4 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Pene

14

3 METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret-Agustus 2011 di Laboratorium
Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan,
Departemen Teknologi Hasil Perairan; Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen
Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan; Laboratorium
Histopatologi, Ruang Diskusi Histopatologi, Departemen Klinik Reproduksi dan
Patologi (KRP), Fakultas kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama
berupa ikan bandeng (Chanos chanos) dengan ukuran 200-250 g/ekor. Ikan
bandeng yang diamati adalah ikan bandeng yang disimpan pada suhu chilling.
Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis proksimat meliputi H2SO4
(MERCK p.a.), kjeltab Selenium (MERCK p.a.), NaOH (MERCK p.a.), H3BO3
(MERCK p.a.), n-heksana (MERCK p.a.), dan HCl (MERCK p.a.). Bahan-bahan
yang digunakan untuk pembuatan preparat histologi terdiri dari larutan Buffer
Normal Formalin 10% (MERCK p.a.), alkohol 50-100% (MERCK p.a.), xylol
(MERCK p.a.), parafin (MERCK p.a.), hematoksilin (MERCK), eosin (MERCK),

dan mounting agent (MERCK).
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sokhlet (SIBATA
SB 6), tabung kjehdahl (PYREX), tanur pengabuan (Yamato FM 38), timbangan
analitik (AND HF 400), oven (Yamato DV 40), cetakan yang terbuat dari kertas
kalender, rotary mikrotom (Yamato Kohki LR-85), Mikroskop Cahaya Olympus
BX51, Microcular MD 130 Electron Eyepiece serta peralatan uji organoleptik.
3.3 Metode Pengambilan Sampel
Ikan bandeng yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari daerah
tambak Kampung Melayu, Teluk Naga, Tanjung Pasir, Kabupaten TangerangBanten. Bobot ikan bandeng yang diamati berkisar antara 200-250 gram/ekor.
Ikan bandeng ini diambil dengan menggunakan pancing. Setelah ditangkap, ikan
langsung dimatikan. Ikan dimatikan dengan cara menusuk kepala bagian medula
oblongata yang menyebabkan ikan langsung mati.

15

3.4 Prosedur Analisis
Pengujian organoleptik dilakukan terhadap sampel ikan bandeng untuk
menentukan tahapan post mortem ikan bandeng tersebut. Sampel kulit ikan
bandeng pada fase prerigor, rigormortis, post rigor, dan fase busuk diambil serta
dilakukan analisis

pembuatan

dan pengamatan

preparat

jaringan

kulit

menggunakan mikroskop. Pada sampel kulit ikan bandeng juga dilakukan uji
proksimat untuk mengetahui komposisi kimia kulit ikan bandeng tersebut.
3.4.1 Uji organoleptik (BSN 2006)
Penentuan fase

kemunduran mutu pada

ikan

bandeng dilakukan

menggunakan metode sensori, yaitu secara organoleptik. Pengujian organoleptik
merupakan cara pengujian menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk
menilai mutu produk. Pengujian organoleptik ini mempunyai peranan yang
penting sebagai pendeteksian awal dalam menilai mutu untuk mengetahui
penyimpangan dan perubahan dalam produk. Pada uji organoleptik ini, ada
beberapa syarat yang harus disepakati oleh panelis, antara lain tertarik dan mau,
terampil dan konsisten dalam mengambil keputusan, siap sedia pada saat
dibutuhkan dalam pengujian, tidak menolak contoh yang akan diuji, berbadan
sehat, bebas dari penyakit THT dan tidak buta warna, serta jumlah panelis
minimum untuk satu kali pengujian adalah 15 orang (semi-terlatih). Penetapan
fase kemunduran mutu pada ikan dilakukan menggunakan alat bantu berupa
lembar nilai (score sheet) yang telah ditetapkan oleh Badan Standardisasi nasional
(BSN) dengan SNI 01-2346-2006 (Lampiran 1).
3.4.2 Analisis proksimat
Analisis

proksimat

adalah

suatu

metode

analisis

kimia

untuk

mengidentifikasi kandungan nutrisi pada suatu bahan. Analisis proksimat terhadap
kulit ikan bandeng meliputi analisis kadar air, abu, protein, lemak, dan
karbohidrat.
(1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan
cawan porselen dalam oven pada suhu 102-105 oC selama 30 menit. Cawan
tersebut diletakkan dalam desikator (kurang lebih 30 menit) hingga dingin
kemudian ditimbang sampai beratnya konstan. Sampel sebesar 5 gram kemudian

16

ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan. Cawan tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 150 oC selama 8 jam. Cawan tersebut
dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar air kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
kadar air % =
Keterangan :

B−C
x 100%
B−A

A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan yang diisi sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram)
(2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu
105 oC selama 30 menit. Cawan abu tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

desikator (30 menit) dan ditimbang. Sampel sebesar 5 gram ditimbang dan
dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Selanjutnya dibakar di atas kompor
listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan (600 oC)
selama 7 jam. Cawan dimasukkan ke dalam desikator dibiarkan sampai dingin
kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar abu kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
Kadar abu % =
Keterangan :

C−A
x 100%
B−A

A = Berat cawan abu porselen kosong (gram)
B = Berat cawan abu porselen dengan sampel (gram)
C = Berat cawan abu porselen dengan sampel setelah dikeringkan (gram)
(3) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)
Sampel sebesar 5 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan
selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah
ditimbang berta tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung sokhlet.

Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung sokhlet dan
disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi
sokhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 oC menggunakan pemanas listrik selama

17

16 jam. Pelarut lemak yang ada di dalam labu lemak didestilasi hingga semuanya
menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut
dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak. Selanjutnya labu lemak
dikeringkan dalam oven pada suhu 105 oC dan didinginkan dalam desikator
sampai beratnya konstan (W3).
Perhitungan kadar lemak kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
kadar lemak % =
Keterangan :

W3 − W2
x 100%
W1

W1 = Berat sampel (gram)

W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram)
W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram)
(4) Analisis kadar protein (AOAC 2005)
Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari destruksi,
destilasi dan titrasi.
(a) Tahap destruksi
Kulit ikan bandeng ditimbang sebesar 1 gram kemudian sampel tersebut
dimasukkan ke dalam tabung kjehdahl. Sebanyak 0,25 gram selenium dan 25 ml
H2SO4 pekat ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan
tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai
larutan berwarna bening .
(b) Tahap destilasi
Sampel yang telah didestruksi dituangkan ke dalam labu destilasi lalu
ditambahkan akuades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi
dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung
kondensor ditampung dalam erlenmeyer 10 ml berisi larutan H3BO3 dan 2 tetes
indikator (cairan methyl red dan brom creosol green) yang ada di bawah
kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 10 ml destilat dan berwarna hijau
kebiruan.
(c) Tahap titrasi

Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan
erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat.

18

Perhitungan kadar protein kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus :
N % =

ml HCl − ml HCl blanko x 0,1 N HCl x 14,007
x 100%
mg sampel

Kadar protein = % N x 6,25
(5) Analisis kadar karbohidrat (AOAC 2005)
Kadar karbohidrat ditentukan dengan cara by difference, yaitu hasil
pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar lemak, dan kadar
protein. Perhitungan kadar karbohidrat kulit ikan bandeng ditentukan dengan
rumus :
Karbohidrat (%) = 100% - (% kadar air - % kadar abu - % kadar protein - % kadar
lemak)

3.4.3 Pembuatan preparat dengan metode parafin (Angka et al. 1984)
Pengamatan jaringan kulit ikan diawali dengan pembuatan preparat kulit
ikan bandeng (Chanos chanos) kemudian pengambilan gambar objek pada
mikroskop. Pembuatan preparat dilakukan dengan metode parafin. Tahapannya
terdiri atas fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi, embedding, blocking,
trimming,

pemotongan

jaringan,

pewarnaan,

serta

perekatan

jaringan

menggunakan mounting agent (Lampiran 2).

Fiksasi dilakukan dalam larutan BNF (Buffer Normal Formalin) selama
lebih dari 24 jam (3 hari), setelah itu larutan fiksasi dibuang, kemudian dilakukan
dehidrasi melalui perendaman jaringan dalam alkohol pada suhu ruang dengan
perincian:
1) Alkohol 70% selama 24 jam
2) Alkohol 80% selama 2 jam
3) Alkohol 90% selama 2 jam
4) Alkohol 95% selama 2 jam
5) Alkohol 95% selama 2 jam
6) Alkohol 95% selama 2 jam
7) Alkohol 100% selama 12 jam
Proses clearing dimulai dari perendaman sampel dalam clearing agent.
Jaringan direndam dalam alkohol:xilol (1:1) selama 30 menit yang dilanjutkan
dengan tahap impregnasi dan embedding. Impregnasi adalah perendaman jaringan

19

ke dalam xilol:parafin (1:1) dalam gelas piala selama 45 menit. Embedding adalah
perendaman jaringan di dalam parafin cair, yakni parafin I, parafin II, parafin III
masing-masing selama 45 menit. Kedua proses ini berlangsung di dalam oven
pada suhu 60 oC.
Jaringan yang telah diembedding dalam parafin cair lalu di blok (dicetak
agar mudah dipotong) dengan parafin cair yang kemudian dibekukan. Proses ini
membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas yang kaku, seperti kertas
kalender, dengan ukuran 2x2x2 cm3. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan
hingga memenuhi sekitar 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit
membeku. Setelah itu jaringan disusun dalam cetakan dan dituangi parafin cair
hingga material jaringan terendam. Selanjutnya dibiarkan membeku dalam suhu
ruang selama 24 jam. Setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin
dikeluarkan dari cetakan lalu ditrimming menggunakan silet.
Pemotongan jaringan dilakukan menggunakan mikrotom putar setebal 4 μm.
Pita-pita parafin yang terbentuk diambil dengan jarum kemudian diletakkan di
permukaan air hangat (45 oC-50 oC). Pita-pita parafin kemudian direkatkan pada
gelas obyek dan dibiarkan hingga mengering.
Proses pewarnaan dilakukan menggunakan hematoksilin dan eosin.
Pewarnaan diawali dengan perendamaan gelas obyek ke dalam xilol I dan xilol II
masing-masing selama 2 menit, dilanjutkan perendaman dalam alkohol absolut
(100%), 95%, 90%, 80%, 70%, dan 50% masing-masing selama 2 menit. Setelah
itu, obyek dibilas dengan akuades selama 2 menit. Kemudian obyek dimasukkan
ke dalam pewarna hematoksilin selama 7 menit dan dicuci dengan air mengalir
untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap. Obyek direndam
kembali dalam pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci kembali dengan akuades.
Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 50%, 70%, 85%, 90%,
100%, 100%, xilol I, xilol II masing-masing selama 2 menit.
Proses selanjutnya adalah penutupan gelas obyek dengan pemberian
mounting agent atau Canada Balsam pada gelas obyek dan ditutupi dengan gelas
penutup kemudian dikeringkan selama 24 jam. Pengamatan preparat awetan
dilakukan dengan mikroskop cahaya Olympus BX51 dengan perbesaran 200x.
Proses pengambilan gambar dilakukan dengan Microcular MD 130 Elektron

20

Eyepiece. Diagram alir pembuatan preparat kulit ikan bandeng (Chanos chanos)
dapat dilihat pada Gambar 3.

Ikan bandeng

Pemotongan bagian kulit
Fiksasi dengan larutan BNF 10%
Dehidrasi dengan alkohol berseri
Penjernihan (clearing) dengan alkohol-xilol (1:1)
Impregnasi dengan menggunakan xilol-parafin (1:1)
Penanaman (embedding) dalam parafin
Trimming
Pemotongan dengan mikrotom
Pelekatan pita parafin pada gelas obyek
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin
Perekatan jaringan dengan mounting agent
Preparat awetan

Pengamatan dengan mikroskop
Pengambilan gambar
Gambar 3 Diagram alir pembuatan preparat kulit ikan bandeng (Chanos chanos).

21

3.5 Analisis Data
Hasil yang diperoleh dari pengamatan dan pengukuran terhadap nilai
organoleptik kulit ikan bandeng (Chanos chanos) dicari nilai rata-ratanya. Nilai
rata-rata tersebut dihitung menggunakan rumus berikut (BSN 2006):
𝑋=

𝑛
𝑖=1

n

𝑋𝑖

Keterangan:
X

: nilai rata-rata

Xi

: nilai X ke-i

N

: jumlah data
Sampel kulit ikan bandeng pada setiap tahapan kemunduran mutu

(prerigor, rigormortis, postrigor, dan busuk) diamati. Data yang diperoleh dari
hasil pengamatan dianalisis secara deskriptif kualitatif dengan melihat preparat
histologi menggunakan mikroskop.