Aktivitas Antibiofilm Dari Bakteri Escherichia Coli Oleh Ekstrak Air Daun Singkong, Pepaya Dan Melinjo Secara In Vitro.

AKTIVITAS ANTIBIOFILM DARI BAKTERI Escherichia coli
OLEH EKSTRAK AIR DAUN SINGKONG, PEPAYA DAN
MELINJO SECARA IN VITRO

LIVIA RHEA ALVITA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Aktivitas
Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli oleh Ekstrak Air Daun Singkong,
Pepaya dan Melinjo secara In Vitro adalah benar karya saya dengan arahan dari
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, 27 Agustus 2015
Livia Rhea Alvita
NRP G851130131

RINGKASAN
LIVIA RHEA ALVITA. Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli oleh
Ekstrak Air Daun Singkong, Pepaya dan Melinjo secara In Vitro. Dibimbing oleh
SYAMSUL FALAH dan NOVIK NURHIDAYAT.
Escherichia coli adalah salah satu spesies bakteri yang mampu membentuk
biofilm dalam industri pangan, dimana kehadiran biofilm sangat berpotensi
menimbulkan pembusukan makanan yang akan memperpendek masa simpan
(shelf-life) maupun mengakibatkan penyebaran penyakit melalui makanan
(foodbom desease). Biofilm dapat hidup pada semua jenis permukaan di pabrik
pengolahan makanan mulai dari lantai, dinding, pipa dan permukaan peralatan
termasuk stainless steel, alumunium, nilon, teflon, karet, plastik, dan kaca.
Biofilm cenderung tumbuh dan berkembang dengan pesat terutama pada
permukaan bahan yang lembab dan kaya akan nutrisi.
Penelitian mengenai biofilm semakin meluas diakibatkan oleh potensi

yang besar sebagai sumber kontaminan pada industri pangan. Banyak kerugian
yang didapatkan akibat keberadaan biofilm dalam sistem pengolahan makanan,
sehingga penghambatan pembentukan biofilm perlu dilakukan. Pengendalian
biofilm dapat dilakukan dengan memanfaatkan bahan alam yang salah satunya
dapat menggunakan senyawa kimia dari tanaman. Ekstrak air daun singkong,
daun pepaya dan daun melinjo memiliki aktivitas antibiofilm, aktivitas tersebut
diduga disebabkan oleh kandungan kimia yang terdapat di dalam ekstrak.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan ekstrak air daun
singkong, pepaya dan melinjo dalam pencegahan perlekatan, penghambatan
pertumbuhan dan pendegradasian biofilm. Penelitian ini menggunakan metode
Microtitter Plate Biofilm Assay dimana masing-masing ekstrak air daun singkong,
pepaya dan melinjo dengan konsentrasi 25, 50, 75 dan 100%(v/v) dioptimasi pada
suhu 25 ,37 dan 50ºC dan waktu kontak 30, 45 dan 60 menit. Pengoptimasian
dalam penghambatan pertumbuhan dilakukan pada waktu kontak 1, 2 dan 3 hari.
Pengukuran aktivitas antibiofilm menggunakan iMark Bio-Rad microplate reader
dengan panjang gelombang 595nm.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak yang memiliki kinerja
terbaik dalam pencegahan perlekatan (45,12%) yaitu ekstrak daun singkong,
sedangkan ekstrak yang memiliki kinerja terbaik dalam penghambatan
pertumbuhan (36,02%) dan pendegradasian biofilm (46,37%) yaitu ekstrak daun

pepaya. Metode Response Surface digunakan untuk pengoptimasian pada
pencegahan perlekatan biofilm sehingga diperoleh kondisi terbaik oleh ekstrak
daun singkong (> 55%) yaitu pada suhu antara 37-50ºC, waktu kontak antara 4560 menit dan konsentrasi diantara 60-100% (v/v). Kondisi terbaik dalam
penghambatan pertumbuhan oleh ekstrak daun pepaya (> 60%) yaitu pada kondisi
suhu 50°C, waktu kontak berada diantara 2-3 hari dan konsentrasi berada diantara
60-100% (v/v) sedangkan pendegradasian biofilm oleh ekstrak daun pepaya (>
50 %) yaitu pada kondisi suhu berada diantara 35-40ºC, waktu kontak berada
diantara 57-60 menit dan konsentrasi berada diantara 80-100%(v/v).
Kata kunci : biofilm, Carica papaya L, ekstrak air, Escherichia coli, Manihot
utilissima Pohl, Gnetum gnemon L

SUMMARY
LIVIA RHEA ALVITA. Antibiofilm Activity from Water Leaves Extract of
Manihot utilissima Pohl, Carica papaya L and Gnetum gnemon L against
Escherichia coli by In Vitro. Supervised by SYAMSUL FALAH and NOVIK
NURHIDAYAT.
Escherichia coli is one of the bacteria species that able forming biofilms in
the food industry. The presence of biofilm is potentially causing food spoilage
that will shorten the shelf life as well as lead to the spread of disease through food.
Biofilms can live on all types of surfaces in food processing plants ranging from

floors, walls, pipes and equipments surfaces including stainless steel, aluminum,
nylon, teflon, rubber, plastic, and glass. Biofilms tend to grow and grown rapidly,
especially on the surface of the material moist and rich in nutrients.
The researches of biofilm have been widely conducted. This is caused its
potential as contaminant source in the food industry. There are many
disadvantages that caused by presence of biofilm in food processing system. So
that, inhibition of biofilm formation needs to be done. Controlling of biofilm can
be done by utilizing natural ingredients which use chemical compounds from
plants. Water extract of cassava, papaya and melinjo leaves have anti-biofilm
activity, their activities are caused by chemical compounds that presence in the
extract.
The purpose of this study was to determine the ability of water extract of
cassava, papaya and melinjo leaves in inhibit of cell attachment, growth and
degradation of the biofilm. Micro-titter Plate Biofilm Assay method was used in
this study with concentrations 25, 50, 75 and 100% (v/v) of water extract from
cassava and papaya leaves. The temperature and time contact were optimized at
25, 37 and 50ºC and 30, 45 and 60 minutes respectively. Optimization of growth
inhibition performed at the contact time of 1, 2 and 3 days. iMark Bio-Rad
microplate reader was used to measure anti-biofilm activity at 595nm
(wavelength).

The results in this study showed that the highest activity in prevention of
biofilm attachment was cassava leave extract namely 45.12 %, while the highest
activity in the inhibition of growth and degradation of biofilm were showed by
papaya leave extract namely 36.02 % and 46.37 %, respectively. Response surface
method was used to obtain optimization the best conditions in the prevention of
biofilm attachment by cassava leaf extract (> 55%) which the temperature was
around 37-50ºC, the contact time was around 45-60 minutes and the concentration
was around 60-100% (v/v). The best conditions in growth inhibition of papaya
extract was > 60% for the temperature condition of 50°C, the contact time was
around 2-3 days and the concentration was around 60-100% (v/v), while the best
condition in biofilm degradation by papaya extract was >50% at the temperature
around 35-40ºC, the contact time was around 57-60 minutes and the concentration
was around 80-100% (v/v).
Keywords: biofilm, Carica papaya L, Escherichia coli, Manihot utilissima Pohl,
Gnetum gnemon L, water extracts

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

AKTIVITAS ANTIBIOFILM DARI BAKTERI Escherichia coli
OLEH EKSTRAK AIR DAUN SINGKONG, PEPAYA DAN
MELINJO SECARA IN VITRO

LIVIA RHEA ALVITA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Judul Tesis : Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli oleh Ekstrak
Air Daun Singkong, Pepaya dan Melinjo secara In Vitro.
Nama
: Livia Rhea Alvita
NRP
: G851130131

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Syamsul Falah SHut, MSi
Ketua

Novik Nurhidayat PhD
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 27 Agustus 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul
Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli oleh Ekstrak Air Daun

Singkong, Pepaya dan Melinjo secara In Vitro yang telah dilaksanakan sejak bulan
Desember 2014 sampai Mei 2015 di Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan, Pusat
Penelitian Biologi-Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
Terima kasih, penghargaan, dan apresiasi penulis ucapkan kepada Dr
Syamsul Falah SHut, MSi sebagai pembimbing utama dan Novik Nurhidayat PhD
sebagai pembimbing kedua atas arahan, bimbingan, nasihat, motivasi dan
masukkannya selama penelitian serta dalam penyusunan tesis ini.
Terimakasih kepada Prof Dr drh Maria Bintang, MS selaku ketua program
studi S2 Biokimia. Penelitian ini didanai oleh DIKTI melalui beasiswa BPPDN
2013. Penghargaan yang sebesar-besarnya penulis ucapkan kepada Ayahanda dan
Ibunda tercinta atas doa, perhatian dan nasehat yang telah diberikan selama ini.
Tidak lupa juga terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Wijiastuti, Ibu Yulia
Atika, Uda Ivan, Diva, Dila, sahabat-sahabat serta teman-teman SPs Biokimia
2013 dan teman-teman Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan yang selalu
mendukung penulis. Penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat
bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, 27 Agustus 2015
Livia Rhea Alvita

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR LAMPIRAN

ix

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

11

11
12
12
12

2 METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Bahan
Alat
Prosedur Penelitian

12
12
12
13
13

3 HASIL
Senyawa Fitokimia
Pencirian Bakteri Uji
Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli pada
Konsentrasi Ekstrak yang Berbeda
Optimasi Aktivitas Antibiofilm
Hasil Scanning Electron Microscopy (SEM)

16
16
17

4 PEMBAHASAN
Senyawa Fitokimia
Pencirian Bakteri Uji
Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli pada
Konsentrasi Ekstrak yang Berbeda
Optimasi Aktivitas Antibiofilm
Hasil Scanning Electron Microscopy (SEM)

22
22
23

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

28
28
29

DAFTAR PUSTAKA

30

LAMPIRAN

34

RIWAYAT HIDUP

46

18
19
22

24
26
28

viii

DAFTAR GAMBAR
1 Bakteri Escherichia coli pada media EMB agar.
2 Karakterisasi bakteri Escherichia coli menggunakan
pewarnaan Gram
3 Aktivitas antibiofilm dari ekstrak air daun singkong, pepaya
dan melinjo.
4 Contour plot aktivitas pencegahan perlekatan biofilm
oleh ekstrak daun singkong
5 Contour plot aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm
oleh ekstrak daun pepaya
6 Contour plot aktivitas pendegradasian biofilm
oleh ekstrak daun pepaya
7 Hasil SEM kemampuan ekstrak singkong dan pepaya dalam pencegahan
dan pendegradasian biofilm
8 Contoh biofilm dalam industri pangan

17
17
19
20
21
22
22
26

DAFTAR TABEL
1 Hasil skrining fitokimia ekstrak air daun singkong, pepaya dan melinjo
2 Hasil aktivitas antibiofilm dari bakteri Escherichia coli pada konsentrasi
ekstrak yang berbeda (%kontrol negatif)
3 Estimasi pengaruh variabel terhadap % pencegahan perlekatan
biofilm oleh ekstrak daun singkong
4 Estimasi pengaruh variabel terhadap % penghambatan pertumbuhan
biofilm oleh ekstrak daun pepaya
5 Estimasi pengaruh variabel terhadap % pendegradasian biofilm
oleh ekstrak daun pepaya

17
18
19
20
21

ix

DAFTAR LAMPIRAN

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Diagram alir penelitian
Diagram alir pewarnaan Gram
Two-way ANOVA pencegahan perlekatan biofilm
Two-way ANOVA penghambatan pertumbuhan biofilm
Two-way ANOVA pendegradasian biofilm biofilm
Uji lanjut Duncan dalam pencegahan perlekatan biofilm
Uji lanjut Duncan dalam penghambatan pertumbuhan biofilm
Uji lanjut Duncan dalam pendegradasian biofilm
Hasil % pencegahan dan pendegradasian biofilm berdasarkan rancangan
percobaan response surface central composite design Minitab 16
10 Hasil % penghambatan pertumbuhan biofilm berdasarkan rancangan
percobaan response surface central composite design Minitab 16
11 Analisis ragam model regresi terhadap respon aktivitas antibiofilm dari
bakteri Escherichia coli menggunakan Response Surface Methodology
(RSM).

35
35
36
36
37
37
39
40
41
43

44

x

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kehadiran biofilm dalam industri pangan beresiko tinggi mengancam
tingkat keamanan pangan, dimana biofilm dapat tumbuh dan berkembang pada
produk susu, daging, buah dan sayuran segar (Chen et al. 2007). Menimbulkan
pembusukan makanan yang akan memperpendek masa simpan (shelf-life) maupun
penyebaran penyakit melalui makanan (foodbom desease) (Houdt dan Michiels
2010). Biofilm cenderung tumbuh dan berkembang dengan pesat terutama pada
permukaan bahan yang lembab dan kaya akan nutrisi (Tarver 2009). Biofilm
dapat hidup pada semua jenis permukaan di pabrik pengolahan makanan mulai
dari lantai, dinding, pipa dan permukaan peralatan termasuk stainless steel,
alumunium, nilon, teflon, karet, plastik, dan kaca (Chmielewski dan Frank 2003).
Peralatan yang kontak langsung dengan makanan dalam proses pengolahannya
memungkinkan menjadi pusat terbentuknya biofilm.
Secara umum, bakteri memiliki kemampuan untuk menempel dan
membentuk biofilm pada permukaan padat. Menempelnya bakteri pada
permukaan benda padat merupakan langkah awal pembentukan biofilm (Donlan
2002). Biofilm yang terbentuk terperangkap di dalam polimer ekstraselular yang
dihasilkan oleh bakteri tersebut (Stoodly et al. 2002) Biofilm sangat berpotensi
merusak proses dan produk pangan, dimana sebagian mikroorganisme dalam
biofilm juga merupakan penyebab penyakit dan penghasil racun. Banyak spesies
bakteri yang mampu membentuk biofilm dalam industri pangan, salah satu bakteri
yang paling sering ditemukan adalah Escherichia coli (Lund et al. 2000).
Escherichia coli adalah agen penting penyebab penyakit gastrointestinal
dan diare berdarah pada manusia. Escherichia coli juga bertanggung jawab untuk
sebagian besar kasus sindrom hemolitik-uremik, penyebab utama gagal ginjal akut
pada anak-anak. Center for Disease Control and Prevention (CDC)
memperkirakan bahwa Escherichia coli menyebabkan lebih dari 70.000 penyakit
dan 60 kematian setiap tahun di Amerika Serikat (Mead 1999).
Potensi yang besar sebagai sumber kontaminan mengakibatkan penelitian
mengenai biofilm di bidang industri pangan semakin meluas. Biofilm berperan
terhadap kerusakan pangan seperti pembusukan produk dan penyebaran penyakit.
Beberapa penelitian terdahulu juga menunjukkan bahwa daya tahan terhadap
kondisi-kondisi buruk dari mikroba yang membentuk biofilm pada proses
pertumbuhannya lebih tinggi jika dibandingkan dengan sel planktonik (Donlan
2002). Banyak kerugian yang didapatkan akibat keberadaan biofilm dalam sistem
pengolahan makanan, sehingga diperlukannya penghambatan pembentukan
biofilm.
Kekayaan alam tumbuhan di Indonesia meliputi 30.000 jenis tumbuhan
dari total 40.000 jenis tumbuhan di dunia, 940 jenis diantaranya merupakan
tumbuhan berkhasiat obat (Inna et al. 2010). Istilah kembali ke alam pun
kemudian sering terdengar seiring dengan upaya pemanfaatan sumberdaya alam
yang belum tereksplorasi secara maksimal. Pemanfaatan tanaman sebagai
antibiofilm alami diharapkan dapat menekan penggunaan antibiofilm berbahan
dasar kimia sintetik yang dapat berdampak negatif bagi lingkungan. Daun

12
singkong, pepaya dan melinjo memiliki senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai
antibiofilm, dimana daun singkong (Manihot utilissima Pohl.) memiliki
kandungan kimia berupa alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin (Ebuehi et al.
2005) sedangkan daun pepaya (Carica papaya L.) mengandung enzim papain
yang diduga berpotensi sebagai penghancur biofilm dan mengandung senyawa
bioaktif berupa senyawa flavonoid, alkaloid, saponin, steroid, triterpenoid dan
tanin (Arumugam et al. 2014). Menurut Barua et al (2015) melinjo mengandung
senyawa bioaktif berupa flavonoid, saponin dan tanin dimana kandungan kimia
pada masing-masing tanaman tersebut berpotensi menghambat perlekatan,
pertumbuhan dan pendegradasian biofilm. Sehingga diperlukannya penelitian
terhadap aktivitas ekstrak air daun singkong, papaya dan melinjo sebagai
antibiofilm dari bakteri Escherichia coli.
Perumusan Masalah
Peningkatan perkembangan biofilm dalam industri pangan mengakibatkan
diperlukannya senyawa antibofilm yang dapat menghambat pelekatan,
pertumbuhan dan pendegradasian dari biofilm tersebut. Penelitian ini
memanfaatkan ekstrak air daun singkong, pepaya dan melinjo yang diharapkan
dapat menjadi solusi alternatif pengendalian bakteri biofilm khususnya untuk
bakteri Escherichia coli.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menguji aktivitas ekstrak air daun singkong,
pepaya dan melinjo dalam penghambatan perlekatan, pertumbuhan dan
pendegradasian biofilm dari bakteri Escherichia coli.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi ilmiah mengenai
aktivitas ekstrak air daun singkong, pepaya dan melinjo sebagai antibiofilm dari
Escherichia coli, sehingga dapat meningkatkan pengembangan potensi bahan
alam dalam pencegahan biofilm.

2 METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2014 - Mei 2015
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Kesehatan, Pusat Penelitian Biologi,
LIPI Cibinong.
.
Bahan
Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur Escherichia
coli yang merupakan koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi LIPI Cibinong.
Beberapa ekstrak tanaman yang digunakan antara lain daun singkong, daun

13

papaya dan daun melinjo yang diperoleh dari sekitar kampus IPB Dramaga.
Media pertumbuhan bakteri yang digunakan yakni Eosin Methylene Blue (EMB)
dan media heterotrof (15 g bacto agar, 15 g pepton, 3 g tripton, 5 g NaCl, 2.5 g
K2HPO4 dilarutkan dalam 1000 mL akuades). Bahan lain yang digunakan antara
lain : akuades steril, reagen uji Gram, etanol 96%, crystal violet 1% dan pereaksi
yang digunakan pada saat uji fitokimia.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Pipet mikro,
microwave, neraca analitik, inkubator sanyo dan isuzu, autoklaf hiclaveTM, oven
vonavex, laminar air flow, vortex Maxi Mix II, sentrifuse Kokusan H-1500F,
mikroskop Nikon Eclipse-50i, spektrofotometer Shimadzu UV-Visible
Pharmaspec 1700, microtiterplate flat-bottom polystyrene 96 wells, iMark BioRad microplate reader, SEM (Scanning Electron Microscope) JEOL JSM-5310
LV dan alat-alat gelas lainnya.
Prosedur Penelitian
Persiapan Ekstrak
Persiapan ekstrak air daun singkong, pepaya dan melinjo dilakukan
sebagaimana diuraikan oleh Gomashe et al (2014) dengan beberapa modifikasi.
Daun singkong (Manihot utilissima Pohl.), daun pepaya (Carica papaya L.) dan
daun melinjo (Gnetum gnemon Linn.) yang digunakan dalam penelitian ini telah
dideterminasi di LIPI-Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor untuk
memastikan klasifikasi dari tanaman yang digunakan dalam penelitian. Preparasi
awal masing-masing sampel daun segar dicuci dengan air bersih, kemudian dibilas
dengan etanol lalu dikeringkan pada temperatur ruang selama 1 minggu. Sample
yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan menggunakan blender. Sampel yang
telah halus sebanyak 5 g diekstraksi dengan 100 mL aquades steril dengan cara
maserasi selama 18 jam dengan dishaker. Sampel daun pepaya dishaker tanpa
pemanasan sedangkan sampel daun singkong dan melinjo dishaker dengan
pemanasan 70°C. Ekstrak disaring dengan kertas saring kemudian filtrat
disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm kemudian disaring
kembali sehingga didapatkan supernatan. Supernatan yang dihasilkan dianggap
sebagai konsentrasi 100%(v/v) kemudian dibuat variasi konsentrasi 25%, 50%,
75% dan 100% (v/v) lalu disimpan dalam botol yang telah disterilkan.
Analisis Fitokimia (Windarini et al. 2013)
Analisis fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, saponin,
flavonoid, terpenoid, steroid dan tanin. Analisis fitokimia dilakukan untuk
menentukan komponen bioaktif yang terdapat pada ekstrak tanaman yang
memiliki aktivitas penghambatan paling besar sebagai antibiofilm.
Uji Lieberman Burchard
Pemeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan dengan reaksi Lieberman
Burchard. Ekstrak teraktif dilarutkan dalam 2 mL kloroform kemudian
ditambahkan 10 tetes anhidrat asam asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat lalu

14
dikocok. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah menjadi biru dan
hijau.
Uji Alkaloid
Sebanyak 3mL ekstrak teraktif ditambahkan 10mL kloroform dan 3 tetes
amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dengan cara menghisap fraksi kloroform
diasamkan dengan H2SO4 2M sebanyak 1 ml. Fraksi H2SO4 diambil, kemudian
ditambahkan pereaksi Dragendorf dan Wagner. Jika terdapat endapan merah
jingga dengan pereaksi Dragendorf dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner
maka positif untuk alkaloid.
Uji Saponin
Ekstrak sebanyak 0,5 gram dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan
10 ml air panas, didinginkan dan kemudian dikocok vertikal selama 10 detik.
Pembentukan busa setinggi 1–10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10
menit menunjukkan adanya saponin. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N, busa tidak
hilang.
Uji Flavonoid
Sebanyak 3mL ekstrak teraktif dtambahkan metanol sampai terendam lalu
dipanaskan. Filtrat diuji dengan spot plate. Jika setelah ditambahkan NaOH 10%
sebanyak 1 mL timbul warna merah, maka positif terhadap flavonoid.
Uji Tanin
Larutan ekstrak uji sebanyak 1 ml direaksikan dengan larutan besi (III) klorida
10%, jika terjadi warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin
dan polifenol
Pembuatan Kultur Bakteri Escherichia coli
Bakteri uji dipurifikasi pada media spesifik untuk pertumbuhan bakteri
Escherichia coli yaitu media agar EMB (Eosin Methylene Blue) selama 18-24 jam
pada suhu 37°C, untuk memperoleh kultur kerja. Sebanyak satu ose kultur kerja
tersebut diperbanyak dengan cara dibiakkan ke dalam tabung berisi media cair
HTR (Heterotrof) sebanyak 10 mL dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C.
Kultur bakteri uji divorteks kemudian diukur nilai OD pada panjang gelombang
600nm untuk mengetahui konsentrasi dari suspesi bakteri tersebut.
Uji Pencegahan Perlekatan Biofilm pada Permukaan (Modifikasi Sandasi et
al. 2010)
Pengujian dilakukan dengan menggunakan microtiterplate flat-bottom
polystyrene 96 wells. Pengujian dilakukan terhadap masing-masing ekstrak
tanaman dengan variasi konsentrasi 25; 50; 75 dan 100% (v/v), 200µL ekstrak
tanaman terlebih dahulu dimasukkan pada tiap well selama 60 menit, kemudian
ekstrak tanaman yang telah melapisi permukaan mikroplate dikeluarkan dari well
dan ditambahkan media HTR (Heterotrof) 100 µL dan suspensi bakteri sebanyak
100µL ke dalam well untuk memulai pembentukan biofilm. Suspensi uji
kemudian diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Setelah masa inkubasi,
mikroplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali, kemudian
ditambahkan 200 µL larutan Crystal violet 1 % ke tiap well dan diinkubasi pada
suhu ruang selama 15 menit. Mikroplate dicuci kembali dengan cara yang sama
seperti sebelumnya, yaitu dengan air mengalir sebanyak 3 kali. Larutan etanol
96% sebanyak 200µL ditambahkan ke dalam tiap well dan dilakukan inkubasi

15

kembali selama 15 menit pada suhu ruang. Pembacaan Optical Density (OD)
dilakukan dengan iMark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang
595nm di laboratorium mikrobiologi, LIPI Cibinong, replikasi sebanyak tiga kali.
% pencegahan =

x 100%

Uji Penghambatan Pertumbuhan dan Perkembangan Biofilm
Pengujian dilakukan sebagaimana diuraikan oleh Sandasi et al (2010)
dengan beberapa modifikasi. Uji dilakukan dengan microtiterplate flat-bottom
polystyrene 96 wells. Media yang digunakan adalah HTR 90µL kemudian
ditambahkan suspensi bakteri E.coli 50µL dan ekstrak tanaman 60µL dengan
variasi konsentrasi 25; 50; 75 dan 100% (v/v) dimasukkan pada masing-masing
well. Suspensi uji kemudian diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Setelah
masa inkubasi, mikroplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali,
kemudian ditambahkan 200 µL larutan Crystal violet 1 % ke tiap well dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Mikroplate dicuci kembali dengan
cara yang sama seperti sebelumnya, yaitu dengan air mengalir sebanyak 3 kali.
Larutan etanol 96% sebanyak 200µL ditambahkan ke dalam tiap well dan
dilakukan inkubasi kembali selama 15 menit pada suhu ruang. Pembacaan Optical
Density (OD) dilakukan dengan iMark Bio-Rad microplate reader pada panjang
gelombang 595 nm di laboratorium Mikrobiologi, LIPI Cibinong, replikasi
sebanyak tiga kali.
x 100%
% penghambatan =
Uji Degradasi Biofilm (Modifikasi Prasasti dan Hertiani 2010)
Pengujian ini dilakukan sebagaimana penghambatan perlekatan dan
pertumbuhan biofilm hanya saja suspensi ekstrak uji ditambahkan pada saat
biofilm telah terbentuk. Biofilm terbentuk setelah masing-masing well diinkubasi
selama 72 jam pada suhu 37°C dengan 60µL suspensi bakteri dalam 90µL media
HTR. Setelah terbentuknya biofilm, suspensi dalam mikroplate tersebut dibuang,
kemudian ditambah 200µL suspensi ekstrak tanaman dengan variasi konsentrasi
25; 50; 75 dan 100% v/v setelah itu diinkubasi selama 24 jam. Setelah masa
inkubasi, mikroplate dicuci menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali, dan
seterusnya sebagaimana dilakukan pada uji penghambatan perlekatan dan
pertumbuhan biofilm. Persentase pendegradasian dari biofilm dapat diukur dengan
rumus sebagai berikut :
% pendegradasian =
x 100%
Scanning Electron Microscopy (SEM)
Pembentukan biofilm dalam pengujian ini menggunakan potongan
polystyrene berukuran 0.5 cm x 0.5 cm. Potongan polystyrene kemudian
dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi 2mL suspensi bakteri dan 2mL
media HTR dan diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37ºC. Setelah biofilm
terbentuk, potongan polystyrene dicuci dengan air steril untuk mengeluarkan
suspensi bakteri yang tidak membentuk biofilm. Potongan Polystyrene kemudian
dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi ekstrak daun pepaya selama 60
menit pada suhu 37ºC. Potongan polystyrene tanpa menggunakan ekstrak

16
digunakan sebagai kontrol negatif. Ekstrak daun singkong dimasukkan terlebih
dahulu sebelum pembetukan biofilm karena berfungsi sebagai pencegahan
perlekatan dalam pembentukan biofilm. Setelah itu potongan polystyrene tersebut
dipreparasi dan diamati menggunakan instrument scanning electron microscope
tipe JEOL seri JSM-5310 LV di Puslit Widyasatwaloka, LIPI Cibinong.
Optimasi Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli menggunakan
Response Surface Methodology (RSM).
Pada penelitian ini, optimasi aktivitas pencegahan perlekatan,
penghambatan pertumbuhan dan pendegradasian biofilm hanya dilakukan pada
ekstrak yang memiliki kinerja terbaik dari masing-masing respon. Optimasi
dilakukan dengan menggunakan aplikasi Response Surface Methodology (RSM)
dengan 3 replikasi pada software minitab 16. Tiga faktor yang dioptimasi adalah
konsentrasi ekstrak (X1) dengan interval 25 - 100% (v/v), suhu inkubasi (X2)
dengan interval (25 - 50ºC), dan waktu kontak pemberian ekstrak (X3) dengan
interval (30 - 60 menit). Khusus pengoptimasian dalam penghambatan
pertumbuhan dilakukan pada waktu kontak pemberian ekstrak 1, 2 dan 3 hari.
Tujuan pengoptimasian aktivitas antibiofilm ini adalah untuk mengetahui
konsentrasi ekstrak, waktu kontak dan suhu inkubasi yang menunjukkan aktivitas
antibiofilm biofilm E.coli yang optimal. Desain percobaan berdasarkan output
response surface design central composite dapat dilihat pada lampiran 4.
Analisis Statistika
Rancangan percobaan yang digunakan dalam menganalisis hasil penelitian
ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RAL Faktorial). Faktor yang
digunakan adalah jenis ekstrak (singkong, pepaya dan melinjo) dan konsentrasi
ekstrak yang berbeda. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan
analisis ragam (two-way ANOVA). Penentuan konsentrasi terbaik dari masingmasing ekstrak pada setiap respon menggunakan analisis ragam (one-way
ANOVA) dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan dengan tingkat kepercayaan 95%.
Uji statistik menggunakan perangkat lunak komputer MS Excel 2010, SPSS 16
dan Minitab 16 (trial version).

3 HASIL
Senyawa Fitokimia
Uji skrining fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi
identifikasi alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, saponin, dan tanin. Hasil uji
fitokimia yang tertera pada Tabel 1 menunjukkan ekstrak daun singkong dan
pepaya sama-sama mengandung alkaloid, flavonoid, tanin dan steroid. Sementara
itu, saponin dan triterpenoid menunjukkan hasil negatif sedangkan hasil uji
fitokimia dari ekstrak daun melinjo menunjukkan hasil positif pada tanin, alkaloid,
saponin, steroid dan menunjukkan hasil negatif pada flavonoid, serta triterpenoid.

17

Tabel 1 Hasil skrining fitokimia ekstrak air daun singkong, pepaya dan melinjo
Hasil Kualitatif

Golongan
Senyawa

Singkong

Pepaya

Melinjo

Flavonoid
Tanin
Alkaloid
Saponin
Steroid
Triterpenoid

+
+
+
+
-

+
+
+
+
-

+
+
+
+
-

Pencirian Bakteri Uji
Escherichia coli diinkubasi selama 24 jam pada media agar Eosin
Methylene Blue pada suhu 37°C. Setelah masa inkubasi, bakteri uji dilakukan
pengamatan secara morfologis dan dikarakterisasi dengan cara pewarnaan Gram.
Alur pewarnaan Gram dapat dilihat pada Lampiran 2. Bakteri uji secara
makroskopik yang ditumbuhkan pada media Eosin Methylene Blue agar jika
dilihat dari sisi atas koloni – koloni terlihat bundar, cembung dan halus dengan
tepi yang nyata, koloni berkilau berwarna hijau metalik dan tumbuh dengan baik
pada media Eosin Methylene Blue agar. Hasil purifikasi bakteri uji pada media
Eosin Methylene Blue agar dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1 Bakteri Escherichia coli berwarna hijau metalik pada media EMB agar
Dari hasil pewarnaan Gram dapat dilihat secara mikroskopik bahwa isolat
bakteri uji yang digunakan menghasilkan warna merah, berbentuk batang pendek,
dan tidak berspora. Jadi dapat disimpulkan isolat yang digunakan adalah benar
merupakan bakteri gram negatif yaitu bakteri Escherichia coli. Hasil karakterisasi
bakteri Escherichia coli menggunakan pewarnaan Gram dapat dilihat pada
Gambar 2.

Gambar 2 Karakterisasi bakteri Escherichia coli menggunakan pewarnaan Gram

18
Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli
pada Konsentrasi Ekstrak yang Berbeda
Pengujian aktivitas antibiofilm dalam penelitian ini terdiri dari 3 tahap yaitu
pencegahan perlekatan, penghambatan pertumbuhan dan pendegradasian biofilm,
dimana hasil dari pengujian aktivitas antibiofilm menunjukkan bahwa ekstrak air
daun singkong, pepaya dan melinjo memiliki aktivitas pencegahan perlekatan,
penghambatan pertumbuhan dan pendegradasian biofilm dari bakteri Escherichia
coli dan dapat dilihat hasilnya pada Tabel 2 dan divisualisasi pada Gambar 3.
Tabel 2 Hasil aktivitas antibiofilm dari bakteri Escherichia coli pada konsentrasi
ekstrak yang berbeda (%kontrol negatif)
Pencegahan (%)
Penghambatan (%) Pendegradasian (%)
Konsentrasi
S
P
M
S
P
M
S
P
M
25%
50%
75%
100%

26.07
34.43
41.86
45.12
36.87

26.21
28.1
37.46
41.89
33.41

29.27
35.49
37.19
39.33
35.32

16.37
32.87
22.32
26.95
24.62

22.64
32.34
35.58
36.02
31.64

Rata-rata
Keterangan: konsentrasi ekstrak %(v/v)
S = Singkong, P = Pepaya, M = Melinjo

20.72
27.76
30.26
32.47
27.80

28.35
30.72
31.55
38.26
32.22

27.4
36.54
48.99
46.37
39.82

24.26
35.49
43.25
39.54
35.63

Berdasarkan hasil analisis statistik two-way ANOVA menggunakan
Minitab 16, faktor berbagai jenis ekstrak (singkong, pepaya dan melinjo) dengan
konsentrasi berbeda terhadap respon aktivitas pencegahan perlekatan biofilm
menunjukkan nilai yang berbeda secara signifikan (P0.05), sedangkan perlakuan konsentrasi dan waktu
kontak menunjukan hasil berbeda nyata (P< 0.05). Ini menunjukkan bahwa pada
masing-masing perlakuan konsentrasi dan waktu kontak menunjukkan aktivitas
pencegahan yang berbeda, akan tetapi pada pelakuan suhu yang berbeda-beda
tidak menunjukkan aktivitas pencegahan yang berbeda. Interaksi konsentrasikonsentrasi juga memberikan hasil yang berbeda nyata (P 55%) berada diantara 45-50ºC, waktu kontak berada diantara
50-60 menit sedangkan konsentrasi berada diantara 60-100% (v/v) setara dengan
30-50 g/L.
60

%
pencegahan
ekstrak
singkong
< 35
– 40
35
– 45
40
– 50
45
– 55
50
> 55

Konsentrasi (%v/v)

90
80
70
60
50
40

Hold Values

Waktu Kontak 45

30

Waktu Kontak (Menit)

100

%
pencegahan
ekstrak
singkong
< 30
30
– 35
35
– 40
40
– 45
45
– 50
50
– 55
> 55

55

50

45

40

35

Hold Values

Suhu 37,5

30
25

30

35

40

45

50

Suhu (ºC)

30

40

50

60

70

80

90

100

Konsentrasi (%v/v)

Gambar 4 Contour plot aktivitas pencegahan perlekatan biofilm oleh ekstrak
daun sigkong
Optimasi Aktivitas Penghambatan Pertumbuhan Biofilm oleh Ekstrak Air
Daun Pepaya
Hasil uji statistik aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm
menggunakan RSM (Response Surface Methodology) pada Minitab 16 diperoleh
hasil faktor waktu kontak tidak berbeda nyata (P > 0.05), sedangkan perlakuan
konsentrasi dan suhu menunjukan hasil berbeda nyata (P < 0.05). Ini
menunjukkan bahwa pada masing-masing perlakuan konsentrasi dan suhu
menunjukkan aktivitas penghambatan yang berbeda, akan tetapi pada pelakuan
waktu kontak yang berbeda-beda tidak menunjukkan aktivitas penghambatan
yang berbeda. Interaksi konsentrasi-konsentrasi dan suhu-suhu juga memberikan
hasil yang berbeda nyata (P 60%) berada pada 50ºC, waktu kontak berada
diantara 2.5-3 hari sedangkan konsentrasi berada diantara 60-100% (v/v) setara
dengan 30-50 g/L.
%
Penghambatan
Pepaya

Suhu (ºC)

45

35
40
45
50
55

40

35

30

<
–
–
–
–
–
>

35
40
45
50
55
60
60

Waktu kontak (hari)

3,0

50

Hold Values

25
30

40

50

60

70

80

90

Konsentrasi (%v/v)

100

Waktu kontak (hari) 3

%
Penghambatan
Pepaya

2,5

54
56
58

2,0

1,5

<
–
–
–
>

54
56
58
60
60

Hold Values

Suhu (ºC) 50
1,0
30

40

50

60

70

80

90

100

Konsentrasi (%v/v)

Gambar 5 Contour plot aktivitas penghambatan pertumbuhan biofilm oleh
ekstrak daun pepaya
Optimasi Aktivitas Pendegradasian Biofilm oleh Ekstrak Air Daun Pepaya
Hasil uji statistik aktivitas pendegradasian biofilm menggunakan RSM
(Response Surface Methodology) pada Minitab 16 diperoleh hasil perlakuan
konsentrasi dan waktu kontak tidak berbeda nyata (P>0.05), sedangkan perlakuan
suhu menunjukan hasil berbeda nyata (P< 0.05). Ini menunjukkan bahwa pada
masing-masing perlakuan suhu menunjukkan aktivitas pencegahan yang berbeda,
akan tetapi pada pelakuan konsentrasi dan waktu kontak yang berbeda-beda tidak
menunjukkan aktivitas pendegradasian yang berbeda. Interaksi suhu-suhu juga
memberikan hasil yang berbeda nyata (P 50%) berada diantara 35-40ºC, waktu kontak berada diantara 55-60
menit sedangkan konsentrasi berada diantara 60-100% (v/v) setara dengan 30-50
g/L.

22
%
pencegahan
ekstrak
pepayaa
< 25
– 30
25
– 35
30
– 40
35
– 45
40
– 50
45
> 50

55

50

45

40

35

Hold Values
30
25

30

35

40

45

50

%
pencegahan
ekstrak
pepayaa
< 25
– 30
25
– 35
30
35
– 40
40
– 45
45
– 50
> 50

100

Konsentrasi (%v/v)

Waktu Kontak (menit)

60

Konsentrasi 62,5

90
80
70
60
50
40
30
25

Hold Values
30

40

45

50

Waktu Kontak 60

Suhu (ºC)

Suhu (ºC)

Gambar 6 Contour plot
pepaya

35

aktivitas pendegradasian biofilm oleh ekstrak daun

Hasil Scanning Electron Microscopy (SEM)
Gambar (a) merupakan kontrol negatif yang menunjukkan pertumbuhan
bioflm E.coli pada plat polystyrene, melalui visualisasi SEM dapat dilihat agregasi
bakteri yang dilapisi oleh matriks ekstraselular. Gambar (b) menunjukkan kinerja
dari ekstrak daun singkong dalam pencegahan perlekatan sedangkan gambar (c)
menunjukan kinerja dari ekstrak daun pepaya dalam pendegradasian biofilm.
Hasil mikrograf SEM menunjukkan ekstrak singkong mampu menghambat
pertumbuhan biofilm dan ekstrak pepaya dapat mendegradasi matriks
ekstraselular dan melisis sel target, terlihat bahwa biofilm yang mendapat
perlakuan ekstrak lebih bersih atau matriks ekstraselular dari biofim lebih sedikit
bahkan tidak ada sama sekali bila dibandingkan dengan dengan biofilm tanpa
perlakuan. Komposisi utama dari biofilm adalah koloni bakteri dan matriks
ekstraselular, dimana koloni bakteri diselimuti oleh matriks ekstraseluler yang
dihasilkan oleh bakteri tersebut (Karatan dan Watnick 2009).
Bakteri dilapisi
matriks biofilm

MAG

X3,500

matriks biofilm
hanya sedikit

Terjadi penghambatan
pembentukan biofilm

(a)

matriks

(b)

MAG

X3,500

(c)

Gambar 7 Kemampuan ekstrak singkong dan pepaya dalam pencegahan dan
pendegradasian biofilm dengan SEM

4 PEMBAHASAN
Senyawa Fitokimia
Ekstrak air daun singkong, pepaya dan melinjo memiliki aktivitas
antibiofilm, aktivitas tersebut diduga disebabkan oleh kandungan kimia yang
terdapat di dalam ekstrak. Sampel daun yang digunakan dalam penelitian ini
adalah daun yang berwarna hijau, baik daun muda maupun daun tua, diambil
secara acak dari pangkal batang sampai ujung batang. Hasil fitokimia pada Tabel

23

1 menunjukkan hasil yang berbeda dari penelitian-penelitan sebelumnya, seperti
hasil penelitian Ebuehi et al (2005) yang menunjukkan ekstrak daun singkong
mengandung alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin. Ekstrak daun pepaya
berdasarkan penelitian Arumugam et al (2014) mengandung keenam senyawa
metabolit yang diuji. Pada penelitian Barua et al (2015) menunjukkan ekstrak
daun melinjo hanya mengandung flavonoid, tanin dan saponin. Perbedaan hasil ini
disebabkan oleh banyak faktor seperti faktor-faktor lingkungan berupa suhu,
cahaya matahari, iklim, mutu atmosfer (CO2, O2 dan kelembaban), lingkungan
perakaran (sifat kimia dan fisika tanah) dan ketersediaan air di dalam tanah
memiliki pengaruh terhadap hasil metabolit sekunder tanaman (Nitisapto dan
Siradz 2005).
Senyawa metabolit sekunder dari ekstrak daun singkong, pepaya dan
melinjo diduga berpotensi memiliki aktivitas antibiofilm, dimana menurut
penelitian Lee et al (2011) flavonoid dapat menghambat pembentukkan biofilm
pada bakteri Escherichia coli O157:H7 pada usus tikus tanpa mengganggu biofilm
baik di dalam usus. Pada penelitian Mudjiono et al (2015) menunjukkan ekstrak
tanin dari kulit manggis mampu mendegradasi biofilm Enterococcus faecalis
sebesar 91% pada konsentrasi tanin 12,5%. Alkaloid juga dapat menghambat
aktivitas quorum sensing atau komunikasi antar sel (Park et al. 2008) dan pada
penelitian Shafiei et al (2014) saponin dapat menghambat pembentukan protein
yang merupakan komponen dari matriks ekstrakseluler sehingga mengakibatkan
terhambatnya pembentukan mikrokoloni biofilm. Pada penelitian Goggin et al
(2014) senyawa steroid dapat menghambat pertumbuhan biofilm Staphylococcus
aureus, sehingga tidak menutup kemungkinan steroid juga mampu menghambat
pertumbuhan biofilm Escherichia coli.
Pencirian Bakteri Uji
Bakteri Escherichia coli yang digunakan dalam pembentukan biofilm
dalam penelitian ini dipurifikasi terlebih dahulu menggunakan media Eosin
Methylene Blue Agar (EMBA) yang merupakan media diferensial (Ifeanyi et al.
2012). Media diferensial yaitu media yang dapat menumbuhkan beberapa jenis
bakteri dan menyebabkan koloni-koloni suatu bakteri tertentu mendapatkan
bentuk yang khas. Media Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) yang merupakan
media padat yang mengandung eosin dan methylene blue yang dapat
dipergunakan untuk menentukan jenis bakteri E.coli, dimana di dalam cawan petri
Escherichia coli akan tumbuh dengan membentuk koloni berwarna hijau dengan
kilap logam (Gambar 1)( Arshad et al. 2006). Media ini merupakan media selektif
untuk bakteri Gram negatif dan mempunyai keistimewaan mengandung laktosa
dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti
bakteri E.coli yang merupakan fermentor yang kuat menghasilkan produk akhir
bersifat asam kuat. (Cheeptham 2012).
Escherichia coli diinkubasi selama 24 jam pada media agar Eosin
Methylene Blue pada suhu 37°C, dimana pada suhu 37°C merupakan suhu yang
optimal bagi pertumbuhan bakteri E.coli sehingga dapat tumbuh dengan baik
(Jawetz et al. 2008). Setelah masa inkubasi, bakteri uji dilakukan pengamatan
secara morfologis dan dikarakterisasi dengan cara pewarnaan Gram.
Hasil pewarnaan Gram bakteri dapat ditentukan berdasarkan pada struktur
dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung lebih banyak

24
protein sedangkan pada bakteri gram negatif mengandung lebih banyak lemak dan
memiliki dinding sel yang lebih tipis (Fitri dan Yasmin 2011). Prinsip pewarnaan
Gram adalah kemampuan dinding sel mengikat zat warna dasar setelah pencucian
dengan alkohol (Narasimhulu et al. 2010). Bakteri gram positif mengandung
peptidoglikan lebih banyak dimana saat pencucian dengan alkohol mengakibatkan
dinding sel terdehidrasi, pori-pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan
membran menurun sehingga pewarnaan safranin tidak dapat masuk dan
mengakibatkan sel tetap bewarna kristal violet yaitu biru-ungu.
Pada bakteri gram negatif pewarnaan safranin dapat masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah, dimana pemberian alkohol
mengakibatkan lunturnya zat warna kristal violet dan terekstraksinya lipid
sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel (Silhavy et al. 2010). Dari hasil
pewarnaan Gram dapat dilihat secara mikroskopik bahwa isolat bakteri uji yang
digunakan menghasilkan warna merah, berbentuk batang pendek, dan tidak
berspora. Jadi dapat disimpulkan isolat yang digunakan adalah benar merupakan
bakteri gram negatif yaitu bakteri E.coli.
Aktivitas Antibiofilm dari Bakteri Escherichia coli pada Konsentrasi Ekstrak
yang Berbeda
Langkah awal dalam pembentukan biofilm adalah perlekatan sel-sel bakteri
pada permukaan benda padat, dimana sel bakteri yang memiliki flagella
cenderung lebih mudah bergerak dan berpindah dari media cair ke permukaan
benda padat (Palmer et al. 2007). Tahap kedua yaitu pertumbuhan biofilm dengan
adanya komunikasi antar sel, saling berikatannya flagella atau pili dari masingmasing bakteri dan jika intensitas sinyal mencapai ambang batas tertentu maka
mekanisme genetik pembentuk matriks ekstraseluler akan diaktifkan sehingga
bakteri dapat berkembang biak dalam matriks yang dihasilkannya dan membentuk
sebuah koloni (Keller dan Surette 2006). Maktriks ekstraselular akan menyelimuti
koloni bakteri tersebut sehingga menyebabkan bakteri akan tahan terhadap
lingkungan yang ekstrim misalnya seperti temperatur dan pH yang ekstrim
ataupun radiasi sinar UV (Jefferson 2004). Sehingga biofilm tidak dapat
dibersihkan dengan cara pembersihan yang sederhana.
Pada tahap pencegahan perlekatan, permukaan benda padat berupa
mikroplate polystyrene 96 wells dilapisi oleh ekstrak uji terlebih dahulu dan
diharapkan terjadi pencegahan perlekatan bakteri ke permukaan oleh ekstrak uji.
Pada tahap penghambatan pertumbuhan, ekstrak uji dicampurkan pada media
pertumbuhan biofilm dan diharapkan dapat menghambat pertumbuhan biofilm
sedangkan pada tahapan pendegradasian biofilm, biofilm yang telah terbentuk
diberikan ekstrak uji dan diharapkan dapat mendegradasi biofilm yang telah
terbentuk tersebut.
Dari data yang dianalisis pada Gambar 3 dapat dilihat ekstrak yang
memiliki kinerja terbaik dalam pencegahan perlekatan sebesar 45.12% yaitu
ekstrak daun singkong, sedangkan ekstrak yang memiliki kinerja terbaik dalam
penghambatan pertumbuhan (36.02%) dan pendegradasian biofilm (46.37%) yaitu
ekstrak daun pepaya. Kinerja ekstrak terbaik dari masing-masing perlakuan
selanjutnya dioptimasi menggunakan RSM (Response Surface Methodology).

25

Kemampuan ekstrak daun singkong dalam mencegah perlekatan biofilm
diduga karena adanya kandungan tanin dan flavonoid, dimana pada ekstrak
tanaman yang telah diteliti oleh Lee et al (2013) yang juga memiliki kandungan
tanin dan flavonoid diketahui mampu menghambat ekspresi gen icaA dan icaD
yang merupakan salah satu regulator pembentukan biofilm. Gen icaA dan icaD
dapat mensintesis Polysaccharide Intercellular Adhesion (PIA) yang mempunyai
peran penting dalam pembentukan biofilm (Rohde et al. 2010). Selain flavonoid
dan tanin, alkaloid juga diduga berperan penting dalam pencegahan perlekatan,
dimana alkaloid dapat mengikat mikronutrien penting seperti zat besi yang
berfungsi sebagai sumber nutrisi pada bakteri dan faktor transkripsi gen csgD
yang merupakan regulator sentral produksi curli dalam pembentukan biofilm
E.coli sehingga dapat menghambat perlekatan permanen bakteri pada permukaan
benda padat (Artini et al. 2012).
Ekstrak daun pepaya yang memiliki aktivitas terbaik dalam penghambatan
pertumbuhan dan pendegradasian biofilm diduga karena adanya senyawa
metabolit sekunder dan beberapa enzim yang terdapat di dalam daun pepaya.
Getah pepaya mengandung tiga jenis enzim seperti enzim papain, dimana enzim
papain merupakan enzim proteolitik yang dapat mendegradasi protein dan diduga
dapat mendegradasi matriks ekstraselular yang terdapat pada biofilm. Enzim
khimopapain yang berfungsi mengkatalisis reaksi hidrolisis protein dan
polipeptida serta enzim lisozim yang berfungsi sebagai enzim antibakteri dimana
dapat memecah dinding sel bakteri (Moussaoui et al. 2001).
Senyawa metabolit dalam ekstrak daun pepaya juga berperan penting
dalam penghambatan pertumbuhan dan pendegradasian biofilm, menurut
penelitian Vikram et al (2010) flavonoid dapat menekan pembentukkan biofilm
melalui penghambatan quorum sensing dan juga flavonoid dapat menghambat
ekspresi gen lsrACDBF, csgA, csgB yang merupakan regulator pembentukan
fimbria pada biofilm E.coli, sehingga terganggunya metabolisme di dalam matriks
ekstraselular dan mengakibatkan terhambatnya transport nutrisi (Lee