Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Daun Melinjo, Daun Singkong, Dan Daun Pepaya Terhadap Bakteri Pseudomonas Aeruginosa Secara In Vitro

AKTIVITAS ANTIBIOFILM EKSTRAK AIR DAUN MELINJO,
DAUN SINGKONG DAN DAUN PEPAYA TERHADAP BAKTERI
Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VITRO

EKAJAYANTI KINING

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aktivitas Antibiofilm
Ekstrak Air Daun Melinjo, Daun Singkong, dan Daun Pepaya terhadap Bakteri
Pseudomonas aeruginosa secara In Vitro adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2015
Ekajayanti Kining
NIM G851130141

RINGKASAN
EKAJAYANTI KINING. Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Daun Melinjo, Daun
Singkong, dan Daun Pepaya terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa secara In
Vitro Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan NOVIK NURHIDAYAT.
P. aeruginosa merupakan pathogen oportunistik yang cenderung
membentuk biofilm untuk mempertahankan kelangsungan hidupnya. Biofilm
terbentuk sebagai hasil dari penempelan mikroorganisme pada berbagai
permukaan dengan memproduksi polimer ekstraseluler (polisakarida dan protein).
Biofilm menyebabkan masalah serius pada industri kimia, kesehatan dan farmasi.
Penemuan terbaru menyatakan bahwa beberapa senyawa fenolik alam yang
ditemukan pada beberapa tanaman memiliki efek terhadap pembentukan biofilm
bakteri Gram negatif. Biofilm mampu menetralkan pengaruh buruk lingkungan
seperti pH, tekanan dan suhu yang ekstrim.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi senyawa fitokimia yang
terkandung dalam ekstrak air daun pepaya, daun singkong dan daun melinjo

dalam penghambatan perlekatan, penghambatan pertumbuhan maupun degradasi
biofilm dengan metode microtiter-plate. Uji ini termasuk pewarnaan dengan
menggunakan Kristal violet kemudian dilarutkan menggunakan etanol absolut.
Optical density (OD) dari larutan diukur menggunakan microplate reader
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun papaya dan daun
singkong secara kualitatif mengandung alkaloid, tanin, flavonoid dan steroid.
Daun melinjo secara kulitatif mengandung alkaloid, tanin, saponin dan steroid.
Ketiga ekstrak tersebut menunjukkan aktivitas antibakteri dan antibiofilm bakteri
P. aeruginosa. Ekstrak yang paling baik dalam menghambat pencegahan
perlekatan dan kemampuan degradasi adalah ekstrak daun papaya, sedangkan
ekstrak melinjo merupakan ekstrak yang paling baik dalam menghambat
pertumbuhan biofilm. Selanjutnya dilakukan optimasi antibiofilm. Tujuan dari
optimasi ini adalah menentukan kondisi optimal untuk meningkatkan respon
penghambatan dan pendegradasian biofilm. Variabel yang akan dioptimasi adalah
konsentrasi ekstrak (A), suhu (B), dan waktu kontak (C). Variabel tersebut dioptimasi
menggunakan Response Surface Methodology (RSM) dengan rancangan Central
Composite Design (CCD). Kondisi optimal untuk penghambatan perlekatan sel
berdasarkan RSM adalah ekstrak daun papaya pada konsentrasi 25%, suhu 37.5 °C
dengan waktu kontak 45 menit. Kondisi optimal untuk penghambatan
pertumbuhan adalah ekstrak daun melinjo pada konsentrasi 25%, suhu 50 °C

dengan waktu kontak 3 hari kemudian kondisi optimal untuk degradasi biofilm
adalah ekstrak daun papaya pada konsentrasi 25% (v/v), suhu 37.5 °C, waktu
kontak 45 menit.

Kata kunci: antibiofilm, Carica papaya L, Gnetum gnemon, Manihot uttilisima
Pohl, Pseudomonas aeruginosa, Metode Respon Permukaan

SUMMARY
EKAJAYANTI KINING. Antibiofilm Activity of Papaya, Cassava and Gnetum
Leaf Water Extracts against Pseudomonas aeruginosa In Vitro. Supervised by
SYAMSUL FALAH and NOVIK NURHIDAYAT
P. aeruginosa is opportunistic pathogen that form biofilm to maintain its
survival. A biofilm is formed as a result of adhesion of microorganisms to various
surfaces with the production of extracellular polymers (polysaccharides and
proteins). Biofilms cause serious problems in the chemical, medical and
pharmaceutical industries. Biofilm resists extreme ph, temperatures and pressure.
Recent findings indicate that some natural phenolic compounds found in plants
have an antibiofilm effect on biofilm formation by Gram-negative bacteria.
The research aimed to study the potential of papaya, cassava and gnetum
leaf on biofilm inhibition and degradation using a microtiter-plate. This assay

involved staining with crystal violet dye and then releasing the bound dye with
ethanol absolute. The optical density (OD) of the solution was measured at 595
nm by using microplate reader.
The results showed that papaya and cassava leaf extract contained alkaloids,
tannins, flavonoids and steroids, while gnetum leaf contained alkaloids, tannins,
saponins and steroid. All of these extract showed antibacterial and antibiofilm
activity againts P. aeruginosa. The best extract to inhibited of adhesion
prevention was papaya leaf extracts, while the extracts of gnetum leaf was the best
to inhibited the growth of biofilm. Further optimization of antibiofilm. The aims of
this study was to select the optimal condition to improve biofilm inhibition and
degradation. The variables involved in this study were concentration of the extract
(A), temperature (B), and contact time (C). These variables would be optimazed
by central composite design (CCD) matrix of response surface methodology
(RSM). The optimal condition for inhibition of attachment obtained with
response surface methodology were papaya leaf extract at concentrations of 25%,
a temperature of 37.5 °C with a contact time of 45 minutes, while optimal
condition for inhibition of the growth were gnetum leaf extract at concentration of
25%, temperature 50 ° C with a time of 3 days of contact, then optimal condition
for degradation were papaya leaf extract at concentration of 25%, a temperature of
37.5 °C with contact time of 45 minutes.

Keywords: antibiofilm, Carica papaya L, Gnetum gnemon, Manihot uttilisima
Pohl, Pseudomonas aeruginosa, Response surface methodology.

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

AKTIVITAS ANTIBIOFILM EKSTRAK AIR DAUN MELINJO,
DAUN SINGKONG, DAN DAUN PEPAYA TERHADAP BAKTERI
Pseudomonas aeruginosa SECARA IN VITRO

EKAJAYANTI KINING

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis :

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul
“Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Air Daun Melinjo, Daun Singkong, dan Daun Pepaya
terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa secara In Vitro“. Penulis mengucapkan
terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam menyelesaikan tesis

ini, terutama kepada:
1. Dr Syamsul Falah, S.Hut, M.Si sebagai pembimbing utama dan Novik Nurhidayat,
Ph.D sebagai pembimbing kedua dalam penelitian ini yang senantiasa
memberikan arahan dan bmbingan, nasehat, saran motivasi, waktu konsultasi,
serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis selama menyelesaikan
tesis ini.
2. Prof Dr drh Maria Bintang, MS sebagai penguji tesis dan Dr Mega Safithri, S.Si,
M.Si sebagai wakil Program Studi yang telah memberikan masukan dan saran
pada saat ujian tesis
3. Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS sebagai ketua program studi Biokimia yang
senantiasa memberikan motivasi dan arahan selama menyelesaikan tesis ini.
4. Kedua orang tua, serta adik-adik yang senantiasa mendoakan dan memberikan
semangat selama menyelesaikan tesis ini.
5. Keluarga besar mahasiswa pascasarjana program studi Biokiimia dan teman
mahasiswa penelitian di Lab. Mikrobiolog LIPI atas kebersamaan dan dorongan
semangat baik selama penelitian maupun penyusunan tesis ini.
6. Teman-teman dan semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
Penyusunan tesis ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Penulis sangat
mengharapkan adanya saran dan kritik yang bermanfaat. Semoga karya ilmiah ini
membawa manfaat.

Bogor, Agustus 2015

Ekajayanti Kining

DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR TABEL
DAFTAR LAMPIRAN

viii
viii
viii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis

Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
2
3
3

2 METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat
Bahan
Prosedur Penelitian

4
4
4
4

4

3 HASIL
Peremajaan Bakteri Uji
Senyawa Fitokimia
Aktivitas Antibakteri
Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Daun Melinjo, Pepaya dan Singkong
Optimasi Penghambatan Perlekatan Sel Ekstrak Daun Pepaya
Optimasi Penghambatan Pertumbuhan Biofilm Ekstrak Daun Melinjo
Optimasi Degradasi Biofilm Ekstrak Daun Pepaya
Visualisasi dengan Scanning Electron Microscopy

9
9
9
9
10
12
13
15

17

4 PEMBAHASAN
Peremajaan Bakteri Uji
Senyawa Fitokimia
Aktivitas Antibakteri
Optimasi Agen Antibiofilm Ekstrak Terpilih
Penghambatan Perlekatan Sel Ekstrak Daun pepaya
Penghambatan Pertumbuhan Biofilm Ekstrak Daun melinjo
Degradasi Biofilm Ekstrak Daun pepaya

18
18
18
19
20
21
22
23

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

25
25
25

DAFTAR PUSTAKA

26

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

43

DAFTAR GAMBAR
1 P. aeruginosa pada media PIA dan hasil pewarnaan Gram
2 Efek ekstrak tanaman terhadap pencegahan perlekatan sel bakteri P.
aeruginosa
3 Efek ekstrak tanaman terhadap pencegahan pertumbuhan biofilm bakteri P.
aeruginosa
4 Efek ekstrak tanaman terhadap kemampuan degradasi biofilm bakteri P.
aeruginosa
5 Contour plot hubungan suhu dan waktu kontak terhadap respon
pencegahan perlekatan sel
6 Optimalisasi pencegahan perlekatan sel menggunakan response optimizer
7 Contour plot hubungan suhu dan waktu terhadap respon penghambatan
pertumbuhan biofilm
8 Optimalisasi penghambatan pertumbuhan menggunakan response
optimizer
9 Contour plot hubungan suhu dan waktu kontak terhadap respon
kemampuan degradasi biofilm
10 Optimalisasi kemampuan degradasi menggunakan response optimizer
11 Visualisasi menggunakan SEM kemampuan ekstrak papaya dalam
menghancurkan EPS biofilm P. aeruginosa

9
11
11
11
13
13
14
14
16
16
17

DAFTAR TABEL
1 Klasifikasi respon hambatan
2 Hasil uji kualitatif fitokimia
3 Diameter zona bening pertumbuhan bakteri Pseudomonas aeruginosa pada
inkubasi 24 jam
4 Estimasi koefisien regresi untuk pencegahan perlekatan sel
5 Estimasi koefisien regresi untuk penghambatan pertumbuhan biofilml
6 Estimasi koefisien regresi untuk kemampuan degradasi biofilm

6
9
10
12
14
15

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5

Diagram alir penelitian
Output Minitab 16 untuk Uji Potensi Ekstrak sebagai Anitibiofilm
Output Minitab 16 untuk Respon Surface Methodology
Jadwal penelitian
Rancangan Biaya

31
32
36
41
38

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen oportunistik, yaitu bakteri
yang memulai infeksinya dengan memanfaatkan kerusakan pada mekanisme
pertahanan inang (Mansouri et al. 2013). Bakteri P. aeruginosa termasuk bakteri
Multi drug resistant yang sulit untuk dikendalikan karena bakteri ini membentuk
biofilm tebal resisten terhadap antibiotik yang juga menjaga dari pertahanan
kekebalan tubuh, menurunkan prognosis jangka panjang pasien terinfeksi.
Biofilm merupakan kumpulan dari sel-sel mikroba yang melekat secara
irreversible pada suatu permukaan dan terbungkus dalam matriks Extracellular
Polymeric Substances (EPS) yang dihasilkannya sendiri serta memperlihatkan
adanya perubahan fenotip seperti perubahan tingkat pertumbuhan dari sel
planktonik atau sel bebasnya (Donlan 2002). Biofilm P. aeruginosa yang telah
matang dikelilingi oleh matriks eksopolisakarida, faktor pelekatan (adhesion)
seperti flagel dan fimbrial, fimbrial non adhesin (Power dan Jennings, 2003).
Kuorum penginderaan (QS) atau komunikasi sel-sel bakteri yang mengatur
banyaknya produksi faktor virulensi termasuk pembentukan biofilm P.
aeruginosa (Adonizio et al. 2008). Hal ini menjadi mikrolingkungan yang unik
dimana mikroorganisme dalam biofilm berbeda secara struktural maupun
fungsional dengan yang hidup bebas atau planktonik. Biofilm juga mampu
menetralkan pengaruh buruk lingkungan seperti pH ekstrim, tipisnya kandungan
oksigen serta tekanan dan suhu yang ekstrim. Sel-sel biofilm dapat saling
memisahkan diri dan bergabung dengan sistem matriks lainnya. Tahap ini
merupakan salah satu tahapan penting siklus hidup biofilm yang berkontribusi
pada penyebaran biologis, kelangsungan hidup bakteri dan penularan penyakit.
(Karatan dan Watnick. 2009). Oleh karena itu, sel-sel penyusun biofilm sulit
untuk ditekan populasinya dibandingkan dengan bakteri non biofilm.
Saat ini upaya pencarian alternatif pengendalian bakteri biofilm yang lebih
efektif, murah, aman, dan ramah lingkungan menjadi prioritas utama untuk
menekan dampak negatif dari penggunaan antibiofilm berbahan dasar kimia
sintetik. Pemanfaatan antibiofilm alami dengan memanfaatkan bahan-bahan
tanaman yang mudah ditemukan di alam, mudah dibuat dan mudah diaplikasikan
serta tidak meninggalkan residu kimia yang berbahaya menjadi salah satu pilihan.
Produk alam yang berpotensi sebagai antibiofilm diidentifikasi sejauh ini
adalah terpenoid, steroid, karotenoid, fenolik, furanon, alkaloid, peptida, tanin dan
lakton (Viju et al. 2013). Oleh sebab itu, usaha pemanfaatan bahan-bahan dengan
kriteria tersebut sebagai antibiofilm khususnya biofilm dari bakteri P. aeruginosa
saat ini perlu lebih dipelajari. Pemilihan daun pepaya (Carica papaya L.), daun
singkong (Manihot utilissima Pohl.), dan daun melinjo (Gnetum gnemon) sebagai
sampel penelitian didasarkan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa
daun pepaya mengandung alkaloid karpainin, karpain, vitamin C, E, kolin, enzim
proteolitik papain, flavonoid dan tanin (Milind dan Gurdita. 2011). Daun melinjo
dan daun singkong mengandung flavonoid, saponin, tanin dan steroid (Lestari
2013 dan Ervina 2014) yang diharapkan dapat menjadi alternatif agen antibiofilm

2
yang dapat mencegah perlekatan sel, pertumbuhan dan dapat mendegradasi
biofilm yang telah terbentuk.
Optimasi perlakuan perlu dilakukan untuk memaksimalkan respon.
Optimasi dengan metode konvensional membutuhkan waktu yang lama dan relatif
mahal. Metode konvensional dalam sekali percobaan, hanya satu variabel yang
divariasikan sehingga variabel yang satu dengan variabel yang lain tidak diketahui
dengan jelas. Tiap variabel diasumsikan independen satu sama lainnya sehingga
perlu dilakukan banyak uji secara bertahap. Oleh karena itu, prosedur optimasi
dengan jumlah percobaan yang banyak dapat dilakukan dengan mudah
mengunakan response surface methodology (RSM) (Saravanakumar et al. 2010).
Response surface methodology merupakan suatu model untuk mempelajari
faktor yang mempengaruhi respon secara bersamaan tanpa banyak percobaan
yang dilakukan. Teknik optimasi dengan menggunakan RSM dilakukan untuk
mendapatkan solusi terbaik dari kombinasi variabel seperti konsentrasi ekstrak,
suhu, serta waktu kontak. Kelebihan teknik RSM ialah untuk meminimalkan
waktu, tenaga dan biaya (Adinarayana dan Ellaiah. 2002).
Perumusan Masalah
Upaya pencarian alternatif pengendalian bakteri biofilm khususnya untuk
bakteri P. aeruginosa sampai saat ini mengalami perkembangan, baik itu agen
bakterisidal atau bakteriostatik. Selama ini yang digunakan adalah antibiofilm
berbahan sintetik yang dapat memberi dampak negatif pada manusia, sehingga
perlu dilakukan upaya mencari alternatif dengan menggunakan bahan berupa
tanaman yang diharapkan efektif, murah, aman, tidak berkompetisi pangan dan
ramah lingkungan.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui kandungan senyawa fitokimia
dan aktivitas antibakteri dari ekstrak daun papaya, daun melinjo dan daun
singkong. Selain itu, untuk mendapatkan agen antibiofilm yang memiliki potensi
dalam pencegahan perlekatan sel, pertumbuhan dan degradasi biofilm bakteri P.
aeruginosa yang ramah lingkungan dan tidak memberi dampak negatif pada
manusia dan mengetahui kondisi optimum
penghambatannya dengan
menggunakan response surface methodology (RSM).
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah diharapkan dapat memberikan informasi
ilmiah mengenai kandungan senyawa fitokimia, aktivitas antibakteri dan kondisi
optimum dari ekstrak air daun melinjo, daun singkong dan daun pepaya dalam
pencegahan perlekatan sel, pertumbuhan dan degradasi biofilm bakteri P.
aeruginosa.

3
Hipotesis
Ekstrak air daun melinjo, daun singkong dan daun pepaya memiliki
aktivitas antibakteri dan mengandung senyawa fitokimia yang berpotensi sebagai
antibiofilm P. aeruginosa yaitu mampu mencegah perlekatan sel pada substrat,
mencegah pertumbuhan biofilm, dan mampu mendegradasi biofilm yang telah
terbentuk.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini meliputi ekstraksi daun melinjo, daun singkong dan daun
pepaya dengan menggunkan pelarut air, kemudian diuji kandungan senyawa
fitokimia yang terdapat dalam ekstrak tanaman tersebut dan uji antibakteri.
Tahapan screening atau uji pendahuluan untuk memilih ekstrak tanaman yang
paling berpotensi sebagai antibiofilm bakteri P. aeruginosa. Ekstrak tanaman
yang paling berpotensi kemudian dioptimasi untuk melihat titik optimum aktivitas
ekstrak terhadap penghambatan perlekatan sel, pertumbuhan dan degradasi
biofilm dengan menggunakan analisis Respon Surface Methodology (RSM) dan
rancangan percobaan menggunakan Central Composite Design (CCD) serta analisis
pemilihan model dilakukan berdasarkan jumlah kuadrat dari urutan model dengan
aplikasi MINITAB 16. Respon terbaik kemudian divisualisasikan menggunakan
Scanning Electron microscope (SEM)

4

2 METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai pada bulan Desember 2014 sampai dengan
dan Mei 2015 di Laboratorium Bidang Mikrobiologi Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) Cibinong.
Alat
Alat yang digunakan adalah autoklaf, inkubator, laminar air flow, cawan
petri, jarum ose, lemari es, spektrofotometer UV-Vis UV-1700 PharmaSpec
Shimidzu, Microplate reader BioRad-iMark, Microplate Flat-bottom Polystyrene
96-wells, kuvet, sentrifuge, mikropipet, mistar, timbangan elektrik, Elenmeyer,
aluminium foil, tabung biakan, rak tabung reaksi, vortek, kertas saring, lampu
spiritus, tisu, pinset, kantong plastik, kaca preparat, gunting, mikroskop, tabung
reaksi, isolatip, gelas beaker, gelas ukur, JEOL JSM 5310LV scanning
microscope.
Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak air dari
daun melinjo, daun singkong dan daun pepaya yang diperoleh dari sekitaran
kampus IPB Dramaga. Untuk mikroba uji digunakan bakteri P. aeruginosa.
Bahan pendukung medium Heterotrof (HTR), medium Pseudomonas Isolation
Agar (PIA), aquades steril, kristal violet, alkohol 96%, alkohol 70%, lugol,
safranin, dan pereaksi yang digunakan pada saat uji fitokimia.
Prosedur Penelitian
Persiapan Sampel (Modifikasi Gomashe et al. 2014)
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun melinjo (Gnetum
gnemon), daun singkong (Manihot utilissima Pohl) dan daun pepaya (Carica
papaya L.) yang diambil di sekitar kampus IPB dan telah dideterminasi di Pusat
Konservasi Tumbuhan Kebun Raya LIPI. Sampel daun dicuci dengan air mengalir
untuk membersihkan dari tanah atau kerikil kemudian ditiriskan. Selanjutnya
dilakukan proses pengeringan dengan cara diangin-anginkan selama kurang lebih
3 hari, selanjutnya dioven selama 24 jam dengan suhu 40 °C. Daun yang telah
kering kemudian dihancurkan secara aseptik menggunakan blender. Sebanyak 5g
sampel kering daun melinjo dan daun singkong dimaserasi menggunakan akuades
panas sebanyak 100 ml (daun pepaya menggunakan air steril dingin) dan dishaker
pada suhu 70°C (daun pepaya suhu ruang) selama 18-24 jam, kemudian hasil
larutan disaring kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 5
menit, supernatan kemudian disaring menggunakan CN membran filter 0.2 µm.
Peremajaan Bakteri Uji (Modifikasi Didik 2010)
Isolat bakteri uji diperoleh dari koleksi laboratorium mikrobiologi
kesehatan LIPI Cibinong. Pada hari pertama, satu ose bakteri diinokulasi ke dalam

5
media HTR cair kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Pada hari
kedua, suspensi bakteri diinokulasikan ke dalam media padat HTR dengan metode
sebar kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Koloni tunggal
kemudian diinokulasi kedalam media selektif PIA menggunakan ose bulat secara
goresan dengan aseptis, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
Untuk meyakinkan isolate yang digunakan adalah benar P. aeruginosa maka
dilakukan pewarnaan Gram.
Analisis Fitokimia (Harborne 1987)
Analisis fitokimia adalah analisis kualitatif untuk melihat komponen
bioaktif yang terdapat pada ekstrak tanaman yang memiliki aktivitas sebagai
antibiofilm. Analisis fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji alkaloid, saponin,
flavonoid, tanin dan uji triterpenoid dan steroid menggunakan metode Harborne
(1987) dalam Ristiyana (2013).
Alkaloid. Uji alkaloid dilakukan dengan menambahkan beberapa tetes asam sulfat
2 N kedalam sampel kemudian diuji dengan pereaksi alkaloid yaitu pereaksi
dragendorff dan pereaksi meyer. Hasil uji positif diperoleh bila terbentuk endapan
merah hingga jingga dengan pereaksi dragendorff dan endapan putih kekuningan
dengan pereaksi meyer.
Triterpenoid dan steroid. Sejumlah sampel ditambahkan 2 ml kloroform lalu
ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi
positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan ungu sampai berwarna merah
untuk triterpenoid, dan biru/hijau untuk steroid.
Saponin. Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang
stabil akan terus terlihat selama 5 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes
HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
Tanin. 1-2 mL sampel ditambahkan 2 tetes FeCl3 1%. Reaksi positif
menunjukkan perubahan warna menjadi hijau kehitaman.
Flavanoid. 1-2 mL Sampel dipanaskan kemudian ditambahkan serbuk Mg
kemudian ditambahkan 4-5 tetes HCl dan etanol 95% kemudian dikocok. Uji
positif diyunjukkan oleh terbentuknya warna jingga.
Uji Aktivitas Antibakteri (Modifikasi Mulyadi et al. 2013)
Aktifitas antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi cakram
Kirby-Bauer. Kertas cakram steril (6 mm) dimasukkan kedalam 1 mL ekstrak
sampel dan dibiarkan selama 15 menit. Kertas cakram selanjutnya dimasukkan ke
dalam agar yang telah berisi bakteri target. Kertas cakram steril yang dimasukkan
kedalam aquades steril digunakan sebagai kontrol negatif dan antibiotik ampisilin
sebagai kontrol positif. Cawan petri yang telah berisi bakteri target dan kertas
cakram diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian
diamati zona hambatnya. Berikut ini merupakan tabel klasifikasi respon hambatan
pertumbuhan bakteri berdasarkan Greenwod (1995).

6
Tabel 1 Klasifikasi respon hambatan (Greenwod 1995)
Diameter zona bening
Respon hambatan pertumbuhan
≤ 10 mm
Tidak ada
11 – 15 mm
Lemah
16 – 20 mm
Sedang
Kuat
> 20 mm
Sumber : Harmely et al. 2014
Uji Penghambatan Perlekatan Sel (Modifikasi Sandasi et al. 2009)
Pengujian dilakukan dengan menggunakan Microplate Flat-bottom
Polystyrene 96-well. Tahap awal yang dilakukan adalah melapisi sumur dengan
sampel. Sebanyak 200 μL sampel dengan seri konsentrasi 25, 50, 75, dan 100%
(v/v) dimasukkan kedalam sumuran, sumur tanpa penambahan sampel digunakan
sebagai kontrol negatif. Mikroplate kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama
1 jam. Mikroplate dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali untuk mengeluarkan
sisa sampel. Selanjutnya dilakukan pembentukan biofilm dengan cara
memasukkan suspensi bakteri 60 μL dan media sebanyak 120 μL pada microplate
dan inkubasi pada suhu 37°C dengan waktu inkubasi selama 3 hari. Microplate
dicuci dengan air steril sebanyak 3 kali untuk mengeluarkan suspensi bakteri yang
tidak membentuk biofilm. Penambahan 200 μL kristal violet 1% inkubasi pada
suhu ruang selama 15 menit. Microplate dicuci dengan air steril. Ditambahkan
etanol absolut 200 μL dan inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Pengamatan
dilakukan dengan iMark Bio-Rad microplate reader pada panjang gelombang 595
nm. Pengujian ini dilakukan dengan 3 kali ulangan.
% Penghambatan =

��

� � −�� �

��

� �

�

�

�

%

Uji Penghambatan Pertumbuhan Biofilm (Modifikasi Yosephine et al. 2013)
Sama dengan pengujian sebelumnya, ke dalam masing-masing sumuran
dimasukkan sebanyak 80 μL larutan sampel dengan seri konsentrasi 25, 50, 75
dan 100% (v/v), 80μL media HTR, serta 40 μL suspensi bakteri lalu mikroplate
diinkubasi pada 37 °C selama 3 hari. Kemudian mikroplate dicuci dengan air
steril dan langkah selanjutnya seperti pada uji penghambatan perlekatan sel.
Pengujian ini dilakukan dengan 3 kali ulangan.
% penghambatan =

��

� � −�� �

��

� �

�

�

�

%

Uji Degradasi Biofilm (Modifikasi Yosephine et al. 2013)
Pengujian seperti pada uji penghambatan biofilm, tetapi pada awal
dilakukan pembentukan biofilm dengan cara memasukkan suspensi bakteri 60 μL
dan media HTR sebanyak 120 μL pada sumur mikroplate dan inkubasi pada suhu
37 °C selama 3 hari. Setelah terbentuk biofilm, mikroplate dicuci dengan air steril
sebanyak 3 kali untuk mengeluarkan suspensi bakteri yang tidak membentuk
biofilm. 200 μL larutan uji dengan variasi konsentrasi yaitu 25, 50, 75 dan 100%
(v/v) dimasukkan pada masing-masing sumur, sumur tanpa penambahan sampel
digunakan sebagai kontrol negatif. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C

7
selama 1 jam. Kemudian mikroplate dicuci kembali dengan air steril dan langkah
selanjutnya seperti pada uji penghambatan perlekatan sel. Pengujian ini dilakukan
dengan 3 kali ulangan.
% degradasi =

��

� � −�� �

��

� �

�

�

�

%

Visualisasi menggunakan Scanning Electron Microscope (SEM)
Bahan polystyrene yang sama dengan bahan mikroplate yang digunakan
pada uji sebelumnya dipotong persegi dengan ukuran 0.5 mm x 0.5 mm dan
ditempatkan di dalam mikroplate dengan 80 µL suspensi sel P. aeruginosa yang
telah ditumbuhkan semalam dan media HTR 120 µL. Sel-sel dan potongan
polystyrene diinkubasi bersama-sama untuk membentuk biofilm pada 37 °C
selama 3 hari. Setelah biofilm terbentuk, mikroplate dicuci dengan air steril
sebanyak 3 kali untuk mengeluarkan suspensi bakteri yang tidak membentuk
biofilm. Larutan uji 200 μL dengan konsentrasi 25% (v/v) dimasukkan ke dalam
sumur berisi potongan polystyrene. Potongan polystyrene tanpa penambahan
larutan uji digunakan sebagai kontrol negatif. Selanjutnya diinkubasi pada suhu
37.5 °C selama 45 menit (perlakuan terbaik pada saat optimasi). Setelah itu
potongan polystyrene tersebut dipreparasi setelah itu diamati menggunakan JEOL
JSM 5310LV scanning microscope di Laboratorium Zoology LIPI Cibinong.
Desain Penelitian dan Analisis Statistik
Uji pendahuluan untuk menentukan ekstrak yang paling berpotensi untuk
masing-masing respon (pencegahan perlekatan dan pertumbuhan serta
kemampuan mendegradasi) dianalisis menggunakan ANOVA apabila sebaran
data (distribusi data) normal dan varians data sama. Jika syarat terpenuhi
dilanjutkan dengan Tukey Post Hoc Test. Jika sebaran data tidak normal dan atau
varians data tidak sama maka digunakan uji alternatif yaitu uji Kurskal Wallis,
yang kemudian dilanjutkan dengan uji Mood’s Median menggunakan MINITAB
16.
Setelah diperoleh ekstrak terbaik, dilanjutkan dengan tahapan optimasi
untuk menentukan kondisi optimumnya dalam meningkatkan respon pencegahan
perlekatan, penghambatan pembentukan biofilm dan kemampuan mendegradasi
biofilm. Faktor yang dioptimasi adalah konsentrasi ekstrak terpilih (A), suhu (B),
dan waktu kontak (C). Pada tahap optimasi ini akan diperoleh titik-titik optimum.
Untuk memperoleh titik-titik optimum tersebut, digunakan metode permukaan
respon Response Surface Methodology (RSM) dengan bantuan software
MINITAB 16.
Keluaran (output) dari rancangan percobaan program ini adalah sederet
kombinasi variabel yang harus dibuat dan diukur tiap responnya (Lampiran 3).
Penentuan kombinasi optimal pada tahap analisis ditentukan berdasarkan hasil
respon yang didapat sesuai dengan keinginan dengan pilihan maksimum,
minimum, dalam kisaran (in range) atau dengan target tertentu. Pada penelitian ini
respon yang diinginkan adalah maksimum. Diharapkan ekstrak dengan kombinasi
yang ada dapat memberikan respon 100%. Hasil akhir dari tahap analisis berupa
kombinasi baru yang ditetapkan berdasarkan sasaran yang telah ditetapkan
sebelumnya. Program akan menetapkan beberapa solusi dengan nilai kesukaan
(desirability) yang berbeda. Semakin tinggi nilai kesukaan (mendekati 1) berarti

8
semakin optimal kombinasi tersebut. Tujuan optimasi bukan untuk memperoleh
nilai desirability 1.0, namun untuk mencari kondisi terbaik yang mempertemukan
semua fungsi tujuan (Raissi & Farzani, 2009). Nilai koefisien determinan R-Sq,
R-Sq (Pred) dan R-Sq (Adj) menunjukkan seberapa besar hubungan antara
pengaruh variabel faktor terhadap respon. Semakin besar nilai R-Sq (Pred) artinya
model yang kita miliki dapat digunakan untuk observasi baru yang akan
menghasilkan nilai respon yang tidak jauh berbeda dari apa yang diprediksi oleh
model.

9

3 HASIL
Peremajaan Bakteri Uji
.

Gambar 1 P. aeruginosa pada media PIA dan hasil pewarnaan Gram
Gambar 1 adalah bakteri P. aeruginosa pada media selektif Pseudomonas
Isolation Agar (PIA) dan hasil pewarnaan Gram. Pada media agar, P. aeruginosa
dapat menyebar di permukaan seperti selaput gel licin yg berbau seperti anggur.
Koloni P. aeruginosa pada media PIA berwarna hijau kebiruan. Berdasarkan hasil
pewarnaan Gram, bakteri uji terlihat berbentuk batang, dan menjadi warna merah
akibat pewarnaan kontras safranin, yang menunjukkan bakteri uji merupakan
bakteri Gram negatif.
Senyawa Fitokimia
Hasil uji kualitatif fitokimia ekstrak air daun pepaya dan daun singkong
(Tabel 2) menunjukkan positif senyawa alkaloid, tanin, steroid dan flavonoid
sedangkan untuk senyawa triterpenoid dan saponin hasilnya negatif. Daun melinjo
positif alkaloid, steroid, tanin dan saponin, tapi negatif triterpenoid dan flavonoid.
Tabel 2 Hasil uji kualitatif fitokimia
No

Uji
Fitokimia

1
2
3
4
5
6

Alkaloid
Triterpenoid
Steroid
Tanin
Saponin
Flavanoid

Daun
Pepaya
+
+
+
+

Hasil Uji
Daun
Daun
Melinjo Singkong
+
+
+
+
+
+
+
+

Aktivitas Antibakteri
Zona bening yang terbentuk pada aktivitas antibakteri dengan metode difusi
cakram menunjukkan adanya pengaruh ekstrak air daun pepaya, daun singkong

10
Tabel 3 Diameter zona bening pertumbuhan bakteri P. aeruginosa pada inkubasi
24 jam
Tipe ekstrak
Kontrol negatif (aquades)
Daun pepaya
Daun melinjo
Daun singkong
Kontrol positif (ampisilin)

Diameter zona
bening
0 mm
25 mm
11 mm
10 mm
40 mm

Respon hambatan
pertumbuhan
Tidak ada
Kuat
Lemah
Lemah
Kuat

dan daun melinjo pada konsentrasi 100% terhadap pertumbuhan bakteri P.
aeruginosa. Tabel 3 menunjukkan bahwa respon hambat yang paling kuat adalah
kontrol positif (ampisilin), diikuti daun pepaya, sedangkan untuk daun melinjo
dan daun singkong respon hambatannya termasuk kategori lemah.
Aktivitas Antibiofilm Ekstrak Daun Melinjo, Pepaya dan Singkong
Berdasarkan hasil penelitian, terlihat bahwa secara umum ketiga ekstrak
memiliki aktivitas sebagai antibiofilm meskipun tidak menghambat secara
keseluruhan. Tahapan awal yang perlu diperiksa sebelum analisis ragam
dilakukan adalah apakah asumsi tentang kehomogenan ragam, sebagai syarat
sahnya ANOVA, terpenuhi. Untuk itu diperlukan uji Bartlett. Analisis statistik
menunjukkan data respon pencegahan perlekatan, pencegahan pertumbuhan dan
kemampuan mendegradasi biofilm adalah homogen (Lampiran 2). Kesimpulan ini
didasarkan pada p-value (p>0.05). Dengan demikian analisis dapat dilanjutkan ke
ANOVA untuk membandingkan perbedaan rata-rata lebih dari dua kelompok
dilanjutkan uji Tukey untuk membandingkan perbedaan rata-rata antar kelompok
menggunakan program MINITAB 16.
Berdasarkan uji statistik semua data penelitian baik itu respon pencegahan
perlekatan, pencegahan pertumbuhan maupun kemampuan degradasi
menunjukkan nilai signifikan (p 40

55

waktu (menit)

50

Hold Values
k onsentrasi 25

45

40

35

30
25

30

35
40
suhu (°C)

45

50

Gambar 5 Contour plot hubungan suhu dan waktu kontak terhadap respon
Optimal
High
D
Cur
1.0000 Low

konsentr
100.0
[100.0]
25.0

suhu
50.0
[40.6566]
25.0

waktu
60.0
[41.8182]
30.0

Composite
Desirability
1.0000

Perlekat
Maximum
y = 47.5547
d = 1.0000

Gambar 6 Optimalisasi pencegahan perlekatan menggunakan response optimizer
Untuk mengetahui korelasi antar faktor dalam model ini terhadap respon
dapat dilihat melalui contour plot (Gambar 5). Melalui Contour plot dapat
diketahui bahwa respon terbaik (>40%) berada pada suhu diantara 35 dan 50 °C
dan waktu kontak antara 35 dan 50 menit. Berdasarkan data hasil penelitian
persen penghambatan perlekatan yang paling besar yaitu sebesar 41.176% pada
konsentrasi 25%, suhu 37.5 °C dengan waktu kontak 45 menit.
Dari hasil output program Respon Optimizer didapatkan optimal setting
untuk respon pencegahan perlekatan sesuai dengan range yang dipilih seperti pada
Gambar 6 terlihat bahwa optimal setting untuk kombinasi perlakuan konsentrasi
ekstrak, suhu dan waktu kontak berdasarkan range yang kita pilih menghasilkan
optimal desirability sebesar 1. Dengan kombinasi variabel baru yang disarankan
yaitu konsentrasi ekstrak 100% (v/v) dengan suhu 40.6566 °C dan waktu kontak
41.8182 menit, respon pencegahan perlekatan dapat ditingkatkan semaksimal
mungkin yaitu sebesar 47.5547%.
Optimasi Penghambatan Pertumbuhan Biofilm Ekstrak Daun Melinjo
Berdasarkan hasil analisis ANOVA, faktor yang menunjukkan adanya
pengaruh secara signifikan (P < 0.05) adalah suhu (P = 0.000), waktu kontak (P =
0.000) dan interaksi antara suhu dengan waktu kontak (P = 0.000) sedangakan
faktor konsentrasi ekstrak tidak berpengaruh secara signifikan (Tabel 5). Nilai

14
koefisien determinan R2 ialah 89.95 % yang berarti bahwa 89.95% variabel respon
dipengaruhi oleh variabel independen, sedangkan sisanya 10.05% dipengaruhi
oleh variable yang tidak diketahui.
Persamaan RSM untuk optimasi konsentrasi (A), suhu (B) dan waktu kontak
(C) terhadap respon penghambatan pertumbuhan (Y) adalah :
Y = -31936 + 259.7B -22393.1C + 14.0A2 - 11.0B2 - 3921.4C2 + 87.6BC
Tabel 5 Estimasi koefisien regresi untuk respon penghambatan pertumbuhan
Term
Coef
SE Coef
Constant
-31936
2992.89
Block
3.0
0.69
Konsentrasi
-27.7
40.33
Suhu
259.7
40.33
Waktu
-22393.1
2088.12
Konsentrasi*konsentrasi
14.0
1.62
Suhu*suhu
-11.0
1.62
Waktu*waktu
-3921.4
364.20
Konsentrasi*suhu
-1.4
0.94
Konsentrasi *waktu
-9.7
14.06
Suhu*waktu
87.6
14.06
S = 4.59331 PRESS = 1517.86
R-Sq = 89.95% R-Sq(pred) = 85.24% R-Sq(adj) = 87.90%

3.0

P
0.000
0.000
0.495
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.147
0.492
0.000

pertumbuhan
< 10
– 20
10
– 30
20
– 40
30
> 40

2.5

Waktu kontak (Hari)

T
-10.671
4.375
-0.687
6.441
-10.724
8.630
-6.777
-10.767
-1.473
-0.693
6.228

Hold Values
k onsentrasi 25

2.0

1.5

1.0
25

30

35
40
Suhu (°C )

45

50

Gambar 7 Contour plot hubungan waktu kontak dan suhu terhadap respon
Optimal
High
D
Cur
1.0000 Low

konsentr
100.0
[25.0]
25.0

suhu
50.0
[44.1919]
25.0

waktu
3.0
[2.2727]
1.0

Composite
Desirability
1.0000

pertumbu
Maximum
y = 49.2211
d = 1.0000

Gambar 8 Optimalisasi penghambatan pertumbuhan menggunakan response
optimizer

15
Untuk mengetahui korelasi antar faktor dalam model ini terhadap respon
dapat dilihat melalui contour plot (Gambar 7). Melalui Contour plot diatas dapat
diketahui bahwa untuk menghasilkan respon >40% berada pada suhu antara 30 °C
dan 50 °C dan waktu kontak antara 1.5 hari dan 3 hari. Berdasarkan data hasil
penelitian persen penghambatan pertumbuhan yang paling besar yaitu sebesar
47.154% pada konsentrasi 25%, suhu 50 °C dengan waktu kontak 3 hari.
Dari hasil output program Respon Optimizer didapatkan optimal setting
untuk respon pencegahan perlekatan sesuai dengan range yang dipilih seperti pada
Gambar 8. Dari gambar diatas, terlihat bahwa optimal setting untuk kombinasi
perlakuan konsentrasi ekstrak, suhu dan waktu kontak berdasarkan range yang
kita pilih hanya menghasilkan optimal desirability sebesar 1.0. Dengan kombinasi
variabel baru yang disarankan yaitu konsentrasi ekstrak 25% (v/v) dengan suhu
44.19 °C dan waktu kontak 2.27 hari, respon pencegahan perlekatan dapat
ditingkatkan semaksimal mungkin yaitu sebesar 49.22%.
Optimasi Degradasi Biofilm Ekstrak Daun Pepaya
Berdasarkan hasil analisis ANOVA, faktor yang menunjukkan adanya
pengaruh secara signifikan (P < 0.05) adalah suhu (P = 0.000), waktu kontak (P =
0.001), interaksi suhu dan waktu kontak (P = 0.001), sedangakan faktor
konsentrasi ekstrak (P=0.240) dan interaksi konsentrasi dan suhu (P = 0.325) tidak
berpengaruh secara signifikan. Nilai koefisien determinan R2 ialah 86.23%.
Artinya 86.23% variabel respon dipengaruhi oleh variabel independen.
Persamaan RSM untuk optimasi konsentrasi (A), suhu (B) dan waktu kontak
(C) terhadap respon pendegradasian (Y) adalah :
Y = 31.6640 + 6.2446B + 3.1426C + 16.7179A2 - 12.0016B2 - 19.6269C2
+ 3.5153BC
Tabel 6 Estimasi koefisien regresi untuk respon kemampuan degradasi
Term
Coef
SE Coef
T
Constant
31.6640
1.0548
30.018
Block
2.6771
0.7708
3.473
Konsentrasi
-1.1062
0.9389
-1.178
Suhu
6.2446
0.9389
6.651
Waktu
3.1426
0.9389
3.347
Konsentrasi*konsentrasi
16.7179
1.8122
9.225
Suhu*suhu
-12.0016
1.8122
-6.623
Waktu*waktu
-19.6269
1.8122
-10.831
Konsentrasi*suhu
-1.0341
1.0497
-0.985
Konsentrasi *waktu
-0.3624
1.0497
-0.345
Suhu*waktu
3.5153
1.0497
3.349
S = 5.14244 PRESS = 1781.31
R-Sq = 86.26% R-Sq(pred) = 81.11% R-Sq(adj) = 83.46%

P
0.000
0.001
0.244
0.000
0.002
0.000
0.000
0.000
0.329
0.731
0.002

16
60

Perlekatan
< -20
– -10
0
–
– 10
– 20
– 30
– 40
> 40

-20
-10
0
10
20
30

Waktu kontak (Menit)

55

50

Hold Values
konsentrasi 25

45

40

35

30
25

30

35
40
Suhu (°C )

45

50

Gambar 9 Contour plot hubungan suhu dan waktu kontak terhadap respon

Optimal
D High
Cur
1.0000 Low

konsentr
100.0
[25.0]
25.0

suhu
50.0
[41.4141]
25.0

waktu
60.0
[46.6667]
30.0

Composite
Desirability
1.0000

degradas
Maximum
y = 50.8599
d = 1.0000

Gambar 10 Optimalisasi kemampuan degradasi menggunakan response optimizer
Untuk mengetahui korelasi antar faktor dalam model ini terhadap respon
dapat dilihat melalui contour plot (Gambar 9). Melalui Contour plot dapat
diketahui bahwa untuk menghasilkan respon terbaik (>40%) berada pada suhu
diantara 35 °C dan 50 °C dengan waktu kontak antara 35 menit dan 45 menit.
Berdasarkan data hasil penelitian yang dilakukan, persen degradasi yang paling
besar yaitu sebesar 49.029% pada suhu 37.5 °C, waktu kontak 45 menit dengan
konsentrasi 25% (v/v).
Untuk mendapatkan optimal setting dengan harapan perlakuan yang kita
lakukan akan menghasilkan respon yang sesuai dengan harapan, dapat diperoleh
dari hasil analisis response optimizer (Gambar 10). Terlihat bahwa optimal
setting untuk kombinasi perlakuan konsentrasi ekstrak, suhu dan waktu kontak
menghasilkan optimal desirability sebesar 1.0.
Dengan kombinasi yang
disarankan yakni konsentrasi ekstrak 25% (v/v) dengan suhu 41.41 °C dan waktu
kontak 46.67 menit, persentase kemampuan degradasi dapat ditingkatkan menjadi
semaksimal mungkin 50.86%.

17
Visualisasi Menggunakan Scanning Electron Microscopy
Hasil visualisasi perlakuan degradasi ekstrak daun pepaya konsentrasi 25%
menggunakan SEM ditunjukkan pada Gambar 11. Perbedaan antara EPS pada
biofilm yang telah diberikan perlakuan ekstrak daun pepaya dengan biofilm tanpa
perlakuan ekstrak terlihat dari hasil SEM diatas. Biofilm yang mendapat
perlakuan ekstrak pepaya lebih bersih atau dalam hal ini EPS-nya lebih sedikit
bahkan tidak ada sama sekali bila dibandingkan dengan biofilm tanpa perlakuan.
Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak pepaya terbukti dapat mendegradasi EPS.

Matriks EPS

MAG 5000x

MAG 5000x

Gambar 11 Visualisasi menggunakan SEM kemampuan ekstrak pepaya dalam
menghancurkan EPS biofilm P. aeruginosa (a) tanpa perlakuan (b)
pemberian ekstrak pepaya 25% (v/v)

18

4 PEMBAHASAN
Peremajaan Bakteri Uji
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram, bakteri uji termasuk bakteri Gram
negatif ditandai dengan warna merah pada saat penambahan safranin. Hal tersebut
terjadi karena pada gram negatif lemak terekstraksi dari dinding sel sehingga pori
membesar dan kompleks violet kristal-iodin keluar sel, sedangkan pada gram
positif dinding sel dehidrasi, pori berkerut dan permeabilitas rendah sehingga
kompleks violet kristal-iodin terperangkap antara dinding sel dan membran
sitoplasma sehingga sel tetap ungu sehingga dengan pewarnaan safranin, bakteri
Gram negatif mengikatnya sedangkan Gram positif melewatkannya Selain
berwarna merah, bentuk selnya terlihat berbentuk batang. Hal ini sesuai dengan
ciri-ciri P. aeruginosa. P. aeruginosa adalah bakteri berbentuk batang Gram
negatif, dengan ukuran sekitar 0,6 x 2 μm termasuk kedalam Familia
Pseudomonadaceae. Bakteri ini terlihat sebagai bakteri tunggal, berpasangan, dan
terkadang membentuk rantai yang pendek. P. aeruginosa bersifat aerob, katalase
positif, oksidase positif, tidak mampu memfermentasi tetapi dapat mengoksidasi
glukosa/karbohidrat lain, tidak berspora, tidak mempunyai selubung (sheat) dan
mempunyai flagel monotrika (flagel tunggal pada kutub) sehingga selalu bergerak
(Todar 2008).
Media selektif yang digunakan adalah media PIA. Pseudomonas isolation
Agar merupakan media yang sangat berguna untuk mengisolasi Pseudomonas spp.
Media ini selektif dan diformulasi untuk meningkatkan pembentukan pigmen biru
atau biru-hijau pyocyanin oleh Pseudomonas aeruginosa. Pigmen berdifusi ke
dalam medium pertumbuhan di sekitarnya. Dalam bahasa latin kata Pseudo berarti
palsu, monas artinya unit single , sedangkan aeruginosa artinya membetuk warna
hijau kebiruan. Pada saat pembiakan didalam laboratorium, bakteri ini diinkubasi
pada suhu 37 °C, sebab lingkungan alami P. aeruginosa adalah pada suhu 4 – 36
ºC, tetapi mereka bisa tahan sampai suhu 42 ºC. Salah satu tempat favorit P.
aeruginosa adalah Mineral Water atau Air Minum Dalam kemasan terutama yang
menggunakan dispenser.
Senyawa Fitokimia
Hasil uji kualitatif fitokimia daun pepaya dan daun singkong (Tabel 2)
menunjukkan uji positif senyawa alkaloid, tanin, flavanoid dan steroid. Daun
melinjo positif saponin, alkaloid, tanin dan steroid. Hasil penelitian ini berbeda
dengan uji fitokimia yang dilakukan oleh Yusha’u et al. (2009) yang menyatakan
bahwa ekstrak air daun pepaya hanya positif mengandung saponin dan tanin.
Begitu juga pada penelitian yang dilakukan Lestari (2013) yang menyatakan
bahwa daun melinjo positif flavanoid dan Ervina (2014) yang menyatakan bahwa
daun singkong positif saponin. Hal ini menunjukkan bahwa faktor lingkungan
seperti iklim, cahaya matahari, suhu udara, lingkungan atmosfer (CO2, O2, dan
kelembaban), lingkungan perakaran (sifat kimia dan fisika tanah), dan
ketersediaan air di dalam tanah memiliki pengaruh terhadap hasil metabolisme
sekunder tanaman (Nitisapto dan Siradz 2005).
Pengujian tanin menunjukkan bahwa tanin yang terkandung di dalam daun
pepaya, singkong dan melinjo merupakan tanin kondensasi karena terbentuk

19
warna hijau kehitaman karena adanya reaksi penambahan FeCl3 dengan salah satu
gugus hidroksil pada tanin. Ketiga ekstrak menunjukkan uji positif pada uji
alkaloid. Pada uji alkaloid diperkirakan nitrogen pada alkaloid akan membentuk
ikatan kovalen koordinat dengan ion logam K+ dari kalium tetraiodomerkurat (II)
membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Marlina 2005). Alkaloid
pada pepaya merupakan alkaloid karpain (Milind dan Gurdita. 2011). Uji
flavonoid menunjukkan uji positif (merah) untuk ekstrak daun pepaya dan daun
singkong, tetapi negatif untuk daun melinjo. Jenis flavonoid yang terkandung
dalam ekstrak, kemungkinan adalah jenis quercetin. Senyawa quercetin
merupakan golongan flavonol yang paling banyak terdapat dalam tanaman dan
merupakan senyawa yang paling aktif dibandingkan senyawa lain dari golongan
flavonol. Hasil positif steroid ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna
menjadi hijau biru. Reaksi yang terjadi antara steroid dengan asam asetat adalah
reaksi asetilasi gugus –OH pada steroid yang akan menghasilkan kompleks asetil
steroid. Penambahan asam sulfat pekat bertujuan untuk mendestruks