Analisis Keragaman Genetik Bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan Teknik Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA) Gen 16S-rRNA

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK BAKTERI Xanthomonas
oryzae pv. oryzae DENGAN TEKNIK AMPLIFIED rDNA
RESTRICTION ANALYSIS (ARDRA) GEN 16S-rRNA

SHERRYN SUNNY ALBANNY

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Keragaman
Genetik Bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan Teknik Amplified rDNA
Restriction Analysis (ARDRA) Gen 16S-rRNA adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2013
Sherryn Sunny Albanny
NIM G84090028

ABSTRAK
SHERRYN SUNNY ALBANNY. Analisis Keragaman Genetik Bakteri
Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan Teknik Amplified rDNA Restriction
Analysis (ARDRA) Gen 16S-rRNA. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
YADI SURYADI.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) merupakan penyebab penyakit hawar
daun bakteri (HDB) pada padi. Sebanyak lima belas isolat Xoo yang berasal dari
beberapa daerah di Indonesia, dianalisis keragaman genetiknya menggunakan
teknik amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) gen 16S-rRNA. Analisis
keragaman genetik ini bertujuan mengidentifikasi kekerabatan Xoo secara genetik
sehingga dapat dijadikan acuan bagi pengembangan tanaman tahan hawar daun
bakteri (HDB). Gen 16S-rRNA diamplifikasi dari genom Xoo, kemudian dipotong
dengan enzim restriksi RsaI sehingga membentuk pola ARDRA. Pola ARDRA
dijadikan data biner sebagai input untuk konstruksi pohon filogenetika.

Berdasarkan pohon filogenetik yang terbentuk, berbagai isolat memiliki
kekerabatan yang cukup dekat. Isolat 1/96 dan 61 memiliki kekerabatan yang
cukup dekat dengan isolat 29D, 59, dan 60 meskipun berasal dari daerah yang
berbeda-beda. Isolat lain yang memiliki kekerabatan cukup dekat yaitu isolat 5
dengan isolat 23D, 28D, 10, 8, dan isolat 6 dengan isolat 3 dan 2. Kelompok
kekerabatan tersebut menunjukkan keragaman genetik isolat Xoo yang diuji cukup
tinggi.
Kata kunci: keragaman genetik, Xanthomonas oryzae, 16S-rRNA, ARDRA

ABSTRACT
SHERRYN SUNNY ALBANNY. Genetic Diversity Analysis of Xanthomonas
oryzae pv. oryzae by Using Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)
Technique 16S-rRNA Gene. Supervised by I MADE ARTIKA and YADI
SURYADI.
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) causes bacterial leaf blight (BLB) of
rice. Fifteen Xoo from several regions in Indonesia were analyzed their genetic
diversity by using amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) technique of
16S-rRNA gene. The aim of this analysis is to identify the genetic diversity of
Xoo and can be used as a reference for HDB-resistance plant research. An
amplified 16S-rRNA gene from Xoo was cut by using RsaI restriction enzyme and

formed ARDRA pattern. ARDRA pattern was further used as the binary data for
the construction of phylogenetics tree. Phylogenetics tree showed that the genetic
relationship of the isolates was quite close. Isolate of 1/96 and 61 are close enough
to 29D, 59, and 60 isolates although they are from different regions. Other isolates
showed close relation are isolate 5 to 23D, 28D, 10, 8, and isolate 6 to 3 and 2
isolates. The genetic cluster quantity showed the genetic diversity of Xoo analyzed
is quite high.
Keywords: genetic diversity, Xanthomonas oryzae, 16S-rRNA, ARDRA

ANALISIS KERAGAMAN GENETIK BAKTERI Xanthomonas
oryzae pv. oryzae DENGAN TEKNIK AMPLIFIED rDNA
RESTRICTION ANALYSIS (ARDRA) GEN 16S-rRNA

SHERRYN SUNNY ALBANNY

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013

Judul Skripsi : Analisis Keragaman Genetik Bakteri Xanthomonas oryzae pv.
oryzae dengan Teknik Amplified rDNA Restriction Analysis
(ARDRA) Gen 16S-rRNA
Nama
: Sherryn Sunny Albanny
NIM
: G84090028

Disetujui oleh

Dr Ir Made Artika, M.App.Sc
Pembimbing I

Ir Yadi Suryadi, M.Sc
Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2013 ini adalah Analisis
Keragaman Genetik Bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae dengan Teknik
amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) Gen 16S-rRNA.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
dan Bapak Ir Yadi Suryadi, M.Sc selaku pembimbing, serta Ibu Dwi N.
Susilowati yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan
penulis sampaikan kepada Bapak Jajang, Ibu Aminah beserta staf Konservasi

Mikrobiologi BB-Biogen yang telah membantu selama pengumpulan data
penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta
seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2013
Sherryn Sunny Albanny

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

PENDAHULUAN ...................................................................................................1
METODE .................................................................................................................2
Bahan ....................................................................................................................2
Alat .......................................................................................................................3
Prosedur Analisis .................................................................................................3
HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................5
Hasil ......................................................................................................................5
Pembahasan ..........................................................................................................9
SIMPULAN DAN SARAN ...................................................................................12
Simpulan .............................................................................................................12
Saran ...................................................................................................................13
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................13
LAMPIRAN ...........................................................................................................15
RIWAYAT HIDUP ................................................................................................16

DAFTAR TABEL
1 Isolat Xanthomonas oryzae pv. oryzae dari beberapa wilayah di Indonesia
2 Pengelompokkan ukuran pola pita hasil pemotongan dengan enzim

restriksi RsaI
3 Data biner pola pita hasil pemotongan dengan enzim restriksi RsaI

2
7
8

DAFTAR GAMBAR
1 Hasil peremajaan Xanthomonas oryzae pv. oryzae dalam Wakimoto
agar miring
2 Elektroforegram hasil isolasi DNA Xoo
3 Amplikon Gen 16S-rRNA Xanthomonas oryzae pv. oryzae
4 Hasil pemotongan gen 16S-rRNA Xoo dengan enzim restriksi RsaI
5 Interpretasi elektroforegram hasil pemotongan gen 16S-rRNA dengan
enzim restriksi RsaI dan pola ARDRA yang terbentuk
6 Pohon filogenetik Xoo berdasarkan pola pita pemotongan enzim RsaI

5
5
6

6
7
8

PENDAHULUAN
Bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) merupakan penyebab
penyakit hawar daun bakteri (HDB) pada padi. Bakteri ini merupakan bakteri
Gram negatif yang berbentuk batang pendek, bersifat aerob, tidak membentuk
spora, dan mempunyai satu flagel di ujung yang berfungsi sebagai alat gerak.
Koloni Xoo berlendir, bentuk koloni pada medium biakan adalah bulat, cembung
dan berdiameter 1-3 mm, menghasilkan pigmen berwarna kuning yang merupakan
pigmen xanthomonadin (Liu et al. 2006). Lendir yang dihasilkan bakteri ini dapat
mengeras menjadi butiran kecil pada permukaan daun yang terinfeksi. Suhu
optimum untuk pertumbuhan bakteri Xoo berkisar antara 25-30 ºC dan suhu
minimumnya berkisar 5-10 ºC. Permukaan daun yang lembab akan
mensuspensikan sel bakteri sehingga sel bakteri tersebut dapat tersebar bebas.
Bakteri Xoo dapat bertahan dalam tanah selama 1-3 bulan, sedangkan dalam benih
selama 7-8 bulan (CABI 2008).
Bakteri Xoo merupakan patogen terbawa benih pada padi. Bakteri ini
menyebabkan penyakit hawar daun bakteri (HDB) yang dapat diawali dari benih

padi yang telah terinfeksi Xoo. Benih atau tanaman muda yang terinfeksi Xoo
hingga layu (kresek) mirip dengan kerusakan awal oleh penggerek batang. Namun,
serangan penggerek gejalanya lebih dahulu timbul pada daun muda, sedangkan
HDB pada daun-daun tua. Beberapa kerugian yang ditimbulkan patogen terbawa
benih tersebut diantaranya menjadi sumber patogen bagi benih lain yang belum
terinfeksi, media penyebaran patogen ke lokasi yang baru, dan merupakan awal
perkembangan penyakit pada tanaman yang sedang berkembang (Semangun
2007).
Penyakit HDB dapat menyebabkan kehilangan hasil panen sampai 60% jika
terjadi serangan yang parah, dalam kondisi lingkungan dengan angin kencang, dan
lembab. Wilayah tropis dan beriklim sedang pada umumnya sering mendapat
serangan HDB (Sakthivel et al. 2001). Pada tingkat keparahan 20%, sebulan
sebelum panen, penyakit sudah mulai menurunkan hasil. Hasil padi turun 4%
setiap kali penyakit bertambah parah 10%. Serangan HDB dapat terjadi pada fase
benih, tanaman muda, dan tanaman dewasa. Serangan ini menyebabkan turunnya
produksi padi. Lahan yang terserang penyakit HDB sangat luas, khususnya di
Indonesia. Tahun 2006, luas lahan di Indonesia yang terserang HDB sebesar
74.243 ha. Tahun 2010, luas lahan yang terserang HDB sebesar 54.796 ha, dan
serangan ini meningkat pada masa tanam 2010-2011 menjadi sebesar 64.123 ha
(Direktorat Perlindungan Tanaman 2011).

Pengendalian terhadap penyakit HDB harus dilakukan sedini mungkin atau
dimulai dari benih untuk dapat mengurangi penyakit HDB. Pengendalian ini telah
dilakukan dengan berbagai cara untuk menghasilkan berbagai varietas padi yang
tahan terhadap HDB. Pengendalian HDB melalui pengembangan varietas tahan
HDB merupakan salah satu cara yang efektif, murah dan mudah diterapkan di
petani. Pengembangan varietas padi tahan HDB harus disesuaikan dengan
keragaman jenis Xoo yang ada. Keragaman jenis Xoo terbentuk dari keragaman
genetik Xoo itu sendiri. Bakteri Xoo dari berbagai daerah di Indonesia memiliki
genetik yang beragam pula. Identifikasi keragaman genetik Xoo tersebut dapat
dilakukan menggunakan teknik molekuler (Keshavarz et al. 2011).

2
Penggunaan teknik molekuler untuk karakterisasi patogen tumbuhan perlu
dikembangkan karena cepat dan sensitif. Salah satu teknik dalam karakterisasi
DNA patogen yaitu teknik hibridisasi DNA secara radioaktif. Namun, teknik
tersebut memiliki kendala dalam hal penanganan limbah radioaktif. Teknik
molekuler yang lebih aman dalam deteksi patogen tumbuhan yaitu menggunakan
primer spesifik dan PCR yang dikembangkan dari sekuen 16S-rRNA. Analisis
polimorfik DNA secara langsung lainnya merupakan teknik untuk deteksi patogen
tertentu dari berbagai wilayah (Pangastuti 2006).
Analisis keragaman genetik menggunakan gen 16S-rRNA dapat dilakukan
dengan metode restriction fragment length polymorphism (RFLP). Metode RFLP
adalah analisis pengukuran perbedaan panjang fragmen DNA yang dihasilkan
oleh pemotongan enzim restriksi. Analisis RFLP pada gen 16S-rRNA disebut
amplified rDNA restriction analysis (ARDRA). PCR 16S-rRNA ini berguna untuk
membedakan antara organisme prokariot dengan eukariot. Organisme prokariot
akan menghasilkan pita amplifikasi gen 16S-rRNA sedangkan eukariot tidak.
Pemotongan dengan enzim restriksi dilakukan setelah PCR 16S-rRNA tersebut.
Berdasarkan pola pita yang dihasilkan dari pemotongan enzim restriksi dapat
direkonstruksi pohon filogenetik yang akan mengelompokkan bakteri berdasarkan
jarak kekerabatannya (Sari 2007).
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi keragaman genetik isolat bakteri
Xanthomonas oryzae pv. oryzae dari beberapa daerah di Indonesia dengan teknik
amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) gen 16S-rRNA. Hasil identifikasi
keragaman genetik isolat bakteri Xoo dari berbagai daerah di Indonesia,
diharapkan dapat membantu pengembangan varietas padi tahan HDB dalam
rangka pengendalian penyakit HDB.

METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah 15 isolat bakteri Xoo yang berasal dari
beberapa daerah di Indonesia (Tabel 1), kentang, pepton, agar, Ca(NO3)2.4H2O,
Na2HPO4.12H2O, sukrosa, media Nutrient Broth, bufer STE, larutan SDS 10%,
Proteinase-K, larutan fenol, kloroform, EtOH 95%, bufer TE, bufer TAE 0.5x pH
7.5, agarosa, akuades steril, pewarna blue juice, marker 100bp DNA ladder, EtBr,
Go Taq master mix (Kappa), primer 63F (5’ CAG GCC TAA CAC ATG CAA
GTC 3’) dan 1387R (5’ GGG CGG WGT GTA CAA GGC 3’), enzim restriksi
RsaI, bufer tango, dan nuclease free water (ddH2O).
Alat
Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, tabung ulir, shaker, jarum
ose, tabung eppendorf, labu Erlenmeyer, pipet mikro, tip, pengaduk magnetik,
neraca analitik OHAUS GA 200, laminar air flow cabinet, pH meter, autoklaf,
microwave, oven, mikrofus 22R Beckman Coulter, perangkat elektroforesis, dan
perangkat PCR.

3

Tabel 1 Isolat Xanthomonas oryzae pv. oryzae dari beberapa wilayah di Indonesia
Kode Isolat
1
2
3
4
5
6
8
10
23D
28D
29D
59
60
61
1/96

Asal Isolat
Inpari 18
Inpari 18
C4
Mentikwangi
Lokal
Ciherang
Ciherang
Ciherang
Inpari10
Hipa6
Ciherang
Si Denok
Ciherang
Ciherang
Ciherang

Lokasi
Jatisari, Karawang
Cikalong wetan, Karawang
Gantar, Indramayu
Pabelan, Magelang
Kaliduren, Doroyudan
Kepanjen, Klaten
Mayudan
Sukamandi Jaya, Subang
Pusakaratu, Subang
Sukamandi
Ciasem, Subang
Comal, Pemalang
Comal, Pemalang
Pekuden, Pemalang
Pamanukan, Subang

Prosedur Analisis
Pembuatan Media Wakimoto Agar (IRRI 1996)
Sebanyak 62.5 g kentang dikupas lalu dimasukkan ke dalam gelas kimia
yang berisi 100 mL akuades. Kentang dimasukkan ke dalam microwave pada suhu
± 100 ºC sampai kentang tersebut empuk untuk diambil sarinya. Sari kentang
disaring kemudian ditambahkan kedalam 150 mL akuades. Sebanyak 0.125 g
Ca(NO3)2.4H2O, 0.5 g Na2HPO4.12H2O, 3.75 g sukrosa, dan 1.25 g pepton
dicampurkan kedalam campuran akuades dan sari kentang. Campuran tersebut
diaduk menggunakan pengaduk magnetik sampai semua bahan larut. Selanjutnya
pH larutan diukur menggunakan pH meter dan dibuat bernilai 7-8. Jika nilai pH
dibawah 7 maka larutan ditambahkan NaOH 1N. Jika nilai pH diatas 8 maka
larutan ditambahkan HCl 1N. Setelah nilai pH konstan, sebanyak 7.5 g agar
ditambahkan ke dalam larutan tersebut kemudian dipanaskan dalam microwave
hingga larut. Media yang telah larut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak
8 mL kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 1 atm dan suhu 121 ºC
selama 2 jam. Tabung reaksi kemudian dimiringkan dan didiamkan satu malam.
Peremajaan Isolat Xoo (IRRI 1996)
Isolat Xoo yang berada di agar miring diremajakan dengan cara
dipindahkan sebanyak satu ose penuh ke dalam WA agar miring yang telah dibuat
sebelumnya. Peremajaan ini dilakukan secara steril. Isolat bakteri yang telah
berada di agar miring kemudian dibiarkan tumbuh selama kurang lebih 3-5 hari
pada suhu ± 25 ºC sampai muncul koloni berwarna kuning dan berlendir.
Isolasi DNA Genom (Lazo et al. modifikasi 1987)
Sebanyak 5 mL kultur sel dalam NB disentrifus pada kecepatan 8000 rpm
selama 10 menit dan suhu 4 ºC. Pelet hasil sentrifus dicuci dan diresuspensi
dengan 1 mL bufer STE kemudian disentrifus kembali pada kecepatan 8000 rpm
selama 10 menit dan suhu 4 ºC. Pelet diresuspensi kembali dengan 200 µL bufer

4
STE kemudian ditambahkan 40 µL larutan SDS 10%. Suspensi diinkubasi dalam
oven pada suhu 65 ºC selama 1 jam 30 menit lalu didinginkan pada suhu ruang.
Suspensi ditambahkan 4 µL 10 mg/mL Proteinase-K lalu diinkubasi dalam oven
pada suhu 37 ºC selama minimal 4 jam.
Suspensi ditambahkan 200-400 µL bufer STE. Selanjutnya suspensi tersebut
ditambahkan larutan fenol dan kloroform masing-masing sebanyak 120 µL. Tahap
ini dilakukan secara perlahan sampai terbentuk emulsi. Suspensi yang telah
teremulsi lalu disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 15 menit atau 8000
rpm selama 15 menit. Supernatan mengandung DNA dipindahkan ke tabung
mikro steril dan dipresipitasi dengan menambahkan EtOH 95% dingin sebanyak
2x volume supernatan. Suspensi selanjutnya diinkubasi pada suhu -20 ºC selama
30 menit. Suspensi disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 2 menit lalu
supernatannya dibuang. Pelet dikeringudarakan selama kurang lebih 2 jam. DNA
hasil pengeringan pelet diresuspensi dalam 20 µL bufer TE yang mengandung 10
µg/mL RNase. DNA disimpan pada suhu -20 ºC untuk digunakan pada tahap
selanjutnya.
Amplifikasi Gen 16S-rRNA (Wahyudi et al. 2011)
Sebanyak 2 µL DNA ditambahkan dengan 10 µL nuclease free water.
Volume total reaksi PCR sebanyak 20 µL. Campuran bahan-bahan untuk PCR
atau cocktail terdiri dari 2 µL DNA, 12,5 µL Go Taq master mix, masing-masing
1 µL primer 63F dan 1387R, dan 8,5 µL ddH2O. Amplifikasi dilakukan pada
kondisi suhu denaturasi awal 94 ºC selama 5 menit dengan 1 siklus, denaturasi 94
ºC selama 1 menit 30 detik, annealing 55 ºC selama 45 detik, dan ekstensi 72 ºC
selama 1 menit dengan 30 siklus, ekstensi akhir 72 ºC selama 1 menit dengan 1
siklus, dan ditahan 15-4 ºC selama beberapa menit.
Digesti dengan Enzim Restriksi RsaI (Susilowati et al. 2010)
Hasil amplifikasi gen 16S-rRNA dari masing-masing sampel dipotong
dengan enzim restriksi RsaI (5’-GTAC). Reaksi pemotongan terdiri atas 10 µL
produk PCR, 18 µL ddH2O, 2 µL 10x buffer tango, dan 1 µL enzim restriksi.
Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 ºC selama ± 20 jam. Hasil
pemotongan dielektroforesis lalu divisualisasi di bawah UV transiluminator.
Elektroforesis gel agarosa (Susilowati et al. 2010)
Elektroforesis gel agarosa dimulai dengan pembuatan gel agarosa yang
terdiri dari campuran 1.8 g agarosa dan 100 mL bufer TAE 0.5x. Campuran
tersebut kemudian dipanaskan dalam microwave hingga larut. Setelah larut,
campuran tersebut dituang ke dalam cetakan pembuat gel elektroforesis lalu
disisipi dengan sisir atau comb untuk membentuk sumur. Gel agarosa ditunggu
sampai mengeras selama kurang lebih satu jam. Setelah mengeras, gel agarosa
diangkat dan dipindahkan ke dalam tangki elektroforesis. Sebanyak masingmasing 3 µL loading dye dan produk PCR 16S-rRNA hasil digesti enzim restriksi
dimasukkan ke dalam sumur gel. Marker VC 100 bp + DNA ladder sebanyak 2
µL dicampur dengan loading dye lalu dimasukkan ke dalam sumur gel. Hasil
elektroforesis divisualisasi dengan EtBr di bawah UV transiluminator.
Elektroforegram dijadikan data biner terhadap pola pita yang terbentuk dan dibuat
pohon filogenetiknya menggunakan program MVSP 3.2 dengan metode
unweighted pair group method arithmetic mean (UPGMA).

5

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Hasil Peremajaan Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
Sebanyak 15 isolat Xoo kultur koleksi Konservasi Mikrobiologi BBBiogen yang berasal dari beberapa daerah di Indonesia, diremajakan ke media
Wakimoto agar miring. Isolat kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-5
hari sehingga menghasilkan lendir berwarna kuning seperti pada Gambar 1.

Gambar 1 Hasil peremajaan Xanthomonas oryzae pv. oryzae dalam Wakimoto agar

miring
Hasil Isolasi DNA
Isolat Xoo yang telah diremajakan selanjutnya diisolasi DNA genomnya
menggunakan metode Lazo et al. modifikasi (1987). Elektroforegram hasil isolasi
DNA ditunjukkan pada Gambar 2.
1

2

3

4

5

6

8

10

23D 28D

29D

59

60

61

1/96

Gambar 2 Elektroforegram hasil isolasi DNA Xoo. Kode isolat 1 (Karawang), 2
(Karawang), 3 (Indramayu), 4 (Magelang), 5 (Doroyudan), 6 (Klaten), 8
(Mayudan), 10 (Subang), 23D (Subang), 28D (Sukamandi), 29D (Subang),
59 (Pemalang), 60 (Pemalang), 61 (Pemalang), 1/96 (Subang).

6

Amplikon Gen 16S-rRNA
Pita-pita DNA dalam elektroforegram menunjukkan bahwa DNA tersebut
dapat digunakan sebagai cetakan untuk amplifikasi. Gen 16S-rRNA diamplifikasi
dengan PCR sehingga menghasilkan produk PCR yang berada pada kisaran 14001500 bp (Gambar 3).
1

2

3

4

5

6

8

10

23D 28D 29D

59

60

61

1/96 M

1500 bp
1200 bp

Gambar 3 Amplikon Gen 16S-rRNA Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Kode isolat 1
(Karawang), 2 (Karawang), 3 (Indramayu), 4 (Magelang), 5 (Doroyudan), 6
(Klaten), 8 (Mayudan), 10 (Subang), 23D (Subang), 28D (Sukamandi), 29D
(Subang), 59 (Pemalang), 60 (Pemalang), 61 (Pemalang), 1/96 (Subang).

Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)
Setelah semua isolat Xoo berhasil diamplifikasi kemudian dipotong dengan
enzim restriksi RsaI. Pemotongan dengan enzim restriksi RsaI ini menghasilkan
13 pola pita ARDRA yang ditandai dengan huruf a sampai m (Gambar 4).
Penerjemahan elektroforegram hasil pemotongan dengan enzim restriksi RsaI
ditunjukkan pada Gambar 5.
M

1

a

2

b

3

c

4

d

5

e

6

f

8

g

10 23D 28D 29D

h

i

j

k

59

60

61

k

k

l

1

/96

m

Gambar 4 Hasil pemotongan gen 16S-rRNA Xoo dengan enzim restriksi RsaI.
M: penanda ukuran molekul 100 bp; a-m: pola ARDRA; Kode isolat 1
(Karawang), 2 (Karawang), 3 (Indramayu), 4 (Magelang), 5 (Doroyudan),
6 (Klaten), 8 (Mayudan), 10 (Subang), 23D (Subang), 28D (Sukamandi),
29D (Subang), 59 (Pemalang), 60 (Pemalang), 61 (Pemalang), 1/96
(Subang).

7

a

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

k

k

l

m

Gambar 5 Penerjemahan elektroforegram hasil pemotongan gen 16S-rRNA
dengan enzim restriksi RsaI dan pola ARDRA yang terbentuk

Penghitungan ukuran pita hasil pemotongan dengan enzim restriksi dilihat
berdasarkan marker yang digunakan. Ukuran pita terbesar 3000 bp terdapat pada
kode isolat 4 sedangkan pita terkecil 200 bp terdapat pada hampir setiap kode
isolat (Tabel 2). Sebanyak 13 pola ARDRA yang terbentuk dari hasil pemotongan
dengan enzim restriksi dijadikan data biner sebagai input data untuk pembentukan
pohon filogenetik (Tabel 3).
Tabel 2 Pengelompokkan ukuran pola pita hasil pemotongan dengan enzim
restriksi RsaI
Pola pita
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
k
l
m

Ukuran basa (bp)
200, 700, 400
200, 500, 600, 900, 1300-1400
200, 400, 500, 600, 900, 1300-1400
1300-1400, 3000
200, 400, 500, 700, 900, 1300-1400
200, 500, 600, 900
200, 500, 600, 700, 900, 1200, 1300-1400
200, 500, 900, 1200, 1300-1400
200, 700, 900, 1200, 1300-1400
200, 400, 700, 900, 1200, 1300-1400
200, 600, 900, 1300-1400
200, 900, 1300-1400
600, 900, 1300-1400

Data biner selanjutnya dimasukkan ke dalam software MVSP 3.2 dengan
metode unweighted pair group method arithmetic mean (UPGMA) untuk
pembentukan pohon filogenetik. Pohon filogenetik berdasarkan pola pita ARDRA
yang terbentuk menunjukkan dua klaster dari 15 isolat Xoo yang diuji. Satu isolat
masuk ke dalam klaster pertama yaitu 4 sedangkan isolat lainnya masuk ke dalam
klaster kedua yaitu 1, 2, 3, 5, 6, 8, 10, 23D, 28D, 29D, 59, 60, 61, dan 1/96.
Klaster kedua memiliki beberapa percabangan kecil yang menunjukkan hubungan
kekerabatan antar isolat (Gambar 6).

8
Tabel 3 Data biner pola pita hasil pemotongan dengan enzim restriksi RsaI
Ukuran
basa
(bp)
3000
1300
1200
900
700
600
500
400
200

1

2

3

4

5

6

8

10

0
0
0
0
1
0
0
1
1

0
1
0
1
0
1
1
0
1

0
1
0
1
0
1
1
1
1

1
1
0
0
0
0
0
0
0

0
1
0
1
1
0
1
1
1

0
0
0
1
0
1
1
0
1

0
1
1
1
1
1
1
0
1

0
1
1
1
0
0
1
0
1

23D 28D 29D
0
1
1
1
1
0
0
0
1

0
1
1
1
1
0
0
0
1

0
1
0
1
0
1
0
0
1

59

60

61

0
1
0
1
0
1
0
0
1

0
1
0
1
0
1
0
0
1

0
1
0
1
0
0
0
0
1

1

/96
0
1
0
1
0
1
0
0
0

Gambar 6 Pohon filogenetik Xoo berdasarkan pola pita pemotongan enzim RsaI. Kode
isolat 1 (Karawang), 2 (Karawang), 3 (Indramayu), 4 (Magelang), 5
(Doroyudan), 6 (Klaten), 8 (Mayudan), 10 (Subang), 23D (Subang), 28D
(Sukamandi), 29D (Subang), 59 (Pemalang), 60 (Pemalang), 61 (Pemalang),
1/96 (Subang).

Berdasarkan pohon filogenetik yang terbentuk, isolat dengan kode 29D, 59,
dan 60 memiliki hasil pola pita yang sama sehingga dikelompokkan dalam satu
pola pita. Kesamaan pola yang dihasilkan isolat 59 dan 60 tersebut dapat
disebabkan oleh kesamaan daerah asal ketiga isolat tersebut yaitu Pemalang. Isolat
29D berasal dari Subang, namun memiliki pola pita yang sama dengan isolat 59
dan 60. Hal ini dapat diartikan bahwa ketiga isolat tersebut memiliki kekerabatan
yang sangat dekat meskipun berada pada daerah yang berbeda. Isolat 1/96 dan 61
terdapat dalam satu percabangan dengan isolat 29D, 59, dan 60. Isolat 1/96
berasal dari Subang sedangkan 61 berasal dari daerah yang sama dengan isolat 59
dan 60 yaitu Pemalang. Meskipun memiliki pola pita yang berbeda, namun dapat
diartikan bahwa isolat 1/96 dan 61 memiliki kekerabatan yang cukup dekat
dengan isolat 29D, 59, dan 60.

9
Selanjutnya, isolat 5 memiliki satu percabangan dengan isolat 23D, 28D, 10
dan 8. Isolat 23D dan 28D berada dalam satu percabangan kecil. Kedua isolat
tersebut berada dalam daerah yang berbeda namun memiliki kekerabatan yang
cukup dekat. Isolat 10 dan 8 juga berada dalam satu percabangan kecil yang lain.
Kedua isolat ini juga berasal dari daerah yang berbeda namun memiliki
kekerabatan yang cukup dekat. Percabangan lain yang terbentuk yaitu isolat 6, 3,
dan 2. Isolat 6 berasal dari Klaten, 3 dari Indramayu, dan 2 dari Karawang. Ketiga
isolat ini memiliki kekerabatan yang juga cukup dekat meskipun berasal dari
daerah yang berbeda. Isolat 1 yang berasal dari daerah yang sama dengan isolat 2
terdapat dalam percabangan yang berbeda, namun masih dalam satu klaster besar
yang sama. Isolat 4 terdapat dalam klaster yang berbeda dengan isolat lain yang
diuji. Hal ini menunjukkan kekerabatan isolat 4 dengan yang lainnya cukup jauh.
Pembahasan
Hasil Peremajaan Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) merupakan bakteri Gram negatif
yang menyebabkan penyakit hawar daun bakteri (HDB). Perkembangan penyakit
HDB sangat dipengaruhi oleh kelembaban tinggi dan suhu relatif tinggi. Pada
musim hujan yang hari-harinya berawan, penyakit berkembang sangat baik. Daundaun yang menunjukkan gejala hawar, dalam keadaan lembab terutama di pagi
hari dapat dengan mudah ditemukan yaitu berupa koloni bakteri berupa butiran
berwarna kuning keemasan. Mekanisme kerusakan pada daun yang diakibatkan
Xoo diawali dengan masuknya patogen melalui bagian daun yang luka,
membukanya hidatoda atau stomata pada daun. Patogen akan memperbanyak diri
di sel epitel dan menyebar melalui xilem. Patogen di dalam xilem akan
berinteraksi dengan sel parenkim. Dalam beberapa hari, sel bakteri dan
polisakarida ekstraseluler (EPS) mengisi pembuluh xilem dan ooze keluar dari
hidatoda sehingga membentuk bulatan-bulatan pada permukaan daun. Hidatoda
merupakan struktur epidermis daun yang terspesialisasi untuk mengeluarkan air
saat daun terbuka (Liu et al. 2005).
Menurut Semangun (2004), bakteri Xoo berbentuk batang, 0,7-2,4 μm x
0,3-0,45 μm, tunggal atau berpasangan, berkapsul, tidak berspora, bergerak
dengan satu bulu cambuk (flagel) di ujung. Xoo menghasilkan pigmen kuning
berlendir yang bernama pigmen xanthomonadin (Liu et al. 2006). Isolat Xoo yang
digunakan merupakan kultur koleksi dari BB-Biogen, Bogor. Isolat Xoo yang
diremajakan dalam media agar miring dan diinkubasi selama 3-5 hari dalam suhu
ruang, menghasilkan warna kuning pada permukaan bagian agar (Gambar 1). Hal
ini menunjukkan adanya pigmen xanthomodin yang dihasilkan Xoo tersebut. Xoo
diinkubasi selama 3-5 hari dengan tujuan agar lendir atau koloni Xoo yang
dihasilkan Xoo tersebut sudah banyak. Suhu ruang digunakan untuk inkubasi
karena suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri Xoo berkisar antara 25-30 ºC.
Penggunaan Wakimoto agar (WA) dimaksudkan untuk meningkatkan
pertumbuhan bakteri Xoo karena dalam media ini mengandung unsur-unsur
nitrogen yang sangat dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri Xoo. Menurut IRRI
(2004), penyakit HDB yang disebabkan oleh Xoo ini dapat berkembang lebih
cepat pada tanah yang mengandung unsur nitrogen yang tinggi.

10
Bakteri Xoo agak sulit jika diisolasi langsung dari tumbuhan atau benih
yang sudah terinfeksi. Hal ini disebabkan pertumbuhan yang lambat dari Xoo itu
sendiri dan pertumbuhan yang lebih cepat pada kontaminan atau bakteri jenis lain.
Kontaminan tersebut dapat berupa bakteri jenis lain yang berwarna kuning juga
seperti Pantoea agglomerans dan bakteri saprofit mirip Xanthomonas (Zhao et al.
2007). Bakteri Xoo ini dapat ditumbuhkan dalam berbagai media seperti peptone
sucrose agar (PSA), nutrient broth yeast extract (NBY), growth factor agar (GF),
dan Wakimoto agar (WA) (Sakhtivel et al. 2001). Xoo tidak cocok ditumbuhkan
di dalam nutrient agar (NA) karena menghasilkan pertumbuhan yang sangat
lambat (EPPO 2007).
Klasifikasi Xoo adalah sebagai berikut:
Filum
: Prokaryota
Kelas
: Scizomycetes
Ordo
: Pseudomonadales
Famili
: Pseudomonadaceae
Genus
: Xanthomonas
Spesies
: Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(EPPO 2007)
Hasil Isolasi DNA
Isolasi DNA genom sangat penting dalam teknik molekuler yang
berhubungan dengan amplifikasi gen target. Konstruksi pustaka genom dan
pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA berasal dari
proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Oleh sebab itu isolasi DNA
genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk
konstruksi filogenetik dan juga pengklonan (Suharsono et al. 2006). Isolasi DNA
yang tepat dapat menghasilkan DNA yang terbebas dari kontaminan sehingga
dapat digunakan dalam berbagai analisis molekuler lanjutan (Restu et al. 2012).
Prinsip isolasi DNA genom yaitu memisahkan DNA kromosom atau
DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Langkah awal yang dilakukan
adalah memecah dinding sel dengan cara menambahkan detergen. Detergen yang
biasa digunakan dalam isolasi ini adalah sodium dodesyl sulfate (SDS). Ekstrak
sel ditambahkan protease untuk mendegradasi protein. Protein yang tersisa
dipresipitasi menggunakan fenol dan kloroform. Penambahan RNase pada tahap
selanjutnya bertujuan untuk mendegradasi RNA (Susanto 2012). Beberapa metode
yang digunakan untuk isolasi DNA diantaranya metode cetyl trimethyl ammonium
bromide (CTAB), metode Lazo et al. modifikasi 1987, dan isolasi menggunakan
kit. Metode CTAB digunakan untuk mengisolasi DNA dari tanaman yang
mengandung karbohidrat yang tinggi. Metode Lazo modifikasi bermanfaat untuk
mengisolasi DNA bakteri Gram negatif. Metode dengan menggunakan kit bersifat
cepat dan sederhana tetapi biaya yang yang harus dikeluarkan lebih mahal.
Metode ini dapat digunakan isolasi DNA bakteri Gram negatif dan Gram positif
(Surzycki 2000).
Metode isolasi DNA yang digunakan adalah metode Lazo et al. modifikasi
1987. Metode Lazo digunakan karena merupakan metode yang spesifik terhadap
bakteri Gram negatif. Hasil isolasi DNA divisualisasi dengan elektroforesis gel
agarosa untuk memastikan bahwa DNA terisolasi dengan baik. Beberapa isolat
seperti isolat dengan kode 28D, 60, dan 61 memiliki DNA yang terkontaminasi

11
oleh pengotor. Hal ini dapat terlihat dari smear yang terdapat pada
elektroforegram hasil isolasi DNA. Pengotor ini dapat disebabkan oleh protein
atau RNA. Penambahan protease dan RNase yang tidak tepat dapat menyebabkan
hasil isolasi DNA belum murni sehingga pengotor tersebut muncul dalam
elektroforegram. Beberapa isolat lain seperti isolat dengan kode 1, 5, dan 6
memiliki pita yang tipis. Hal ini disebabkan kode isolat tersebut memiliki
pertumbuhan yang lebih lambat pada saat ditumbuhkan dalam nutrient broth (NB)
sehingga pelet yang dihasilkan pada proses sentrifugasi hanya sedikit.
Amplikon Gen 16S-rRNA
Teknik yang akurat untuk identifikasi molekular prokariot khususnya
bakteri yaitu identifikasi terhadap gen penyandi 16S-rRNA yang dikenal juga
dengan sebutan ribotyping atau riboprinting. Identifikasi tersebut didasarkan pada
tingkat kesamaan dalam sekuens gen 16S-rRNA sebagai sidik jari genetik bakteri
atau disebut sekuens sidik jari (fingerprinting). Beberapa keuntungan dalam
analisis terhadap gen penyandi 16S-rRNA ini yaitu RNA secara umum dimiliki
semua bakteri dan merupakan unit yang konstan. Jika terdapat kemiripan atau
sedikit perbedaan basa pada sekuens nukleotida gen 16S-rRNA dari dua jenis
organisme maka kedua organisme tersebut memiliki hubungan kekerabatan yang
dekat ditinjau dari kedekatan secara evolusinya (Pangastuti 2006).
Identifikasi molekular dalam menganalisis keragaman genetik Xoo
menggunakan identifikasi terhadap gen penyandi 16S-rRNA. Sebanyak 15 isolat
Xoo dari beberapa daerah di Indonesia, dapat diamplifikasi gen penyandi 16SrRNAnya menggunakan primer 63F dan 1387R. Proses amplifikasi ini
menghasilkan produk pada kisaran ukuran 1400-1500 bp (Gambar 3). Hampir
setiap isolat menghasilkan pita tunggal yang cukup tebal kecuali isolat dengan
kode 1/96. Pita yang tebal tersebut menunjukkan bahwa DNA isolat teramplifikasi
dengan baik. Hal ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor yang mempengaruhi
PCR diantaranya optimasi PCR dan kesesuaian primer yang digunakan.
Optimasi PCR menyangkut suhu denaturasi DNA dan annealing
(penempelan) primer pada DNA cetakan. Suhu denaturasi yang terlalu rendah
dapat menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda sehingga tidak
memungkinkan terjadinya polimerisasi DNA baru. Proses penempelan primer
pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu optimum karena suhu yang
terlalu tinggi dapat menyebabkan amplifikasi tidak terjadi. Sebaliknya, suhu yang
terlalu rendah menyebabkan primer menempel pada sisi lain genom yang bukan
sisi homolognya sehingga dapat teramplifikasi daerah-daerah yang tidak spesifik
dalam genom tersebut. Suhu penempelan primer ini ditentukan berdasarkan
primer yang digunakan yang dipengaruhi oleh panjang dan komposisi primer.
Suhu penempelan sebaiknya sekitar 5 °C di bawah suhu leleh (Tm) (Stackebrandt
2002).
Faktor lain yang mempengaruhi proses PCR yaitu kesesuaian primer.
Kesesuaian primer merupakan salah satu hal penting dalam keberhasilan proses
PCR. Primer yang digunakan seharusnya bersifat spesifik. Primer yang digunakan
dalam amplifikasi gen 16S-rRNA ini merupakan primer spesifik yang dapat
mengamplifikasi gen tersebut. Gen penyandi 16S-RNA merupakan gen yang
terdapat pada setiap prokariot. Primer yang tidak spesifik dapat menyebabkan
teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang bukan sasarannya atau tidak ada

12
daerah genom yang teramplifikasi. Primer yang digunakan adalah primer spesifik
63F dan 1387R. Primer 63F memiliki panjang sekuen 21 nukleotida dan 1387R
sebanyak 18 nukleotida. Primer ini tidak membentuk struktur dupleks dengan
ujung 5’ yang dapat dikenali enzim eksonuklease dan tidak terdapat nukleotida
yang terpotong pada ujung 5’. Hal ini dapat mempengaruhi suhu annealing
(penempelan) primer (Pangastuti 2006).
Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA)
Amplified rDNA Restriction Analysis (ARDRA) merupakan teknik RFLP
yang digunakan untuk membedakan jenis bakteri misalnya berdasarkan gen
ribosomal DNA seperti 16S-rRNA. Teknik ini menggunakan enzim restriksi
untuk melihat polimorfisme dalam genom organisme. Situs enzim restriksi dari
genom suatu kelompok organisme yang kemudian berubah karena mutasi atau
berpindah karena genetic rearrangement dapat menyebabkan situs tersebut tidak
lagi dikenali oleh enzim atau enzim restriksi akan memotong daerah lain yang
berbeda. Proses ini menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmen DNA yang
berbeda ukurannya antara satu organisme dengan organisme lainnya.
Polimorfisme ini selanjutnya digunakan untuk membuat pohon filogenetik atau
dendogram kekerabatan kelompok (Sasaki et al. 2004).
Pohon filogenetik yang dibentuk berdasarkan pola pita ARDRA
menunjukkan dua klaster dari 15 isolat Xoo yang diuji. Kode isolat 4 memiliki
klaster yang berbeda sendiri atau berada pada satu klaster tersendiri. Klaster besar
lainnya berisikan isolat-isolat lain. Beberapa isolat memiliki kekerabatan yang
cukup dekat meskipun berasal dari daerah yang berbeda. Beberapa isolat tersebut
diantaranya 29D dengan 59 dan 60, isolat 1/96 dan 61 dengan 29D, 59 dan 60,
isolat 5 dengan 23D, 28D, 10 dan 8, isolat 6, 3, dan 2.
Enzim restriksi yang digunakan untuk memotong produk PCR 16S-rRNA
dari Xoo yaitu RsaI. Enzim RsaI merupakan enzim endonuklease restriksi
tetramerik atau memiliki sisi pengenalan empat basa sehingga bila penyebaran
nukleotida terjadi secara acak pada organisme dengan G+C sekitar 50% maka
setiap sekitar 256 pasang basa dapat diharapkan memiliki satu sisi pengenalan.
enzim restriksi tersebut menghasilkan sejumlah besar fragmen yang bervariasi
ukurannya (Susilowati et al. 2010). Enzim restriksi RsaI memotong dengan sifat
blunt end pada situs 5’...GT↓AC...3’ dan 3’...CA↑TG...5’. Pemotongan dengan
RsaI pada isolat Xoo yang diuji menghasilkan 13 pola pita ARDRA yang berbeda.
Pengelompokkan tersebut berdasarkan kesamaan di situs pemotongan enzim
restriksi RsaI pada setiap spesies.
Menurut Schlegel et al. 2003, tidak terdapat keragaman pada intraspesies
dan situs pemotongan yang terkonservasi pada spesies yang berdekatan
menunjukkan keragaman yang rendah. Hal ini berbanding terbalik dengan hasil
keragaman yang terbentuk dari Xoo yang diuji. Hasil pohon filogenetik yang
terbentuk menunjukkan keragaman yang cukup tinggi pada isolat Xoo yang diuji
meskipun berada dalam spesies yang sama. Keragaman genetik yang cukup tinggi
dari Xoo yang diuji dapat disebabkan perbedaan daerah asal setiap isolat.

13

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sebanyak 15 isolat Xoo yang diuji yang berasal dari beberapa daerah di
Indonesia, secara genetik menunjukkan keragaman yang cukup tinggi. Hal ini
terlihat dari banyaknya pola pita ARDRA yang terbentuk yaitu 13 pola. Analisis
pohon filogenetik menunjukkan antara satu isolat dengan isolat yang lain
memiliki kekerabatan yang cukup dekat meskipun berasal dari daerah yang
berbeda. Beberapa isolat tersebut diantaranya 29D (Subang) dengan 59
(Pemalang) dan 60 (Pemalang), isolat 1/96 (Subang) dan 61 (Pemalang) dengan
29D (Subang), 59 (Pemalang) dan 60 (Pemalang), isolat 5 (Doroyudan) dengan
23D (Subang), 28D (Sukamandi), 10 (Subang) dan 8 (Mayudan), isolat 6 (Klaten),
3 (Indramayu), dan 2 (Karawang).
Saran
Identifikasi molekuler yang cepat dan mudah seperti teknik ARDRA perlu
dikembangkan lagi untuk analisis keragaman genetik patogen lainnya. Selain itu,
setelah dilakukan analisis keragaman genetik Xoo diperlukan penelitian lebih
lanjut untuk membantu mengembangkan varietas padi tahan HDB dalam rangka
pengendalian penyakit HDB sehingga dapat diterapkan oleh petani.

DAFTAR PUSTAKA
[CABI] Commonwealth Agricultural Bureau International. 2008. Xanthomonas
oryzae pv. oryzae. Wallingford (UK): CABI.
[Ditjen TP] Direktorat Perlindungan Tanaman Pangan. 2011. Prakiraan Serangan
BLB pada Padi di Indonesia Masa Tanam Tahun 2011. Jakarta (ID): Ditjen TP.
[EPPO] European and Mediterranean Plant-Protection Organization.
2007. Xanthomonas oryzae. Bull OEPP/EPPO. 37: 543-553.
[IRRI] International Rice Research Institute. 2004. Bacterial leaf streak. Rice
Fact Sheet [Internet]. [6 September 2004]. Manila (PH): IRRI. hlm 1; [diunduh
2013 Okt 8]. Tersedia pada: http://www.knowledgebank.irri.org.
Keshavarz K, Sijam K, Abidin MHZ, Habibudin H, Nazerian E. 2011. Rapid
identification and differentiation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain with
primer 16S-23S rDNA from the rice fields in Peninsular Malaysia. Asian
Journal of Plant Pathology. 5(2): 93-99. doi: 10.3923/ajppaj.2011.93.99.
Liu DO, Ronald PC, Bogdanove AJ. 2005. A simple method of mass inoculation
of rice effective for both pathovars of Xanthomonas oryzae, and the
construction of comparable sets of host cDNA libraries spanning early stages
of bacterial leaf blight and bacterial leaf streak. Journal of Phytopathology.
153: 500-504.
Liu DO, Darnielle L, Bogdanove AJ. 2006. Xanthomonas oryzae pathovars:
model pathogen of a model crop. Molecular Plant Pathology. 75: 303-324. doi:
10.1111/j.1364-3703.2006.00344.x.

14
Pangastuti A. 2006. Definisi spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen
penyandi 16S rRNA dan gen penyandi protein. Biodiversitas. 3(7): 292-296.
Restu M, Mukrimin, Gusmiaty. 2012. Optimalisasi teknik ekstraksi dan isolasi
DNA tanaman suren (Toona sureni Merr.) untuk analisis keragaman genetik
berdasarkan random amplified polymorphic DNA (RAPD). J Natur Indonesia.
14(2): 138-142.
Sakthivel N, Mortensen CN, Mathur SB. 2001. Detection of Xanthomonas
campestris pv. oryzae in artificially inoculated and naturally infected rice seeds
and plants by molecular techniques. Appl Microbiol Biotechnol. 56: 435-441.
doi: 10.1007/s002530100641.
Sari IP. 2007. Keragaman genetik bakteri endofitik dan filosfer dari tanaman padi
(Oryza sativa). [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sasaki E, Osawa R, Nishitani Y, Whiley RA. 2004. ARDRA and RAPD analysis
of human and animal isolates of Streptococcus gallolyticus. J Vet Med Sci. 66:
1467-1470. doi: 10.1292/jvms.66.1467.
Semangun H. 2007. Penyakit-Penyakit Tanaman Hortikultura di Indonesia.
Yogyakarta (ID): Gadjah Mada University Pr.
Schlegel L, Grimont F, Grimont PAD, Bouvet A. 2003. Identification of Major
Streptococcal species by rrn-amplified ribosomal DNA restriction analysis. J
Clin Microbiol. 41: 657-666. doi: 10.1128/JCM.41.2.657-666.2003.
Stackebrandt E. 2002. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the
species definition in bacteriology. International Jurnal of Systematic and
Evolution Microbiology. 52: 1043-1047.
Suharsono, Widyastuti U. 2006. Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor (ID):
Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi IPB.
Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. New York (US):
Springer-Verlag.
Susanto AH. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Purwokerto (ID): Universitas
Jenderal Soedirman.
Susilowati DN, Nurul H, Tasliah, K Mulya. 2010. Keragaman bakteri endofitik
diisolasi dari empat varietas padi dengan metode ARDRA. Berita Biologi.
10(2): 241-248.
Zhao WJ, Zhu SF, Liao XL, Chen HY, Tan TW. 2007. Detection of Xanthomonas
oryzae pv. oryzae in seeds using a specific Taqman probe. Molecular
Biotechnology. 36: 119-127.

15
Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Peremajaan isolat Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Isolasi DNA genom

Elektroforesis gel agarosa

PCR 16S-rRNA

Elektroforesis gel agarosa

Digesti dengan enzim restriksi RsaI

Elektroforesis gel agarosa

Pembentukan data biner

Analisis data biner dengan software
MVSP

Profil setiap isolat dibandingkan

16

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 4 Agustus 1991 dari ayah Husin
dan ibu Asmuni. Penulis merupakan putri kedua dari empat bersaudara. Tahun
2009 penulis lulus dari SMU Negeri 77 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis
diterima di Program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti program S1 di IPB penulis pernah
bergabung dengan organisasi SERUM-G (Serambi Rukhiyah Mahasiswa FMIPA)
dan CREBs (Community Research and Education in Biochemistry Student) di
Departemen Biokimia IPB. Pada tahun 2012 penulis melaksanakan praktik
lapangan di Balai Besar Laboratorium Kesehatan, Jakarta dengan judul Penentuan
Kadar Logam Berat dalam Darah (Pb) dan Air Minum (As, Cd, Cr, Pb, dan Se)
dengan Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometry (ICP-OES).