Isolasi Bakteri Keratinolitik Dari Limbah Bulu Ayam Dan Karakterisasi Enzim Keratinasenya

Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian

Isolasi bakteri keratinolitik
dari limbah bulu ayam

Pengukuran Indeks Keratinolitik

Penentuan Isolat Terpilih

Penentuan waktu produksi
enzim keratinase selama 8 hari

Pengukuran aktivitas dan kadar
protein enzim kasar

Presipitasi enzim keratinase
dengan konsentrasi amonium
sulfat secara bertingkat

Pengukuran aktivitas dan kadar
protein enzim keratinase dengan

konsentrasi amonium sulfat secara
bertingkat

Dialisis

Pengukuran aktivitas dan kadar
protein enzim keratinase hasil
dialisis

Penentuan suhu dan pH optimum

Identifikasi isolat terpilih
berdasarkan gen penyandi 16S rRNA

Lampiran 2. Uji Aktivitas Enzim Keratinase

Pereaksi

Blanko (ml)

Sampel (ml)

Larutan penyangga Fosfat
Enzim
TCA
Substrat

0,5
0,5
1
0,5

0,5
0,5
0,5

Diinkubasi pada suhu 31 oC selama 15 menit

Ditambahkan 1 ml TCA pada sampel

Disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 30 menit

Diukur pada λ 280 nm

Rumus :





Aktivitas enzim (U/ml) = (nilai absorbansi sampel – nilai absorbansi
kontrol/blanko) : 0,01
Aktivitas spesifik (U/mg) = aktivitas enzim (U/ml)
total protein (mg/ml)
Hasil (%) = aktivitas enzim n
aktivitas enzim 0

x 100 %

Tingkat kemurnian (kali) = aktivitas spesifik n

aktivitas spesifik 0

Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA)

Konsentrasi BSA
(mg/ml)
0
5
10
20
40
60
80
100

Absorbansi
(595 nm)
0
0,070
0,106

0,120
0,197
0,226
0,338
0,482

0,6

Absorbansi (nm)

0,5
y = 0,0041x + 0,0308
R² = 0,9577

0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

20

40

60

80

Konsentrasi BSA (mg/ml)

100

120

Lampiran 4. Uji Kadar Protein

Pereaksi

Blanko (ml)

Sampel (ml)

Akuades
Enzim
Reagen Bradford

0,5
0
0,75

0
0,5
0,75

Dilakukan pengadukan dengan vorteks

Diukur absorbansinya pada λ 595 nm

Dihubungkan dengan kurva standar BSA

Lampiran 5. Komposisi Reagen Bradford dan Pembuatan Reagen Bradford

A. Larutan Stok Bradford
Comassie Blue G-250
Etanol 95%
Asam Fosfat 85%

70 mg
20 ml
40 ml

Dihomogenkan dengan magnetic stirer
Disaring dengan kertas saring

B. Pembuatan Reagen Bradford
Akuades
Etanol 95%
Asam Fosfat 85%
Larutan Stok

Dihomogenkan dengan magnetic stirer
Disaring dengan kertas saring

425 ml
20 ml
40 ml
30 ml

Lampiran 6. Nilai Absorbansi Kadar Protein
1. Kadar Protein Pada Enzim Kasar
No

Kode Isolat

Absorbansi

Kadar Protein
(mg/ml)

1

A4

2,30255

55,408

2

B6

2,76920

66,790

3

B4

2,17000

52,175

2. Kadar Protein Pada Penambahan Amonium Sulfat Bertingkat
A4

B6

B4

Konsentrasi
Amonium
Sulfat

Absorbansi

Kadar
Protein

Absorbansi

Kadar
Protein

Absorbansi

Kadar
Protein

20%

1,625

38,883

2,023

48,590

2,722

65,639

30%

2,402

57,834

1,952

46,859

2,453

59,078

40%

2,117

50,883

1,765

42,298

1,915

45,956

50%

1,773

42,493

1,797

43,078

1,817

43,566

60%

2,255

54,249

1,857

44,541

1,908

45,785

70%

1,958

47,005

2,049

49,224

1,786

42,810

3. Kadar Protein Setelah Dialisis
No

Kode Isolat

Absorbansi

1

A4

0,917

Kadar Protein
(mg/ml)
21,642

2

B6

0,873

20,542

3

B4

0,859

20,200

Lampiran 7. Identifikasi Isolat Bakteri Keratinolitik

a. Hasil Elektroforesis
B6

B4

A4

M

b. Hasil Sekuensing Isolat Berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Isolat

Nomor AC

Mendekati gen dari

Dengan
kecocokan
1072

Dari
total
1100

Homologi
(%)
97

A4

KJ806377.1

Leclercia adecarboxylata
strain M-X17B

B4

KF494187.1

Azotobacter chroococcum
strain ABA-1

513

602

85

B6

KJ719248.1

Stenotrophomonas
maltophilia strain BIW

408

425

96