Dasar Genetik Sifat Hiper Dan Hipo Respons Monyet Ekor Panjang (Macaca Fascicularis) Terhadap Diet Aterogenik
DASAR GENETIK SIFAT HIPER- DAN HIPO-RESPONS
MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK
ACHMAD TAHER
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Dasar Genetik Sifat
Hiper- dan Hipo-respons Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) terhadap
Diet Aterogenik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2016
Achmad Taher
NIM P063110011
RINGKASAN
ACHMAD TAHER. Dasar Genetik Sifat Hiper- dan Hipo-respons Monyet Ekor
Panjang (Macaca fascicularis) terhadap Diet Aterogenik. Dibimbing oleh DEDY
DURYADI SOLIHIN, SULISTIYANI, DONDIN SAJUTHI, dan DEWI APRI
ASTUTI
Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) merupakan satu dari spesies
satwa primata yang paling umum digunakan sebagai model dalam penelitian
biomedis. Sensitivitas spesies ini terhadap lemak jenuh dan kolesterol diet
menjadikannya sebagai model dalam mempelajari pengaruh diet terhadap profil
lipid plasma dan etiologi penyakit aterosklerosis pada manusia. Walaupun secara
umum bersifat sensitif (hiper-responder), namun terdapat pula individu monyet
ekor panjang yang kurang atau tidak sensitif terhadap perubahan diet (hiporesponder). Selama ini seleksi monyet ekor panjang hipo- dari hiper-responder
dilakukan dengan intervensi diet aterogenik selama 2 bulan. Cara ini tidak efisien
karena membutuhkan volume darah hewan dalam jumlah banyak dan
pengontrolan yang ketat terhadap diet. Penelitian ini dilakukan untuk mencari
metode yang mampu mengidentifikasi secara cepat monyet ekor panjang hipodari hiper-responder sehingga seleksi hewan menjadi lebih efisien. Pendekatan
yang digunakan adalah penanda genetik.
Penelitian ini menggunakan 22 ekor monyet ekor panjang hasil penangkaran
di Pusat Studi Satwa Primata Institut Petanian Bogor (PSSP IPB) dan terdiri dari
tiga tahapan, meliputi (1) Intervensi diet menggunakan diet aterogenik IPB-1 yang
berbahan baku lokal dan analisis variasi respons kadar kolesterol plasma. Tahap
ini bertujuan menyeleksi sensitivitas hewan berdasarkan status kolesterol plasma.
(2) Identifikasi variasi genetik umum, berupa polimorfisme nukleotida tunggal
(single nucleotide polymorphism, SNP) pada gen reseptor liporotein densitas
rendah (low density lipoprotein receptor, LDLR). Tahap ini bertujuan
mengelompokkan hewan berdasarkan polimorfisme umum. (3) Analisis ekspresi
gen LDLR dalam sel darah tepi berinti tunggal (peripheral blood mononuclear
cell, PBMC) dan membuat pustaka cDNA individu hipo-responder. Tahap ini
bertujuan menjelaskan mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan antara
variasi genetik dan variasi respons.
Analisis respons kadar kolesterol plasma setelah intervensi diet aterogenik
mengelompokkan hewan dalam tiga kategori, yaitu hipo-respons, hiper-respons,
dan ekstrem. Pengelompokkan individu monyet ekor panjang yang bersifat hiporespons berdasarkan status kolesterol plasma menunjukkan kesamaan dengan
pengelompokkan hewan berdasarkan jenis haplotipe pada intron 5 dan ekson 6.
Berdasarkan status kolesterol plasma terdapat 2 hewan dengan sifat hipo-respons,
sementara berdasarkan jenis haplotipe kedua hewan tersebut memiliki jenis
haplotipe yang sama, yaitu haplotipe CGGTG pada intron 5 dan haplotipe GC
pada ekson 6. Kesamaan pengelompokkan berdasarkan jenis haplotipe
menjadikan SNP yang diidentifikasi pada posisi IVS5−6 (dalam intron 5) dan
pada posisi 825 (dalam ekson 6) berpotensi digunakan sebagai penanda genetik
idenifikasi sifat respons. Alel C pada posisi IVS5−6 adalah penanda genetik bagi
monyet ekor panjang hiper-responder, sementara alel G untuk hewan yang bukan
hiper-responder. Alel G pada posisi 825 adalah penanda genetik bagi monyet ekor
panjang ekstrem. Selain itu alel T pada posisi −416 dalam promotor adalah
penanda genetik bagi monyet ekor panjang hipo-responder ekstrem dan alel C
pada posisi *167 dalam 3’UTR adalah penanda genetik bagi monyet ekor panjang
sangat ekstrem. Kelimpahan mRNA individu hipo-responder ekstrem yang lebih
tinggi dan individu sangat ekstrem yang lebih rendah dibandingkan individu lain
menunjukkan bagaimana mekanisme yang mendasari keterkaitan antara
polimorfisme dan sensitivitas hewan. Penggunaan penanda genetik merupakan
terobosan baru karena membuat seleksi hewan hipo- dan hiper-responder menjadi
lebih cepat dan efisien.
Kata kunci: LDLR, Macaca fascicularis, sifat respons, SNP
SUMMARY
ACHMAD TAHER. Genetic Basis of the Hyper- and Hypo-Response of Long
Tail Macaques (Macaca fascicularis) to the Atherogenic Diet. Supervised by
DEDY DURYADI SOLIHIN, SULISTIYANI, DONDIN SAJUTHI and DEWI
APRI ASTUTI
Long tail macaques or cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) are one
of the primate species, which are commonly used as models in biomedical
researches. The sensitivity of this species to saturated lipids and cholesterol diets
leads them to be as models in investigating the effect of diet to plasma lipids and
the etiology of the atherosclerosis diseases in human. Generally, even though this
species is sensitive (hyper-responder) to diet changes but some individuals may
show less sensitive and even insensitive to the diet changes (Hypo-responder).
The selections of the hypo-responder macaques from the hyper-responder ones are
commonly performed by intervention the atherogenic diet within 2 months. This
method is inefficient because it involves a large number of bloods and strict
controls of the diet. This research was conducted to find a method that can
identify promptly hypo- from the hyper-responder macaques so that selecting
animal became more efficient. The approach used was a genetic markers.
The research used 22 long tail macaques from captivity in the Primate
Research Center Bogor Agricultural University (PSSP IPB) and comprised three
stages. The first stage was diet intervention using IPB-1 atherogenic diet which
was local raw material contents, and response variation analysis of plasma
cholesterol levels. This stage purposed to select animal sensitivity based on
plasma cholesterol status. The second stage was identification of common genetic
variation like single nucleotide polymorphism (SNP) on low density lipoprotein
receptor gene (LDLR). This stage aimed to classify animals based on common
polymorphism. The third stage was to analyze expression of LDLR gene in
peripheral blood mononuclear cell (PBMC), and constructing of cDNA library of
hypo-response individual. This stage aimed to explain molecular mechanisms
underlying linkage between genetic variation and response variation.
Analysis of response to plasma cholesterol after intervention atherogenic
diet grouped the animal into three categories: hypo-response, hyper-response and
extreme. Individual grouping of the long tail macaques with hypo-response based
on plasma cholesterol status showed the similarity to the animal grouping based
on the haplotypes on intron 5 and exon 6. According to plasma cholesterol status,
2 animals were hypo-responsive, while based on haplotype type, both animals had
the same type of haplotypes, which were CGGTG haplotype in intron 5 and GC
haplotype in exon 6. The similarity of classification based on the haplotypes may
lead the identified SNP on position IVS5−6 (in intron 5) to be potentially used as
genetic marker for response identification. C allele on position IVS5−6 was
genetic marker for hyper-response long tail macaques, while G allele was for non
hyper-response animal. The G allele on position 825 was a genetic marker for
macaques having extreme responses. Besides that, T allele on position -416 in
promoter was genetic marker for extremely hypo-response long tail macaque,
whereas C allele on position *167 in 3’UTR was genetic marker for more extreme
long tail macaques. The high abundance of mRNA of the extremely individual
hypo-responder and low abundance of the more extreme individual in compared
to other individuals showed how mechanism underlying linkage between
polymorphism and sensitivity of animal. The use of genetic markers is a new
improvement method, which is quicker and more efficient, in the processes of
selecting hypo- and hyper-responsive animals.
Keywords: LDLR, Macaca fascicularis, responsiveness, SNP
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
DASAR GENETIK SIFAT HIPER- DAN HIPO-RESPONS
MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK
ACHMAD TAHER
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Primatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji pada Ujian Tertutup
:
1. Dr dr Irma Herawati Suparto, MS
2. Dr Ir R R Dyah Perwitasari, MSc
Penguji pada Sidang Promosi
:
1. Dr dr Irma Herawati Suparto, MS
2. Prof Dr Ibnu Maryanto
Judul Disertasi
Nama
NIM
: Dasar Genetik Sifat Hiper- dan Hipo-respons Monyet Ekor
Panjang (Macaca fascicularis) terhadap Diet Aterogenik
: Achmad Taher
: P063110011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA
Ketua
Drh Sulistiyani, MSc, PhD
Anggota
Prof drh Dondin Sajuthi, MT, PhD
Anggota
Prof Dr Ir Dewi Apri Astuti, MS
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Primatologi
Prof drh Dondin Sajuthi, MT, PhD
Tanggal Ujian Tertutup : 9 Juni 2016
Tanggal Sidang Promosi: 21 Juli 2016
Dekan Sekolah
Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak januari 2013 ini ialah genetik
satwa primata dengan judul Dasar genetik sifat hiper- dan hipo-respons monyet
ekor panjang (Macaca fascicularis) terhadap diet aterogenik. Penelitian ini
merupakan bagian dari proyek penelitian pada Pusat Studi Satwa Primata IPB
yang dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) Kementrian
Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia melalui dana Kerjasama
Penelitian Internasional dan Publikasi Ilmiah atas nama Prof Dr Ir Dewi Apri
Astuti MS dan dana BOPTN untuk Penelitian Unggulan Sesuai Mandat Pusat IPB
atas nama Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir Dedy Duryadi Solihin
DEA selaku ketua komisi, Ibu drh Sulistiyani MSc PhD, Bapak Prof drh Dondin
Sajuthi MT PhD, dan Ibu Prof Dr Ir Dewi Apri Astuti MS selaku anggota komisi
yang telah banyak memberi saran. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Ibu Dr dr Irma Herawati Suparto MS, Ibu Dr R R Dyah Perwitasari MSc, dan
Bapak Prof Dr Ibnu Maryanto selaku penguji luar komisi pada ujian tertutup dan
sidang promosi atas saran dan masukan yang diberikan. Tak lupa ucapan terima
kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr drh Joko Pamungkas MSc, Ibu Dr drh
Diah Iskandriati, dan Bapak Dr Uus Saepulloh, SSi Mbiomed, yang telah
membantu selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada
ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2016
Achmad Taher
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ...........................................................................
xv
1 PENDAHULUAN ...........................................................................
Latar Belakang .........................................................................
Perumusan Masalah .................................................................
Tujuan Penelitian .....................................................................
Manfaat Penelitian ...................................................................
Hipotesis...................................................................................
Kebaharuan (Novelty) Penelitian..............................................
Ruang Lingkup Penelitian ........................................................
1
1
6
7
7
7
7
7
2 SELEKSI MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
HIPER- DAN HIPO-RESPONDER BERDASARKAN STATUS
KOLESTEROL PLASMA ..............................................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
10
10
11
13
19
3 VARIASI GENETIK PADA DAERAH PROMOTOR GEN LDLR
DAN SIFAT RESPONS MONYET EKOR PANJANG
(Macaca fascicularis) TERHADAP DIET ATEROGENIK ...........
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
20
20
21
23
30
4 KERAGAMAN GENETIK DALAM 3’UTR GEN LDLR DAN SIFAT
RESPONS MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK...............................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
31
31
32
34
41
5 POLIMORFISME NUKLEOTIDA TUNGGAL PADA GEN LDLR DAN
SIFAT RESPONS MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK ...............................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
42
42
43
45
54
6 EKSPRESI GEN LDLR PADA MONYET EKOR PANJANG
YANG DIINDUKSI DIET ATEROGENIK ...................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
55
55
56
59
61
7 PEMBAHASAN UMUM ...............................................................
62
8 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................
69
DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................
70
RIWAYAT HIDUP ..............................................................................
81
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Komposisi diet aterogenik IPB-1
Bobot badan bulanan individual monyet ekor panjang
Rerata konsumsi diet bulanan individual monyet ekor panjang
Konsentrasi kolesterol plasma (TPC) bulanan individual
monyet ekor panjang
Konsumsi bahan kering, peningkatan bobot badan, dan konsentrasi
kolesterol plasma monyet ekor panjang setelah tiga bulan intervensi
diet aterogenik serta sifat responsnya berdasarkan status kolesterol
plasma
.........................................................................
Komposisi nukleotida sekuen promotor .......................................
Matriks jumlah perbedaan nukleotida antar pasangan sekuen ......
Uji homogenitas pola substitusi antar pasangan sekuen ..............
SNP dalam daerah promotor gen LDLR .......................................
Polimorfisme fungsional putatif yang ditemukan dalam
daerah promotor gen LDLR ..........................................................
Haplotipe yang dihasilkan dari 3 situs polimorfik pada daerah
Promotor dan disejajarkan dengan referensi (ref) monyet ekor
Panjang di GenBank (nomor aksesi XM_005587996.2) ..............
Komposisi nukleotida pada 3’UTR ..............................................
Matriks jumlah perbedaan nukleotida antar pasangan sekuen .....
Uji homogenitas pola substitusi antar pasangan sekuen .............
Haplotipe yang dihasilkan dari 4 situs polimorfik pada daerah
3’UTR dan disejajarkan dengan referensi (ref) monyet ekor
panjang di GenBank (nomor aksesi XM005587996.2).................
Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi
daerah target dalam gen LDLR .....................................................
Matriks jumlah perbedaan nukleotida antar pasangan sekuen ......
Uji homogenitas pola substitusi antar pasangan sekuen .............
Situs polimorfik yang diidentifikasi pada daerah intron 5 gen LDLR
dan haplotipe yang dihasilkan, dan disejajarkan dengan referensi
(ref) monyet rhesus di GenBank (nomor aksesi AY466854)........
Situs polimorfik yang diidentifikasi pada daerah ekson 6 gen
LDLR dan haplotipe yang dihasilkan, dan disejajarkan dengan
referensi (ref) monyet ekor panjang di GenBank
(nomor aksesi XM005587996.2) ..................................................
Variasi genetik berupa SNP dalam ekson 12 ................................
Monyet ekor panjang yang digunakan dalam penelitian, konsentrasi
kolesterol plasma dan sifat responsnya terhadap diet aterogenik .
Primer yang digunakan untuk amplifikasi cDNA gen LDLR
(http://primer3.wi.mit.edu/)
Tingkat ekspresi relatif gen LDLR ................................................
Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) pada gen LDLR .............
Perbandingan metode seleksi sensitivitas monyet ekor panjang
berdasarkan status kolesterol plasma dan penanda genetik .........
12
14
15
16
18
24
25
26
27
28
28
35
37
38
39
45
47
48
49
51
53
56
58
59
64
68
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Elemen pengatur transkripsi gen LDLR adalah yang terletak dalam
177 pb upstream dari kodon inisiasi (ATG), terutama dua boks
TATA dan tiga pengulangan. R1 dan R3 mengikat Sp1 yang
mengatur tingkat transkripsi basal, sedangkan R2 mengikat SREBP
2
yang menjalankan pengaturan transkripsi termediasi kolesterol
3’UTR gen LDLR manusia. Kotak putih ekson 18 dengan
kodon stop diikuti sekuen ARE dan kaya Alu. Letak tiga sekuen ARE
ditunjukkan oleh anak panah. Kotak hitam menunjukkan sekuen
Alu dalam 2,5 kb 3’UTR
3
Struktur LDL-R manusia. Bagian kanan adalah ekson yan
Mengkode protein dan bagian kiri adalah domain protein matang
4
9
Bagan kerangka pikir penelitian...............................................
Pita DNA berukuran 789 pb hasil amplifikasi PCR. 1 kb adalah
Marker DNA yang dgunakan, angka 1-6 adalah perwakilan
sampel hewan ...........................................................................
23
Rekonstruksi pohon filogenetik monyet ekor panjang
berdasarkan sekuen daerah promotor yang dibuat dengan
metode Neighbor Joining dengan bootstrop 1000 kali ............
29
Pita DNA berukuran 750 pb hasil amplifikasi PCR. 1 kb adalah
marker DNA yang digunakan, angka 7-14 adalah perwakilan
sampel hewan
34
Rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen 3’UTR yang
dibuat dengan metode Neighbor Joining dengan bootstrop
1000 kali. Angka yang terdapat pada cabang pohon
menunjukkan nilai bootstrop .................................................
40
46
Pita DNA berukuran 1010 pb hasil amplifikasi PCR
Rekonstruksi pohon filogenetik monyet ekor panjang
berdasarkan sekuen intron 5 yang dibuat dengan metode
Neighbor Joining dengan bootstrop 1000 kali. Angka yang
50
terdapat pada cabang menunjukkan nilai bootstrop
Pita DNA berukuran 184 pb hasil amplifikasi PCR
Keterangan: M=marker DNA 100 pb
51
Hasil elektroforesis SDS-PAGE terhadap RLFP yang menggunakan
enzim restriksi Tsp45I pada produk hasil amplifikasi. Sampel
hipo-responder (T3707 dan K30) memiliki 3 pita, sedangkan
sampel lain 4 pita
51
Elektroferogram dari tiga pola haplotipe
51
Pita-pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan pasangan primer
cDNA_1 (A), pasangan primer cDNA_2 (B), dan pasangan primer
cDNA-3 dan cDNA_4 (C). Amplifikasi PCR dengan pasangan
primer tersebut berturut-turut menghasilkan pita DNA berukuran
745,757, 621, dan 624 bp. Keterangan: M= Marker DNA 1 kb
60
Seleksi awal untuk memisahkan hewan hiper-responder dari
hipo-responder dan ekstrem berdasarkan SNP pada ekson 6
66
Seleksi lanjut untuk mendapatkan hewan murni hipo-respons dan
ekstrem berdasarkan SNP pada promotor dan 3’UTR
67
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) memiliki sejarah panjang
sebagai model satwa primata untuk mengkaji aterosklerosis pada manusia
karena bersifat respons terhadap induksi lemak dan kolesterol diet. Spesies
ini mengalami peningkatan kolesterol bila diberi diet tinggi lemak dan
kolesterol dan sejalan dengan peningkatan kolesterol plasma dalam waktu
lama mengalami aterosklerosis yang mirip dengan yang diamati pada
manusia. Mulai dari lesi retensi makrofag kaya lipid (sel busa) dan sel-sel
kekebalan lainnya di subendotelium, kemunculan garis-garis lemak di aorta
dan arteri koroner, perkembangan dari garis-garis lemak menjadi ateroma
berserat rumit dengan proliferasi sel-sel otot polos, hingga perkembangan
menjadi lesi lebih kompleks yang ditandai dengan nekrosis intima,
kalsifikasi, dan perdarahan. Selain itu, monyet ekor panjang yang diberi
makan diet eksperimental juga menunjukkan perkembangan yang sesuai
dengan tahapan penyakit secara klinik, termasuk iskemia dengan stenosis
arteri koroner dan kematian mendadak yang dihasilkan dari trombosis
oklusif dan infark miokard (Shelton et al. 2012).
Dalam kajian diet, peningkatan kolesterol plasma akibat intervensi
diet aterogenik hanya dapat diprediksi pada tingkat populasi, tetapi tidak
pada individual. Walaupun secara umum monyet ekor panjang bersifat
hiper-respons (hiper-responder) dan rentan terhadap hiperkolesterolemia
namun ada pula hewan dengan sifat hipo-respons (hipo-responder) yang
kurang atau tidak rentan terhadap hiperkolesterolemia. Konsep sifat respons
merujuk pada perbedaan yang besar dalam kadar kolesterol plasma yang
ditemukan diantara individu yang diberi diet serupa, terutama diet yang
mengandung lemak jenuh dan kolesterol dalam jumlah besar. Fenomena
sifat respons menunjukkan perbedaan sensitivitas individual terhadap
kolesterol diet dan merupakan sifat alamiah monyet ekor panjang karena
kekonsistenannya dalam setiap pengulangan eksperimen. Secara teori 10%
individu dalam populasi hipo-responder, 80% hiper-responder dan 10%
sisanya adalah individu ekstrem (Beynen et al. 1987). Individu hiperresponder menunjukkan perkembangan aterosklerosis yang nyata, sementara
individu hipo-responder tidak (Clarkson et al. 1988). Secara alami sulit
untuk membedakan individu monyet ekor panjang hipo- dari hiperresponder karena fluktuasi diet di alam yang berpengaruh pada konsentrasi
kolesterol plasma. Selama ini seleksi monyet ekor panjang hipo- dari hiperresponder dilakukan dengan intervensi diet aterogenik selama 2 bulan dan
sensitivitas hewan ditentukan berdasarkan status kolesterol plasma setelah
masa intervensi. Cara ini membutuhkan darah hewan dalam jumlah banyak
dan berulang setiap interval waktu tertentu serta pengontrolan yang ketat
terhadap diet (Clarkson et al. 1988; Turley et al. 1997).
Pada manusia, adanya variasi respons yang besar antar individu dan
kekonsistenan hiper- dan hipo-responder menunjukkan bahwa sifat respons
terkait dengan variasi genetik (Ordovas et al. 1995, Friedlander et al. 1999).
2
Kandidat gen yang potensial menyebabkan variasi respons terhadap diet
asam lemak jenuh dan tinggi kolesterol antara lain: klaster gen
apolipoprotein A-I, C-III dan A-IV, gen apolipoprotein B, gen
apolipoprotein E, gen pengkode
enzim-enzim yang terlibat dalam
metabolisme kolesterol (lipoprotein lipase, hepatik lipase, dan kolesterol 7αhidroksilase), dan gen reseptor lipoprotein densitas rendah (low density
lipoprotein receptor, LDLR) serta gen-gen lain seperti gen protein transfer
ester kolesterol (cholesterol ester transfer protein, CETP), gen protein
pengikat asam lemak usus (intestinal fatty acid-binding protein, FABP2)
dan gen neuropeptida (Masson et al. 2003).
Hiperkolesterolemia turunan (familial hypercholesterolemia, FH)
merupakan salah satu contoh keadaan hiperkolesterolemia akibat mutasi
pada gen LDLR yang secara nyata menyebabkan tingginya kadar kolesterol
LDL (LDL-C) plasma dan penyakit jantung koroner (PJK) dini (Hobbs et
al. 1990). Gen LDLR manusia, terletak pada kromosom 19p13.2, terdiri dari
18 ekson dan 17 intron yang membentang sepanjang 45 kilo basa (kb) dan
3’-untranslated region (3‟UTR). 3‟UTR meliputi hampir setengah dari
keseluruhan mRNA. Dua daerah yang diketahui mengatur transkripsi gen
LDLR adalah daerah promotor dan downstream gen (Gambar 1). Elemen
pengatur transkripsi pada daerah promotor terletak berkelompok dalam 280
pasang basa (pb) pada daerah upstream dari kodon awal. Elemen ini terdiri
atas dua boks TATA (TATA box) sebagai sisi awal transkripsi dan tiga
pengulangan tidak sempurna 16 pb kaya GC (Sudhof et al. 1987).
Pengulangan 1 (repeat 1, R1) dan pengulangan 3 (repeat 3, R3) memiliki
sisi pengikatan untuk faktor transkripsi specificity protein 1 (Sp1) dan
bertanggung jawab terhadap tingkat transkripsi basal, sementara
pengulangan 2 (repeat 2, R2) memiliki sisi elemen pengatur sterol-1 (sterol
regulatory element SRE-1) tempat protein pengatur sterol berikatan
sehingga meningkatkan transkripsi (Briggs et al. 1993).
Gambar 1 Elemen pengatur transkripsi gen LDLR adalah yang terletak
dalam 288 pb upstream dari kodon inisiasi (ATG), terutama dua
boks TATA dan tiga pengulangan. R1 dan R3 mengikat Sp1
yang mengatur tingkat transkripsi basal, sedangkan R2 mengikat
SREBP yang menjalankan pengaturan transkripsi termediasi
kolesterol
Transkripsi gen LDLR diatur oleh kadar kolesterol intraseluler (Smith
et al. 1990). Apabila kadar kolesterol intraseluler rendah, transkripsi
meningkat sehingga jumlah LDL-C pada permukaan sel yang diikat dan
3
diinternalisasi semakin banyak. Sebaliknya, apabila kadar kolesterol dalam
sel tinggi, transkripsi menurun sehingga pengambilan LDL-C ditekan
(Dawson et al. 1988). Pengaturan ini bergantung pada protein pengikat
elemen pengatur steroid (sterol regulatory element binding protein, SREBP)
yang berikatan pada SRE-1 dalam R2 (Brigg et al. 1993). Penempatan
SREBP inti diatur oleh protein lain yang disebut protein pengaktivasi
pemecah protein pengikat elemen pengatur steroid (SREBP cleavageactivating protein, SCAP). SCAP mempunyai domain peka sterol (sterol
sensong domain, SSD) sehingga apabila kandungan sterol intraseluler
rendah, SCAP mengaktifkan protease sisi-1 (site-1 protease, SIP) yang
memecah SREBP pada sisi pertama. Produk pecahan selanjutnya dipecah
oleh protease sisi-2, sehingga daerah domain-N aktif dari SREBP berpindah
ke inti untuk menginisiasi transkripsi (Hua et al. 1993; Wang et al. 1994).
Apabila kolesterol intraseluler tinggi, SCAP menginaktifkan SIP sehingga
menghambat pemecahan domain terminal-N (Dawson et al. 1988).
Daerah downstream utama yang merupakan pengatur gen LDLR
adalah 3‟UTR. Sekuen 3‟UTR telah lama dikenal sebagai daerah pengatur
penting ekspresi gen melalui stabilisasi mRNA-nya (Conne et al. 2000;
Chen et al. 2006). Beberapa kajian menunjukkan bahwa 3‟UTR dari gen
LDLR merupakan sisi penting dari regulasi pascatranskripsi (Goto et al.
1997; Wilson et al. 1997). Daerah ini mengandung elemen-cis yang
mempengaruhi stabilitas transkripsi, dan/atau mempengaruhi translasi
melalui interaksi dengan runutan 5‟ dari transkrip, misalnya untaian elemen
kaya AU (AU-rich element, ARE) yang mengandung motif penta-nukleotida
AUUUA dan berfungsi sebagai sisi pengenal bagi protein spesifik yang
meningkatkan laju pemendekan ekor poli A dan degradasi mRNA. 3‟UTR
gen LDLR manusia mengandung tiga segmen yang masing-masing
mengandung ARE. Selain itu daerah ini juga mengandung banyak sekuen
Alu (Gambar 2).
Gambar 2 3‟UTR gen LDLR manusia. Kotak putih ekson 18 dengan kodon
stop diikuti sekuen ARE dan kaya Alu. Letak tiga sekuen ARE
ditunjukkan oleh anak panah. Kotak hitam menunjukkan sekuen
Alu dalam 2,5 kb 3‟UTR
Gen LDLR menghasilkan mRNA dengan ukuran 5,3 kb dan
menyandikan protein dengan 860 asam amino. Reseptor LDL (LDL-R)
matang (tanpa peptida sinyal) yang dihasilkan adalah suatu protein 839
asam amino yang dapat dibagi menjadi 5 daerah fungsional yaitu: (i) daerah
pengikat ligan yang mengandung 292 asam amino (ekson 2-6), (ii) daerah
homolog prekursor faktor pertumbuhan epidermal yang mengandung 400
asam amino, yang dibutuhkan untuk disosiasi reseptor dari ligan dalam
4
lisosom dan mengembalikan reseptor ke membran plasma (ekson 7-14), (iii)
daerah terglikosilasi yang mengandung 58 asam amino (ekson 15), (iv)
daerah transmembran (ekson 16,17), dan (v) daerah sitoplasma (ekson
17,18) (Sudhof et al. 1985). Struktur LDL-R manusia ditunjukkan pada
Gambar 3. LDL-R berperan penting dalam dalam lintas metabolisme
lipoprotein yang dimediasi reseptor. LDL-R memodulasi kadar LDL-C
plasma dengan mengatur pengambilan partikel LDL oleh hati dan membawa
kolesterol menuju kelenjar adrenal dan gonad untuk sintesis hormon steroid
menuju hati untuk sintesis asam empedu (Goldstein et al. 2001).
Gambar 3 Struktur LDL-R manusia. Bagian kanan adalah ekson yang
mengkode protein dan bagian kiri adalah domain protein
matang
Mutasi pada gen LDLR menyebabkan sintesis LDL-R tidak terjadi
atau fungsinya menjadi tidak normal (Hobbs et al. 1990). Analisis terhadap
varian gen LDLR terkait FH diperkirakan ada 1066 mutasi atau penyusunan
ulang pada gen LDLR, 65% (n=689) diantaranya adalah substitusi DNA,
24% (n=260) penyusunan ulang beberapa DNA (100 pb). Substitusi dan penyusunan ulang
terjadi sepanjang gen, 839 dalam daerah ekson (93 nonsense, 499 missense,
dan 247 penyusunan ulang beberapa DNA), 86 dalam daerah intron, dan 24
dalam daerah promotor. Proporsi terbanyak pada ekson terjadi dalam daerah
pengikat ligan (ekson 2-6) dan daerah prekursor EGF (ekson 7-14) (Leigh et
al. 2008).
Selain karena mutasi, adanya variasi genetik umum pada gen LDLR
berupa polimorfisme nukleotida tunggal (single nucleotide polymorphism,
SNP), juga telah dilaporkan mempengaruhi variasi normal dalam profil lipid
plasma. Boright et al. (1998) yang mengkaji keterkaitan polimorfisme sr688
5
(1773C>T) dalam ekson 12 terhadap kadar LDL-C menunjukkan bahwa
pengaruh rerata (dari rerata sampel) dari alel 1773T terhadap LDL-C adalah
+3.9 mg/dL, sementara pengaruh rerata dari alel 1773C adalah −6,2 mg/dL.
Pengaruh kedua alel tersebut kecil tetapi nyata. Perubahan nukleotida dalam
ekson 12 ini tidak mengubah asam amino, sehingga disimpulkan bahwa
SNP ini berada dalam linkage disequilibrium dengan varian fungsional
lainnya. Knoblauch et al. (2002) yang mengkaji pengaruh haplotipe SNP
umum dari gen LDLR menunjukkan keberadaan SNP pada rs5930
(26462G>A dalam ekson 10), rs5925 (33078A>G dalam ekson 13), dan
rs5927 (36138C>T alam ekson 15) yang dikelompokkan ke dalam 7
haplotipe: GTG, GTA, GCG, GCA, ATG, ATA, dan ACG. Haplotipe GTG
adalah haplotipe yang terkait dengan profil lipid karena secara nyata
menurunkan total kolesterol sebesar 0,32 mg/dl dan LDL-C sebesar 0,41
mg/dl. Kajian lebih luas yang meliputi SNP, rs2228671 (13109C>T dalam
ekson 2), rs885765 (18896A>C dalam intron 4), rs5930 (26462G>A dalam
ekson 10), rs5925 (33078A>G dalam ekson 13), rs5927 (36138C>T dalam
ekson 15), Pvu II intron 15, C/T dan rs1433099 (44857C>T dalam 3‟UTR)
menunjukkan bahwa kontribusi haplotipe gen LDLR terhadap varian LDL-C
adalah 5%, HDL-C 6% dan LDL/HDL 2% dan tidak ada dari polimorfisme
yang dilaporkan memiliki pengaruh fungsional sehingga dianggap berada
dalam linkage disequilibrium dengan polimorfisme penyebab variasi
(Knoblauch et al. 2004).
SNP rs688 (1773C>T dalam ekson 12) yang potensial terkait dengan
perubahan ekspresi gen LDLR telah dilaporkan oleh Zhu et al. (2007).
Wanita homozigot dengan alel 1773T mempunyai efisiensi penyambungan
ekson 12 yang menurun sekitar 8,6% dibandingkan wanita homozigot
dengan alel 1773C. Alel 1773T mengarah pada peningkatan jumlah
transkrip LDLR tanpa ekson 12 sehingga menghasilkan perubahan kerangka
baca dan protein terminasi dini. Pada kajian ini alel 1773T terkait dengan
kenaikan 10% dalam total kolesterol dan LDL-C pada wanita
pramenopause. Di sisi lain, penurunan efisiensi penyambungan tidak nyata
pada pria. Perbedaan ini disebabkan pengaruh modulasi estrogen pada
SRp40, faktor penyambungan prediksi yang mengikat pada enhancer
splising ekson (ESE). SNP 1773C>T tidak mengubah runutan asam amino,
tetapi berada di dalam daerah ESE. Ini adalah SNP umum fungsional
potensial pertama dalam gen LDLR manusia yang dilaporkan. Beberapa
kajian terkait genom secara luas (genome wide association studies, GWAS)
yang dilakukan selama dekade terakhir menunjukkan bahwa variabilitas
pada gen LDLR terkait dengan kadar LDL-C (Sandu et al. 2008; Kathiresan
et al. 2008; Willer et al. 2008). Saat ini gen LDLR merupakan salah satu gen
kandidat penyebab hiperkolesterolemia poligenik (Teslovich et al. 2010; De
Castro-Oros et al. 2013) dan termasuk dalam skor gen LDL-C, walaupun
mekanismenya masih belum diketahui (Talmud et al. 2013).
Seperti pada manusia, reseptor LDL pada genus macaca, termasuk
monyet ekor panjang, juga mempunyai peran penting dalam metabolisme
lipid dan memiliki mekanisme yang sama dengan yang terjadi pada manusia
(Turley et al. 1995). Dengan demikian identifikasi polimorfisme yang
terjadi pada gen LDLR dan analisis kuantitatif ekspresi gen, termasuk
6
ekspresi messenger RNA (mRNA), akan berdampak penting pada
pemahaman mengenai kerentanan terhadap kejadian dan perkembangan
penyakit dalam organisme model tersebut.
Informasi mengenai variasi genetik pada spesies dalam genus macaca
yang banyak digunakan sebagai organisme model dalam penelitian
biomedis telah banyak dilaporkan. Sebagian besar spesies model ini
menunjukkan variabilitas genetik terkait asal geografis (Tosi dan Coke
2007; Zinner et al. 2009; Haus et al. 2013). Data sekuen lima daerah
genomik (150 kb) pada 9 monyet rhesus (M. mulatta) asal Cina dan 38 asal
india menunjukkan bahwa densitas SNP 7,25 per kb dalam rhesus asal Cina
dan 5,8 per kb dalam rhesus asal India (Hernandez et al. 2007). Kajian
terhadap sekuen genom utuh 3 monyet rhesus India menunjukkan
keberadaan lebih dari 3 juta SNP (Fawcett 2011). Dalam subspesies Pan
troglodytes verus, simpanse Afrika Barat yang paling umum digunakan di
laboratorium penelitian biomedis, rerata heterosigositas diperkirakan
0,0008, sedangkan subspesies P. t troglodytes dari Afrika tengah
diperkirakan dua kali lebih tinggi (Chimpanzee Sequencing and Analysis
Consortium 2005). Tanpa memperhitungkan tambahan variasi pada
subspesies Timur (P. t schweinfurthi), kedua subspesies memiliki rerata
heterosigositas 0,00019. Scally et al. (2012) menemukan bahwa dua gorila
dataran rendah barat memiliki tingkat heterosigositas minimal 1,8 per kb,
sedangkan gorila dataran rendah timur menunjukkan tingkat heterosigositas
setengahnya. Semua perkiraan tingkat heterosigositas pada kera dan macaca
menunjukkan keragaman lebih tinggi daripada yang diamati pada manusia
(Abecasis et al. 2012; Yuan et al. 2012; Rogers dan Gibbs 2014).
Sebagai spesies out-bred monyet ekor panjang juga menunjukkan
variasi genetik yang cukup besar (Yan et al. 2011; Higashino et al. 2012;
Ogawa dan Vallender 2014). Beberapa diantaranya adalah polimorfisme
fungsional dalam gen yang terlibat lintas metabolik dan inflamasi (Flynn et
al. 2009; Uno et al. 2010; Blancher et al. 2012; Wu dan Adkins 2012).
Walaupun demikian belum ada data yang menunjukkan variasi genetik pada
gen LDLR dan keterkaitannya dengan sifat respons monyet ekor panjang
terhadap diet aterogenik.
Perumusan Masalah
Monyet ekor panjang memiliki perbedaan sensitivitas terhadap
perubahan diet. Selama ini seleksi monyet ekor panjang hiper- dan hiporesponder untuk kajian heterogenitas metabolik dari kolesterol diet dan
aterogenesis dilakukan melalui pemberian diet aterogenik selama dua bulan.
Cara seleksi ini tidak efisien karena membutuhkan volume darah hewan
dalam jumlah banyak dan pengontrolan yang ketat terhadap diet. Oleh
karena itu perlu dikembangkan metode lain yang lebih cepat dan sederhana,
yaitu menggunakan pendekatan variasi genetik. Keterkaitan variasi genetik
umum pada gen LDLR manusia dengan variasi profil normal lipid plasma
menunjukkan bahwa variasi serupa kemungkinan juga dapat berkontribusi
pada variasi respons monyet ekor panjang terhadap terhadap diet aterogenik.
Hal ini didukung tingginya variasi genetik pada monyet ekor panjang dan
7
kesamaan peran LDL-R dalam mengatur homeostasis kolesterol antara
manusia dan monyet ekor panjang. Untuk itu pada penelitian ini dilakukan
analisis variasi genetik umum pada gen LDLR monyet ekor dan
keterkaitannya dengan sifat respons hewan terhadap diet aterogenik.
Tujuan Penelitian
Tujuan utama penelitian ini adalah mendapatkan penanda genetik sifat
hiper- dan hipo-respons monyet ekor panjang terhadap diet aterogenik.
Untuk mencapai tujuan utama tersebut, penelitian ini memiliki beberapa
beberapa tujuan khusus, yaitu
1. Menyeleksi hewan sesuai sifat responsnya berdasarkan status kolesterol
plasma setelah diintervensi diet aterogenik selama tiga bulan.
2. Mengelompokkan hewan berdasarkan polimorfisme nukleotida tunggal
(SNP) dalam gen LDLR.
3. Menjelaskan mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan antara
variasi genetik dan variasi respons.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat dalam seleksi monyet ekor panjang sebagai
hewan model dalam penelitian aterosklerosis. Penggunaan penanda genetik
membuat seleksi hewan hipo- dari hiper-responder menjadi lebih cepat dan
efisien.
Hipotesis
Variasi genetik umum pada gen LDLR berkaitan dengan sifat hiperatau hipo-respons monyet ekor panjang terhadap diet aterogenik
Kebaharuan (Novelty) Penelitian
Berdasarkan kajian literatur, hingga saat ini belum ada data genetik
mengenai variasi umum pada gen LDLR monyet ekor panjang dan kaitannya
dengan sifat hiper- atau hipo-respons terhadap diet tinggi kolesterol.
Penelitian ini menghasilkan informasi baru mengenai SNP pada gen LDLR
monyet ekor panjang yang berpotensi sebagai penanda genetik untuk
menyeleksi sensitivitas hewan terhadap diet aterogenik.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini difokuskan pada analisis terhadap gen LDLR untuk
menunjukkan bahwa sifat hiper- atau hipo-respon monyet ekor panjang
terhadap diet aterogenik berkaitan dengan variasi genetik berupa SNP pada
gen tersebut. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi:
1. Tahap pertama diawali dengan intervensi diet terhadap 22 monyet ekor
panjang jantan dewasa menggunakan diet aterogenik IPB-1 yang
berbahan baku lokal selama tiga bulan. Setelah tiga bulan dilakukan
8
analisis variasi respons kadar kolesterol plasma untuk menyeleksi
sensitivitas hewan berdasarkan status kolesterol plasma. Tahapan ini
dibahas dalam Bab II.
2. Tahap kedua adalah identifikasi variasi genetik umum pada gen LDLR.
Identifikasi dilakukan pada daerah pengatur yaitu promotor dan 3‟UTR,
ekson dan intron gen LDLR. Analisis genetik dilakukan untuk
mengelompokkan hewan berdasarkan polimorfisme umum. Tahapan ini
dibahas dalam Bab III, IV, dan V.
3. Tahap ketiga adalah analisis ekspresi gen LDLR dan membuat pustaka
cDNA individu hipo-responder. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan
mengukur kelimpahan mRNA dalam sel darah tepi berinti tunggal
(peripheral blood mononuclear cell, PBMC). Analisis ini dilakukan
untuk menjelaskan mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan
antara variasi genetik dan variasi respons. Tahapan ini dibahas dalam
Bab VI.
Kesamaan individu hewan dalam pengelompokkan berdasarkan dua
analisis yang berbeda menunjukkan keterkaitan variasi genetik terhadap
sensitivitas, sementara pengukuran kelimpahan mRNA gen menunjukkan
bagaimana mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan antara
polimorfisme dan sensitivitas hewan. Dengan demikian polimorfisme dapat
dijadikan sebagai dasar dalam melakukan seleksi hewan hipo- dari hiperresponder yang digunakan sebagai model dalam penelitian biomedis terkait
aterosklerosis. Secara skematis kerangka pikir rencana penelitian ini
ditunjukkan pada Gambar 4.
9
Intervensi diet aterogenik
Identifikasi variasi
genetik umum
Promotor
dan 3‟UTR
Ekson
Analisis variasi
respons kolesterol
plasma
Kadar kolesterol
total plasma
(mg/dL)
Analisis
ekspresi gen
Profil mRNA
dan sekuensing
cDNA
Intron
Individu
hiper-responder
Polimorfisme
nukleotida tunggal
(SNP)
Individu
hipo-responder
Penanda genetik
Dasar seleksi hipo- dari hiper-responder
Hewan model dalam penelitian biomedis terkait aterosklerosis
Gambar 4 Bagan kerangka pikir penelitian
10
2 SELEKSI MONYET EKOR PANJANG (Macaca
fascicularis) HIPER- DAN HIPO-RESPONDER
BERDASARKAN STATUS KOLESTEROL PLASMA
[Selection of Hyper- and Hyporesponder Cynomolgus
Macaque (Macaca fascicularis) Based on the Status of Plasma
Cholesterol]
Abstract
The effectiveness of atherogenic diet in raising plasma cholesterol
level of cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) can be predicted for
population, but not for individuals. This study aimed to evaluate the
individual plasma cholesterol of cynomolgus macaques in response to IPB-1
atherogenic diet and to select the animals according their responsiveness
based on the status of plasma cholesterol after intervention of atherogenic
diet. The animals under study were 22 adult male monkeys from the animal
facility of Primate Research Center Bogor Agricultural University (PSSP
IPB). All animals were intervened with the IPB-1 atherogenic diet for three
months and individual plasma cholesterol was evaluated in a monthly basis.
The results showed that the macaques‟ plasma cholesterol had increased
significantly (P
MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK
ACHMAD TAHER
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Dasar Genetik Sifat
Hiper- dan Hipo-respons Monyet Ekor Panjang (Macaca fascicularis) terhadap
Diet Aterogenik adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2016
Achmad Taher
NIM P063110011
RINGKASAN
ACHMAD TAHER. Dasar Genetik Sifat Hiper- dan Hipo-respons Monyet Ekor
Panjang (Macaca fascicularis) terhadap Diet Aterogenik. Dibimbing oleh DEDY
DURYADI SOLIHIN, SULISTIYANI, DONDIN SAJUTHI, dan DEWI APRI
ASTUTI
Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) merupakan satu dari spesies
satwa primata yang paling umum digunakan sebagai model dalam penelitian
biomedis. Sensitivitas spesies ini terhadap lemak jenuh dan kolesterol diet
menjadikannya sebagai model dalam mempelajari pengaruh diet terhadap profil
lipid plasma dan etiologi penyakit aterosklerosis pada manusia. Walaupun secara
umum bersifat sensitif (hiper-responder), namun terdapat pula individu monyet
ekor panjang yang kurang atau tidak sensitif terhadap perubahan diet (hiporesponder). Selama ini seleksi monyet ekor panjang hipo- dari hiper-responder
dilakukan dengan intervensi diet aterogenik selama 2 bulan. Cara ini tidak efisien
karena membutuhkan volume darah hewan dalam jumlah banyak dan
pengontrolan yang ketat terhadap diet. Penelitian ini dilakukan untuk mencari
metode yang mampu mengidentifikasi secara cepat monyet ekor panjang hipodari hiper-responder sehingga seleksi hewan menjadi lebih efisien. Pendekatan
yang digunakan adalah penanda genetik.
Penelitian ini menggunakan 22 ekor monyet ekor panjang hasil penangkaran
di Pusat Studi Satwa Primata Institut Petanian Bogor (PSSP IPB) dan terdiri dari
tiga tahapan, meliputi (1) Intervensi diet menggunakan diet aterogenik IPB-1 yang
berbahan baku lokal dan analisis variasi respons kadar kolesterol plasma. Tahap
ini bertujuan menyeleksi sensitivitas hewan berdasarkan status kolesterol plasma.
(2) Identifikasi variasi genetik umum, berupa polimorfisme nukleotida tunggal
(single nucleotide polymorphism, SNP) pada gen reseptor liporotein densitas
rendah (low density lipoprotein receptor, LDLR). Tahap ini bertujuan
mengelompokkan hewan berdasarkan polimorfisme umum. (3) Analisis ekspresi
gen LDLR dalam sel darah tepi berinti tunggal (peripheral blood mononuclear
cell, PBMC) dan membuat pustaka cDNA individu hipo-responder. Tahap ini
bertujuan menjelaskan mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan antara
variasi genetik dan variasi respons.
Analisis respons kadar kolesterol plasma setelah intervensi diet aterogenik
mengelompokkan hewan dalam tiga kategori, yaitu hipo-respons, hiper-respons,
dan ekstrem. Pengelompokkan individu monyet ekor panjang yang bersifat hiporespons berdasarkan status kolesterol plasma menunjukkan kesamaan dengan
pengelompokkan hewan berdasarkan jenis haplotipe pada intron 5 dan ekson 6.
Berdasarkan status kolesterol plasma terdapat 2 hewan dengan sifat hipo-respons,
sementara berdasarkan jenis haplotipe kedua hewan tersebut memiliki jenis
haplotipe yang sama, yaitu haplotipe CGGTG pada intron 5 dan haplotipe GC
pada ekson 6. Kesamaan pengelompokkan berdasarkan jenis haplotipe
menjadikan SNP yang diidentifikasi pada posisi IVS5−6 (dalam intron 5) dan
pada posisi 825 (dalam ekson 6) berpotensi digunakan sebagai penanda genetik
idenifikasi sifat respons. Alel C pada posisi IVS5−6 adalah penanda genetik bagi
monyet ekor panjang hiper-responder, sementara alel G untuk hewan yang bukan
hiper-responder. Alel G pada posisi 825 adalah penanda genetik bagi monyet ekor
panjang ekstrem. Selain itu alel T pada posisi −416 dalam promotor adalah
penanda genetik bagi monyet ekor panjang hipo-responder ekstrem dan alel C
pada posisi *167 dalam 3’UTR adalah penanda genetik bagi monyet ekor panjang
sangat ekstrem. Kelimpahan mRNA individu hipo-responder ekstrem yang lebih
tinggi dan individu sangat ekstrem yang lebih rendah dibandingkan individu lain
menunjukkan bagaimana mekanisme yang mendasari keterkaitan antara
polimorfisme dan sensitivitas hewan. Penggunaan penanda genetik merupakan
terobosan baru karena membuat seleksi hewan hipo- dan hiper-responder menjadi
lebih cepat dan efisien.
Kata kunci: LDLR, Macaca fascicularis, sifat respons, SNP
SUMMARY
ACHMAD TAHER. Genetic Basis of the Hyper- and Hypo-Response of Long
Tail Macaques (Macaca fascicularis) to the Atherogenic Diet. Supervised by
DEDY DURYADI SOLIHIN, SULISTIYANI, DONDIN SAJUTHI and DEWI
APRI ASTUTI
Long tail macaques or cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) are one
of the primate species, which are commonly used as models in biomedical
researches. The sensitivity of this species to saturated lipids and cholesterol diets
leads them to be as models in investigating the effect of diet to plasma lipids and
the etiology of the atherosclerosis diseases in human. Generally, even though this
species is sensitive (hyper-responder) to diet changes but some individuals may
show less sensitive and even insensitive to the diet changes (Hypo-responder).
The selections of the hypo-responder macaques from the hyper-responder ones are
commonly performed by intervention the atherogenic diet within 2 months. This
method is inefficient because it involves a large number of bloods and strict
controls of the diet. This research was conducted to find a method that can
identify promptly hypo- from the hyper-responder macaques so that selecting
animal became more efficient. The approach used was a genetic markers.
The research used 22 long tail macaques from captivity in the Primate
Research Center Bogor Agricultural University (PSSP IPB) and comprised three
stages. The first stage was diet intervention using IPB-1 atherogenic diet which
was local raw material contents, and response variation analysis of plasma
cholesterol levels. This stage purposed to select animal sensitivity based on
plasma cholesterol status. The second stage was identification of common genetic
variation like single nucleotide polymorphism (SNP) on low density lipoprotein
receptor gene (LDLR). This stage aimed to classify animals based on common
polymorphism. The third stage was to analyze expression of LDLR gene in
peripheral blood mononuclear cell (PBMC), and constructing of cDNA library of
hypo-response individual. This stage aimed to explain molecular mechanisms
underlying linkage between genetic variation and response variation.
Analysis of response to plasma cholesterol after intervention atherogenic
diet grouped the animal into three categories: hypo-response, hyper-response and
extreme. Individual grouping of the long tail macaques with hypo-response based
on plasma cholesterol status showed the similarity to the animal grouping based
on the haplotypes on intron 5 and exon 6. According to plasma cholesterol status,
2 animals were hypo-responsive, while based on haplotype type, both animals had
the same type of haplotypes, which were CGGTG haplotype in intron 5 and GC
haplotype in exon 6. The similarity of classification based on the haplotypes may
lead the identified SNP on position IVS5−6 (in intron 5) to be potentially used as
genetic marker for response identification. C allele on position IVS5−6 was
genetic marker for hyper-response long tail macaques, while G allele was for non
hyper-response animal. The G allele on position 825 was a genetic marker for
macaques having extreme responses. Besides that, T allele on position -416 in
promoter was genetic marker for extremely hypo-response long tail macaque,
whereas C allele on position *167 in 3’UTR was genetic marker for more extreme
long tail macaques. The high abundance of mRNA of the extremely individual
hypo-responder and low abundance of the more extreme individual in compared
to other individuals showed how mechanism underlying linkage between
polymorphism and sensitivity of animal. The use of genetic markers is a new
improvement method, which is quicker and more efficient, in the processes of
selecting hypo- and hyper-responsive animals.
Keywords: LDLR, Macaca fascicularis, responsiveness, SNP
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB.
DASAR GENETIK SIFAT HIPER- DAN HIPO-RESPONS
MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK
ACHMAD TAHER
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Primatologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
Penguji pada Ujian Tertutup
:
1. Dr dr Irma Herawati Suparto, MS
2. Dr Ir R R Dyah Perwitasari, MSc
Penguji pada Sidang Promosi
:
1. Dr dr Irma Herawati Suparto, MS
2. Prof Dr Ibnu Maryanto
Judul Disertasi
Nama
NIM
: Dasar Genetik Sifat Hiper- dan Hipo-respons Monyet Ekor
Panjang (Macaca fascicularis) terhadap Diet Aterogenik
: Achmad Taher
: P063110011
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA
Ketua
Drh Sulistiyani, MSc, PhD
Anggota
Prof drh Dondin Sajuthi, MT, PhD
Anggota
Prof Dr Ir Dewi Apri Astuti, MS
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Primatologi
Prof drh Dondin Sajuthi, MT, PhD
Tanggal Ujian Tertutup : 9 Juni 2016
Tanggal Sidang Promosi: 21 Juli 2016
Dekan Sekolah
Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak januari 2013 ini ialah genetik
satwa primata dengan judul Dasar genetik sifat hiper- dan hipo-respons monyet
ekor panjang (Macaca fascicularis) terhadap diet aterogenik. Penelitian ini
merupakan bagian dari proyek penelitian pada Pusat Studi Satwa Primata IPB
yang dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) Kementrian
Pendidikan dan Kebudayaan Republik Indonesia melalui dana Kerjasama
Penelitian Internasional dan Publikasi Ilmiah atas nama Prof Dr Ir Dewi Apri
Astuti MS dan dana BOPTN untuk Penelitian Unggulan Sesuai Mandat Pusat IPB
atas nama Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Ir Dedy Duryadi Solihin
DEA selaku ketua komisi, Ibu drh Sulistiyani MSc PhD, Bapak Prof drh Dondin
Sajuthi MT PhD, dan Ibu Prof Dr Ir Dewi Apri Astuti MS selaku anggota komisi
yang telah banyak memberi saran. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Ibu Dr dr Irma Herawati Suparto MS, Ibu Dr R R Dyah Perwitasari MSc, dan
Bapak Prof Dr Ibnu Maryanto selaku penguji luar komisi pada ujian tertutup dan
sidang promosi atas saran dan masukan yang diberikan. Tak lupa ucapan terima
kasih penulis sampaikan kepada Bapak Dr drh Joko Pamungkas MSc, Ibu Dr drh
Diah Iskandriati, dan Bapak Dr Uus Saepulloh, SSi Mbiomed, yang telah
membantu selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada
ayah, ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2016
Achmad Taher
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ................................................................................
xiv
DAFTAR GAMBAR ...........................................................................
xv
1 PENDAHULUAN ...........................................................................
Latar Belakang .........................................................................
Perumusan Masalah .................................................................
Tujuan Penelitian .....................................................................
Manfaat Penelitian ...................................................................
Hipotesis...................................................................................
Kebaharuan (Novelty) Penelitian..............................................
Ruang Lingkup Penelitian ........................................................
1
1
6
7
7
7
7
7
2 SELEKSI MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
HIPER- DAN HIPO-RESPONDER BERDASARKAN STATUS
KOLESTEROL PLASMA ..............................................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
10
10
11
13
19
3 VARIASI GENETIK PADA DAERAH PROMOTOR GEN LDLR
DAN SIFAT RESPONS MONYET EKOR PANJANG
(Macaca fascicularis) TERHADAP DIET ATEROGENIK ...........
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
20
20
21
23
30
4 KERAGAMAN GENETIK DALAM 3’UTR GEN LDLR DAN SIFAT
RESPONS MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK...............................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
31
31
32
34
41
5 POLIMORFISME NUKLEOTIDA TUNGGAL PADA GEN LDLR DAN
SIFAT RESPONS MONYET EKOR PANJANG (Macaca fascicularis)
TERHADAP DIET ATEROGENIK ...............................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
42
42
43
45
54
6 EKSPRESI GEN LDLR PADA MONYET EKOR PANJANG
YANG DIINDUKSI DIET ATEROGENIK ...................................
Pendahuluan ............................................................................
Bahan dan Metode ...................................................................
Hasil dan Pembahasan..............................................................
Simpulan .................................................................................
55
55
56
59
61
7 PEMBAHASAN UMUM ...............................................................
62
8 SIMPULAN DAN SARAN ............................................................
69
DAFTAR PUSTAKA ..........................................................................
70
RIWAYAT HIDUP ..............................................................................
81
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Komposisi diet aterogenik IPB-1
Bobot badan bulanan individual monyet ekor panjang
Rerata konsumsi diet bulanan individual monyet ekor panjang
Konsentrasi kolesterol plasma (TPC) bulanan individual
monyet ekor panjang
Konsumsi bahan kering, peningkatan bobot badan, dan konsentrasi
kolesterol plasma monyet ekor panjang setelah tiga bulan intervensi
diet aterogenik serta sifat responsnya berdasarkan status kolesterol
plasma
.........................................................................
Komposisi nukleotida sekuen promotor .......................................
Matriks jumlah perbedaan nukleotida antar pasangan sekuen ......
Uji homogenitas pola substitusi antar pasangan sekuen ..............
SNP dalam daerah promotor gen LDLR .......................................
Polimorfisme fungsional putatif yang ditemukan dalam
daerah promotor gen LDLR ..........................................................
Haplotipe yang dihasilkan dari 3 situs polimorfik pada daerah
Promotor dan disejajarkan dengan referensi (ref) monyet ekor
Panjang di GenBank (nomor aksesi XM_005587996.2) ..............
Komposisi nukleotida pada 3’UTR ..............................................
Matriks jumlah perbedaan nukleotida antar pasangan sekuen .....
Uji homogenitas pola substitusi antar pasangan sekuen .............
Haplotipe yang dihasilkan dari 4 situs polimorfik pada daerah
3’UTR dan disejajarkan dengan referensi (ref) monyet ekor
panjang di GenBank (nomor aksesi XM005587996.2).................
Pasangan primer yang digunakan untuk mengamplifikasi
daerah target dalam gen LDLR .....................................................
Matriks jumlah perbedaan nukleotida antar pasangan sekuen ......
Uji homogenitas pola substitusi antar pasangan sekuen .............
Situs polimorfik yang diidentifikasi pada daerah intron 5 gen LDLR
dan haplotipe yang dihasilkan, dan disejajarkan dengan referensi
(ref) monyet rhesus di GenBank (nomor aksesi AY466854)........
Situs polimorfik yang diidentifikasi pada daerah ekson 6 gen
LDLR dan haplotipe yang dihasilkan, dan disejajarkan dengan
referensi (ref) monyet ekor panjang di GenBank
(nomor aksesi XM005587996.2) ..................................................
Variasi genetik berupa SNP dalam ekson 12 ................................
Monyet ekor panjang yang digunakan dalam penelitian, konsentrasi
kolesterol plasma dan sifat responsnya terhadap diet aterogenik .
Primer yang digunakan untuk amplifikasi cDNA gen LDLR
(http://primer3.wi.mit.edu/)
Tingkat ekspresi relatif gen LDLR ................................................
Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) pada gen LDLR .............
Perbandingan metode seleksi sensitivitas monyet ekor panjang
berdasarkan status kolesterol plasma dan penanda genetik .........
12
14
15
16
18
24
25
26
27
28
28
35
37
38
39
45
47
48
49
51
53
56
58
59
64
68
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Elemen pengatur transkripsi gen LDLR adalah yang terletak dalam
177 pb upstream dari kodon inisiasi (ATG), terutama dua boks
TATA dan tiga pengulangan. R1 dan R3 mengikat Sp1 yang
mengatur tingkat transkripsi basal, sedangkan R2 mengikat SREBP
2
yang menjalankan pengaturan transkripsi termediasi kolesterol
3’UTR gen LDLR manusia. Kotak putih ekson 18 dengan
kodon stop diikuti sekuen ARE dan kaya Alu. Letak tiga sekuen ARE
ditunjukkan oleh anak panah. Kotak hitam menunjukkan sekuen
Alu dalam 2,5 kb 3’UTR
3
Struktur LDL-R manusia. Bagian kanan adalah ekson yan
Mengkode protein dan bagian kiri adalah domain protein matang
4
9
Bagan kerangka pikir penelitian...............................................
Pita DNA berukuran 789 pb hasil amplifikasi PCR. 1 kb adalah
Marker DNA yang dgunakan, angka 1-6 adalah perwakilan
sampel hewan ...........................................................................
23
Rekonstruksi pohon filogenetik monyet ekor panjang
berdasarkan sekuen daerah promotor yang dibuat dengan
metode Neighbor Joining dengan bootstrop 1000 kali ............
29
Pita DNA berukuran 750 pb hasil amplifikasi PCR. 1 kb adalah
marker DNA yang digunakan, angka 7-14 adalah perwakilan
sampel hewan
34
Rekonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen 3’UTR yang
dibuat dengan metode Neighbor Joining dengan bootstrop
1000 kali. Angka yang terdapat pada cabang pohon
menunjukkan nilai bootstrop .................................................
40
46
Pita DNA berukuran 1010 pb hasil amplifikasi PCR
Rekonstruksi pohon filogenetik monyet ekor panjang
berdasarkan sekuen intron 5 yang dibuat dengan metode
Neighbor Joining dengan bootstrop 1000 kali. Angka yang
50
terdapat pada cabang menunjukkan nilai bootstrop
Pita DNA berukuran 184 pb hasil amplifikasi PCR
Keterangan: M=marker DNA 100 pb
51
Hasil elektroforesis SDS-PAGE terhadap RLFP yang menggunakan
enzim restriksi Tsp45I pada produk hasil amplifikasi. Sampel
hipo-responder (T3707 dan K30) memiliki 3 pita, sedangkan
sampel lain 4 pita
51
Elektroferogram dari tiga pola haplotipe
51
Pita-pita DNA hasil amplifikasi PCR dengan pasangan primer
cDNA_1 (A), pasangan primer cDNA_2 (B), dan pasangan primer
cDNA-3 dan cDNA_4 (C). Amplifikasi PCR dengan pasangan
primer tersebut berturut-turut menghasilkan pita DNA berukuran
745,757, 621, dan 624 bp. Keterangan: M= Marker DNA 1 kb
60
Seleksi awal untuk memisahkan hewan hiper-responder dari
hipo-responder dan ekstrem berdasarkan SNP pada ekson 6
66
Seleksi lanjut untuk mendapatkan hewan murni hipo-respons dan
ekstrem berdasarkan SNP pada promotor dan 3’UTR
67
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Monyet ekor panjang (Macaca fascicularis) memiliki sejarah panjang
sebagai model satwa primata untuk mengkaji aterosklerosis pada manusia
karena bersifat respons terhadap induksi lemak dan kolesterol diet. Spesies
ini mengalami peningkatan kolesterol bila diberi diet tinggi lemak dan
kolesterol dan sejalan dengan peningkatan kolesterol plasma dalam waktu
lama mengalami aterosklerosis yang mirip dengan yang diamati pada
manusia. Mulai dari lesi retensi makrofag kaya lipid (sel busa) dan sel-sel
kekebalan lainnya di subendotelium, kemunculan garis-garis lemak di aorta
dan arteri koroner, perkembangan dari garis-garis lemak menjadi ateroma
berserat rumit dengan proliferasi sel-sel otot polos, hingga perkembangan
menjadi lesi lebih kompleks yang ditandai dengan nekrosis intima,
kalsifikasi, dan perdarahan. Selain itu, monyet ekor panjang yang diberi
makan diet eksperimental juga menunjukkan perkembangan yang sesuai
dengan tahapan penyakit secara klinik, termasuk iskemia dengan stenosis
arteri koroner dan kematian mendadak yang dihasilkan dari trombosis
oklusif dan infark miokard (Shelton et al. 2012).
Dalam kajian diet, peningkatan kolesterol plasma akibat intervensi
diet aterogenik hanya dapat diprediksi pada tingkat populasi, tetapi tidak
pada individual. Walaupun secara umum monyet ekor panjang bersifat
hiper-respons (hiper-responder) dan rentan terhadap hiperkolesterolemia
namun ada pula hewan dengan sifat hipo-respons (hipo-responder) yang
kurang atau tidak rentan terhadap hiperkolesterolemia. Konsep sifat respons
merujuk pada perbedaan yang besar dalam kadar kolesterol plasma yang
ditemukan diantara individu yang diberi diet serupa, terutama diet yang
mengandung lemak jenuh dan kolesterol dalam jumlah besar. Fenomena
sifat respons menunjukkan perbedaan sensitivitas individual terhadap
kolesterol diet dan merupakan sifat alamiah monyet ekor panjang karena
kekonsistenannya dalam setiap pengulangan eksperimen. Secara teori 10%
individu dalam populasi hipo-responder, 80% hiper-responder dan 10%
sisanya adalah individu ekstrem (Beynen et al. 1987). Individu hiperresponder menunjukkan perkembangan aterosklerosis yang nyata, sementara
individu hipo-responder tidak (Clarkson et al. 1988). Secara alami sulit
untuk membedakan individu monyet ekor panjang hipo- dari hiperresponder karena fluktuasi diet di alam yang berpengaruh pada konsentrasi
kolesterol plasma. Selama ini seleksi monyet ekor panjang hipo- dari hiperresponder dilakukan dengan intervensi diet aterogenik selama 2 bulan dan
sensitivitas hewan ditentukan berdasarkan status kolesterol plasma setelah
masa intervensi. Cara ini membutuhkan darah hewan dalam jumlah banyak
dan berulang setiap interval waktu tertentu serta pengontrolan yang ketat
terhadap diet (Clarkson et al. 1988; Turley et al. 1997).
Pada manusia, adanya variasi respons yang besar antar individu dan
kekonsistenan hiper- dan hipo-responder menunjukkan bahwa sifat respons
terkait dengan variasi genetik (Ordovas et al. 1995, Friedlander et al. 1999).
2
Kandidat gen yang potensial menyebabkan variasi respons terhadap diet
asam lemak jenuh dan tinggi kolesterol antara lain: klaster gen
apolipoprotein A-I, C-III dan A-IV, gen apolipoprotein B, gen
apolipoprotein E, gen pengkode
enzim-enzim yang terlibat dalam
metabolisme kolesterol (lipoprotein lipase, hepatik lipase, dan kolesterol 7αhidroksilase), dan gen reseptor lipoprotein densitas rendah (low density
lipoprotein receptor, LDLR) serta gen-gen lain seperti gen protein transfer
ester kolesterol (cholesterol ester transfer protein, CETP), gen protein
pengikat asam lemak usus (intestinal fatty acid-binding protein, FABP2)
dan gen neuropeptida (Masson et al. 2003).
Hiperkolesterolemia turunan (familial hypercholesterolemia, FH)
merupakan salah satu contoh keadaan hiperkolesterolemia akibat mutasi
pada gen LDLR yang secara nyata menyebabkan tingginya kadar kolesterol
LDL (LDL-C) plasma dan penyakit jantung koroner (PJK) dini (Hobbs et
al. 1990). Gen LDLR manusia, terletak pada kromosom 19p13.2, terdiri dari
18 ekson dan 17 intron yang membentang sepanjang 45 kilo basa (kb) dan
3’-untranslated region (3‟UTR). 3‟UTR meliputi hampir setengah dari
keseluruhan mRNA. Dua daerah yang diketahui mengatur transkripsi gen
LDLR adalah daerah promotor dan downstream gen (Gambar 1). Elemen
pengatur transkripsi pada daerah promotor terletak berkelompok dalam 280
pasang basa (pb) pada daerah upstream dari kodon awal. Elemen ini terdiri
atas dua boks TATA (TATA box) sebagai sisi awal transkripsi dan tiga
pengulangan tidak sempurna 16 pb kaya GC (Sudhof et al. 1987).
Pengulangan 1 (repeat 1, R1) dan pengulangan 3 (repeat 3, R3) memiliki
sisi pengikatan untuk faktor transkripsi specificity protein 1 (Sp1) dan
bertanggung jawab terhadap tingkat transkripsi basal, sementara
pengulangan 2 (repeat 2, R2) memiliki sisi elemen pengatur sterol-1 (sterol
regulatory element SRE-1) tempat protein pengatur sterol berikatan
sehingga meningkatkan transkripsi (Briggs et al. 1993).
Gambar 1 Elemen pengatur transkripsi gen LDLR adalah yang terletak
dalam 288 pb upstream dari kodon inisiasi (ATG), terutama dua
boks TATA dan tiga pengulangan. R1 dan R3 mengikat Sp1
yang mengatur tingkat transkripsi basal, sedangkan R2 mengikat
SREBP yang menjalankan pengaturan transkripsi termediasi
kolesterol
Transkripsi gen LDLR diatur oleh kadar kolesterol intraseluler (Smith
et al. 1990). Apabila kadar kolesterol intraseluler rendah, transkripsi
meningkat sehingga jumlah LDL-C pada permukaan sel yang diikat dan
3
diinternalisasi semakin banyak. Sebaliknya, apabila kadar kolesterol dalam
sel tinggi, transkripsi menurun sehingga pengambilan LDL-C ditekan
(Dawson et al. 1988). Pengaturan ini bergantung pada protein pengikat
elemen pengatur steroid (sterol regulatory element binding protein, SREBP)
yang berikatan pada SRE-1 dalam R2 (Brigg et al. 1993). Penempatan
SREBP inti diatur oleh protein lain yang disebut protein pengaktivasi
pemecah protein pengikat elemen pengatur steroid (SREBP cleavageactivating protein, SCAP). SCAP mempunyai domain peka sterol (sterol
sensong domain, SSD) sehingga apabila kandungan sterol intraseluler
rendah, SCAP mengaktifkan protease sisi-1 (site-1 protease, SIP) yang
memecah SREBP pada sisi pertama. Produk pecahan selanjutnya dipecah
oleh protease sisi-2, sehingga daerah domain-N aktif dari SREBP berpindah
ke inti untuk menginisiasi transkripsi (Hua et al. 1993; Wang et al. 1994).
Apabila kolesterol intraseluler tinggi, SCAP menginaktifkan SIP sehingga
menghambat pemecahan domain terminal-N (Dawson et al. 1988).
Daerah downstream utama yang merupakan pengatur gen LDLR
adalah 3‟UTR. Sekuen 3‟UTR telah lama dikenal sebagai daerah pengatur
penting ekspresi gen melalui stabilisasi mRNA-nya (Conne et al. 2000;
Chen et al. 2006). Beberapa kajian menunjukkan bahwa 3‟UTR dari gen
LDLR merupakan sisi penting dari regulasi pascatranskripsi (Goto et al.
1997; Wilson et al. 1997). Daerah ini mengandung elemen-cis yang
mempengaruhi stabilitas transkripsi, dan/atau mempengaruhi translasi
melalui interaksi dengan runutan 5‟ dari transkrip, misalnya untaian elemen
kaya AU (AU-rich element, ARE) yang mengandung motif penta-nukleotida
AUUUA dan berfungsi sebagai sisi pengenal bagi protein spesifik yang
meningkatkan laju pemendekan ekor poli A dan degradasi mRNA. 3‟UTR
gen LDLR manusia mengandung tiga segmen yang masing-masing
mengandung ARE. Selain itu daerah ini juga mengandung banyak sekuen
Alu (Gambar 2).
Gambar 2 3‟UTR gen LDLR manusia. Kotak putih ekson 18 dengan kodon
stop diikuti sekuen ARE dan kaya Alu. Letak tiga sekuen ARE
ditunjukkan oleh anak panah. Kotak hitam menunjukkan sekuen
Alu dalam 2,5 kb 3‟UTR
Gen LDLR menghasilkan mRNA dengan ukuran 5,3 kb dan
menyandikan protein dengan 860 asam amino. Reseptor LDL (LDL-R)
matang (tanpa peptida sinyal) yang dihasilkan adalah suatu protein 839
asam amino yang dapat dibagi menjadi 5 daerah fungsional yaitu: (i) daerah
pengikat ligan yang mengandung 292 asam amino (ekson 2-6), (ii) daerah
homolog prekursor faktor pertumbuhan epidermal yang mengandung 400
asam amino, yang dibutuhkan untuk disosiasi reseptor dari ligan dalam
4
lisosom dan mengembalikan reseptor ke membran plasma (ekson 7-14), (iii)
daerah terglikosilasi yang mengandung 58 asam amino (ekson 15), (iv)
daerah transmembran (ekson 16,17), dan (v) daerah sitoplasma (ekson
17,18) (Sudhof et al. 1985). Struktur LDL-R manusia ditunjukkan pada
Gambar 3. LDL-R berperan penting dalam dalam lintas metabolisme
lipoprotein yang dimediasi reseptor. LDL-R memodulasi kadar LDL-C
plasma dengan mengatur pengambilan partikel LDL oleh hati dan membawa
kolesterol menuju kelenjar adrenal dan gonad untuk sintesis hormon steroid
menuju hati untuk sintesis asam empedu (Goldstein et al. 2001).
Gambar 3 Struktur LDL-R manusia. Bagian kanan adalah ekson yang
mengkode protein dan bagian kiri adalah domain protein
matang
Mutasi pada gen LDLR menyebabkan sintesis LDL-R tidak terjadi
atau fungsinya menjadi tidak normal (Hobbs et al. 1990). Analisis terhadap
varian gen LDLR terkait FH diperkirakan ada 1066 mutasi atau penyusunan
ulang pada gen LDLR, 65% (n=689) diantaranya adalah substitusi DNA,
24% (n=260) penyusunan ulang beberapa DNA (100 pb). Substitusi dan penyusunan ulang
terjadi sepanjang gen, 839 dalam daerah ekson (93 nonsense, 499 missense,
dan 247 penyusunan ulang beberapa DNA), 86 dalam daerah intron, dan 24
dalam daerah promotor. Proporsi terbanyak pada ekson terjadi dalam daerah
pengikat ligan (ekson 2-6) dan daerah prekursor EGF (ekson 7-14) (Leigh et
al. 2008).
Selain karena mutasi, adanya variasi genetik umum pada gen LDLR
berupa polimorfisme nukleotida tunggal (single nucleotide polymorphism,
SNP), juga telah dilaporkan mempengaruhi variasi normal dalam profil lipid
plasma. Boright et al. (1998) yang mengkaji keterkaitan polimorfisme sr688
5
(1773C>T) dalam ekson 12 terhadap kadar LDL-C menunjukkan bahwa
pengaruh rerata (dari rerata sampel) dari alel 1773T terhadap LDL-C adalah
+3.9 mg/dL, sementara pengaruh rerata dari alel 1773C adalah −6,2 mg/dL.
Pengaruh kedua alel tersebut kecil tetapi nyata. Perubahan nukleotida dalam
ekson 12 ini tidak mengubah asam amino, sehingga disimpulkan bahwa
SNP ini berada dalam linkage disequilibrium dengan varian fungsional
lainnya. Knoblauch et al. (2002) yang mengkaji pengaruh haplotipe SNP
umum dari gen LDLR menunjukkan keberadaan SNP pada rs5930
(26462G>A dalam ekson 10), rs5925 (33078A>G dalam ekson 13), dan
rs5927 (36138C>T alam ekson 15) yang dikelompokkan ke dalam 7
haplotipe: GTG, GTA, GCG, GCA, ATG, ATA, dan ACG. Haplotipe GTG
adalah haplotipe yang terkait dengan profil lipid karena secara nyata
menurunkan total kolesterol sebesar 0,32 mg/dl dan LDL-C sebesar 0,41
mg/dl. Kajian lebih luas yang meliputi SNP, rs2228671 (13109C>T dalam
ekson 2), rs885765 (18896A>C dalam intron 4), rs5930 (26462G>A dalam
ekson 10), rs5925 (33078A>G dalam ekson 13), rs5927 (36138C>T dalam
ekson 15), Pvu II intron 15, C/T dan rs1433099 (44857C>T dalam 3‟UTR)
menunjukkan bahwa kontribusi haplotipe gen LDLR terhadap varian LDL-C
adalah 5%, HDL-C 6% dan LDL/HDL 2% dan tidak ada dari polimorfisme
yang dilaporkan memiliki pengaruh fungsional sehingga dianggap berada
dalam linkage disequilibrium dengan polimorfisme penyebab variasi
(Knoblauch et al. 2004).
SNP rs688 (1773C>T dalam ekson 12) yang potensial terkait dengan
perubahan ekspresi gen LDLR telah dilaporkan oleh Zhu et al. (2007).
Wanita homozigot dengan alel 1773T mempunyai efisiensi penyambungan
ekson 12 yang menurun sekitar 8,6% dibandingkan wanita homozigot
dengan alel 1773C. Alel 1773T mengarah pada peningkatan jumlah
transkrip LDLR tanpa ekson 12 sehingga menghasilkan perubahan kerangka
baca dan protein terminasi dini. Pada kajian ini alel 1773T terkait dengan
kenaikan 10% dalam total kolesterol dan LDL-C pada wanita
pramenopause. Di sisi lain, penurunan efisiensi penyambungan tidak nyata
pada pria. Perbedaan ini disebabkan pengaruh modulasi estrogen pada
SRp40, faktor penyambungan prediksi yang mengikat pada enhancer
splising ekson (ESE). SNP 1773C>T tidak mengubah runutan asam amino,
tetapi berada di dalam daerah ESE. Ini adalah SNP umum fungsional
potensial pertama dalam gen LDLR manusia yang dilaporkan. Beberapa
kajian terkait genom secara luas (genome wide association studies, GWAS)
yang dilakukan selama dekade terakhir menunjukkan bahwa variabilitas
pada gen LDLR terkait dengan kadar LDL-C (Sandu et al. 2008; Kathiresan
et al. 2008; Willer et al. 2008). Saat ini gen LDLR merupakan salah satu gen
kandidat penyebab hiperkolesterolemia poligenik (Teslovich et al. 2010; De
Castro-Oros et al. 2013) dan termasuk dalam skor gen LDL-C, walaupun
mekanismenya masih belum diketahui (Talmud et al. 2013).
Seperti pada manusia, reseptor LDL pada genus macaca, termasuk
monyet ekor panjang, juga mempunyai peran penting dalam metabolisme
lipid dan memiliki mekanisme yang sama dengan yang terjadi pada manusia
(Turley et al. 1995). Dengan demikian identifikasi polimorfisme yang
terjadi pada gen LDLR dan analisis kuantitatif ekspresi gen, termasuk
6
ekspresi messenger RNA (mRNA), akan berdampak penting pada
pemahaman mengenai kerentanan terhadap kejadian dan perkembangan
penyakit dalam organisme model tersebut.
Informasi mengenai variasi genetik pada spesies dalam genus macaca
yang banyak digunakan sebagai organisme model dalam penelitian
biomedis telah banyak dilaporkan. Sebagian besar spesies model ini
menunjukkan variabilitas genetik terkait asal geografis (Tosi dan Coke
2007; Zinner et al. 2009; Haus et al. 2013). Data sekuen lima daerah
genomik (150 kb) pada 9 monyet rhesus (M. mulatta) asal Cina dan 38 asal
india menunjukkan bahwa densitas SNP 7,25 per kb dalam rhesus asal Cina
dan 5,8 per kb dalam rhesus asal India (Hernandez et al. 2007). Kajian
terhadap sekuen genom utuh 3 monyet rhesus India menunjukkan
keberadaan lebih dari 3 juta SNP (Fawcett 2011). Dalam subspesies Pan
troglodytes verus, simpanse Afrika Barat yang paling umum digunakan di
laboratorium penelitian biomedis, rerata heterosigositas diperkirakan
0,0008, sedangkan subspesies P. t troglodytes dari Afrika tengah
diperkirakan dua kali lebih tinggi (Chimpanzee Sequencing and Analysis
Consortium 2005). Tanpa memperhitungkan tambahan variasi pada
subspesies Timur (P. t schweinfurthi), kedua subspesies memiliki rerata
heterosigositas 0,00019. Scally et al. (2012) menemukan bahwa dua gorila
dataran rendah barat memiliki tingkat heterosigositas minimal 1,8 per kb,
sedangkan gorila dataran rendah timur menunjukkan tingkat heterosigositas
setengahnya. Semua perkiraan tingkat heterosigositas pada kera dan macaca
menunjukkan keragaman lebih tinggi daripada yang diamati pada manusia
(Abecasis et al. 2012; Yuan et al. 2012; Rogers dan Gibbs 2014).
Sebagai spesies out-bred monyet ekor panjang juga menunjukkan
variasi genetik yang cukup besar (Yan et al. 2011; Higashino et al. 2012;
Ogawa dan Vallender 2014). Beberapa diantaranya adalah polimorfisme
fungsional dalam gen yang terlibat lintas metabolik dan inflamasi (Flynn et
al. 2009; Uno et al. 2010; Blancher et al. 2012; Wu dan Adkins 2012).
Walaupun demikian belum ada data yang menunjukkan variasi genetik pada
gen LDLR dan keterkaitannya dengan sifat respons monyet ekor panjang
terhadap diet aterogenik.
Perumusan Masalah
Monyet ekor panjang memiliki perbedaan sensitivitas terhadap
perubahan diet. Selama ini seleksi monyet ekor panjang hiper- dan hiporesponder untuk kajian heterogenitas metabolik dari kolesterol diet dan
aterogenesis dilakukan melalui pemberian diet aterogenik selama dua bulan.
Cara seleksi ini tidak efisien karena membutuhkan volume darah hewan
dalam jumlah banyak dan pengontrolan yang ketat terhadap diet. Oleh
karena itu perlu dikembangkan metode lain yang lebih cepat dan sederhana,
yaitu menggunakan pendekatan variasi genetik. Keterkaitan variasi genetik
umum pada gen LDLR manusia dengan variasi profil normal lipid plasma
menunjukkan bahwa variasi serupa kemungkinan juga dapat berkontribusi
pada variasi respons monyet ekor panjang terhadap terhadap diet aterogenik.
Hal ini didukung tingginya variasi genetik pada monyet ekor panjang dan
7
kesamaan peran LDL-R dalam mengatur homeostasis kolesterol antara
manusia dan monyet ekor panjang. Untuk itu pada penelitian ini dilakukan
analisis variasi genetik umum pada gen LDLR monyet ekor dan
keterkaitannya dengan sifat respons hewan terhadap diet aterogenik.
Tujuan Penelitian
Tujuan utama penelitian ini adalah mendapatkan penanda genetik sifat
hiper- dan hipo-respons monyet ekor panjang terhadap diet aterogenik.
Untuk mencapai tujuan utama tersebut, penelitian ini memiliki beberapa
beberapa tujuan khusus, yaitu
1. Menyeleksi hewan sesuai sifat responsnya berdasarkan status kolesterol
plasma setelah diintervensi diet aterogenik selama tiga bulan.
2. Mengelompokkan hewan berdasarkan polimorfisme nukleotida tunggal
(SNP) dalam gen LDLR.
3. Menjelaskan mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan antara
variasi genetik dan variasi respons.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat dalam seleksi monyet ekor panjang sebagai
hewan model dalam penelitian aterosklerosis. Penggunaan penanda genetik
membuat seleksi hewan hipo- dari hiper-responder menjadi lebih cepat dan
efisien.
Hipotesis
Variasi genetik umum pada gen LDLR berkaitan dengan sifat hiperatau hipo-respons monyet ekor panjang terhadap diet aterogenik
Kebaharuan (Novelty) Penelitian
Berdasarkan kajian literatur, hingga saat ini belum ada data genetik
mengenai variasi umum pada gen LDLR monyet ekor panjang dan kaitannya
dengan sifat hiper- atau hipo-respons terhadap diet tinggi kolesterol.
Penelitian ini menghasilkan informasi baru mengenai SNP pada gen LDLR
monyet ekor panjang yang berpotensi sebagai penanda genetik untuk
menyeleksi sensitivitas hewan terhadap diet aterogenik.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini difokuskan pada analisis terhadap gen LDLR untuk
menunjukkan bahwa sifat hiper- atau hipo-respon monyet ekor panjang
terhadap diet aterogenik berkaitan dengan variasi genetik berupa SNP pada
gen tersebut. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi:
1. Tahap pertama diawali dengan intervensi diet terhadap 22 monyet ekor
panjang jantan dewasa menggunakan diet aterogenik IPB-1 yang
berbahan baku lokal selama tiga bulan. Setelah tiga bulan dilakukan
8
analisis variasi respons kadar kolesterol plasma untuk menyeleksi
sensitivitas hewan berdasarkan status kolesterol plasma. Tahapan ini
dibahas dalam Bab II.
2. Tahap kedua adalah identifikasi variasi genetik umum pada gen LDLR.
Identifikasi dilakukan pada daerah pengatur yaitu promotor dan 3‟UTR,
ekson dan intron gen LDLR. Analisis genetik dilakukan untuk
mengelompokkan hewan berdasarkan polimorfisme umum. Tahapan ini
dibahas dalam Bab III, IV, dan V.
3. Tahap ketiga adalah analisis ekspresi gen LDLR dan membuat pustaka
cDNA individu hipo-responder. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan
mengukur kelimpahan mRNA dalam sel darah tepi berinti tunggal
(peripheral blood mononuclear cell, PBMC). Analisis ini dilakukan
untuk menjelaskan mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan
antara variasi genetik dan variasi respons. Tahapan ini dibahas dalam
Bab VI.
Kesamaan individu hewan dalam pengelompokkan berdasarkan dua
analisis yang berbeda menunjukkan keterkaitan variasi genetik terhadap
sensitivitas, sementara pengukuran kelimpahan mRNA gen menunjukkan
bagaimana mekanisme molekuler yang mendasari keterkaitan antara
polimorfisme dan sensitivitas hewan. Dengan demikian polimorfisme dapat
dijadikan sebagai dasar dalam melakukan seleksi hewan hipo- dari hiperresponder yang digunakan sebagai model dalam penelitian biomedis terkait
aterosklerosis. Secara skematis kerangka pikir rencana penelitian ini
ditunjukkan pada Gambar 4.
9
Intervensi diet aterogenik
Identifikasi variasi
genetik umum
Promotor
dan 3‟UTR
Ekson
Analisis variasi
respons kolesterol
plasma
Kadar kolesterol
total plasma
(mg/dL)
Analisis
ekspresi gen
Profil mRNA
dan sekuensing
cDNA
Intron
Individu
hiper-responder
Polimorfisme
nukleotida tunggal
(SNP)
Individu
hipo-responder
Penanda genetik
Dasar seleksi hipo- dari hiper-responder
Hewan model dalam penelitian biomedis terkait aterosklerosis
Gambar 4 Bagan kerangka pikir penelitian
10
2 SELEKSI MONYET EKOR PANJANG (Macaca
fascicularis) HIPER- DAN HIPO-RESPONDER
BERDASARKAN STATUS KOLESTEROL PLASMA
[Selection of Hyper- and Hyporesponder Cynomolgus
Macaque (Macaca fascicularis) Based on the Status of Plasma
Cholesterol]
Abstract
The effectiveness of atherogenic diet in raising plasma cholesterol
level of cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) can be predicted for
population, but not for individuals. This study aimed to evaluate the
individual plasma cholesterol of cynomolgus macaques in response to IPB-1
atherogenic diet and to select the animals according their responsiveness
based on the status of plasma cholesterol after intervention of atherogenic
diet. The animals under study were 22 adult male monkeys from the animal
facility of Primate Research Center Bogor Agricultural University (PSSP
IPB). All animals were intervened with the IPB-1 atherogenic diet for three
months and individual plasma cholesterol was evaluated in a monthly basis.
The results showed that the macaques‟ plasma cholesterol had increased
significantly (P