Isolasi Dan Karakterisasi Protein Kepiting, Cumi Cumi , Kacang Hijau, Dan Kacang Koro Pedang Untuk Pembuatan Isolat Alergen
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN KEPITING
(Scylla serrata), CUMI-CUMI (Photololigo duvaucelii), KACANG
HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), DAN KACANG KORO
PEDANG (Canavalia ensiformis (L.) DC) UNTUK PEMBUATAN
ISOLAT ALERGEN
HENDRA WIJAYA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Isolasi dan
Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla serrata), Cumi-cumi (Photololigo
duvaucelii), Kacang hijau (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), dan Kacang koro
pedang (Canavalia ensiformis (L.) DC) untuk Pembuatan Isolat Alergen adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2014
Hendra Wijaya
NIM F261100081
RINGKASAN
HENDRA WIJAYA. Isolasi dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla serrata),
Cumi-cumi (Photololigo duvaucelii), Kacang hijau (Vigna radiata (L.) R.
Wilczek), dan Kacang koro pedang (Canavalia ensiformis (L.) DC) untuk
Pembuatan Isolat Alergen. Dibimbing oleh FRANSISCA RUNGKAT
ZAKARIA, DAHRUL SYAH dan ENDANG PRANGDIMURTI.
Alergi makanan merupakan salah satu reaksi hipersensitivitas yang
memiliki manifestasi klinik yang cukup fatal. Sampai saat ini, metode pencegahan
penyakit alergi pangan yang dianjurkan adalah menghindari pangan sumber
alergen, yaitu protein penyebab alergi. Hal ini menyebabkan alergi merupakan
masalah ganda yaitu reaksi imun yang tidak normal dan berdampak pada kondisi
kekurangan zat gizi protein. Untuk menghindari hal tersebut, diagnosis alergi
pangan sangat penting dilakukan. Diagnosis alergi pangan bertujuan untuk
mengetahui penyebab alergi pangan sehingga hanya menghindari atau membatasi
mengkonsumsi makanan penyebab alergi. Skin prick test (SPT) atau uji tusuk kulit
merupakan metode yang dipercaya dan diyakini dapat digunakan untuk
mengetahui penyebab alergi yang dimediasi oleh antibodi IgE. Bahan utama yang
digunakan untuk SPT adalah ekstrak alergen atau reagen SPT yang
ketersediaannya di rumah sakit atau klinik di Indonesia masih kurang dan masih
impor. Penelitian ini bertujuan untuk membuat reagen SPT dari bahan baku lokal
terdiri dari makanan laut (cumi-cumi dan kepiting) dan kacang-kacangan (kacang
hijau dan kacang koro pedang). Spesifikasi reagen SPT mengacu pada standar
European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063
(EDQM 2010).
Metode ekstraksi protein yang digunakan pada pangan laut adalah dengan
cara memisahkan protein sarkoplasma dan miofibril sedangkan isolasi protein
kacang dilakukan dengan metode isoelektrik. Karakterisasi isolat dilakukan
dengan metode elektroforesis dan uji alergenisitas dilakukan dengan metode
ELISA dan immunoblotting. Pembuatan reagen SPT dilakukan secara aseptis
menggunakan larutan gliserol saline. Setelah memenuhi persyaratan European
Pharmacopoeia Monograph on Allergen Products 7 01/2010:1063 (EDQM
2010), reagen SPT diaplikasikan pada uji SPT menggunakan responden manusia
kemudian dihitung sensitivitas dan spesifisitas diagnosisnya.
Rendemen protein miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi hasil ekstraksi
masing-masing adalah 27,8% dan 19,4% (% protein cumi-cumi). Fraksi protein
miofibril terdiri dari 11 pita protein dengan bobot molekul 18,2 -108,4 kDa dan
fraksi protein sarkoplasma terdiri dari 13 pita protein dengan bobot molekul 9,5119,3 kDa. Protein miofibril yang bersifat alergen adalah bobot molekul 8,9 –
122,7 kDa dan protein sarkoplasma yang bersifat alergen adalah 11,8 -143,9 kDa.
Reagen miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi memenuhi persyaratan European
Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 untuk
parameter kadar air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Uji tusuk kulit pada
responden menunjukkan bahwa nilai sensitivitas reagen miofibril cumi-cumi
adalah 86% dan sarkoplasma cumi-cumi adalah 64% dengan tingkat kesalahan
negatifnya untuk masing-masing reagen miofibril dan sarkoplasma adalah 14%
dan 36%. Hasil diagnosis miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi akan diperoleh
nilai sensitivitas 100%. Pemisahan protein cumi-cumi menjadi mofibril dan
sarkoplasma untuk uji tusuk kulit dapat meningkatkan nilai sensitivitasnya dan
menurunkan kesalahan diagnosis negatif. Nilai spesifisitas masing-masing protein
miofibril dan sarkoplasma adalah 100% dengan tingkat kesalahan terjadinya
diagnosis positif 0 %.
Rendemen protein miofibril dan sarkoplasma kepiting masing-masing
adalah 28,4% dan 18,4% (% protein kepiting). Fraksi protein miofibril terdiri dari
19 pita protein dengan bobot molekul 9.6-111.6 kDa dan fraksi protein
sarkoplasma terdiri dari 19 pita protein dengan bobot molekul 9,5-104,6 kDa.
Protein miofibril yang bersifat alergen adalah bobot molekul 13.9-155.4 kDa dan
protein sarkoplasma yang bersifat alergen adalah 8.4-129.4 kDa. Reagen miofibril
dan sarkoplasma kepiting memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia 7
Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 untuk parameter kadar air, kadar
protein, sterilitas dan mikrobiologi. Hasil SPT pada responden menunjukkan nilai
sensitivitas reagen miofibril kepiting adalah 85% dan sarkoplasma kepiting adalah
69% dengan tingkat kesalahan negatifnya untuk masing-masing reagen miofibril
dan sarkoplasma adalah 15% dan 31%. Sensitivitas diagnosis alergi kepiting
adalah 100%. Pemisahan protein kepiting menjadi mofibril dan sarkoplasma
untuk uji tusuk kulit dapat memperbaiki nilai sensitivitasnya dan menurunkan
kesalahan diagnosis negatif. Nilai spesifisitas masing-masing protein miofibril
dan sarkoplasma adalah 100% dengan tingkat kesalahan terjadinya diagnosis
positif 0 %.
Kandungan protein isolat kacang hijau adalah 87,98% dengan rendemen
82,70% dan recovery 20.5 g/100g. Isolat protein kacang hijau terdiri dari 16 pita
protein dengan berat molekul 11.1-127.4 kDa. Protein alergen kacang hijau
mempunyai bobot molekul 10.9-142.2 kDa kDa setelah dianalisis dengan metode
immunoblotting. Hasil analisis menunjukkan bahwa reagen kacang hijau untuk
SPT memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia untuk parameter kadar air,
kadar protein, sterilitas dan mikrobiology. Hasil Skin Prick test terhadap
responden menunjukkan bahwa sensitivitas reagen kacang hijau dalam diagnosis
alergi adalah 75% dengan tingkat kesalahan negatif 25%. Spesifisitas reagen
kacang koro pedang adalah 100% dengan tingkat kesalahan positif adalah 0%.
Kandungan protein isolat kacang koro pedang adalah 85,90% dengan
rendemen 64,30% dan recovery 21.0 g/100g. Isolat protein kacang koro pedang
terdiri dari 15 pita protein dengan berat molekul 11,6-77,4 kDa. Protein alergen
kacang koro pedang mempunyai bobot molekul 18,2-127,7 kDa setelah dianalisis
dengan metode immunoblotting. Hasil analisis menunjukkan reagen kacang koro
pedang untuk SPT memenuhi European Pharmacopoeia untuk parameter kadar
air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Hasil SPT terhadap responden
menunjukkan bahwa sensitivitas reagen kacang koro pedang dalam diagnosis
alergi adalah 87,5% dengan tingkat kesalahan negatif 12,5%. Spesifisitas reagen
kacang koro pedang adalah 100% dengan tingkat kesalahan positif adalah 0%.
Uji stabilitas reagen SPT miofibril cumi-cumi, sarkoplasma cumi-cumi,
kacang hijau, dan kacang koro pedang stabil pada suhu anjuran penyimpanan 28°C untuk parameter kadar protein dan kemampuan mengikat IgE spesifik.
Kata kunci: Cumi-cumi, kepiting, kacang hijau, kacang koro pedang, protein
alergen, diagnosis alergi, reagen SPT, skin prick test.
SUMMARY
HENDRA WIJAYA. Isolation and Characterization of Proteins from Crab (Scylla
serrata), Squid (Photololigo duvaucelii), Mung Bean (Vigna radiata (L.) R.
Wilczek), and Jack Bean (Canavalia ensiformis (L.) DC) for the Preparation of
Allergen Isolates. Supervised By FRANSISCA RUNGKAT ZAKARIA,
DAHRUL SYAH, and ENDANG PRANGDIMURTI.
Food allergy is one of the hypersensitivity reactions that has potentially fatal
clinical manifestations. Until now, the recommended method for food allergy
prevention is to avoid food that becomes the source of allergens, namely
allergenic proteins. This causes the allergy problem as a dual problem caused by
pathological abnormal immune reaction and impacts on protein malnutrition
condition. To avoid that, diagnosis of food allergy is very important, that can to
determine the cause of food allergies and the consumption of food allergens can
be avoided or limited. Skin prick test (SPT) is a reliable method and believed can
be used to find the cause of allergy mediated by IgE antibodies. The main material
used for the SPT is allergen protein extracts or SPT reagents in which their
availability in hospitals or clinics in Indonesia is still lacking and still imported
from other countries. This study aimed to produce skin prick test reagents from
local raw materials consisted of seafood such as squids and crabs as sumur as
legumes such as mung beans and jack beans. The specification of SPT reagents
referred to the European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products
(2010:1063), including stability for recommended storage temperature.
Protein extraction method used in seafood was to separate the sarcoplasmic
and myofibrillar proteins while the legumes protein isolation was conducted using
isoelectric method. Characterization of isolates was conducted using
electrophoresis and allergenicity test performed by indirect ELISA method and
immunoblotting using sera of allergic subject. Preparation of SPT reagents was
conducted aseptically using glycerol saline solution. The SPT reagents were test
for sensitivity, specificity and stability according to the European Pharmacopoeia
7 requirements. The SPT reagents were applied to the skin prick test using human
respondents in allergy clinic, and then the sensitivity and specificity of the
diagnosis were measured.
The extraction yields of squids myofibrillar and sarcoplasmic proteins were
27.8% and 19.4%, respectively (% squids protein). Myofibrillar protein fractions
were composed of 11 protein bands with molecular weights of 18.2-108.4 kDa
and sarcoplasmic protein fractions were composed of 13 protein bands with
molecular weights of 9.5-119.3 kDa. Allergenic myofibrillar proteins have the
molecular weights of 8.9-122.7 kDa and allergenic sarcoplasmic proteins have the
molecular weights of 11.8-143.9 kDa. Each allergen extract was formulated into a
skin prick test reagent. proteins reagent has met the requirements of the European
Pharmacopoeia for the parameters of moisture content, protein content, sterility
and microbiology. Skin prick test to the respondents indicated that the sensitivity
value of squids myofibrillar reagent was 86% and squids sarcoplasmic reagent
was 64% with the negative error rate for myofibrilar and sarcoplasmic reagents
were 14% and 36%, respectively. The diagnosis results of squids myofibrillar and
sarcoplasmic would generate a sensitivity value at 100%. Separation of squids
proteins and into myofibrils and sarcoplasm for skin prick test could improve the
sensitivity value and decrease the negative misdiagnosis. The specificity of each
myofibrillar and sarcoplasmic proteins was 100% with an error rate of positive
diagnosis occurrence at 0%.
The extraction yields of crabs myofibrillar and sarcoplasmic proteins were
28.4% and 18.4%, respectively (% crabs protein). Myofibrillar protein fraction
was composed of 19 protein bands with the molecular weights of 9.6-111.6 kDa
and sarcoplasmic protein fraction was composed of 19 protein bands with the
molecular weights of 9.5-104.6 kDa. The allergenic myofibrillar protein has the
molecular weights of 13.9-155.4 kDa while the allergenic sarcoplasmic protein
has the molecular weights of 8.4-129.4 kDa. Crab myofibrillar and sarcoplasmic
reagents met the requirements of the European Pharmacopoeia Monograph on
Allergen Products 7 (2010:1063) for the parameters of moisture content, protein
content, sterility and microbiology. A SPT to the respondents indicated that the
sensitivity value of crab myofibrillar reagent was 85% and crab sarcoplasmic
reagent was 69% with a negative error rate for each myofibrillar and sarcoplasmic
reagents was 15% and 31%, respectively. The result diagnosis of crab myofibrillar
and sarcoplasmic sensitivities would generate sensitivity value at 100%. The
separation of crab proteins into myofibrils and sarcoplasm for skin prick test could
improve its sensitivity value and lowered the negative misdiagnosis. The
specificity of each myofibrillar and sarcoplasmic proteins was 100% with an error
rate of positive diagnosis occurrence at 0%.
The mung bean protein isolate content was 87.98% with 82.70% yield and
20.5 g/100g recovery. Mung bean protein isolate composed of 16 protein bands
with molecular weights of 11.1-127.4 kDa. Allergenic proteins of mung bean have
molecular weights of 10.9-142.2 kDa kDa after being analyzed with
immunoblotting method. The analysis result showed that the mung bean reagent
for SPT met the European Pharmacopoeia for the parameters of moisture content,
protein content, sterility and microbiology. Skin prick test to the respondents
indicated that the sensitivity of mung bean reagent in the diagnosis of allergies
was 75% with a negative error rate at 25%. Specificity of mung bean reagent was
100% with positive error rate at 0%.
The jack bean protein isolate content was 85.90% with 64.30% yield and
21.0 g/100g recovery. Jack bean protein isolate consisted of 15 protein bands with
molecular weights of 11.6-77.4 kDa. Allergenic proteins of jack bean have
molecular weights of 18.2-127.7 kDa after being analyzed with immunoblotting
method. The analysis result showed that the jack bean reagent for SPT met the
European Pharmacopoeia for the parameters of moisture content, protein content,
sterility and microbiology. Skin prick test to the respondents indicated that the
sensitivity of jack bean reagent in the diagnosis of allergies was 87,5% with a
negative error rate at 12,5%. Specificity of jack bean reagent was 100% with
positive error rate at 0%. SPT reagent stability test of squids myofibrillar and
sarcoplasmic, mung beans, and jack bean stable at the recommended storage
temperature of 2-8 ° C for the parameters of the protein content and specific IgE
binding ability.
Keywords: Squids, crabs, mung beans, jack beans, allergenic protein, allergy
diagnosis, SPT reagent, skin prick test.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN KEPITING
(Scylla serrata), CUMI-CUMI (Photololigo duvaucelii), KACANG
HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), DAN KACANG KORO
PEDANG (Canavalia ensiformis (L.) DC) UNTUK PEMBUATAN
ISOLAT ALERGEN
HENDRA WIJAYA
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
2
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc.
Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan, FATETA, IPB
Prof. Bambang Pontjo Priosoeryanto, DVM, MS,
PhD, APVet, DACCM.
Staf Pengajar Fakultas Kedokteran Hewan, IPB
Penguji pada Ujian Terbuka: Dr. Puspo Edi Giriwono, S.TP.
Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan, FATETA, IPB
April Hari Wardhana, SKH, M.Si, Ph.D
Peneliti Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor
3
Judul Disertasi: Isolasi dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla serrata), CumiCumi (Photololigo duvaucelii), Kacang Hijau (Vigna radiata (L.)
R. Wilczek), dan Kacang Koro Pedang (Canavalia ensiformis (L.)
DC) untuk Pembuatan Isolat Alergen
Nama
: Hendra Wijaya
NIM
: F261100081
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Fransisca R. Zakaria, M.Sc
Ketua
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si
Anggota
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Ratih Dewanti Hariyadi, M.Sc
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian:
20 November 2014
Tanggal Lulus:
4
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 ini ialah
alergen pangan, dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla
serrata), Cumi-Cumi (Photololigo duvaucelii), Kacang Hijau (Vigna radiata (L.)
R. Wilczek), dan Kacang Koro Pedang (Canavalia ensiformis (L.) DC) untuk
Pembuatan Isolat Alergen
Terima kasih yang tulus penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Fransisca
R. Zakaria, M.Sc selaku ketua komisi pembimbing yang telah banyak
memberikan bimbingan, dukungan, saran dan bantuan. Penulis juga mengucapkan
terima kasih yang tulus kepada Bapak Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr dan Ibu Dr.
Ir. Endang Prangdimurti, M.Si selaku anggota komisi pembimbing yang telah
banyak memberikan bimbingan dan saran terhadap penelitian ini. Terima kasih
disampaikan kepada Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc., dan Bapak Prof.
Bambang Pontjo Priosoeryanto, DVM, MS, PhD, APVet, DACCM sebagai
penguji luar komisi pada ujian tertutup dan kepada Bapak Dr. Puspo Edi
Giriwono, S.TP. dan Bapak April Hari Wardhana, SKH, M.Si, Ph.D sebagai
penguji luar komisi pada ujian terbuka yang telah memberikan masukan mendasar
pada keseluruhan isi disertasi ini. Terima kasih kepada Bapak Kepala Badan
Pengkajian Kebijakan, Iklim dan Mutu Industri (BPKIMI), Kementerian
Perindustrian atas Beasiswa yang telah diberikan. Terima kasih kepada Bapak Ir.
Yang Yang Setiawan, M.Sc sebagai Kepala Balai Besar Industri Agro dan saat ini
menjabat sebagai Sekretaris BPKIMI yang telah memberikan izin sekolah dan
dukungan penelitian. Terima kasih kepada Ibu Ir. Rochmi Widjajanti, M.Eng
sebagai kepala Balai Besar Industri Agro yang telah memberikan dukungan.
Terima kasih kepada Fakultas Farmasi Universitas Indonesia atas kerjasama uji
alergenisitas reagen SPT. Terima kasih kepada Bapak Dr. Mustopo Widjaja
sebagai Direktur Klinik Asma dan Alergi DR. Indrajana dan Dr. Iwan Santoso
sebagai Koordinator Dokter Klinik Asma dan Alergi DR. Indrajana, Jakarta yang
telah memberikan izin dan membantu melakukan uji skin prick test. Terima kasih
kepada Bapak dr. Boenjamin Setiawan, PhD sebagai Komisaris Utama PT Kalbe
Farma Tbk yang telah memberikan dukungan dalam penelitian ini. Terima kasih
kepada Mahasiswa Universitas Esa Unggul, Jakarta atas partisipasinya sebagai
peserta skin prick test. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr.
Toshiaki Nishigaki, temen-temen BBIA, dan temen-temen IPN angkatan 2010.
Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak April Hari
Wardhana, SKH, MSi, Ph.D, Bapak Drh. Didik Tulus Subekti, M.Kes dan seluruh
staf Laboratorium Parasitologi Balai Besar Penelitian Veteriner yang telah
memberikan izin untuk bekerja dan menggunakan fasilitas laboratorium.
Ungkapan terima kasih yang mendalam dan tak terhingga juga disampaikan
kepada orang tua, keluarga mertua, istri tercinta, anak-anakku tersayang, Faiza
Fatiya Ammar, Azifa Ghaida Ammar, Azmina Daniya Ammar serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2014
Hendra Wijaya
5
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
v
vii
viii
1.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
2.
TINJAUAN PUSTAKA
Alergi
Diagnosis Alergi
Ekstrak Alergen Pangan
Kepiting
Cumi-cumi
Kacang Hijau
Kacang Koro Pedang
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
3.
METODE
Alat
Bahan
Isolasi Protein
Analisis Protein dengan Metode Kjeldahl
Analisis protein dengan Metode Bradford
Analisis Kadar Lemak
Elektroforesis SDS-PAGE
Preparasi Serum Penderita Alergi
Analisis IgE total
Analisis IgE spesifik
Immunoblotting
Persiapan Isolat untuk SPT
Uji Sterilitas
Analisis Angka Lempeng Total
Analisis Kapang dan Khamir
Analisis Pseudomonas Aeruginosa
Analisis Staphylococcus Aureus
Uji Tusuk Kulit
Uji Stabilitas
Error! Bookmark not defined.
24
25
25
27
27
28
29
30
31
31
32
32
32
33
35
36
37
38
39
4.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Bahan Baku
Isolasi Protein
Elektroforesis
40
40
44
48
6
Antibodi IgE Total
Antibodi IgE Spesifik
Immunoblotting
Formulasi dan Syarat Mutu Reagen SPT
Hasil SPT
Uji Stabilitas Produk Alergen
5.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
57
60
70
82
86
92
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
97
104
123
7
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Karakteristik alergen pangan hewani
Error! Bookmark not defined.
Karakteristik alergen pangan nabati
Error! Bookmark not defined.
Karakteristik dan struktur tiga dimensi beberapa alergenError! Bookmark not defined.
Komposisi kimia daging kepiting
Error! Bookmark not defined.
Komposisi asam amino protein daging kepitingError! Bookmark not defined.
Komposisi kimia daging cumi-cumi
Error! Bookmark not defined.
Komposisi asam amino protein daging cumi-cumiError! Bookmark not defined.
Komposisi asam amino protein kacang hijau Error! Bookmark not defined.
Hasil analisis komposisi bahan baku kepiting dan cumi-cumiError! Bookmark not defined.
Hasil analisis komposisi bahan baku kacang hijau dan kacang koro
pedang
Error! Bookmark not defined.
Recovery dan rendemen ekstrak protein cumi-cumi dan kepitingError! Bookmark not defined.
Recovery dan rendemen isolat protein kacang hijau dan kacang koro
pedang
Error! Bookmark not defined.
Riwayat alergi pasien berdasarkan hasil wawancaraError! Bookmark not defined.
Hasil diagnosis alergi cumi-cumi responden 1-25Error! Bookmark not defined.
Status alergi responden 1-25 terhadap kepitingError! Bookmark not defined.
Rangkuman status alergi 25 responden
Error! Bookmark not defined.
Persentase status alergi responden terhadap isolat proteinError! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein miofibril cumi-cumi terhadap serum
responden 1, 12, 15, dan 20
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein sarkoplasma cumi-cumi terhadap serum
responden 4, 5, 12 dan 23
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein miofibril kepiting terhadap
serum
responden 12, 14, 16, dan 24
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein sarkoplasma kepiting terhadap serum
responden 12, 13, 14, dan 16
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting isolat protein kacang hijau terhadap serum
responden 2, 12, 16, dan 23
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting isolat protein kacang koro pedang terhadap serum
responden 13 dan 23
Error! Bookmark not defined.
Hasil analisis kadar air reagen SPT dan persyaratan oleh European
Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063Error! Bookmark not define
Hasil analisis sterilitas isolat alergen
Error! Bookmark not defined.
Hasil analisis mikrobiologi masing-masing isolat alergen sesuai
persyaratan European Pharmacopoeia 7 (01/2011:50104 )Error! Bookmark not defined.
Konsentrasi protein masing-masing isolat alergenError! Bookmark not defined.
Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
cumi-cumi pada responden alergi cumi-cumi Error! Bookmark not defined.
Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
cumi-cumi pada responden tidak alergi cumi-cumi.Error! Bookmark not defined.
Sensitivitas dan spesifisitas reagen cumi-cumi untuk skin prick testError! Bookmark not define
Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
kepiting pada responden alergi kepiting
Error! Bookmark not defined.
8
32 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
kepiting pada responden tidak alergi kepiting Error! Bookmark not defined.
33 Sensitivitas dan spesifisitas reagen kepiting untuk skin prick testError! Bookmark not defined.
34 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang hijau pada
responden alergi kacang hijau
Error! Bookmark not defined.
35 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang hijau pada
responden tidak alergi kacang hijau
Error! Bookmark not defined.
36 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang koro pedang pada
responden alergi kacang koro pedang
Error! Bookmark not defined.
37 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang koro pedang pada
responden tidak alergi kacang koro pedang Error! Bookmark not defined.
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Mekanisme reaksi alergi tipe I (Singh dan Bhalla 2008)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme reaksi alergi tipe II (Pawankar et al. 2009)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme reaksi alergi tipe III (Pawankar et al. 2009)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme reaksi alergi tipe IV (Pawankar et al. 2009)Error! Bookmark not defined.
Gambaran umum pendekatan diagnosis alergi (Holgat et al. 2006)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme kerja uji tusuk kulit (Holgat et al. 2006)Error! Bookmark not defined.
Peralatan kerja uji tusuk kulit (Holgate et al. 2006)Error! Bookmark not defined.
Epitop dan paratop pada suatu antigen
Error! Bookmark not defined.
Antigen yang mempunyai empat epitop berbedaError! Bookmark not defined.
Struktur
morfologi
kepiting
bakau
(http://deviansouisa.blogspot.com/2011/10/kepiting-bakau.html)Error! Bookmark not defined.
Struktur
morfologi
cumi-cumi
(http://alifranmcrmy.blogspot.com/2011/10/morfologi-anatomi-cumi-cumi-loligosp.html)
Error! Bookmark not defined.
Kacang
hijau
(http://www.diytrade.com/china/pd/5620300/green_mung_bean.html)Error! Bookmark not defined.
Kacang
koro
pedang
(http://chipling88.files.wordpress.com/2010/08/koro.jpg)Error! Bookmark not defined.
Diagam alir penelitian
Error! Bookmark not defined.
Bahan baku untuk pembuatan isolat alergen (A) kepiting (Scylla serrata)
dan (B) cumi-cumi (Photololigo duvaucelii) Error! Bookmark not defined.
Bahan baku untuk pembuatan isolat alergen (A) kacang hijau (Vigna
radiata (L.) R. Wilczek) dan kacang koro pedang (Canavalia ensiformis
(L.) DC).
Error! Bookmark not defined.
Hasil SDS-PAGE protein marker (M), protein miofibril cumi-cumi (A,
1= 5 µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) dan protein sarkoplasma cumi-cumi (B,
1= 5 µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) (sebelum dianalisis dengan software
GelAnalyzer 2010a)
Error! Bookmark not defined.
Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein miofibril cumi-cumi
(A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein sarkoplasma cumicumi (A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
9
20 Hasil SDS-PAGE protein marker (M), protein miofibril kepiting (A, 1=
5 µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) dan protein sarkoplasma kepiting (B, 1= 5
µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) (sebelum dianalisis dengan Software
GelAnalyzer 2010a)
Error! Bookmark not defined.
21 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein miofibril kepiting (B)
setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
22 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein sarkoplasma
kepiting (A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defin
23 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan isolat protein kacang hijau (1)
3 ug/sumur, (2) 10 ug/sumur, dan (3) 30 ug/sumur sebelum dianalisis
dengan software GelAnalyzer 2010a.
Error! Bookmark not defined.
24 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan isolat protein kacang hijau
(A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
25 Hasil SDS-PAGE protein marker (M)dan isolat protein kacang koro
pedang (1) 3 ug/sumur, (2) 10 ug/sumur, dan (3) 30 ug/sumur (sebelum
dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010a).Error! Bookmark not defined.
26 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan isolat protein kacang koro
pedang (A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not define
27 Analisis IgE total pada 25 serum penderita alergi dengan metode ELISAError! Bookmark not d
28 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein miofibril cumi-cumi pada
25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
29 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein sarkoplasma cumi-cumi
pada 25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
30 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein miofibril kepiting pada
25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
31 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein sarkoplasma kepiting
pada 25 responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
32 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap isolat protein kacang hijau pada
25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
33 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap isolat protein kacang koro
pedang pada 25 serum responden penderita alergiError! Bookmark not defined.
34 Hasil immunoblotting protein marker dan protein miofibril cumi-cumi
terhadap serum responden 1, 12, 15 dan 20 sebelum dianalisis dengan
software GelAnalyzer 2010.
Error! Bookmark not defined.
35 Hasil immunoblotting protein miofibril cumi-cumi terhadap serum
responden 1, 12, 15 dan 20 setelah dianalisis dengan software
GelAnalayzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
36 Hasil immunoblotting protein sarkoplasma cumi-cumi terhadap serum
responden 4, 5, 12 and 23 sebelum dianalisis dengen software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
37 Hasil immunoblotting protein sarkoplasma cumi-cumi terhadap serum
responden 4, 5, 12 and 23 setelah dianalisis dengen software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
38 Hasil immunoblotting protein marker dan miofibril kepiting terhadap
serum responden 12, 14, 16 and 24 sebelum dianalisis dengan software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
10
39 Hasil immunoblotting protein miofibril kepiting terhadap serum
responden 12, 14, 16 and 24 setelah dianalisis dengen software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
40 Hasil immunoblotting marker dan protein sarkoplasma kepiting
terhadap serum responden 12, 13, 14 dan 16. Error! Bookmark not defined.
41 Hasil immunoblotting protein sarkoplasma kepiting terhadap responden
12, 13, 14 dan 16 setelah dianalisis dengan Gel Analyzer2010Error! Bookmark not defined.
42 Hasil immunoblotting marker dan isolat protein kacang hijau terhadap
serum responden 2, 12, 16, dan 23
Error! Bookmark not defined.
43 Hasil Immunoblotting isolat protein kacang hijau terhadap serum
responden 2, 12, 16 dan 23
Error! Bookmark not defined.
44 Hasil immunoblotting protein marker dan protein kacang koro pedang
terhadap serum responden 13 dan 23 sebelum dianalisis dengan software
GelAnalyzer 2010.
Error! Bookmark not defined.
45 Hasil immunoblotting protein kacang koro pedang terhadap serum
responden 13 dan 23 setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer
2010
Error! Bookmark not defined.
46 Reagen Skin Prick Test steril untuk diagnosis alergiError! Bookmark not defined.
47 Hasil skin prick test miofibril dan sarkoplasma kepiting pada responden
alergi kepiting
Error! Bookmark not defined.
48 Nilai recovery konsentrasi protein alergen (A) miofibril cumi-cumi, (B)
sarkoplasma cumi-cumi, (C) kacang hijau dan (D) kacang koro pedang
disimpan pada suhu 2-8 °C selama 6 bulan (hijau: recovery > 70%,
kuning: recovery 50-70% dan merah: recovery 70%,
kuning: recovery 50-70% dan merah: recovery
(Scylla serrata), CUMI-CUMI (Photololigo duvaucelii), KACANG
HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), DAN KACANG KORO
PEDANG (Canavalia ensiformis (L.) DC) UNTUK PEMBUATAN
ISOLAT ALERGEN
HENDRA WIJAYA
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Isolasi dan
Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla serrata), Cumi-cumi (Photololigo
duvaucelii), Kacang hijau (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), dan Kacang koro
pedang (Canavalia ensiformis (L.) DC) untuk Pembuatan Isolat Alergen adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2014
Hendra Wijaya
NIM F261100081
RINGKASAN
HENDRA WIJAYA. Isolasi dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla serrata),
Cumi-cumi (Photololigo duvaucelii), Kacang hijau (Vigna radiata (L.) R.
Wilczek), dan Kacang koro pedang (Canavalia ensiformis (L.) DC) untuk
Pembuatan Isolat Alergen. Dibimbing oleh FRANSISCA RUNGKAT
ZAKARIA, DAHRUL SYAH dan ENDANG PRANGDIMURTI.
Alergi makanan merupakan salah satu reaksi hipersensitivitas yang
memiliki manifestasi klinik yang cukup fatal. Sampai saat ini, metode pencegahan
penyakit alergi pangan yang dianjurkan adalah menghindari pangan sumber
alergen, yaitu protein penyebab alergi. Hal ini menyebabkan alergi merupakan
masalah ganda yaitu reaksi imun yang tidak normal dan berdampak pada kondisi
kekurangan zat gizi protein. Untuk menghindari hal tersebut, diagnosis alergi
pangan sangat penting dilakukan. Diagnosis alergi pangan bertujuan untuk
mengetahui penyebab alergi pangan sehingga hanya menghindari atau membatasi
mengkonsumsi makanan penyebab alergi. Skin prick test (SPT) atau uji tusuk kulit
merupakan metode yang dipercaya dan diyakini dapat digunakan untuk
mengetahui penyebab alergi yang dimediasi oleh antibodi IgE. Bahan utama yang
digunakan untuk SPT adalah ekstrak alergen atau reagen SPT yang
ketersediaannya di rumah sakit atau klinik di Indonesia masih kurang dan masih
impor. Penelitian ini bertujuan untuk membuat reagen SPT dari bahan baku lokal
terdiri dari makanan laut (cumi-cumi dan kepiting) dan kacang-kacangan (kacang
hijau dan kacang koro pedang). Spesifikasi reagen SPT mengacu pada standar
European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063
(EDQM 2010).
Metode ekstraksi protein yang digunakan pada pangan laut adalah dengan
cara memisahkan protein sarkoplasma dan miofibril sedangkan isolasi protein
kacang dilakukan dengan metode isoelektrik. Karakterisasi isolat dilakukan
dengan metode elektroforesis dan uji alergenisitas dilakukan dengan metode
ELISA dan immunoblotting. Pembuatan reagen SPT dilakukan secara aseptis
menggunakan larutan gliserol saline. Setelah memenuhi persyaratan European
Pharmacopoeia Monograph on Allergen Products 7 01/2010:1063 (EDQM
2010), reagen SPT diaplikasikan pada uji SPT menggunakan responden manusia
kemudian dihitung sensitivitas dan spesifisitas diagnosisnya.
Rendemen protein miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi hasil ekstraksi
masing-masing adalah 27,8% dan 19,4% (% protein cumi-cumi). Fraksi protein
miofibril terdiri dari 11 pita protein dengan bobot molekul 18,2 -108,4 kDa dan
fraksi protein sarkoplasma terdiri dari 13 pita protein dengan bobot molekul 9,5119,3 kDa. Protein miofibril yang bersifat alergen adalah bobot molekul 8,9 –
122,7 kDa dan protein sarkoplasma yang bersifat alergen adalah 11,8 -143,9 kDa.
Reagen miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi memenuhi persyaratan European
Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 untuk
parameter kadar air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Uji tusuk kulit pada
responden menunjukkan bahwa nilai sensitivitas reagen miofibril cumi-cumi
adalah 86% dan sarkoplasma cumi-cumi adalah 64% dengan tingkat kesalahan
negatifnya untuk masing-masing reagen miofibril dan sarkoplasma adalah 14%
dan 36%. Hasil diagnosis miofibril dan sarkoplasma cumi-cumi akan diperoleh
nilai sensitivitas 100%. Pemisahan protein cumi-cumi menjadi mofibril dan
sarkoplasma untuk uji tusuk kulit dapat meningkatkan nilai sensitivitasnya dan
menurunkan kesalahan diagnosis negatif. Nilai spesifisitas masing-masing protein
miofibril dan sarkoplasma adalah 100% dengan tingkat kesalahan terjadinya
diagnosis positif 0 %.
Rendemen protein miofibril dan sarkoplasma kepiting masing-masing
adalah 28,4% dan 18,4% (% protein kepiting). Fraksi protein miofibril terdiri dari
19 pita protein dengan bobot molekul 9.6-111.6 kDa dan fraksi protein
sarkoplasma terdiri dari 19 pita protein dengan bobot molekul 9,5-104,6 kDa.
Protein miofibril yang bersifat alergen adalah bobot molekul 13.9-155.4 kDa dan
protein sarkoplasma yang bersifat alergen adalah 8.4-129.4 kDa. Reagen miofibril
dan sarkoplasma kepiting memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia 7
Monograph on Allergen Products 01/2010:1063 untuk parameter kadar air, kadar
protein, sterilitas dan mikrobiologi. Hasil SPT pada responden menunjukkan nilai
sensitivitas reagen miofibril kepiting adalah 85% dan sarkoplasma kepiting adalah
69% dengan tingkat kesalahan negatifnya untuk masing-masing reagen miofibril
dan sarkoplasma adalah 15% dan 31%. Sensitivitas diagnosis alergi kepiting
adalah 100%. Pemisahan protein kepiting menjadi mofibril dan sarkoplasma
untuk uji tusuk kulit dapat memperbaiki nilai sensitivitasnya dan menurunkan
kesalahan diagnosis negatif. Nilai spesifisitas masing-masing protein miofibril
dan sarkoplasma adalah 100% dengan tingkat kesalahan terjadinya diagnosis
positif 0 %.
Kandungan protein isolat kacang hijau adalah 87,98% dengan rendemen
82,70% dan recovery 20.5 g/100g. Isolat protein kacang hijau terdiri dari 16 pita
protein dengan berat molekul 11.1-127.4 kDa. Protein alergen kacang hijau
mempunyai bobot molekul 10.9-142.2 kDa kDa setelah dianalisis dengan metode
immunoblotting. Hasil analisis menunjukkan bahwa reagen kacang hijau untuk
SPT memenuhi persyaratan European Pharmacopoeia untuk parameter kadar air,
kadar protein, sterilitas dan mikrobiology. Hasil Skin Prick test terhadap
responden menunjukkan bahwa sensitivitas reagen kacang hijau dalam diagnosis
alergi adalah 75% dengan tingkat kesalahan negatif 25%. Spesifisitas reagen
kacang koro pedang adalah 100% dengan tingkat kesalahan positif adalah 0%.
Kandungan protein isolat kacang koro pedang adalah 85,90% dengan
rendemen 64,30% dan recovery 21.0 g/100g. Isolat protein kacang koro pedang
terdiri dari 15 pita protein dengan berat molekul 11,6-77,4 kDa. Protein alergen
kacang koro pedang mempunyai bobot molekul 18,2-127,7 kDa setelah dianalisis
dengan metode immunoblotting. Hasil analisis menunjukkan reagen kacang koro
pedang untuk SPT memenuhi European Pharmacopoeia untuk parameter kadar
air, kadar protein, sterilitas dan mikrobiologi. Hasil SPT terhadap responden
menunjukkan bahwa sensitivitas reagen kacang koro pedang dalam diagnosis
alergi adalah 87,5% dengan tingkat kesalahan negatif 12,5%. Spesifisitas reagen
kacang koro pedang adalah 100% dengan tingkat kesalahan positif adalah 0%.
Uji stabilitas reagen SPT miofibril cumi-cumi, sarkoplasma cumi-cumi,
kacang hijau, dan kacang koro pedang stabil pada suhu anjuran penyimpanan 28°C untuk parameter kadar protein dan kemampuan mengikat IgE spesifik.
Kata kunci: Cumi-cumi, kepiting, kacang hijau, kacang koro pedang, protein
alergen, diagnosis alergi, reagen SPT, skin prick test.
SUMMARY
HENDRA WIJAYA. Isolation and Characterization of Proteins from Crab (Scylla
serrata), Squid (Photololigo duvaucelii), Mung Bean (Vigna radiata (L.) R.
Wilczek), and Jack Bean (Canavalia ensiformis (L.) DC) for the Preparation of
Allergen Isolates. Supervised By FRANSISCA RUNGKAT ZAKARIA,
DAHRUL SYAH, and ENDANG PRANGDIMURTI.
Food allergy is one of the hypersensitivity reactions that has potentially fatal
clinical manifestations. Until now, the recommended method for food allergy
prevention is to avoid food that becomes the source of allergens, namely
allergenic proteins. This causes the allergy problem as a dual problem caused by
pathological abnormal immune reaction and impacts on protein malnutrition
condition. To avoid that, diagnosis of food allergy is very important, that can to
determine the cause of food allergies and the consumption of food allergens can
be avoided or limited. Skin prick test (SPT) is a reliable method and believed can
be used to find the cause of allergy mediated by IgE antibodies. The main material
used for the SPT is allergen protein extracts or SPT reagents in which their
availability in hospitals or clinics in Indonesia is still lacking and still imported
from other countries. This study aimed to produce skin prick test reagents from
local raw materials consisted of seafood such as squids and crabs as sumur as
legumes such as mung beans and jack beans. The specification of SPT reagents
referred to the European Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products
(2010:1063), including stability for recommended storage temperature.
Protein extraction method used in seafood was to separate the sarcoplasmic
and myofibrillar proteins while the legumes protein isolation was conducted using
isoelectric method. Characterization of isolates was conducted using
electrophoresis and allergenicity test performed by indirect ELISA method and
immunoblotting using sera of allergic subject. Preparation of SPT reagents was
conducted aseptically using glycerol saline solution. The SPT reagents were test
for sensitivity, specificity and stability according to the European Pharmacopoeia
7 requirements. The SPT reagents were applied to the skin prick test using human
respondents in allergy clinic, and then the sensitivity and specificity of the
diagnosis were measured.
The extraction yields of squids myofibrillar and sarcoplasmic proteins were
27.8% and 19.4%, respectively (% squids protein). Myofibrillar protein fractions
were composed of 11 protein bands with molecular weights of 18.2-108.4 kDa
and sarcoplasmic protein fractions were composed of 13 protein bands with
molecular weights of 9.5-119.3 kDa. Allergenic myofibrillar proteins have the
molecular weights of 8.9-122.7 kDa and allergenic sarcoplasmic proteins have the
molecular weights of 11.8-143.9 kDa. Each allergen extract was formulated into a
skin prick test reagent. proteins reagent has met the requirements of the European
Pharmacopoeia for the parameters of moisture content, protein content, sterility
and microbiology. Skin prick test to the respondents indicated that the sensitivity
value of squids myofibrillar reagent was 86% and squids sarcoplasmic reagent
was 64% with the negative error rate for myofibrilar and sarcoplasmic reagents
were 14% and 36%, respectively. The diagnosis results of squids myofibrillar and
sarcoplasmic would generate a sensitivity value at 100%. Separation of squids
proteins and into myofibrils and sarcoplasm for skin prick test could improve the
sensitivity value and decrease the negative misdiagnosis. The specificity of each
myofibrillar and sarcoplasmic proteins was 100% with an error rate of positive
diagnosis occurrence at 0%.
The extraction yields of crabs myofibrillar and sarcoplasmic proteins were
28.4% and 18.4%, respectively (% crabs protein). Myofibrillar protein fraction
was composed of 19 protein bands with the molecular weights of 9.6-111.6 kDa
and sarcoplasmic protein fraction was composed of 19 protein bands with the
molecular weights of 9.5-104.6 kDa. The allergenic myofibrillar protein has the
molecular weights of 13.9-155.4 kDa while the allergenic sarcoplasmic protein
has the molecular weights of 8.4-129.4 kDa. Crab myofibrillar and sarcoplasmic
reagents met the requirements of the European Pharmacopoeia Monograph on
Allergen Products 7 (2010:1063) for the parameters of moisture content, protein
content, sterility and microbiology. A SPT to the respondents indicated that the
sensitivity value of crab myofibrillar reagent was 85% and crab sarcoplasmic
reagent was 69% with a negative error rate for each myofibrillar and sarcoplasmic
reagents was 15% and 31%, respectively. The result diagnosis of crab myofibrillar
and sarcoplasmic sensitivities would generate sensitivity value at 100%. The
separation of crab proteins into myofibrils and sarcoplasm for skin prick test could
improve its sensitivity value and lowered the negative misdiagnosis. The
specificity of each myofibrillar and sarcoplasmic proteins was 100% with an error
rate of positive diagnosis occurrence at 0%.
The mung bean protein isolate content was 87.98% with 82.70% yield and
20.5 g/100g recovery. Mung bean protein isolate composed of 16 protein bands
with molecular weights of 11.1-127.4 kDa. Allergenic proteins of mung bean have
molecular weights of 10.9-142.2 kDa kDa after being analyzed with
immunoblotting method. The analysis result showed that the mung bean reagent
for SPT met the European Pharmacopoeia for the parameters of moisture content,
protein content, sterility and microbiology. Skin prick test to the respondents
indicated that the sensitivity of mung bean reagent in the diagnosis of allergies
was 75% with a negative error rate at 25%. Specificity of mung bean reagent was
100% with positive error rate at 0%.
The jack bean protein isolate content was 85.90% with 64.30% yield and
21.0 g/100g recovery. Jack bean protein isolate consisted of 15 protein bands with
molecular weights of 11.6-77.4 kDa. Allergenic proteins of jack bean have
molecular weights of 18.2-127.7 kDa after being analyzed with immunoblotting
method. The analysis result showed that the jack bean reagent for SPT met the
European Pharmacopoeia for the parameters of moisture content, protein content,
sterility and microbiology. Skin prick test to the respondents indicated that the
sensitivity of jack bean reagent in the diagnosis of allergies was 87,5% with a
negative error rate at 12,5%. Specificity of jack bean reagent was 100% with
positive error rate at 0%. SPT reagent stability test of squids myofibrillar and
sarcoplasmic, mung beans, and jack bean stable at the recommended storage
temperature of 2-8 ° C for the parameters of the protein content and specific IgE
binding ability.
Keywords: Squids, crabs, mung beans, jack beans, allergenic protein, allergy
diagnosis, SPT reagent, skin prick test.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN KARAKTERISASI PROTEIN KEPITING
(Scylla serrata), CUMI-CUMI (Photololigo duvaucelii), KACANG
HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), DAN KACANG KORO
PEDANG (Canavalia ensiformis (L.) DC) UNTUK PEMBUATAN
ISOLAT ALERGEN
HENDRA WIJAYA
Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor
pada
Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
2
Penguji pada Ujian Tertutup: Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc.
Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan, FATETA, IPB
Prof. Bambang Pontjo Priosoeryanto, DVM, MS,
PhD, APVet, DACCM.
Staf Pengajar Fakultas Kedokteran Hewan, IPB
Penguji pada Ujian Terbuka: Dr. Puspo Edi Giriwono, S.TP.
Staf Pengajar Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan, FATETA, IPB
April Hari Wardhana, SKH, M.Si, Ph.D
Peneliti Balai Besar Penelitian Veteriner, Bogor
3
Judul Disertasi: Isolasi dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla serrata), CumiCumi (Photololigo duvaucelii), Kacang Hijau (Vigna radiata (L.)
R. Wilczek), dan Kacang Koro Pedang (Canavalia ensiformis (L.)
DC) untuk Pembuatan Isolat Alergen
Nama
: Hendra Wijaya
NIM
: F261100081
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Fransisca R. Zakaria, M.Sc
Ketua
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Dr. Ir. Endang Prangdimurti, M.Si
Anggota
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Ratih Dewanti Hariyadi, M.Sc
Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian:
20 November 2014
Tanggal Lulus:
4
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 ini ialah
alergen pangan, dengan judul Isolasi dan Karakterisasi Protein Kepiting (Scylla
serrata), Cumi-Cumi (Photololigo duvaucelii), Kacang Hijau (Vigna radiata (L.)
R. Wilczek), dan Kacang Koro Pedang (Canavalia ensiformis (L.) DC) untuk
Pembuatan Isolat Alergen
Terima kasih yang tulus penulis ucapkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Fransisca
R. Zakaria, M.Sc selaku ketua komisi pembimbing yang telah banyak
memberikan bimbingan, dukungan, saran dan bantuan. Penulis juga mengucapkan
terima kasih yang tulus kepada Bapak Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr dan Ibu Dr.
Ir. Endang Prangdimurti, M.Si selaku anggota komisi pembimbing yang telah
banyak memberikan bimbingan dan saran terhadap penelitian ini. Terima kasih
disampaikan kepada Bapak Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc., dan Bapak Prof.
Bambang Pontjo Priosoeryanto, DVM, MS, PhD, APVet, DACCM sebagai
penguji luar komisi pada ujian tertutup dan kepada Bapak Dr. Puspo Edi
Giriwono, S.TP. dan Bapak April Hari Wardhana, SKH, M.Si, Ph.D sebagai
penguji luar komisi pada ujian terbuka yang telah memberikan masukan mendasar
pada keseluruhan isi disertasi ini. Terima kasih kepada Bapak Kepala Badan
Pengkajian Kebijakan, Iklim dan Mutu Industri (BPKIMI), Kementerian
Perindustrian atas Beasiswa yang telah diberikan. Terima kasih kepada Bapak Ir.
Yang Yang Setiawan, M.Sc sebagai Kepala Balai Besar Industri Agro dan saat ini
menjabat sebagai Sekretaris BPKIMI yang telah memberikan izin sekolah dan
dukungan penelitian. Terima kasih kepada Ibu Ir. Rochmi Widjajanti, M.Eng
sebagai kepala Balai Besar Industri Agro yang telah memberikan dukungan.
Terima kasih kepada Fakultas Farmasi Universitas Indonesia atas kerjasama uji
alergenisitas reagen SPT. Terima kasih kepada Bapak Dr. Mustopo Widjaja
sebagai Direktur Klinik Asma dan Alergi DR. Indrajana dan Dr. Iwan Santoso
sebagai Koordinator Dokter Klinik Asma dan Alergi DR. Indrajana, Jakarta yang
telah memberikan izin dan membantu melakukan uji skin prick test. Terima kasih
kepada Bapak dr. Boenjamin Setiawan, PhD sebagai Komisaris Utama PT Kalbe
Farma Tbk yang telah memberikan dukungan dalam penelitian ini. Terima kasih
kepada Mahasiswa Universitas Esa Unggul, Jakarta atas partisipasinya sebagai
peserta skin prick test. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr.
Toshiaki Nishigaki, temen-temen BBIA, dan temen-temen IPN angkatan 2010.
Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak April Hari
Wardhana, SKH, MSi, Ph.D, Bapak Drh. Didik Tulus Subekti, M.Kes dan seluruh
staf Laboratorium Parasitologi Balai Besar Penelitian Veteriner yang telah
memberikan izin untuk bekerja dan menggunakan fasilitas laboratorium.
Ungkapan terima kasih yang mendalam dan tak terhingga juga disampaikan
kepada orang tua, keluarga mertua, istri tercinta, anak-anakku tersayang, Faiza
Fatiya Ammar, Azifa Ghaida Ammar, Azmina Daniya Ammar serta seluruh
keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Desember 2014
Hendra Wijaya
5
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
v
vii
viii
1.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
2.
TINJAUAN PUSTAKA
Alergi
Diagnosis Alergi
Ekstrak Alergen Pangan
Kepiting
Cumi-cumi
Kacang Hijau
Kacang Koro Pedang
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
3.
METODE
Alat
Bahan
Isolasi Protein
Analisis Protein dengan Metode Kjeldahl
Analisis protein dengan Metode Bradford
Analisis Kadar Lemak
Elektroforesis SDS-PAGE
Preparasi Serum Penderita Alergi
Analisis IgE total
Analisis IgE spesifik
Immunoblotting
Persiapan Isolat untuk SPT
Uji Sterilitas
Analisis Angka Lempeng Total
Analisis Kapang dan Khamir
Analisis Pseudomonas Aeruginosa
Analisis Staphylococcus Aureus
Uji Tusuk Kulit
Uji Stabilitas
Error! Bookmark not defined.
24
25
25
27
27
28
29
30
31
31
32
32
32
33
35
36
37
38
39
4.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Bahan Baku
Isolasi Protein
Elektroforesis
40
40
44
48
6
Antibodi IgE Total
Antibodi IgE Spesifik
Immunoblotting
Formulasi dan Syarat Mutu Reagen SPT
Hasil SPT
Uji Stabilitas Produk Alergen
5.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
57
60
70
82
86
92
Error! Bookmark not defined.
Error! Bookmark not defined.
97
104
123
7
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
Karakteristik alergen pangan hewani
Error! Bookmark not defined.
Karakteristik alergen pangan nabati
Error! Bookmark not defined.
Karakteristik dan struktur tiga dimensi beberapa alergenError! Bookmark not defined.
Komposisi kimia daging kepiting
Error! Bookmark not defined.
Komposisi asam amino protein daging kepitingError! Bookmark not defined.
Komposisi kimia daging cumi-cumi
Error! Bookmark not defined.
Komposisi asam amino protein daging cumi-cumiError! Bookmark not defined.
Komposisi asam amino protein kacang hijau Error! Bookmark not defined.
Hasil analisis komposisi bahan baku kepiting dan cumi-cumiError! Bookmark not defined.
Hasil analisis komposisi bahan baku kacang hijau dan kacang koro
pedang
Error! Bookmark not defined.
Recovery dan rendemen ekstrak protein cumi-cumi dan kepitingError! Bookmark not defined.
Recovery dan rendemen isolat protein kacang hijau dan kacang koro
pedang
Error! Bookmark not defined.
Riwayat alergi pasien berdasarkan hasil wawancaraError! Bookmark not defined.
Hasil diagnosis alergi cumi-cumi responden 1-25Error! Bookmark not defined.
Status alergi responden 1-25 terhadap kepitingError! Bookmark not defined.
Rangkuman status alergi 25 responden
Error! Bookmark not defined.
Persentase status alergi responden terhadap isolat proteinError! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein miofibril cumi-cumi terhadap serum
responden 1, 12, 15, dan 20
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein sarkoplasma cumi-cumi terhadap serum
responden 4, 5, 12 dan 23
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein miofibril kepiting terhadap
serum
responden 12, 14, 16, dan 24
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting protein sarkoplasma kepiting terhadap serum
responden 12, 13, 14, dan 16
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting isolat protein kacang hijau terhadap serum
responden 2, 12, 16, dan 23
Error! Bookmark not defined.
Data immunoblotting isolat protein kacang koro pedang terhadap serum
responden 13 dan 23
Error! Bookmark not defined.
Hasil analisis kadar air reagen SPT dan persyaratan oleh European
Pharmacopoeia 7 Monograph on Allergen Products 01/2010:1063Error! Bookmark not define
Hasil analisis sterilitas isolat alergen
Error! Bookmark not defined.
Hasil analisis mikrobiologi masing-masing isolat alergen sesuai
persyaratan European Pharmacopoeia 7 (01/2011:50104 )Error! Bookmark not defined.
Konsentrasi protein masing-masing isolat alergenError! Bookmark not defined.
Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
cumi-cumi pada responden alergi cumi-cumi Error! Bookmark not defined.
Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
cumi-cumi pada responden tidak alergi cumi-cumi.Error! Bookmark not defined.
Sensitivitas dan spesifisitas reagen cumi-cumi untuk skin prick testError! Bookmark not define
Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
kepiting pada responden alergi kepiting
Error! Bookmark not defined.
8
32 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen miofibril dan sarkoplasma
kepiting pada responden tidak alergi kepiting Error! Bookmark not defined.
33 Sensitivitas dan spesifisitas reagen kepiting untuk skin prick testError! Bookmark not defined.
34 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang hijau pada
responden alergi kacang hijau
Error! Bookmark not defined.
35 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang hijau pada
responden tidak alergi kacang hijau
Error! Bookmark not defined.
36 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang koro pedang pada
responden alergi kacang koro pedang
Error! Bookmark not defined.
37 Hasil IgE total, IgE spesifik, dan SPT reagen kacang koro pedang pada
responden tidak alergi kacang koro pedang Error! Bookmark not defined.
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Mekanisme reaksi alergi tipe I (Singh dan Bhalla 2008)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme reaksi alergi tipe II (Pawankar et al. 2009)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme reaksi alergi tipe III (Pawankar et al. 2009)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme reaksi alergi tipe IV (Pawankar et al. 2009)Error! Bookmark not defined.
Gambaran umum pendekatan diagnosis alergi (Holgat et al. 2006)Error! Bookmark not defined.
Mekanisme kerja uji tusuk kulit (Holgat et al. 2006)Error! Bookmark not defined.
Peralatan kerja uji tusuk kulit (Holgate et al. 2006)Error! Bookmark not defined.
Epitop dan paratop pada suatu antigen
Error! Bookmark not defined.
Antigen yang mempunyai empat epitop berbedaError! Bookmark not defined.
Struktur
morfologi
kepiting
bakau
(http://deviansouisa.blogspot.com/2011/10/kepiting-bakau.html)Error! Bookmark not defined.
Struktur
morfologi
cumi-cumi
(http://alifranmcrmy.blogspot.com/2011/10/morfologi-anatomi-cumi-cumi-loligosp.html)
Error! Bookmark not defined.
Kacang
hijau
(http://www.diytrade.com/china/pd/5620300/green_mung_bean.html)Error! Bookmark not defined.
Kacang
koro
pedang
(http://chipling88.files.wordpress.com/2010/08/koro.jpg)Error! Bookmark not defined.
Diagam alir penelitian
Error! Bookmark not defined.
Bahan baku untuk pembuatan isolat alergen (A) kepiting (Scylla serrata)
dan (B) cumi-cumi (Photololigo duvaucelii) Error! Bookmark not defined.
Bahan baku untuk pembuatan isolat alergen (A) kacang hijau (Vigna
radiata (L.) R. Wilczek) dan kacang koro pedang (Canavalia ensiformis
(L.) DC).
Error! Bookmark not defined.
Hasil SDS-PAGE protein marker (M), protein miofibril cumi-cumi (A,
1= 5 µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) dan protein sarkoplasma cumi-cumi (B,
1= 5 µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) (sebelum dianalisis dengan software
GelAnalyzer 2010a)
Error! Bookmark not defined.
Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein miofibril cumi-cumi
(A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein sarkoplasma cumicumi (A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
9
20 Hasil SDS-PAGE protein marker (M), protein miofibril kepiting (A, 1=
5 µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) dan protein sarkoplasma kepiting (B, 1= 5
µg/sumur, 2= 10 µg/sumur) (sebelum dianalisis dengan Software
GelAnalyzer 2010a)
Error! Bookmark not defined.
21 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein miofibril kepiting (B)
setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
22 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan protein sarkoplasma
kepiting (A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defin
23 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan isolat protein kacang hijau (1)
3 ug/sumur, (2) 10 ug/sumur, dan (3) 30 ug/sumur sebelum dianalisis
dengan software GelAnalyzer 2010a.
Error! Bookmark not defined.
24 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan isolat protein kacang hijau
(A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not defined.
25 Hasil SDS-PAGE protein marker (M)dan isolat protein kacang koro
pedang (1) 3 ug/sumur, (2) 10 ug/sumur, dan (3) 30 ug/sumur (sebelum
dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010a).Error! Bookmark not defined.
26 Hasil SDS-PAGE protein marker (M) dan isolat protein kacang koro
pedang (A) setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer 2010aError! Bookmark not define
27 Analisis IgE total pada 25 serum penderita alergi dengan metode ELISAError! Bookmark not d
28 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein miofibril cumi-cumi pada
25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
29 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein sarkoplasma cumi-cumi
pada 25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
30 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein miofibril kepiting pada
25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
31 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap protein sarkoplasma kepiting
pada 25 responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
32 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap isolat protein kacang hijau pada
25 serum responden penderita alergi
Error! Bookmark not defined.
33 Analisis antibodi IgE spesifik terhadap isolat protein kacang koro
pedang pada 25 serum responden penderita alergiError! Bookmark not defined.
34 Hasil immunoblotting protein marker dan protein miofibril cumi-cumi
terhadap serum responden 1, 12, 15 dan 20 sebelum dianalisis dengan
software GelAnalyzer 2010.
Error! Bookmark not defined.
35 Hasil immunoblotting protein miofibril cumi-cumi terhadap serum
responden 1, 12, 15 dan 20 setelah dianalisis dengan software
GelAnalayzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
36 Hasil immunoblotting protein sarkoplasma cumi-cumi terhadap serum
responden 4, 5, 12 and 23 sebelum dianalisis dengen software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
37 Hasil immunoblotting protein sarkoplasma cumi-cumi terhadap serum
responden 4, 5, 12 and 23 setelah dianalisis dengen software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
38 Hasil immunoblotting protein marker dan miofibril kepiting terhadap
serum responden 12, 14, 16 and 24 sebelum dianalisis dengan software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
10
39 Hasil immunoblotting protein miofibril kepiting terhadap serum
responden 12, 14, 16 and 24 setelah dianalisis dengen software
GelAnalyzer 2010a
Error! Bookmark not defined.
40 Hasil immunoblotting marker dan protein sarkoplasma kepiting
terhadap serum responden 12, 13, 14 dan 16. Error! Bookmark not defined.
41 Hasil immunoblotting protein sarkoplasma kepiting terhadap responden
12, 13, 14 dan 16 setelah dianalisis dengan Gel Analyzer2010Error! Bookmark not defined.
42 Hasil immunoblotting marker dan isolat protein kacang hijau terhadap
serum responden 2, 12, 16, dan 23
Error! Bookmark not defined.
43 Hasil Immunoblotting isolat protein kacang hijau terhadap serum
responden 2, 12, 16 dan 23
Error! Bookmark not defined.
44 Hasil immunoblotting protein marker dan protein kacang koro pedang
terhadap serum responden 13 dan 23 sebelum dianalisis dengan software
GelAnalyzer 2010.
Error! Bookmark not defined.
45 Hasil immunoblotting protein kacang koro pedang terhadap serum
responden 13 dan 23 setelah dianalisis dengan software GelAnalyzer
2010
Error! Bookmark not defined.
46 Reagen Skin Prick Test steril untuk diagnosis alergiError! Bookmark not defined.
47 Hasil skin prick test miofibril dan sarkoplasma kepiting pada responden
alergi kepiting
Error! Bookmark not defined.
48 Nilai recovery konsentrasi protein alergen (A) miofibril cumi-cumi, (B)
sarkoplasma cumi-cumi, (C) kacang hijau dan (D) kacang koro pedang
disimpan pada suhu 2-8 °C selama 6 bulan (hijau: recovery > 70%,
kuning: recovery 50-70% dan merah: recovery 70%,
kuning: recovery 50-70% dan merah: recovery