Topik 2 Isolasi dan Pengawetan Mikroorga
Skrining, Isolasi dan Pengawetan
Mikroorganisme
Pendahuluan
• Meskipun teknologi DNA rekombinan telah
meningkatkan produksi berbagai produk
fermentasi, pencarian mikroorganisme baru dari
alam yang memiliki potensi untuk menghasilkan
produk tertentu masih tetap di eksploitasi.
Prescott et al. (2002) Industrial
Microbiology and Biotechnology.
Prescott et al. (2002) Industrial
Microbiology and Biotechnology.
Koleksi kultur murni
Mengapa harus mengkarakterisasi isolat
mikrobial?
• Memastikan taksonomi yang tepat untuk
menentukan metode pengawetan yang tepat.
• Menguji ketepatan metode pengawetan yang
digunakan dan dapat melakukan modifikasi
serta memperbaiki prosedur pengawetan.
• Untuk mempermudah monitorinig stabilitas
jangka panjang mikroorganisme tersebut.
Tujuan Skrining
mikroorganisme
Skrining mikroorganisme dilakukan untuk:
Mendeteksi produk baru (metabolit, vitamin,
enzim) serta potensi kegunaan ekonomis lainnya
seperti:
•Kontrol biologis
•Biodegradasi
•Bioremediasi
• Proses Kimiawi (biotransformasi,
bioakumulasi)
•Pangan dan pemrosesan pangan
•Pengembangan uji
Metode dalam isolasi mikroorganisme
• Metode kualitatif (Pengamatan, Mikroskopi)
• Metode kuantitatif (Kecepatan pertumbuhan,
kapasitas sporulasi)
• Metode Biokimiawi (kromatografi, uji enzimatis,
analisis protein)
• Metode molekular (PCR, Sekuensing)
Metode Kualitatif
1. Morfologi dan anatomi kultur
Studi anatomi (bentuk dan ukuran spora,
kloroplas, organisasi intraselular)
Morfologi kultur (pigmentasi, radius koloni,
pembentukan hifa dan agregasi, penampakan
total)
Sporulasi (kelimpahan, jenis)
Pergerakan (nematoda dan organisme yang
berflagela)
Morfologi kultur tiga spesies Monilina
(A) Monilinia laxa; (B) M. fructicola; (C) M. fructigena
Morfologi kultur tiga spesies Monilina
Catatan: Penentuan berdasarkan morfologi kultur mudah dan murah, tapi
memerlukan isolat murni dan memerlukan waktu yang lama.
Metode Kualitatif (Lanj.)
2. Mikroskopi
Analisis morfologi, anatomi, dan organisasi
intraselular
Deteksi senyawa biokimia dan struktur makro
dengan teknik staining (pewarnaan)
Identifikasi menggunakan oligonukleotida dari
organisme dengan pewarna spesifik
Penentuan viabilitas
Morfologi Bakteri
Penentuan viabilitas ragi dengan pewarnaan
metilen violet
Metode-metode mikroskopi
Mikroskop
cahaya
SEM
Fluorescence
TEM
Metode Kuantitatif
1.
2.
3.
4.
5.
Laju Pertumbuhan (bakteri, jamur, alga)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Laju fotosintesis (alga dan bakteri fotosintetik)
Laju respirasi
Produksi enzim / penggunaan substrat
Laju Pertumbuhan
Laju pertumbuhan mikroorganisme (bakteri, ragi,
jamur, alga) dapat ditentukan dengan cara:
Penghitungan jumlah sel (mis.: hemasitometer)
Kerapatan Optis pada 600 nm
CFU
Berat kering sel
Penghitungan jumlah sel dengan
hemasitometer
E
Untuk sel yang dihitung di kotak A, B, C, D:
Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang
dihitung × 104 × fp
Untuk sel yang dihitung di kotak kecil di
kotak E:
Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang
dihitung × 2,5 × 105× fp
CFU
Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme
Rao, D.G. (2005). Introduction to
Biochemical Engineering. McGraw Hill.
Kromatografi lapis tipis
Untuk menentukan jumlah metabolit (bakteri,
jamur, ragi) atau senyawa lain (misal: klorofil pada
alga)
Produksi enzim / Penggunaan Substrat
Riffel, A. & A. Brandelli. (2006). Braz. J.
Produksi enzim / Penggunaan Substrat
Plate 1 & 2 memiliki aktivitas ligninilitik menunjukkan bahwa mikroorganisme
pada plate 1 & 2 memiliki kemampuan untuk memetabolisme lignin.
Mikroorganisme yang ditumbuhkan pada
media dengan sumber nitrogen berbeda
Dari kiri ke kanan:
1. Urea
2. Hipoksantin
3. Nitrit
4. Nitrat
Metabolit Primer
• Metabolit primer: senyawa yang sangat penting
untuk hidup dan reproduksi sel, dan
metobolisme primer berlangsung hampir sama
pada semua mikrorganisme
Metabolit sekunder
• Setiap metabolit sekunder dibentuk oleh sedikit
mikroorganisme
• Metabolit sekunder tidak esensial untuk
pertumbuhan dan reproduksi
• Pembentukannya sangat bergantung pada kondisi
lingkungan
• Beberapa metabolit sekunder dihasilkan dengan
struktur yang sangat berhubungan
• Beberapa mikroorganisme menghasilkan berbagai
golongan senyawa sebagai metabolit sekunder
• Pengaturan biosintesis metabolit sekunder sangat
berbeda dengan biosintesis metabolit primer
Metabolit Primer Vs Metabolit sekunder
Metabolisme sekunder dapat dimodifikasi tanpa mengganggu
metabolisme primer. Modifikasi genetik yang menyebabkan modifikasi
metabolit sekunder diharapkan tidak mengganggu fungsi sel.
Crueger & Crueger. 1989.
Biotechnology. Sinauer Associates.
Isolasi Mikroorganisme
• Isolasi mikroorganisme dilakukan untuk
memperoleh kultur murni ataupun
campuran yang kemudian diuji untuk
menentukan isolat mana yang
menunjukkan reaksi atau produk yang
diinginkan.
• Dalam beberapa kasus, dimungkinkan
pada tahap isolasi, mikroorganisme yang
diinginkan dapat dikenali.
Isolasi Mikroorganisme (Cont.)
• Kriteria penting untuk pemilihan
mikroorganisme:
1. Karakteristik nutrisi dari mikroorganisme
2. Suhu optimum mikroorganisme
3. Reaksi organisme dengan alat yang akan
digunakan dan kesesuaian organisme
dengan jenis proses yang akan digunakan
4. Stabilitas mikroorganisme dan kemudahan
untuk manipulasi genetik
5. Produktivitas mikroorganisme
6. Kemudahan untuk memperoleh produk dari
kultur
Pengayaan pada media cair
• Dilakukan dalam labu kocok
• Pertumbuhan inokulum campuran akan
menyebabkan modifikasi media mengubah
kekuatan seleksi media dilakukan beberapa
kali sub-kultur pada media baru.
Pengayaan pada media cair
• Waktu pemindahan menentukan keberhasilan
isolasi, namun tidak selalu mikroorganisme
dengan kecepatan tumbuh spesifik tertinggi
adalah yang diinginkan. Mikroorganisme yang
diinginkan adalah organisme yang memiliki
afinitas tertinggi terhadap substrat pembatas.
• Substrat pembatas: substrat dalam medium
yang konsentrasinya mempengaruhi
pertumbuhan sel dan mengubah fase
pertumbuhan dari fase log ke fase stasioner dan
akhirnya ke fase kematian.
Pengaruh konsentrasi substrat terhadap
kecepatan pertumbuhan spesifik mikroorganisme
Stanbury ,P.F. et al. (2003). Principles of
Fermentation of Technology. ButterworthHeinemann
Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan
tumbuh spesifik mikroorganisme A dan B
Stanbury ,P.F. et al. (2003). Principles of
Fermentation of Technology. ButterworthHeinemann
Pengayaan kultur pada media padat
• Media padat pada umumnya digunakan untuk
isolasi mikroorganisme yang menghasilkan
enzim tertentu.
• Pada teknik ini, digunakan media selektif yang
mengandung substrat enzim yang diinginkan,
yang pada akhirnya mendorong pertumbuhan
mikroorganisme yang menghasilkan enzim yang
diharapkan.
Skrining mikroorganisme yang diinginkan
Metode Pengayaan
Jenis isolat
Nilai pH yang ekstrim (pH 4-2)
Asidofilik
Suhu yang rendah (4-15°C)
Psikotrof
Suhu tinggi (42-100°C)
Termofilik
Konsentrasi NaCl yang tinggi
Halofilik
Atmosfir N2
Anaerobik
Kitin sebagai substrat pertumbuhan
Lysobacter
Kulit batang pohon, akar
Myxobacteria
Butiran pollen
Actinoplanes
Crueger & Crueger. 1989.
Biotechnology. Sinauer Associates.
Sistem uji untuk skrining metabolit
Produk yang
diinginkan
Sistem uji
antibiotik
Plat agar dengan mikroorganisme uji. Terbentuknya
zona bening digunakan sebagai indikator.
Resistensi terhadap
antibiotik β-laktamase
Plat agar yang telah ditambah β-laktamase.
Protease
Plat agar dengan kasein, pemilihan koloni yang
menghasilkan zona bening.
Amilase
Plat agar dengan pati, pemilihan koloni setelah
pewarnaan dengan iodin.
Lipase
Plat agar dengan emulsi minyak, pemilihan koloni
setelah pengendapan asam lemak bebas dengan ion
Ca2+.
Fosfatase
Plat agar dengan fenolftalein-difosfat dan indikator
pH. Seleksi berdasarkan perubahan warna
NAD
Plat agar dengan mikroorganisme auksotrof
terhadap NAD.
Pengawetan Mikroorganisme
• Penyimpanan harus dilakukan sedemikian
hingga:
▫ Menghilangkan perubahan genetik
▫ Melindungi dari kontaminasi
▫ Mempertahankan viabilitas
Pengawetan mikroorganisme
• Penyimpanan pada suhu rendah
▫ Penyimpanan pada slope agar
kultur ditumbuhkan pada slop agar dan dapat
disimpan pada lemari pendingin (4°C) atau frezer
(-20°C), dan disub kultur setiap 6 bulan sekali
▫ Penyimpanan pada nitrogen cair
aktivitas mikroorganisme sangat minim pada suhu
sangat rendah (-150 sampai -196°C), yang dapat
dicapai dengan penyimpanan pada nitrogen cair.
Pada penyimpannnya, mikroorganisme
disuspensikan dalam agen krioprotektif (mis.:
gliserol 10%)
Pengawetan mikroorganisme
• Penyimpanan dalam bentuk dehidrasi
▫ Kultur kering
Tanah yang lembab dan steril diinokulasi dengan
kultur dan diinkubasi selama beberapa hari agar
mikroorganisme tumbuh, kemudian dikeringkan pada
suhu kamar. Tanah kering disimpan pada suhu ruang
atau 4°C. MO dapat bertahan sampai 20 th dengan
viabilitas 50%.
▫ Liofilisasi
liofilisasi atau pengeringan beku dilakukan dengan
membekukan kultur dan dikeringkan pada keadaan
vakum, sehingga mengakibatkan sublimasi air dari
sel. Pada proses pengeringan, harus ditambahkan
pelindung seperti susu, serum, atau natrium glutamat,
Mikroorganisme
Pendahuluan
• Meskipun teknologi DNA rekombinan telah
meningkatkan produksi berbagai produk
fermentasi, pencarian mikroorganisme baru dari
alam yang memiliki potensi untuk menghasilkan
produk tertentu masih tetap di eksploitasi.
Prescott et al. (2002) Industrial
Microbiology and Biotechnology.
Prescott et al. (2002) Industrial
Microbiology and Biotechnology.
Koleksi kultur murni
Mengapa harus mengkarakterisasi isolat
mikrobial?
• Memastikan taksonomi yang tepat untuk
menentukan metode pengawetan yang tepat.
• Menguji ketepatan metode pengawetan yang
digunakan dan dapat melakukan modifikasi
serta memperbaiki prosedur pengawetan.
• Untuk mempermudah monitorinig stabilitas
jangka panjang mikroorganisme tersebut.
Tujuan Skrining
mikroorganisme
Skrining mikroorganisme dilakukan untuk:
Mendeteksi produk baru (metabolit, vitamin,
enzim) serta potensi kegunaan ekonomis lainnya
seperti:
•Kontrol biologis
•Biodegradasi
•Bioremediasi
• Proses Kimiawi (biotransformasi,
bioakumulasi)
•Pangan dan pemrosesan pangan
•Pengembangan uji
Metode dalam isolasi mikroorganisme
• Metode kualitatif (Pengamatan, Mikroskopi)
• Metode kuantitatif (Kecepatan pertumbuhan,
kapasitas sporulasi)
• Metode Biokimiawi (kromatografi, uji enzimatis,
analisis protein)
• Metode molekular (PCR, Sekuensing)
Metode Kualitatif
1. Morfologi dan anatomi kultur
Studi anatomi (bentuk dan ukuran spora,
kloroplas, organisasi intraselular)
Morfologi kultur (pigmentasi, radius koloni,
pembentukan hifa dan agregasi, penampakan
total)
Sporulasi (kelimpahan, jenis)
Pergerakan (nematoda dan organisme yang
berflagela)
Morfologi kultur tiga spesies Monilina
(A) Monilinia laxa; (B) M. fructicola; (C) M. fructigena
Morfologi kultur tiga spesies Monilina
Catatan: Penentuan berdasarkan morfologi kultur mudah dan murah, tapi
memerlukan isolat murni dan memerlukan waktu yang lama.
Metode Kualitatif (Lanj.)
2. Mikroskopi
Analisis morfologi, anatomi, dan organisasi
intraselular
Deteksi senyawa biokimia dan struktur makro
dengan teknik staining (pewarnaan)
Identifikasi menggunakan oligonukleotida dari
organisme dengan pewarna spesifik
Penentuan viabilitas
Morfologi Bakteri
Penentuan viabilitas ragi dengan pewarnaan
metilen violet
Metode-metode mikroskopi
Mikroskop
cahaya
SEM
Fluorescence
TEM
Metode Kuantitatif
1.
2.
3.
4.
5.
Laju Pertumbuhan (bakteri, jamur, alga)
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Laju fotosintesis (alga dan bakteri fotosintetik)
Laju respirasi
Produksi enzim / penggunaan substrat
Laju Pertumbuhan
Laju pertumbuhan mikroorganisme (bakteri, ragi,
jamur, alga) dapat ditentukan dengan cara:
Penghitungan jumlah sel (mis.: hemasitometer)
Kerapatan Optis pada 600 nm
CFU
Berat kering sel
Penghitungan jumlah sel dengan
hemasitometer
E
Untuk sel yang dihitung di kotak A, B, C, D:
Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang
dihitung × 104 × fp
Untuk sel yang dihitung di kotak kecil di
kotak E:
Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang
dihitung × 2,5 × 105× fp
CFU
Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme
Rao, D.G. (2005). Introduction to
Biochemical Engineering. McGraw Hill.
Kromatografi lapis tipis
Untuk menentukan jumlah metabolit (bakteri,
jamur, ragi) atau senyawa lain (misal: klorofil pada
alga)
Produksi enzim / Penggunaan Substrat
Riffel, A. & A. Brandelli. (2006). Braz. J.
Produksi enzim / Penggunaan Substrat
Plate 1 & 2 memiliki aktivitas ligninilitik menunjukkan bahwa mikroorganisme
pada plate 1 & 2 memiliki kemampuan untuk memetabolisme lignin.
Mikroorganisme yang ditumbuhkan pada
media dengan sumber nitrogen berbeda
Dari kiri ke kanan:
1. Urea
2. Hipoksantin
3. Nitrit
4. Nitrat
Metabolit Primer
• Metabolit primer: senyawa yang sangat penting
untuk hidup dan reproduksi sel, dan
metobolisme primer berlangsung hampir sama
pada semua mikrorganisme
Metabolit sekunder
• Setiap metabolit sekunder dibentuk oleh sedikit
mikroorganisme
• Metabolit sekunder tidak esensial untuk
pertumbuhan dan reproduksi
• Pembentukannya sangat bergantung pada kondisi
lingkungan
• Beberapa metabolit sekunder dihasilkan dengan
struktur yang sangat berhubungan
• Beberapa mikroorganisme menghasilkan berbagai
golongan senyawa sebagai metabolit sekunder
• Pengaturan biosintesis metabolit sekunder sangat
berbeda dengan biosintesis metabolit primer
Metabolit Primer Vs Metabolit sekunder
Metabolisme sekunder dapat dimodifikasi tanpa mengganggu
metabolisme primer. Modifikasi genetik yang menyebabkan modifikasi
metabolit sekunder diharapkan tidak mengganggu fungsi sel.
Crueger & Crueger. 1989.
Biotechnology. Sinauer Associates.
Isolasi Mikroorganisme
• Isolasi mikroorganisme dilakukan untuk
memperoleh kultur murni ataupun
campuran yang kemudian diuji untuk
menentukan isolat mana yang
menunjukkan reaksi atau produk yang
diinginkan.
• Dalam beberapa kasus, dimungkinkan
pada tahap isolasi, mikroorganisme yang
diinginkan dapat dikenali.
Isolasi Mikroorganisme (Cont.)
• Kriteria penting untuk pemilihan
mikroorganisme:
1. Karakteristik nutrisi dari mikroorganisme
2. Suhu optimum mikroorganisme
3. Reaksi organisme dengan alat yang akan
digunakan dan kesesuaian organisme
dengan jenis proses yang akan digunakan
4. Stabilitas mikroorganisme dan kemudahan
untuk manipulasi genetik
5. Produktivitas mikroorganisme
6. Kemudahan untuk memperoleh produk dari
kultur
Pengayaan pada media cair
• Dilakukan dalam labu kocok
• Pertumbuhan inokulum campuran akan
menyebabkan modifikasi media mengubah
kekuatan seleksi media dilakukan beberapa
kali sub-kultur pada media baru.
Pengayaan pada media cair
• Waktu pemindahan menentukan keberhasilan
isolasi, namun tidak selalu mikroorganisme
dengan kecepatan tumbuh spesifik tertinggi
adalah yang diinginkan. Mikroorganisme yang
diinginkan adalah organisme yang memiliki
afinitas tertinggi terhadap substrat pembatas.
• Substrat pembatas: substrat dalam medium
yang konsentrasinya mempengaruhi
pertumbuhan sel dan mengubah fase
pertumbuhan dari fase log ke fase stasioner dan
akhirnya ke fase kematian.
Pengaruh konsentrasi substrat terhadap
kecepatan pertumbuhan spesifik mikroorganisme
Stanbury ,P.F. et al. (2003). Principles of
Fermentation of Technology. ButterworthHeinemann
Pengaruh konsentrasi substrat pada kecepatan
tumbuh spesifik mikroorganisme A dan B
Stanbury ,P.F. et al. (2003). Principles of
Fermentation of Technology. ButterworthHeinemann
Pengayaan kultur pada media padat
• Media padat pada umumnya digunakan untuk
isolasi mikroorganisme yang menghasilkan
enzim tertentu.
• Pada teknik ini, digunakan media selektif yang
mengandung substrat enzim yang diinginkan,
yang pada akhirnya mendorong pertumbuhan
mikroorganisme yang menghasilkan enzim yang
diharapkan.
Skrining mikroorganisme yang diinginkan
Metode Pengayaan
Jenis isolat
Nilai pH yang ekstrim (pH 4-2)
Asidofilik
Suhu yang rendah (4-15°C)
Psikotrof
Suhu tinggi (42-100°C)
Termofilik
Konsentrasi NaCl yang tinggi
Halofilik
Atmosfir N2
Anaerobik
Kitin sebagai substrat pertumbuhan
Lysobacter
Kulit batang pohon, akar
Myxobacteria
Butiran pollen
Actinoplanes
Crueger & Crueger. 1989.
Biotechnology. Sinauer Associates.
Sistem uji untuk skrining metabolit
Produk yang
diinginkan
Sistem uji
antibiotik
Plat agar dengan mikroorganisme uji. Terbentuknya
zona bening digunakan sebagai indikator.
Resistensi terhadap
antibiotik β-laktamase
Plat agar yang telah ditambah β-laktamase.
Protease
Plat agar dengan kasein, pemilihan koloni yang
menghasilkan zona bening.
Amilase
Plat agar dengan pati, pemilihan koloni setelah
pewarnaan dengan iodin.
Lipase
Plat agar dengan emulsi minyak, pemilihan koloni
setelah pengendapan asam lemak bebas dengan ion
Ca2+.
Fosfatase
Plat agar dengan fenolftalein-difosfat dan indikator
pH. Seleksi berdasarkan perubahan warna
NAD
Plat agar dengan mikroorganisme auksotrof
terhadap NAD.
Pengawetan Mikroorganisme
• Penyimpanan harus dilakukan sedemikian
hingga:
▫ Menghilangkan perubahan genetik
▫ Melindungi dari kontaminasi
▫ Mempertahankan viabilitas
Pengawetan mikroorganisme
• Penyimpanan pada suhu rendah
▫ Penyimpanan pada slope agar
kultur ditumbuhkan pada slop agar dan dapat
disimpan pada lemari pendingin (4°C) atau frezer
(-20°C), dan disub kultur setiap 6 bulan sekali
▫ Penyimpanan pada nitrogen cair
aktivitas mikroorganisme sangat minim pada suhu
sangat rendah (-150 sampai -196°C), yang dapat
dicapai dengan penyimpanan pada nitrogen cair.
Pada penyimpannnya, mikroorganisme
disuspensikan dalam agen krioprotektif (mis.:
gliserol 10%)
Pengawetan mikroorganisme
• Penyimpanan dalam bentuk dehidrasi
▫ Kultur kering
Tanah yang lembab dan steril diinokulasi dengan
kultur dan diinkubasi selama beberapa hari agar
mikroorganisme tumbuh, kemudian dikeringkan pada
suhu kamar. Tanah kering disimpan pada suhu ruang
atau 4°C. MO dapat bertahan sampai 20 th dengan
viabilitas 50%.
▫ Liofilisasi
liofilisasi atau pengeringan beku dilakukan dengan
membekukan kultur dan dikeringkan pada keadaan
vakum, sehingga mengakibatkan sublimasi air dari
sel. Pada proses pengeringan, harus ditambahkan
pelindung seperti susu, serum, atau natrium glutamat,