-dion dapat terlepas dengan mudah, sehingga dapat terbentuk ion karbanion. Terbentuknya sikloheksana-1,3-dion yang bermuatan negatif, maka senyawa tersebut bertindak sebagai nukleofil dalam reaksi sintesis ini.

Pada penelitian ini, reaksi diawali dengan proses pembentukan ion enolat dari dion. Proses pembentukan ion enolat dari sikloheksana-1,3-dion diawali dengan menambahkan katalis KOH yang akan mengalami ionisasi menjadi ion kalium (K+_{) dan hidroksil (}-_{OH). Ion hidroksil yang terbentuk akan} mengambil hidrogen alfa pada sikloheksana-1,3-dion sehingga terbentuk ion enolat. Ion enolat yang terbentuk kemudian akan mengalami proses stabilisasi dengan mekanisme resonansi.

Gambar 11. Reaksi pembentukan dan stabilisasi ion enolat yang terbentuk Senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida merupakan senyawa yang bermuatan parsial positif pada atom C karbonilnya sehingga berperan sebagai elektrofil pada reaksi sintesis ini. Muatan yang terbentuk pada senyawa

4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida adalah efek yang ditimbulkan akibat pengaruh induksi dan resonansi dari atom oksigen yang bersifat elektronegatif. Adanya atom oksigen yang bersifat elektronegatif menyebabkan elektron pada atom karbon akan lebih tertarik pada atom oksigen sehingga atom C akan bermuatan parsial positif. Terbentuknya senyawa yang mempunyai muatan parsial positif memungkinkan ion enolat yang berasal dari sikloheksana-1,3-dion dapat menyerang atom C karbonil dari senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida.

Sintesis 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion dengan metode solidphasereaction dilakukan dengan menggerus starting material yang digunakan di dalam mortir. Tujuan dari penggerusan tersebut adalah untuk meratakan persebaran dan memperkecil ukuran partikel dari starting material yang digunakan dalam campuran tersebut. Adanya penggerusan tersebut menyebabkan ukuran partikel starting material akan semakin kecil dan luas bidang kontak antarpartikel akan semakin besar sehingga kontak antara 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida dan sikloheksana-1,3-dion semakin meningkat dan reaksi berlangsung secara efisien. Setelah campuran homogen, kemudian ditambahkan katalis berupa pellet kalium hidroksida ke dalam campuran tersebut. Pada proses penggerusannya, akan terjadi perubahan warna dari campuran yang digerus, dimana perlahan-lahan campuran tersebut yang semula berwarna putih akan berubah warna menjadi kekuningan. Perubahan warna merupakan pertanda terjadinya reaksi, dimana terdapat perpanjangan kromofor yang menyebabkan timbulnya warna kuning pada campuran yang digerus. Adanya energi yang diberikan melalui proses penggerusan mengakibatkan terjadinya reaksi pada campuran tersebut.

2-(4-hidroksi-3-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion C O O sikloheksana-1,3-dion H H

Pembentukan ion enolat:

-_OH

-H₂O

C O O H C O O H

resonansi ion enolat Pembentukan ion alkoksida:

C O

O HO

H3CO C

O H 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida CH O O H3CO

HO

O

(ion alkoksida)

Pembentukan 2-(4-hidroks i-3-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion melalui dehidrasi aldol:

CH O

O H3CO

HO

O

CH O

O H3CO

HO

OH

CH O

O H3CO

HO OH H H O H

--_OH

CH O

O H3CO

HO

OH

-_OH

-H2O

CH O

O H3CO

HO

OH

--OH

O

O H3CO

HO

KOH K + OH

Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

HO H₃CO

O

O

= auksokrom

= kromof or

Gambar 13. Kromofor dan auksokrom dari senyawa 2-(4’-hidroksi-3’ -metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion

Proses penggerusan yang berlangsung kurang lebih selama 10 menit akan menghasilkan padatan yang berwarna kuning jingga. Untuk memperoleh senyawa hasil sintesis dalam bentuk serbuknya, maka akan dilakukan proses kristalisasi pada padatan yang terbentuk dengan menambahkan HCl 2N sebanyak 10 mL. Proses kristalisasi dilakukan dengan cara mengasamkan padatan yang terbentuk karena senyawa hasil sintesis berada dalam bentuk garam akibat keberadaan ion hidroksil (dari KOH) yang akan mengambil atom H dari gugus fenolik senyawa hasil sintesis (gambar 14). Dalam suasana asam, akan terjadi pendesakan oleh ion H+ dari asam yang ditambahkan terhadap garam yang terbentuk (dalam hal ini adalah kalium-4-((2,6-dioksosikloheksilidena)metil)-2-metoksifenolat), sehingga struktur senyawa hasil sintesis akan kembali ke dalam bentuk molekulnya. Adanya penambahan asam tersebut menyebabkan garam senyawa target yang sebelumnya larut dalam air akan dapat dipisahkan dengan starting material-nya. Endapan yang berupa serbuk kemudian disaring dengan kertas saring menggunakan bantuan pompa vakum. Endapan yang tertinggal pada kertas saring kemudian dicuci dengan aquades untuk menghilangkan sisa asam dari HCl yang ditambahkan ke dalamnya dari startingmaterial. Setelah dicuci hingga diperoleh serbuk yang sifatnya netral, serbuk tersebut kemudian dikeringkan dalam desikator selama dua hari. Pengeringan selama dua hari dimaksudkan agar pengeringan berlangsung dengan optimal dan diperoleh serbuk kering senyawa hasil sintesis.

H3CO

HO

O

O

+ KOH

H3CO

O

O

O

kalium-4-((2,6-dioksosikloheksilidena)metil)-2-metoksif enolat) K+

H3CO

O

O

O

+ HCl

H3CO

HO

O

O

2-(4'-hidroksi-3'-metoksibenzilidena) sikloheksana,1-3-dion K+

+ H₂O

+ KCl

Gambar 14. Pembentukan garam dari senyawa hasil sintesis akibat keberadaan kalium hidroksida (KOH) dan penambahan HCl yang mengembalikan bentuk

garam senyawa target menjadi bentuk molekulnya

Berdasarkan perhitungan stoikiometri yang dilakukan terhadap rendemen hasil sintesis (crude product), diketahui bahwa jumlah senyawa yang dihasilkan dari tiga kali replikasi masing-masing sebanyak 0,378 g; 0,374 g; dan 0,378 g dengan rendemen crude product masing-masing sebesar 38,157%; 38,075%; dan 37,661%. Hasil perhitungan yang ada menunjukkan bahwa rendemen hasil sintesis yang diperoleh relatif kecil, dimana rendemen hasil masih kurang dari 50%. Rendemen hasil sintesis yang diperoleh relatif kecil disebabkan starting material yang ditambahkan belum habis bereaksi karena sifatnya yang kurang reaktif dan saat proses pencucian untuk menghilangkan vanilin, terdapat serbuk senyawa hasil sintesis yang tercuci pada saat proses pencucian. Bila ditinjau dari struktur 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida yang merupakan starting material, atom C karbonil yang berperan sebagai elektrofil dapat mengalami stabilisasi resonansi menyebabkan atom C karbonil menjadi kurang positif untuk diserang oleh ion enolat yang terbentuk. Berdasarkan serbuk senyawa yang diperoleh dari tahapan sintesis tersebut, perlu dilakukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui apakah

serbuk yang didapat merupakan senyawa 2-(4’-hidroksi-3’-metoksibenzilidena) sikloheksana-1,3-dion atau bukan.

HO H3CO

H O

HO H3CO

H O

elektrofil 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida

O H3CO

H O

peristiwa stabilisasi resonansi

H

Gambar 15. Proses stabilisasi resonansi dari elektrofil yang terbentuk pada senyawa 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida

C. Analisis Pendahuluan 1. Pemeriksaan organoleptis

Pemeriksaan organoleptis dilakukan dengan memeriksa penampakan fisik dari serbuk senyawa hasil sintesis yang dihasilkan. Pemeriksaan ini dilakukan untuk mengetahui sifat fisik dari senyawa hasil sintesis. Pemeriksaan yang dilakukan meliputi bentuk, warna, dan bau. Selain dilakukan pemeriksaan penampakan fisik dari serbuk senyawa hasil sintesis, pemeriksaan ini juga ditujukan untuk membandingkan sifat-sifat fisik dari senyawa hasil sintesis dengan starting material yang digunakan.

Tabel IV. Perbandingan sifat fisik senyawa hasil sintesis dan starting material

Pengamatan Sikloheksana-1,3-dion 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida Senyawa hasil sintesis Bentuk

Warna Putih kekuningan Putih Kuning

Pemeriksaan organoleptis yang dilakukan pada senyawa hasil sintesis menunjukkan profil yang berbeda dengan starting material yang digunakan. Perbedaan yang tampak nyata antara starting material dan senyawa hasil sintesis adalah bentuk dan warna. Sedangkan dari segi bau, baik starting material yang digunakan dan senyawa hasil sintesis, keduanya mempunyai karakteristik bau khas dan berbeda satu sama lainnya. Hasil pemeriksaan organoleptis membuktikan bahwa senyawa hasil sintesis merupakan senyawa baru yang mempunyai perbedaan signifikan dengan starting material dari segi bentuk, warna dan bau.

2. Pemeriksaan kelarutan

Pemeriksaan kelarutan senyawa hasil sintesis dilakukan untuk mengetahui profil kelarutan dari senyawa hasil sintesis pada beberapa pelarut yang mempunyai kepolaran yang berbeda-beda. Dalam pengujiannya, pelarut yang digunakan antara lain: etanol, DMSO, n-heksan, aseton, etil asetat, kloroform, air dingin, air panas (80o_{C), NaOH 3N, HCl 3N. Selain digunakan} untuk mengetahui profil kelarutan dari serbuk senyawa hasil sintesis, pemeriksaan ini juga dimaksudkan untuk membandingkan kelarutan antara senyawa hasil sintesis dan starting material yang digunakan. Pemeriksaan kelarutan tersebut akan menghasilkan data kelarutan dari senyawa hasil sintesis yang dapat digunakan sebagai panduan untuk memilih pelarut yang sesuai dalam pengujian kromatografi gas – spektroskopi massa (GC-MS).

Lampiran 14. Spektra Inframerah 4-hidroksi-3-metoksibenzaldehida (pellet

86

BIOGRAFI PENULIS

Kenny Ryan Limanto yang akrab disapa Kenny merupakan anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Mashudi dan Djap Siat Fun. Lahir di Pontianak pada tanggal 18 Juli 1991. Penulis menyelesaikan pendidikannya di TK Immanuel Pontianak pada tahun 1997, SD Suster Pontianak pada tahun 2003, SMP Suster Pontianak pada tahun 2006, dan SMA Gembala Baik Pontianak pada tahun 2009. Pendidikan Strata 1 ditempuhnya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2009-2013. Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif dalam kegiatan internal fakultas maupun eksternal sebagai wakil fakultas dalam mengikuti beberapa kompetisi. Penulis pernah menjuarai Olimpiade Kimia Wilayah Kopertis V Yogyakarta sebagai juara II pada tahun 2010 dan juara I pada tahun 2012. Penulis juga memiliki pengalaman sebagai asisten praktikum Kimia Dasar (2010-2012), Kimia Organik (2010-2012), Kromatografi (2012), Kimia Analisis (2012), Farmakognosi Fitokimia (2012), Toksikologi Dasar (2012). Selain itu, penulis terlibat aktif dalam kegiatan pengabdian masyarakat bersama dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan penelitian PKM dengan judul “Formulasi Nikotin dalam Sediaan Tablet Sublingual dengan Ekstrak Daun Tembakau sebagai

Penurun Tekanan Darah” yang lolos seleksi dan didanai oleh DIKTI pada tahun