PERCOBAAN PENUMBUHAN KALUS AGAVE AMANIENSIS TREL. & NOWELL SERTA DETEKSI STEROIDNYA Repository - UNAIR REPOSITORY

  S K R I P S I SET 1 A D E W I W U L A N S A R I P E R C O B A A N P E N U M B U H A N K A L U S A G A V E A M A N I E N S I S T REL. & N O W E L L S E R T A DET EK SI S T E R O I D N Y A FAKULTAS FARMAS1 UNIVERSITAS AIRLANGGA

  1988 PERCOBAAN PENUMBUHAN KALUS AGAVE AMANIENSIS TREL. & NOWELL

  SERTA DETEKSI STEROIDNYA SKRIPSI DIBUAT UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR MENCAPAI GELAR SARJANA FARMASI PADA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA

  1988

  oleh

  S t /

  SETIA DEWI WULANSARI 058110363

  M I L I t PBRPUSTAKAAB ‘ WHITBRSITAS A IR L A U O O A '

  S U R A B A Y A

  Disetujui oleh pembimbing D_R/ NQOR._IFA_NSYAH ERAYANTO Pra,.

  2 SN untuk yang tercinta mas ton dan sahabat-sahabatku _{i e} myr, ran* et, mar, rin.

KATA PENGANTAR Segala puji dan syukur eaya panjatkan pada Allah swt yang melimpahkan rahmatNya, sehingga saya dapat raenyele - saikan tugas untuk menyusun skripsi ini sebagai salah satu syarat mencapai gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Univer sitas Airlangga.

  Hasil yang diperoleh dari skripsi yang berjudul "Per- cobaan Penurabuhan Kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell 'serta Deteksi Steroidnya" ini, sangatlah sederhana dan ja- uh dari sempurna. Naraun demikian, harapan saya, seraoga ha­ sil sederhana yang diperoleh ini dapat bermanfaat sebagai langkah awal untuk penelitian-penelitian selanjutnya.

  Untuk itu perkenankanlah pada kesempatan ini saya me- nyampaikan rasa terima kasih yang tulus dan sedalam-dalam- nya kepada :

  Bapak DR. Noor Ifaneyah, Bapak DR. Gunawan Indrayanto serta Ibu Dra. Isnaeni MS sebagai pembimbing yang telah berkenan meluangkan waktu untuk membimbing, memberikan sa- ran, pengarahan dan semangat serta dorongan moral yang sa- ngat berharga selama saya melakukan penelitian hingga se - lesainya penulisan skripsi ini,

  Kepala Kebun Raya Cabang Purwodadi - Pasuruan Jawa Timur yang telah membantu memberikan tanaman sebagai bahan penelitian saya ini. ii

  Ketua Jurusan Biologi Farmasi dan Laboratorium Bio - teknologi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang te- lah menyediakan fasilitas seiaraa penelitian.

  Tidak lupa pula kepada bapak dan ibu dosen, rekan- rekam mahasiswa serta semua pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu yang telah dengan tulus ikhlas mem- berikan dorongan moral dan bantuan, juga kepada para kar- yawan jurusan biologi farmasi yang telah membantu kelancar- an penelitian ini, saya sampaikan rasa terima kasih yang tulus pula.

  Terakhir kepada suami saya, atas dukungan moral dan pengertiannya demikian juga kepada sahabat-sahabat saya, saya sangat berterima kasih.

  Semoga segala amal baik yang telah diberikan ter^ebut .mendapat balasan yahg melimpah dari Allah sv/t, Arnin.

  Surabaya, Januari 1988 Penyusun iii

  DAFTAR

  ISI

  Halaman KATA PENGANTAR ............................. ii DAFTAR 1ST ' ............................. iv DAFTAR TABEL .......................... . vii DAFTAR GAMBAR ............................. viii BAB I. PENDAHULUAN ..........................

  1 II. TINJAUAN PUSTAKA

  1. Tinjauan tentang kultur jafcingan tanam- an ...... ................... ...... ......

  5

  1.1. Media Kultur jaringan tanaraan .... ...... 6 1.2. Hormon p«rtumbuhan tanaman ........

  7

  1.3. Teknik kultur jaringan tanaraan untuk produksi metabolit eekunder ...... ...... 8

  2. Tinjauan tentang steroid ...........

  11 2.1. Deteksi steroid ...............

  13

  2.1.1. Kromatografi lapis tipis

  13

  3. Tinjauan tentang tanaman Agave ..... lif

  3.1. Penyebaran, habitus dan klsifika- si ........................... m 3«2*.Kandungan kimia Agave amaniensis Trel. & Nowell ................

  15 III. METODE PENELITIAN 1. Bahan penelitian ......... .........

  16

  1.1. Bahan kimia ................. . ^

  1.2. Potongan jaringan ( eksplan ) ^ 1.3. Media .........................

  Halaman

  2. Alat- alat yang digunakan ........... .....18 . Metode penelitian ........ ................18

  3

  3-1. Pembuatan media ....... ....... .....18

  3.2. Penanaman eksplan ......... .... 2k 3*3# Pemeriksaan kalus yang terbentuk..

  27 3**+.. Pemeliharaan kalus yang telah tum- buh ........................... .... 27

  3.5. Deteksi steroid dari kalus ..... .... 28 3.5*1. Reaksi warna pada ekstrak kloroforra ...... ........ .... 23 3.5*2. Analisis kualitatif dengan kromatotfrafi lapis tipis ..

  29 IV. HASIL PENELITIAN

  1. Pemeriksaan kalus yang terjadi ........ .... 31

  2. Subkultur kalus A,flave amaniensis Trel. & Nowell ........................ '...... ....

  35

  3. Deteksi steroid dalara kalus ...... ......... 36 3*1. Hasil reaksi warna Salkowski 36 •••••• 3.2. Hasil reaksi warna Liebermann-.

  Burchard ........................ .... 37

  3.3. Hasil kromatografi lapis tipis ter- hadap ekstrak kloroform .......... ....

  38 V. PEMBAHASAN 1. Penumbuhan kalus ........ .................

  ^7

  . . Pemilihan eksplan ............... .... t+7

  1

  1

  1.2. Pemilihan media uatuk penanaman eks­ plan ............................. ....

  ^7

  2. Deteksi steroid ualara kalas ........ ....... 50 VI. KESIMPULAN ............................. ....

  52 V

  Halaman VII. SARAN' - SARAN ............ . /..........

  53 VIII. RINGKASAN .........................

  54 IX. KEPUSTAKAAN .........................

  55

  DAFTAR TABEL TABEL Halaman

  I. Komposisi kimiawi media hurashige & Skoog ...........................

  21 II. Korabinasi dan kadar hormon pertum -

  buhan yang ditambahkan pada media MS untuk pcnumbuhan kalus Agave amanien sis Trel. & Nowell ..............

  22 III. Kombinasi hormon pertumbuhan yang dapat menumbuhkan kalus Agave ama - niensis Trel. & Cowell ..........

  32 IV. Pemeriksaan makroskopis kalus Agave

  Sc

  amaniensis Trel. Nowell ....... 3*t

  V. Hasil reaksi warna ekstrak kloroform dengan pereaksi Salkowski ....... 3?

  VI. Hasil reaksi warna Liebermann-Bur - chard terhadap ekstrak kloroform ...

  38 VII. Hasil kromatografi lapis tipis eks­

  trak kloroform kalus Agave amanien- sis Trel. & Nowell ..............

  39 VIII. Hasil kromatografi lapis tipis eks­ trak kloroform knave amaniensia Trel. & Nowell .................. i+3

  IX. Jenis steroid yang terdeteksi dalam kalus Agave amaniensirs Trel. & Nowell i

• 6

  vii

  GAMBAR Halaman viii

  6

  11. Kromatogram ekstrak kloroform Agave amaniensis Trel. & Nowell ,,. kb

  41

  36 10, Kromatogram ekstrak kloroform kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell ...

  35 9. Sel-sel kjilus Agave amaniensis Trel. & Nowell .........................

  8

  26

  . Daun Agave amaniensis Trel, & Nowell yang akan ditanam pada media •••«•• 25 7. Penanaman eksplan pada media .....

  20

  DAFTAR GAMBAR

  17 5. Skema pembuatan media ............

  bulan yang digunak'an seba- gai sumber eksplan ...............

  1 - 2

  15 b, Agave a m a n i o n s l G Trel* & Nowell beru. mur

  12 3. Agave amaniensis Trel. & Nowell ...

  2. Skema pembagian sapogenin steroid ••

  10

  1. Skema langkah-langkah produksi meta- bolit sekunder ..................

• Kalus Agave amaniensis Trel, & Nowell

  BAB I PENDAHULUAN Penelitian-penelitian dalam bidang kultur jaringan ta naman dimulai sejak keberhasilan White dan Gautheret pada tahun 193^• ( ). Keberhasilan mereka ialah ber - hasilnya dibuat suatu kultur kalus, dan kultur akar dari po tongan jaringan tanaman tinggi pada media buatan. (

  1

  ,

  2

  ,

  3

  > 4 ) Menurut Koblitz, kultur jaringan tanaman dapat didefi nisikan sebagai potongan jaringan dari tanaman yang ditum- buhkan dalam kondisi steril pada media buatan dimana sel - selnya marapu mengadakan pembelahan dan pertambahan massa

• plasma. ( k )

  Berdasarkan teori sel dan teori totipotensi sel, bah- wa sel merupakan unit terkecil kehidupan yang mampu menga­ dakan aktifitas dan bila sel tumbuhan ditanam pada media yang sesuai akan mampu tumbuh menjadi tanaman dewasa. (

  6

  ) Maka dari itu teknik kultur jaringan tanaman ini dapat di- pakai sebagai teknik pembudidayaan tanaman dengan kandung- an metabolit sekunder yang tinggi. ( 7 ). Keuntungan- ke- untungan dari teknik ini adalah kultur bebas dari pengaruh mikroba, kondisi dapat dikontrol sehingga produk-produk tertentu dapat dihasilkan sesuai dengan keinginan serta tidak tergantung pada iklim dan letak geografis. (

  7,8

  ) Namun produksi metabolit

  6

  ekunder pada kultur jaring-

  1

  2 an tanaman dapat dipengaruhi oleh faktor fisika aeperti u- sia kultur, cahaya atau oleh faktor kimia seperti raacam dan konsentrasi nutrien atau hormon pertumbuhan yang ditam bahkan pada media atau kapasitas biosintesis pada kultur,

  ( )• Karena itu produksi metabolit sekunder dari kul -

  7*9

  tur jaringan tanaman dapat lebih besar, sama atau lebih ke cil daripada tanaman induknya, Kadang-kadang dapat berbeda atau bahkan kultur tersebut tidak rnampu menghasilkan meta­ bolit seperti tanarnan induknya. ( 8,9 )• Dalam kultur ja - ringan tanaman, metabolit sekunder’ yang terdapat antara lain : alkaloid,flavonoid, steroid, tanin, asam-asam orga- nik dan lain-lain. ( U, )•

  5»9

  Untuk produksi metabolit sekunder dalam skala besar, dilakukan suatu kultur suspensi. Adapun tahapan-tahapan dalam perabuatan kultur suspensi adalah sebagai berikut : pertama dibuat kultur kalus dari potongan jaringan tanaman yang mengandung metabolit sekunder tertentu pada media pa- dat, baru kemudian kalus yang didapatkan tadi dipindahkan ke dalam media cair dan diagitasi dengan rpm tertentu. (i*,

  7,10 ) Selain untuk langkah awalpada produksi skala besar, ternyata pada kalus dc*pat diproduksi metabolit sekunder yang lebih bervariasi dibanding kultur suspensi. ( )

  8 Hal ini dapat terjadi karena kondisi lingkungan yang sa -

  ngot berbeda bila sel-sel tanaman ditumbuhkan secara in vitro dibundingkan dengan sebelumnya di alam. ( )

  10 Potongan jaringan tanaman dapat tumbuh dan berkerabang

  3 menjadi kalus bila kebutuhan akan makronutrien, mlkronu - trien, vitamin-vitarain dan suplemen organiknya telah ter- penuhi serta pengaruh macam dan konsentrasi horrnon pertum- buhan dari golongan auksin dan sitokinin yang ditambahkan pada media tersebut. ( 1,2,3 j 6>9>10 ). Pada penelitian yang dilakukan oleh Weier et al. 197*f ( 11 ), penambahah auksin dan sitokinin dalam konsentrasi tertentu akan ter- bentuk kalus pada kultur jaringan batang terabakau*

  Permasalahan n£ Limbul pada pembuatan kultur kalus ini terletak pada bagaimanakah raenentukan komposisi dan konsentrasi horrnon auksin dan sitokinin yang tepat yang harus ditambahkan pada media dasarnya. Selain itu apakah metabolit sekunder yang diproduksi kultur kalus dapat sama, berbeda atau bahkan tidak ada sama sekali seperti pada ta­ naman induknya. Untuk mengetahui hal tersebut, tahapan yang : perlu dilakukan adalah perabentukan kalus dari eksplan kemu- dian baru dilakukan deteksi pada kalus tersebut.

  Penelitian-penelitian terhadap tanaman dengan kandung- an metabolit sekunder steroid dengan teknik kultur jaring­ an tanaman telah banyak dilakukan, seperti pada Solanum s p p

  Dioscorea s p p . Digitalis s p p . Apocvnum cannabinum dan Yucca glauca ( 5 )• Namun penelitian-penelitian terhadap tanaman jenis Agave dengan teknik kultur jaringan tanaman masih belum banyak dilakukan. ( )

  Dari skrining yang telah dilakukan, tanaman dari jenis Agave mengandung sterol, diosgenin, hekogenin dan lain-lain. ( 15, l'f )•

  

k

  Berdasarkan hal tersebut di atas, raaka pada peneliti­ an ini akan dicoba untuk menumbuhkan kalus dari Agave ama- niensis Trel, & Nowell pada media dasar MS dengan penambah an hormon auksin dan sitokinin, keroudian dilakukan deteksi steroid dalam kalus yang tumbuh, Dalam penelitian yang dilakukan oleh Blunden et al.

  ( 15,16 ), kandungan steroid 'yang paling banyak pada bagi- an pangkal daun. Maka untuk penelitian ini sebagai sumber eksplan ( potongan jaringan ), digunakan juga bagian pang­ kal daun Agave amaniensis Trel. & Nowell,

  Diharapkan dari hasil penelitian ini dapat bermanfaat sebagai langkah awal untuk penelitian-penelitian selanjut- nya dalam penerapan metode kultur jaringan tanaman untuk produksi metabolit sekunder dari tanaman jenis Agave.

  BAB IX TINJAUAN PUSTAKA I . Tin.iauan tentang kultur laringan tanaman KuXtur jaringan tanaman oXeh Koblitz. ( i* ), dide - finisikan sebagai potongan jaringan tanaman yang dipi - sahkan dari lingkungan alamiahnya dan ditumbuhkan pada

  'media buatan dalam kondisi steril, di mana sel-selnya dapat mengadakan pembelahan dan pertambahan plasma.

  Keberhasilan penelitian-penelitian yang dilakukan oleh Gautheret, Nobecourt dan White pada tahun 1939 dalam percobaan pembuatan kultur kalus, mengawali penelitian berikutnya dalam bidang tersebut.(

  3

  , 4,5,17 ) Kultur kalus adalah suatu kultur sel-sel yang ti - dak terdiferensiasi menjadi org^n-organ seperti tanaman induknya* (1,2,3,4,5,8,9,10,17 K Hal yang menarik dari kalus ialah bahwa ia dapat atau mampu tumbuh dan berkem bang menjadi tanaman baru seperti tanaman induknya apa- bila dipindahkan pada media baru yang komposisinya con- cok dan tergantung pula pada hormon pertumbuhan yang ditambahkan.

  Selain kultur kalus, dikenal pula kultur suspensi yaitu sel-sel kalus yang ditanam pada media cair*(

  5,10

  ) Dibandingkan dengan teltnik propagasi tanaman seca- ra konvensional,teknik kultur jaringan tanaman mempu. - nyai beberapa keuntungan yaitu dengan kondisi yang ter-

  5

  6 kontrol dapat diproduksi senyawa-senyawa tertentu sesuai keinginan, kultur bebas dari pengaruh mikroba dan ^nsekfca, sel dapat memproduksi senyawa-uenyawa spesifik, biotrans - forraasi senyawa tertentu menjadi senyawa yang berguna da - lam bidang farmasi / medis, dapat dilakukan dimana saja ti dak tergantung letak geografis dan iklim, seleksi strain tanaman unggul atau tanaraan dengan metabolit tinggi dan dapat untuk multiplikasi tanaman secara cepat dan seragam.

  ( 7,8,9,18 ) l.i. Media kultur .jaringan tanaman ( 1,2,3»)

  Keberhasilan teknik kultur jaringan tanaman sa- ngat tergantung pada media yang digunakan dan yang pa ling penting adalah penambahan horrnon pertumbuhan da­ ri golongan auksin dan sitokinin* Kebutuhan akan hor- mon-hormon ini juga tergantung pada spesies dan kul­ tur yang akan dibuat • Kebutuhan nutrien dari kultur jaringan tanaman terdiri atas :

• makronutrien, seperti N, P, K, Ca, Mg, S - mikronutrien, sepertiFe, Mn, Zn, B, Cu, Co, Mo - sumber karbon, biasa dipakai adalah sukrosa untuk mengganti karbon yang didapat tanaman normal dari u- dara secara fotosintesis
• suplemen organik, seperti vitamin, asam amino
• hormon pertumbuhan, golongan auksin ( IAA, NAA j

  ^ ^ - D ) golongan sitokinin ( Kinetin, BA ) Media MS ( Murashige dan Skoog, 1962 ) telah banyak dipakai dalam berbagai penelitian kultur

  7 jaringan tanaman setelah keberhasilannya menu.iibuh- kan kalus Nicotiana tabacum dengan berat kering kalus 167 % lebih besar daripada bila digunakan me­ dia yang pertama kali digunakan oleh Hildebrandt

  e t 1 9 4 6 . ( 1 ) .

  Murashige dan Skoog menyatakan bahwa pH media dibuat

  5.7

  sebelum disterilisasi secara oto- klaf pada 121°C selama 20 menit, karena pada keada- an tersebut komponen-kornponen media berada dalarn bentuk terlarut. Disamping itu penelitian Mann et al. menunjukkan bahwa pengaturan pH pada 5»7 sete­ lah diotoklaf pada 121°C selama 20 menit pH media menjadi 5*0. ( 1 ). Hal ini juga berkaitan dengan pemadatan media oleh agar, karena di b;-.wah pH 5>0 agar tidak dapat berbentuk padat. (

• 5>8

  1

  ,

  2

  ) Sebagai sumber karbon yang biasa dipakai ada- lah sukrosa. Gautheret pada 1959 mencoba beberapa sumber karbon lain seperti galaktosa, maltosa, ma- nosa dan laktosa pada kultur jaringan tanaman. Ter- nyata penggunaan sukrosa lebih baik, karena setelah media diotoklaf pada 121°C selama 20 menit, akan terhidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa yang di- butuhkan oleh kultur,

  1*2. Hormon pertumbuhan tanaman ( 1,2,3**+ ) Dalam kultur jaringan tanaman, yang dimaksud dengan hormon pertumbuhan adalah zat pengatur tum­ buh yan_; bcrupa senyawa kimia yaitu golongan auksin

  8 ( IAA, NAA dan 2,i+-D ) dan golongan sitokinin ( Ki- netin, BA ). Selain itu sebagai zat pengatur tumbuh juga kadang-kadang ditambahkan cairan dari buah- buahan, kasein hidrolisat dan ekstrak ragi.

  IAA ( asam indolasetat ) merupakan auksin alara dan selalu terdapat dalam tanaman dan berperan da­ lam perpanjangan el. Dalam kultur jaringan tanara­

  6

  an, auksin baik alam maupun sintetis berperan da­ lam pembentukan kalus dari eksplan. Golongan auk­ sin sintetis seperti NAA ( asam naftalenasetat ) dan ( asam , -diklorofenoksiasetat ) dapat

  2

  4

  ditambahkan dalam konsentrasi yang lebih rendah daripada IAA- 2,i+-D adalah yang paling poten di an- tara ketiga senyawa tersebut.

• Golongan hormon yang lain yaitu sitokinin. Pe­ ngaruh horrnon ini dalam kultur merangsang pembelah- an sel. Peranan hormon-hormon auksin dan sitokinin selain menginduksi pembentukan kalus, perpanjangan dan pembelahan sel, juga mempengaruhi pembentukan metabolit dalam sel. Pengaruh ini bervariasi ter­ gantung pada konsentrasi, stabilitas dan metabolis- me dalam jaringan selama kulturisasi. ( ).

  6

  . * Teknik kultur jaringan tanaman untuk produksi me­

  1

  3

  tabolit sekunder Teknik kultur jaringan tanaman diterapkan un­ tuk men^ataBi.macalah-masalah yang timbul pada pro­ duksi metabolit tanaman secara konvensoinal»

  9 di mana biasanya metabolit sering diakumulasi pada bagian tertentu dari tanaman. Dengan adanya kondi­ si lingkungan yang berbeda dari kondisi tanaman a- ealnya, sel-sel tanaman pada kultur jaringan dapat memproduksi senyawa yang berbeda macam dan kadarnya atau bahkan sama sekali tidak dapat memproduksi metabolit seperti tanaman induknya. ( » )*

  9

  10 Untuk memproduksi metabolit sekunder dalam

  skala besar dipakai sistem kultur euspensi atau kultur fermentor. Adapun tahapan-tahapan dalam pera- buatan kultur suspensi adalah sebagai berikut se­ perti terlihat pada gambar . : ( , )

  1

  7

  10

  10 Tanaman asal sterilisasi permukaan Eksplan

  Medisrpadat ( media penumbuh )

  4 /

  K A L U S \

  1

  ) / Pendispersian pada media cair

  Suspensi sel Optimasi kondisi untuk mendapatkan pertumbuhan yang maksimal v j U

  Induksi pembentukau metabolit sekunder

  4 ^

  Seleksi klonal untuk mendapatkan 'cell line* dengan produktifitas maksimal

  . Optimasi media untuk produksi metabolit sekunder Suspensi sel

  ( rmedia produksi skala besar ferrnentor / bioreaktor ) Gambar 1. Skeraa langkah-langkah produksi metabolit sekunder.

  11 Dalam kultur jaringan tanaman, horrnon pertum - buhan yang digunakan dapat berpengaruh terhadap pro duksi metabolit sekunder. Pada kultur Trigonella foenum-graecum. hormon kinetin dan IAA dapat mensti mulasi produksi sitosterol dan stigmaeterol• Dalam sel- el Trigonella foenum-graecum. kinetin menaikkan

  6

  pertumbuhan sedangkan 2,if-D menaikkan konsentrasi sterol dan pertumbuhan. ( 9 ) • Pada penelitian yang dilakukan oleh Rokem et $ ., kadar diosgenin dalam

  1

  kultur Dioscorea deltoidea dapat ditingkatkan deng­ an modifikasi komponen media dan hormon pertumbuhan pada media MS, ( 18 )

  2. Tinjauan tentang steroid Secara umum steroid adalah senyawa organik yang mem punyai kerangka inti jperhidrosiklopentanofenantren, dengan substituen metil pada atom C-10 dan atom C-IJ,

  ( 14 ). Secara garis besar steroid dibagi dua golongan yaitu : steroid dengan atom karbon tidak lebih dari ,

  21

  disebut steroid sederhana dan steroid dengan atom kar - bon lebih dari , misalnya sterol, sapogenin steroid,

  21

  alkaloid steroid dan lain-lain.( )

  6 Struktur kerangka inti steroid :

  12 Sterol yang terdapat dalam kultur jaringan tanam­ an dikenal sebagai fitosterol, dan yan^ paling banyak ditemukan adalah sitosterol dan stigmasterol. ( )

  9 CH HO

  HO Stigmasterol Sitosterol

  Dalam tanaman, sterol dapat mengalami transformasi men­ jadi saponin steroid. Saponin dapatberupa glikosida triterpenoid atau glikosida steroid, ( 9 ). Sapogenin steroid merupakan gugus aglikon dari glikosida steroid, Berdasarkan cabang cincin yang tidak mengandung atom nitrogen ( cincin spiroketal ) dan cincin yang mengan­ dung atom nitrogen ( cincin spiroaminoketal ) dalam Tarigan ( 1/f )p sapogenin steroid dibagi menjadi :

  S a p o g e n in s te ro id (alam )

  Cn

  C »bang C ab au g U n p a N d e n g an N

  Ciambar 2, Skema pumbagiun sapog<min steroid.

  13

  2 .

  1

  . Deteksi steroid Untuk mendeteksi steroid dalam tanaman dipakai prosedur yang cepat, sederhana dan dengan sedikit peralatan. ( 19 ). Namun kerugian metode tersebut ia- lah tidak dapat membedakan sterol dan sapogenin ste - roid. ( 6,19 ). Untuk itu, perlu dilakukan hidrolisa dengan HC1 2H d;.n analisis dilakukan terhadup ekstrak kloroform. ( 19 )

  2.1.1. Kromatografi lapis tipis ( 20,21,22 ) Kromatografi adalah teknik pemisahan ber- dasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing- masing komponen pada fase diam di bawah penga­ ruh suatu pelarut yang bergerak. (

  20

  ) Pada kromatografi lapis tipis fase diam berupa suatu lapis tipis dengan ketebalan tertentu pa da suatu lempeng*

  Adapun mekanisme pemisahan terjadi seca­ ra adsorpsi, partisi,pertukaran ion ataupun filtrasi, tergantung pada adsorben yang dipa - kai dan jenis pelarutnya. Pada umumnya mekanis me yang terjadi adalah adsorpsi dan partisi.

  ( 20 ,21,2a )

  Untuk analisis kualitatif, kromatografi lapis tipis dapat membedakan campuran zat atas komponen-komponennya. (

  20,21

  )

  14 3* Tin.lauan tentang tanaman Agave

  3.1. Penvebaran. habitus dan klasifikasi Agave tumbuh tersebar di ciaerah tropis dan subtropis. Di Indonesia Agave ditanam sebagai ta­

• naman hias. ( » )

  23

  24

  25 Agave mempunyai tanda-tanda raorfologi :

  Merupakan tanaman herba tegak, kuat, daun ter- susun roset, bertulang daun sejajar, daun berben- tuk lansot, sedikit berbentuk talang, tebal berda- ging. Daun berwarna biru atau hijau kelabu, kadang- kadang bertepi putih. Tepi daun ada yang berduri dengan jarak 1 - 2 cm. Pada ujung daun tumbuh duri yang berwarna coklat hitam, panjang cm.

  1 - 2

  Klasifikasi Agave amaniensls Trel. & Nowell adalah sebagai berikut : ( 26 ) Divisi s Spermatophyta Anak divisi : Angiospermae Kelas : Monocotyledoneae

  Bangsa : Liliales Suku : Amaryllidaceae

  Marga : Agave Jenis : Agave amaniensis Trel. Sc Nowell

  Pada halaman berikut dapat dilihat bentuk ta­ naman Agave amaniensis Trel. & Nov/ell ( gambar 3 )

  15 Gambar 3* Agave amaniensis Trel., & Nowell, 3*2. Kandungan kimia Agave amaniensis Trel. & NOwell

  Agave amaniensis Trel. & Nowell mempunyai kan- dungan kimia sapogenin steroid diosgenin, tigogenin, hekogenin dan sterol serta senyawa steroid lain yang belum diketahui. ( » » 16 )

  13

  15 BAD III METODE PENELITIAN

  1. Bahan penelitian

  1.1. Bahan kimia Semua bahan kimia yang dipergunakan untuk pembuatan media adalah produksi E. Merck Darmstadt, dengan derajad 'pro analisa', kecuali apabila diee- butkan lain. Hormon 2,4-D yang digunakan produksi Sigma. Agar yang digunakan adalah Difco Bacto-Agar,

  'Difco' certified, buatan Difco Laboratories - Detroit Michigan USA. Steroid pembanding sitosterol dan hekogenin produksi Sigma serta diosgenin pro­ duksi E. Merck Darmstadt.

• 1.2. Potongan .jaringan ( eksplan )

  Potongan jaringan berasal dari pangkal daun Agave amaniensis Trel. & Nowell, berumur 1-2 bulan, yan& diperoleh dari Kebun Raya Cabang Purwodadi -

  Pasuruan Jawa Timur. Pada halaraan berikutnya da - pat dilihat Agave amaniensis Trel. & Nowell yang berumur bulan. ( gambar )

  1-2

  4

  16

  17 Gambar Z+* Agave amaniensis Trel. & Nowell berumur bulan yang diguna -

  1-2

  kan sebagai sumber eksplan,

  1.3. Media Media ysng digunakan dalam penelitian ini ada- lah media standar Murashige & Skoog, 1^62 ( media

  MS ) yang terdiri atas makroelemen, mikroelemen, vitamin, suplemen organik dan hormon pertumbuhan dari golongan aukuin dan aitokinin*

  IComposisi media MS yang digunakan dalara pe­ nelitian ini tertera pada tabel 1. Sedangkan kode media, kombinasi dan kadar hormon pertumbuhan ter­ tera pada tabel , ( halaman dan )

  2

  21

  22

  18 2* Alat-alat yang digunakan pll-meter Fisher untuk mengatur pH larutan media.

  Otoklaf ?3 1 ( American Portable Autoclave '.'/AF Co Inc. ), untuk sterilisasi media dan air suling. Laminar air flow cabinet digunakan untuk pengerja- an 'aseptis.

  Kieselgel 60 F ?_5k ( E. Merck, Darmstadt ). 3« Metode penelitian

  3*1* Pembuatan media Semua bahan kimia komponen media Muranhige &

  Skoog ( MS ) dibuat dan disimpan dalam bentuk la­ rutan stok, kecuali mio-inositol dan sukrosa. Da­ lam penelitian ini media dibuat 'padat dengan pe - nambahan agar 1%* Pembuatan media padat dalam per- cobaan ini sesuai dengan metode Murashige & Skoog dalam Bhojwani, 1983 (!)• Untuk masing-masing kom­ ponen media dasar MS dibuat stok dengan konsentra­ si sebesar 100 kali jumlah yang tertera pada ta - bel I, Jadi untuk memperoleh media dengan volume sa'tu liter, dibuat sebagai berikut :

  19 dari masing-masing larutan stok diambil ml, di-

  10

  tambah mg mio-inositol dan g sukrosa ; di-

  100

  30

  tambnh hormon yang tergantung pada konsentrasi dan macam yang digunakan dalam percobaan, kemudi- an ditambahkan air culing samp^i volume lebih-ku- rang tiga per emnat volume akhir dan pH larutan diatur antara dengan penambahan larutan

• NaOH 0,1 N atau larutan HC1 0,1 N. Setelnh ditam- bah agar

  5,7 5,6

  g, volume dibuat menjadi liter de­

  10

  1

  ngan menambahkan air suling. Kemudian campuran tersebut dipanaskan cambil diaduk sampai jernih.

  Larutan dituang ke dalam botol-botol kultur, ma - sing-macing sebanyak lebih-kurang i ml, kemudian

• 0

  ditutup rapat-rapat dengan aluminium foil dan di- sterilkan dalam otoklaf 121°C selama 20 menit. Media disimpan dalam ruang bersuhu 20 - 25°C bila tidak dipakai. Untuk lebih jelasnya, pembuatan me­ dia tersebut di atas dapat dilihat pada skema be­ rikut ini ( gambar )> komposisi hormon dan kode

  

5

  media pada tabel II( halaman ). :

  22

  20 Larutan stok komponen media MS dengan konsentrasi kali

  100 i

  Masing-masing diambil 10 ml Ditambah 100 mg mio-inositol

  i

  Ditambah 30 g sukrosa

  i

  Ditambah hormon pertumbuhan ( jumlah sesuai dengan macam yang akan dibuat untuk perco baan )

  Ditambah air suling eampai volume

  3/4

  akhir 4. pH diatur 5,7 - 5,8 dengan NaOH 0,1 N atau HC1 0,1 N

  i

  Ditambah agar 10 g, volume dibuat liter

  1 I

  Otoklaf 121°C 20 menit Gambar 5• Skema pembuatan media ( 1 )

  21 Tabel X • Komposisi kimiawi media Murashige & Skoog, 1962 ( )

2 Jumlah ( mg/1 )

  Komponen NHL NO,

  1650

  if 3 KN0

  5 1900

  CaCl2# 2 H20 440

  MgSỘ 7 H^O 370 KH P0/+

  2 170

  KI 0,83

  6,2

  MnSO,. k H O 22,3

  u. £

  ZnSOif. 7 H aO

  8,6

  Na MoO,. Z H O 0,25

  (L if £-

  CuSO • 5 H O 0,025

  /i

  2 CoCl2 . H

  6

  20 0,025

  FeSO,. 7 H O 27,8 ii

  2 Na2. EDTA. 2 H^O

  37 3 Mio-inositol

  100

  Asam nikotinat 0,5

  Piridoksina HC1 0,5

  Tiamina HC1

  0,1

  Glisina

  2 Sukrosa 30000

  Agar

  10000

• D

IAA NAA

• 1
• 1,5
• 2
• ,
• >;

• 1
• 1*5

• 2 - -
• 3
• 1
• 2
• 1
• 1 l
• 2
• 2 l
• 0,5
• 0,5 1,5
• SD
• sd
• sd
• 0,5
• 3D2if
• SD25
• SD26

  0,5

  2

  1 SD2 i

  1

  20

  1

  1

  SD10

  19

  22

  ?

  1

  SD

  sd16

  0,5

  15

  1

  1

  2

  1

  :== = = = : :

  II It ______ U

  II 1!

  rr

  1

  o,5

  1

  0,5

  SD23 0,5 0,5

  1

  1

  1

  :

  0,5

  1 1 0,5

  0,5

  s d

  o,5

  ■s»lk

  ,

  2 0,5

  SD

  0,5

  : = = = = = = = : :s= = = s: :=== = = : • SDX

  ..

  =========* : ==== = d:== = = = :

  4

  2

  13

  BA

  K

  media X.

  ( rmm ) kodes.

  (utrni) auksin

  Nhormon ® X sitokinin

  22 Tabel II. Kombinasi aan kadar hormon pertumbuhan yang di- tambahkan pada media MS untuk periumbuhan kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell

  SD, 0,5

  1

  SD5

  1

  sd

  1

  SD12 2 -

  0,5

  SD11 2 -

  1.5

  SD10

  s d 9 1,5

  1

  6

  SB

  1

  SDo

  1

  6

  s d

II II

11 II

  23 Keterangan : = untuk setiap rnacam media dibuat <

  5 lima )

  botol = tidak ditambahkan hormon tersebut

  K = kinetin BA ss benziladenin

  ,if-D = asam ,if-diklorofenoksiasetat

  2

2 XAA = asam indolasetat

  NAA- = asam naftalenasetat

  24 3*2. Penanaman eksplan

  Penanaman eksplan Agave amaniensis pada media dilakukan sesuai dengan metode yang dikemukakan oleh Reinert dan Yeoman ( ) sebagai berikut : pangkal

  6

  daun Agave amaniensis muda-yang akan dipakai sebagai eksplan dicuci bersih dengan air suling, kemudian di rendam dalam alkohol 90 % seloma 2 menit. Setelah itu disterilkan dalam larutan pensteril •Clorox

  1 4 0 $

  ( 'Clorox' 100% mengandung NaOCl 5,25$ sebagai bahan aktifnya ) selama

  4 menit, dsn dicuci / dibilas de­

  ngan air suling steril

  3 - 5 kali untuk menghilang-

  kan sisa-sisa larutan pensteril, Hssplan yang telah

  1 0 , 3

  steril dipotong-potong dengan ukuran + x cm dan ditanam pada media MS dengan berbagai komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang berbeda-be - da. Semua pekerjaan ini dilakukan secara aseptis da­ lam *laminar air flow cabinet1* Botol'kultur yang te lah berisi / ditanami eksplan tersebut disimpan da­ lam ruang bersuhu 20 - 25°C. Gambar

  6 * berikut ini

  menunjukkan daun Agave amaniensis muda ( gambar _i

  6 A ),

  dan gambar

6 B, potongan melintang daun yang berukuran

  ±

  1 X 0,3 cm. Sedangkan gambar 7. menunjukkan cara penanaman eksplan pada media, yaitu dengan cara me- nempatkan eksplan diatas media dengan raenggunakan pinset steril.

  25 Gambar . Daun Agave amaniensis vane akan

  6 ditanam pada media.

  Keterangan : A : bagian daun yang dipakai untuk eksplan

  B : potongan eksplan yang ditanam

  26 Gambar 7, Penanaman eksplan pada media, Keterangan : penanaman dilakukan dengan cara meletakkan eksplan steril di atas media padat dengan satu sisi potongan melintang daun / ekplan menerapel pada media.

  27 3.3* Pemeriksaan kalus yang terbentuk

  Kalus dinyatakan terbentuk, apabila terbentuk suatu massa sel yang tidak terorganisasi atau tidak terdiferensiasi menjadi organ tanaman induknya.

  ( 1,2,3 ) Kalus yang tumbuh mempunyai tokstur kompak atau ra- puh dan dapat bervvarna kekuningan, putih, hijau atau hitam, ( 3 )• Kemudian untuk melihat sel-sel kalus yang terbentuk dilakukan pemeriksaan mikroskopis.

  Pemeliharaan kalus yang telah tumbuh Untuk pemeliharaan dan perbanyakan kultur kalus dilakukan subkultur yaitu kalus dari satu botol kul­ tur dipindahkan ke beberapa media segar ( 3), de­ ngan cara sebagai berikut : botol kultur yang berisi kalus dibuka tutup alumini- umnya kemudian mulut botol diflambir dengan lampu spiritus. Dengan menggunakan skalpel steril, kalus dipindahkan ke dalam botol yang berisi media segar.

  Setelah diisi kalus, botol media segar tersebut ditu tup dengan aluminium foil kembali setelah diflambir dengan lampu spiritus. Pekerjaan ini dilakukan dalam

  'laminar air flow cabinet*. (

  3 )

  28 3*5. Deteksi steroid dari kalus (

  6 )

  Kalus yang terbentuk dipisahkan dari media agar yang menempel* Setelah dikeringkan dalam lemari pe- ngering atau.lampu pengering pada suhu 40 - 60°C, di serbuk dan dihomogenkan. Kemudian serbuk kalus terse but ditimbang

  1 g dihidrolisis dengan 2 0 ml asam klo

  rida 2 N pada suhu 100°C selama.dua jam, setelah di- ngin dinetralkan dengan natrium' hidroksida 1 N dan disaring. Filtrat yang didapat diekstraksi dengan _i kloroform tiga kali menggunakan corong pisah. Residu hasil hidrolisis setelnh dikeringkan dalam lemari pe ngering bersuhu 40 - 60°C, direfluks tiga kali sela­ ma dua jam dengan 30 ml kloroform kemudian disaring,

  Filtrat yang didapat dicampur dengan ekstrak kloro­ form dan diuapkan sampai kental,.Pada ekstrak kental yang didapat dilakukan analisis kualitatif dengan menggunakan reaksi warna dan kromatografi lapis ti - pis. 3.5.1* Reaksi warna r>ada ekstrak kloroform

• Reaksi warna Salkowski (

  1 9 )

  Sedikit ekstrak dalam tdbung reaksi ditam- bah asam sulfat pekat volume sama melalui dinding tabung perlahan-lahan. Diamati war-

  : na yang terjadi di antara dua lapisan, kemu dian dikocok dan diamati juga warna pada la pisan asam dan pada lapisan kloroformnya. Perlakuan yang sama dilakukan pula terhadap

  Ekstrak dalam tabling reaksi ditambah de- ngan tiga tetes asam asetat anhidrat, dikocok dan ditambah satu tetes asam sul- fat pekat kemudian dikocok perlahan-lahan dan diamati warna yang terjadi. Hal yang soma dilakukan pula terhadap steroid pem­ banding. Analisis kualitatif dengan kromatografi la­ pis tipis

  29 steroid pemuanding. Dalam penelitian ini steroid yang dipakai sebagai pembanding adalah sitosterol, diosgenin dan hekogenin.

• Reaksi warna Liebermann-Burchard ( 19 )

  Ekstrak kental ditotolkan pada lempeng jadi Kieselgel 60 F 254 kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi yang telah je- nuh dengan fase gerak. Untuk deteksi ini fase gerak yang digunakan adalah n-heksan : etilasetat = 8 : 2 ; kloroform : etilasetat =

  9 : 1 ; kloroform : metanol = 9 : 1 dan kar- bontetraklorid : etilasetat = 1 : 1 . Setelah fase gerak mencapai batas yang di- tentukan, lempeng diangkat, dikeringkan dan disemprot dengan pereaksi penampak noda anisaldehida sulfat.

30 Lempeng hasil kromatografi dikeringkan da­

  lam lemari pengering pada suhu 100 - 105°C selaina 5 - 1 0 menit, Warna noda yang tampak dan harga dibandingkan dengan steroid pembanding.

  BAB IV HASIL PENELITIAN

  1. Pemeriksaan kalus yang ter.iadi Hasil penanaman eksplan daun Agave amaniensis

  Trel. & Nowell menunjukkan, bahwa pembentukan kalus ter- baik pada media MS dengan penambahan kinetin sebesar 1 ppm dan 2,4-D sebeaar 1 ppm. Sedangkan bila konsentra- kinetin dan 2,4-D diperbesar dan atau diperkecil, per­ tumbuhan kalus lambat sekali dan teksturnya rapuh bah- kan kalus tidak dapat tumbuh sama sekali,

  Pada media MS dengan penambahan hormon sitokinin yang lain yaitu benziladenin, pertumbuhan kalus tidak sebaik dan secepat seperti pada media di atas ( kine­ tin 1 ppm dan 2,4-D 1 ppm ), begitu juga pada media MS dengan penambahan kinetin, benziladenin, 2,4-D dan IAA yang lain. Pada tabel III., dapat dilihat kombinssi hormon pertumbunan pada media MS yang dapat menumbuhkan kalus Agave amaniensis Trel. & Nowell. Pemeriksaan se-

  'cara makroskopis kalus Agave amaniensis pada media yang dapat menumbuhkan kalus dapat dilihat pada tabel IV,

  31

  32 Tabel III. Kombinasi hormon pertumbuhan yang dapat raenumbuhkan kalus Agave amaniensis Trel. t

  8 Nowell

  ^hormon sitokinin auksin e \

  (ppm) (ppm) kalus kodiK

  K BA 2,4-D

  IAA NAA media\^

  svx

  0,5 tidak tumbuh

  1

  sd ^{- - -}

  2

  0,5 1,5 _{— 11 -}

• ^- SD
• ^{- -} e

  ,5

  2

  — ._ It _

  svj' _{_}

  1 ^{I •}

• ^- 0,5

  SD

  5 ^—

  1 ^{- -}

  tumbuh, baik

  1 SDe :

  1

• ^- 1,5 ^{- ~} tidak tumbuh

  SD

  7 ^{— —}

  1 ^-

  2 SD q _■1

  1

• ^- 3

  SD ^_

  9

^{- f—}

1,5 1 _{w m}

  SD 1,5 ^{____ M}

  10 ^-

  2 S D H

• _{- -}

  2

• ^- 0,5 tumbuh, rapuh

  SD

  12

  2 _{- -} ^-

  1

  tidak tumbuh SDI

  3 ^- 1 tumbuh ^{- ■}

• ^- 0,5

  SDl

  4

  1 ^-

  1

• ^- tidak tumbuh ^- sd

  15 _“ ^{- -}

  2 ¹¹ _— 0,5 2 1 ti

• ^{- -}

  SDI

  6 SD1? ^-

  0,5

  1 ^{- - -----------} _{- -} ^{11 - — —}

• ^- tumbuh

  0,5 1,5

  SD18

• _{- - -}

  1

  tidak tumbuh

  1 SD19

  1 ^{- - - m}

  1 SD20

  SD

  2

• ^{----------- — 41 -}
• _- ^- _{- M}

  0,5 _-----------

• ^{---------------} 2

  0,5

• ^- SD2 2

  0,5

  11

  0,5

  1

• ^- o,5'

  SD23

  1

  l tumbuh

• 0,5

  0,5 SIH sd ■ ^_

  25

  1

  l tidak tumbuh

  1

  o', 5

  1 u

  1

  0,5

  1 — SD26

  33 Keterangan : © = untuk setiap macara media dibuat 5 ( lima ) botol

  = tidak ditambahkan hormon tersebut K ss kinetin

  BA = benziladenin 2,4-D = asam 2,4-diklorofenoksiasetat

  IAA' = asam indolasetat NAA = asam naftalenasetat

  Pertumbuhan kalus diamati saat permukaan eksplan terlihat kasar dan beberapa hari kemudian terli- hat adanya massa sel yang tidak terdiferensiasi menjadi organ seperti tanaman asalnya.