Produksi Enzim Protease Dari Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam

PRODUKSI ENZIM PROTEASE DARI BAKTERI ASAM
LAKTAT ASAL BEKASAM

NURTIKA KURNIATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Produksi enzim protease
dari bakteri asam laktat asal bekasam adalah benar karya saya dengan arahan dari
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan
tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor

Bogor, Februari 2015

Nurtika Kurniati
NIM P051120061

RINGKASAN
NURTIKA KURNIATI. Produksi Enzim Protease dari Bakteri Asam Laktat asal
Bekasam. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan DESNIAR.
Protease adalah enzim yang mampu menghidrolisis protein menjadi
senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida kecil dan asam amino.
Industri enzim dunia hampir 60% merupakan enzim protease yang berasal dari
mikroba. Industri pengguna protease diantaranya ialah industri deterjen, makanan,
obat-obatan, kimia, kulit, dan kertas. Mikroorganisme sebagai sumber enzim lebih
menguntungkan karena biaya produksi yang murah, menggunakan sumber yang
ramah lingkungan, lebih mudah ditingkatkan produktivitasnya dan termostabil.
Salah satu mikroorganisme potensial penghasil enzim protease ialah bakteri
asam laktat (BAL) yang diisolasi dari bekasam. Lactobacillus plantarum SK (5)
ialah jenis bakteri asam laktat yang diisolasi dari produk fermentasi ikan
(bekasam) Indonesia yang digunakan pada penelitian ini. Penelitian pendahuluan
dilakukan sebelum melakukan optimasi medium, pH, dan inokulum meliputi

pemeliharaan dan pertumbuhan bakteri asam laktat dengan menggunakan medium
de Man Ragosa Sharpe (MRSA), penapisan isolat bakteri asam laktat penghasil
protease berdasarkan zona bening yang terbentuk dari medium dengan
menggunakan nutrient broth (NB), skim milk agar (SMA), MRSA, serta
pembuatan kurva tumbuh dan produksi protease untuk mengetahui waktu
optimum dari bakteri asam laktat terpilih. Selanjutnya dilakukan produksi enzim
protease dengan menggunakan response surface methodology (RSM). Tujuan
penelitian ini ialah untuk mendapatkan kondisi optimum produksi enzim protease
dari bakteri asam laktat terpilih dengan menggunakan RSM dengan variasi
glukosa, pepton, ekstrak khamir, volume inokulum, dan pH.
Penentuan titik optimum aktivitas enzim protease menggunakan response
surface methodology (RSM) dan rancangan percobaan menggunakan central
composite design (CCD). Response surface methodology mempelajari faktor
terhadap respon secara bersamaan dan juga mempelajari hubungan satu atau lebih
faktor (variabel independen) dengan respon (variabel dependent). Nilai respon
aktivitas spesifik protease (U/mg) tertinggi ialah 6.393 U/mg protein dengan
variabel independen yang mempengaruhi ialah glukosa 6%, pepton 6%, ekstrak
khamir 7.5%, inokulum 3 mL, dan pH 6 pada isolat Lactobacillus plantarum
SK (5) dan nilai validasi komposisi media sebesar 6.5034 U/mg protein pada jam
ke-12. Sedangkan kondisi aktivitas enzim protease sebelum dioptimasi ialah 3.615

U/mg protein. Hasil validasi menunjukan bahwa model persamaan kondisi
optimum ialah Y = -130.1888 + 11.7A + 9.433B + 3.896C + 5.976D + 15.573E –
0.976A2 – 0.7683B2 – 0.251C2 – 0.98D2 – 1.25E2. Optimasi produksi protease
L. plantarum SK (5) dengan menggunakan RSM mengalami peningkatan dua kali
lipat aktivitas enzim spesifik sebelum dioptimasi dan setelah dioptimasi.

Keyword : bakteri asam laktat, protease, RSM, bekasam

SUMMARY
NURTIKA KURNIATI. Production of Protease Enzyme by Lactic Acid Bacteria
from Bekasam. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK and DESNIAR.
Proteases are the enzymes that hydrolyze the peptide linkages of proteins
to simple proteins, peptides, and amino acid. Among all the different commercial
enzymes, microbial protease in particular, represents about 60% of the enzyme
industrial sales in the world. Proteases find their applications in several industrial
sector like in the detergent, food, pharmaceuticals, chemicals, leather and paper.
Microbial proteases are gaining more important because of the cheaper production
cost, use of renewble resources, due to their productivity and thermostability
One potential microorganism producing the protease enzyme is lactic acid
bacteria (LAB ) were isolated from bekasam. Lactobacillus plantarum SK (5) is a

lactid acid bacteria which isolated from Indonesia fermented fish (bekasam). The
isolate was chosen to this study. Preliminary research conducted prior to the
optimization of medium, pH, and inoculum covers the maintenance and growth of
lactic acid bacteria by using the medium of de Man Ragoso Sharpe (MRSA)
screening isolates of protease producing lactic acid bacteria based on a clear zone
formed from the medium by using nutrient broth (NB), skim milk agar (SMA),
MRSA, as well as the manufacture and production of protease growth curve to
determine the optimum time of selected lactic acid bacteria. Further optimization
of enzyme production using response surface method (RSM). The aims of this
study was to select the composition of medium having the highest spesific
protease activity produced from lactid acid bacteria selected using response
surface methodology. The variables involved in this study were glucose, peptone,
yeast extract, inoculation and pH.
These variables would be optimazed by central composite design (CCD)
matrix of response surface methodology. Response surface methodology is a
usefull tool for studying factors the effect the responses by varying them
simultaneously and it can also be used to study the relationships between one are
more factors (independent variables) and response (dependent variables). The
optimal cultural condition for protease production obtained with response surface
methodology were glucose 6%, peptone 6%, yeast extract 7.5%, inoculation 3 mL

and pH 6. The spesific protease activity under unoptimized conditions was 3.615
U/mg. Under the final optimed conditions, the predicted response from protease
production was 6.393 U/mg and the observed validated experiment value was
6.503 U/mg. The result of optimum equation based on the experiment RSM for
spesific activity of protease Y = -130.1888 + 11.7A + 9.433B + 3.896C + 5.976D
+ 15.573E – 0.976A2 – 0.7683B2 – 0.251C2 – 0.98D2 – 1.25E2. The optimization
of the production of protease with response surface methodology resulted in about
two fold increase in the production of enzyme by L. plantarum SK (5).
Keyword : lactid acid bacteria, protease, optimization, RSM, bekasam

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PRODUKSI ENZIM PROTEASE DARI BAKTERI ASAM
LAKTAT ASAL BEKASAM

NURTIKA KURNIATI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul
"Produksi Enzim Protease dari Bakteri Asam Laktat asal Bekasam". Penulis
mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam
menyelesaikan tesis ini, terutama kepada:
1. Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si dan Dr. Desniar, S.Pi, M.Si sebagai dosen
pembimbing tesis yang telah senantiasa memberikan arahan dan bimbingan,
nasehat, saran, motivasi, waktu konsultasi, serta solusi dari setiap
permasalahan yang dihadapi penulis selama menyelesaikan tesis ini.
2. Dr. Ir. Titi Candra Sunarti, M.Si sebagai penguji tesis yang telah memberikan
masukan dan saran pada saat ujian tesis.
3. Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA sebagai ketua program studi Bioteknologi yang
senantiasa memberikan motivasi dan arahan selama menyelesaikan tesis ini.
4. Kedua orang tua, mertua serta kakak, adik-adik, mba leni dan neng rike yang
senantiasa mendoakan dan memberikan semangat selama menyelesaikan tesis
ini.
5. Suami saya tercinta, Dwi Fitrian Saputro, S.Si, M.Si yang selalu memberikan
motivasi, dukungan moril dan materil selama menyelesaikan tesis ini.
6. Keluarga besar mahasiswa sekolah pascasarjana program studi Bioteknologi,
yang telah memberikan dorongan semangat baik selama penelitian maupun
saat penyusunan tesis ini.

7. Teman-teman dan semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan dalam penyusunan
tesis ini. Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Semoga
karya ilmiah ini bermanfaat

Bogor, 26 Februari 2015

Nurtika Kurniati

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

viii

DAFTAR GAMBAR

viii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
2
2
3
3

TINJAUAN PUSTAKA
Bekasam
Bakteri Asam Laktat

Enzim Protease
Sistem Proteolitik pada Bakteri Asam Laktat
Produksi Enzim Protease
Response Surface Methodology

3
3
4
5
5
7
7

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Peremajaan dan Penapisan Isolat Proteolitik
Penentuan Kurva Tumbuh dan Produksi Enzim
Penentuan Kondisi Produksi Protease
Rancangan untuk Produksi Enzim Protease
Prosedur Pengukuran

9
9
9
10
10
11
11

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

12
12
20

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

24
24
24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

31

RIWAYAT HIDUP

34

DAFTAR TABEL
1 Optimasi enzim menggunakan RSM dengan berbagai bakteri
2 Penentuan kondisi produksi protease
3 Kode dan variabel percobaan dari 5 variabel bebas yang diamati dengan
CCD berdasarkan respon surface methodology
4 Aktivitas protease dari delapan isolat BAL
5 Hasil Analisi Ragam (ANOVA)

8
10
11
12
16

DAFTAR GAMBAR
1 Mekanime kerja enzim protease
2 Sistem proteolitik pada bakteri asam laktat (Savikoji et al. 2006)
3 Zona bening di sekeliling koloni bakteri Lactobacillus plantarum SK (5)
pada medium A) skim milk agar, B) nutrient agar; C) MRSA
yang mengandung susu skim 1%
4 Pertumbuhan sel dan aktivitas protease pada Lactobacillus plantarum
SK (5) pada media MRS ditambahkan 1% susu skim
5 Pengaruh konsentrasi glukosa (%)
6 Pengaruh konsentrasi pepton (%)
7 Pengaruh konsentrasi ekstrak khamir (%)
8 Pengaruh inokulum (mL)
9 Response surface plots bentuk tiga dimensi yang menggambarkan
pengaruh variabel independen dengan respon (aktivitas enzim spesifik
(U.mg-1); a) pepton dan glukosa, b) ekstrak khamir dan glukosa
10 Response surface plots bentuk tiga dimensi yang menggambarkan
pengaruh variabel independen dengan respon (aktivitas enzim spesifik
(U.mg-1); a) pH dan glukosa, b) pH dan ekstrak khamir
11 Response surface plots bentuk tiga dimensi yang menggambarkan
pengaruh variabel independen dengan respon (aktivitas enzim spesifik
(U.mg-1); a) inokulum dan ekstrak khamir, b) ektrak khamir dan pepton
12 Response surface plots bentuk tiga dimensi yang menggambarkan
pengaruh variabel independen dengan respon (aktivitas enzim spesifik
(U.mg-1); a) inokulasi dan pepton dan b) pH dan pepton

5
6

13
13
14
15
15
16

18

18

19

20

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Metode pengujian aktivitas protease (Walter 1984)
Prosedur pembutan reagen yang digunakan dalam penelitian
Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976)
Respon aktivitas spesifik protease yang diamati dan diprediksi dengan
5 faktor independen dan 6 nilai tengah

31
32
32
33

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Industri enzim telah berkembang pesat dan menempati posisi penting
dalam bidang industri. Kesadaran masyarakat terhadap masalah lingkungan serta
adanya tekanan dari para ahli dan pecinta lingkungan menjadikan teknologi enzim
sebagai salah satu altematif untuk menggantikan berbagai proses kimiawi dalam
bidang industri (Akhdiya 2003). Menurut laporan baru oleh Industri Global
Analis, Inc (2011) pasar global untuk enzim industri diperkirakan akan mencapai
US$ 3,74 miliar pada tahun 2015. Pada tahun 2000 nilai perdagangan enzim di
dunia telah mencapai 1.8 miliar US$ (Marketresearch 2001) dimana 60%
diantaranya adalah enzim protease (Rao et al. 1998; Suhartono 2000; Industri
Global Analis 2011).
Protease adalah enzim yang mampu menghidrolisis protein menjadi
senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida kecil dan asam amino.
Industri pengguna protease di antaranya ialah industri deterjen, kulit, tekstil,
makanan, hidrolisat protein, pengolahan susu, farmasi, makanan, bir, film, dan
limbah (Huang et al. 2006). Kebutuhan enzim protease di Indonesia terus
mengalami peningkatan namun masih tergantung pada produksi impor. Hampir
semua kebutuhan enzim dipenuhi dari impor mencapai 108 ribu ton pada tahun
2000 dan 122.33 ribu ton pada 2001 dengan nilai perdagangan masing-masing
US$ 124.1 juta dan US$ 124.1 juta (BPS 2001). Pada tahun 2013, menurut data
Badan Pusat Statistik 2013 Indonesia mengimpor enzim sebanyak 531 ribu ton
dengan nilai perdagangan mencapai US$ 2.48 miliar.
Melihat potensi pasar yang demikian besar, Indonesia seharusnya mampu
memanfaatkan peluang tersebut untuk mendapatkan sumber penghasil enzim yang
potensial. Menurut Oyeleke et al. (2010) protease dapat dengan mudah diisolasi
dari berbagai sumber dari tanaman, hewan dan mikroorganisme dengan proses
fermentasi. Mikroorganisme sebagai sumber enzim lebih menguntungkan
dibandingkan dengan tumbuhan dan hewan karena pertumbuhannya cepat, dapat
tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah ditingkatkan hasilnya melalui
pengaturan kondisi pertumbuhan (Burhan et al. 2003) dan rekayasa genetika
(Sandhya et al. 2005), serta mampu mencukupi aplikasi bioteknologi (Kumar et
al. 2005). Adinarayana dan Ellaiah (2002) melaporkan bahwa sumber enzim
protease yang digunakan industri berasal dari mikroorganisme. Adanya
mikroorganisme yang unggul merupakan salah satu faktor penting dalam usaha
produksi enzim.
Salah satu mikroorganisme potensial penghasil enzim protease adalah
bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi dari bekasam. Pada bekasam ikan nila,
ditemukan bakteri asam laktat yang memiliki aktivitas proteolitik sebanyak
64,2 % dan bekasam ikan bandeng 62,26 %. Kemampuan proteolitik BAL sangat
beragam tergantung level genus maupun strain pada spesies sama (Wikandari et al.
2012). Menurut Adawyah (2007) bekasam merupakan produk olahan ikan dengan
cara fermentasi menggunakan kadar garam rendah dan bakteri asam laktat.
Beberapa jenis bakteri asam laktat diketahui mempunyai aktivitas proteolitik
seperti L. plantarum, L. brevis, Pediococcus, dan Lactobacillus spp. yang diisolasi

2

dari pla-ra (Vichasilp et al. 2008). Pediococcus acidilactici ATCC 8042 diketahui
menunjukkan aktivitas proteolitik ekstraseluler (Adriana et al. 2008). BAL telah
terkenal secara luas sebagai mikroorganisme yang aman sehingga enzim yang
dihasilkan dari BAL dapat digunakan secara langsung khususnya pada makanan
(Jokar dan Karbassi 2011).
Banyak penelitian dilakukan untuk mencari dan mendapatkan informasi
tentang BAL. Penelitian BAL dari bekasam telah dilakukan oleh Desniar (2012)
yang secara umum memiliki ciri dan sifat Gram positif, berbentuk selnya batang
atau bulat, katalase negatif, tidak membentuk endospora dan tidak motil. Enzim
protease yang dihasilkan dari bakteri asam laktat seperti Pediococcus pentosaceus
menghasilkan aktivitas sebesar 0,501 U/mL (Suri et al. 2013).
Optimasi produksi perlu dilakukan untuk memaksimalkan nilai produksi
enzim protease (El Enshasy et al. 2008). Optimasi dengan metode konvensional
membutuhkan waktu yang lama dan sangatlah mahal (Vohra dan Satyanarayana
2002). Dalam menggunakan metode konvensional dalam sekali percobaan, hanya
satu variabel yang divariasikan sehingga variabel yang satu dengan variabel yang
lain tidak diketahui dengan jelas. Tiap variabel diasumsikan independen satu sama
lainnya sehingga perlu dilakukan banyak uji secara bertahap dan akan ada banyak
variabel yang dipelajari pada saat proses produksi. Proses optimasi secara normal
membutuhkan waktu yang lama dengan biaya yang mahal (Saravanakumar et al.
2010) untuk mempelajari berbagai variabel. Oleh karena itu, prosedur optimasi
dengan jumlah percobaan yang begitu banyak dapat dilakukan dengan mudah
mengunakan response surface methodology.
Response surface methodology merupakan suatu model untuk mempelajari
faktor yang mempengaruhi respon secara bersamaan tanpa banyak percobaan
yang dilakukan. Teknik optimasi dengan menggunakan response surface
methodology dilakukan untuk mendapatkan solusi terbaik dari kombinasi variabel
seperti pH, sumber karbon, serta nitrogen. Kelebihan teknik response surface
methodology ialah untuk meminimalkan waktu, tenaga dan biaya (Adinarayana
dan Ellaiah 2002).

Perumusan Masalah
1. Apakah produksi enzim protease dari BAL asal bekasam dapat dioptimasi
dengan menggunakan response surface methodology (RSM)?
2. Bagaimana kondisi dan parameter produksi ketika jumlah enzim protease yang
dihasilkan mencapai optimum?

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menapis bakteri asam laktat (BAL) asal
bekasam penghasil enzim protease dan melakukan produksi enzim protease
dengan rancangan percobaan menggunakan response surface methodology (RSM)
untuk mendapatkan kondisi optimum produksi enzim protease dari bakteri asam
laktat terpilih dengan variasi sumber karbon, sumber nitrogen, pH, dan volume
inokulum.

3
Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kondisi
optimum produksi enzim protease dari Lactobacillus plantarum SK (5) dengan
menggunakan response surface methodology (RSM) pada bidang industri
makanan dan pakan hewan.

Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup dalam penelitian ini meliputi penapisan isolat serta
optimasi kondisi bakteri asam laktat terpilih penghasil protease dengan variasi
sumber karbon, nitrogen, pH, dan volume inokulum. Substrat yang digunakan
pada saat produksi protease menggunakan metode RSM ialah glukosa sebagai
sumber karbon, pepton dan ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen. Bakteri asam
laktat yang digunakan merupakan hasil isolasi oleh Dr. Desniar, S.Pi, M.Si dari
bekasam yang karakteristiknya sudah diuji. Optimasi meliputi analisis regresi
menggunakan menggunakan Software statistic „Design-ExpertR 8.0’, Stat-Ease,
Inc., Minneapolis, USA, penentuan titik optimum aktivitas enzim protease
menggunakan respon surface methodology (RSM) dan rancangan percobaan
menggunakan central composite design (CCD) serta analisis pemilihan model
dilakukan berdasarkan jumlah kuadrat dari urutan model (Sequential Model Sum
of Squares), pengujian ketidaktepatan model (Lack of Fit) dan ringkasan model
secara statistika (Model Summary Statistics).

TINJAUAN PUSTAKA
Bekasam
Bekasam adalah salah satu produk fermentasi ikan yang dijumpai di
berbagai daerah di Indonesia terutama Sumatera Selatan, Kalimantan Selatan, dan
Sulawesi. Fermentasi ikan menurut Adams (2009) merupakan suatu proses
penguraian glikogen (protein kompleks) menjadi asam laktat yang disebabkan
oleh pembakaran yang terjadi dalam daging ikan sesaat setelah aliran pada daging
ikan berhenti. Protein kompleks tersebut terdapat dalam tubuh ikan yang diubah
menjadi senyawa-senyawa lebih sederhana dengan bantuan enzim dari tubuh ikan
atau mikroorganisme serta berlangsung dalam keadaan terkontrol atau diatur.
Selama proses fermentasi, protein ikan akan terhidrolisis menjadi asam-asam
amino dan peptida, kemudian asam-asam amino akan terurai lebih lanjut menjadi
komponen-komponen lain yang berperan dalam pembentukan cita rasa produk.
Menurut Ng et al. (2011) aktivitas protease pada hidrolisis protein ikan selama
proses fermentasi ikan di Malaysia (Budu) menggunakan Valamugil seheli dan
Ilisha melastoma sebagai substrat fermentasi mengindikasikan peningkatan
aktivitas protease dan hidrolisisnya.
Pengertian fermentasi secara lebih luas adalah salah satu proses
biopreservasi yang bertujuan untuk memperpanjang masa simpan produk

4

(Hwanhlem et al. 2010) dengan menggunakan proses metabolisme mikrob
ataupun enzimatik dan menyebabkan perubahan dalam struktur biokimiawinya.
Proses fermentasi menghasilkan zat-zat yang memberikan hasil rasa dan aroma
yang spesifik dan disukai orang.
Proses pembuatan bekasam secara umum ialah ikan dibersihkan kemudian
dicampur dengan garam dan diberi nasi setelah ditiriskan lalu dimasukkan ke
dalam plastik, diikat dan disimpan pada wadah yang kedap udara selama kurang
lebih satu minggu (Irianto dan Irianto 2009).

Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan kelompok ordo Lactobacillales
(Brener et al. 2005) yang memiliki ciri-ciri: Gram positif, berbentuk batang atau
kokus, tidak berspora, non motil, katalase negatif dan oksidase negatif. BAL
menggunakan karbohidrat sebagai sumber energi dan menghasilkan asam laktat
sebagai produk utama atau satu-satunya fermentasi dan merupakan golongan
bakteri fakultatif anaerob (Willey et al. 2009).
Berdasarkan hasil fermentasinya bakteri asam laktat dapat dibedakan atas 2
kelompok. Bakteri homofermentatif yaitu glukosa difermentasi menghasilkan
asam laktat sebagai satu-satunya produk. Contoh bakteri homofermentatif ialah
Streptococus, Pediococcus, dan beberapa Lactobacillus. Bakteri heterofermentatif
yaitu glukosa difermentasikan selain menghasilkan asam laktat juga memproduksi
senyawa-senyawa lainnya yaitu etanol, asam asetat dan CO2. Contoh bakteri
heterofermentatif ialah Leuconostoc, dan beberapa spesies Lactobacillus.
Perbedaan kedua kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan bakteri
asam laktat dalam menghasilkan enzim fruktosa difosfat aldolase. Bakteri asam
laktat homofermentatif mampu menghasilkan enzim fruktosa difosfat aldolase,
sedangkan bakteri asam laktat heterofermentatif tidak mampu menghasilkan
enzim tersebut tetapi bakteri asam laktat heterofermentatif mampu menghasilkan
glukosa 6 fosfat dehidrogenase dan 6 fosfat glukonat dehidrogenase sehingga
mempunyai jalur pembentukan asam laktat yang berbeda. Pada heterofermentatif,
tidak ada aldolase dan heksosa isomerase tetapi menggunakan enzim
fosfoketolase dan menghasilkan CO2. Metabolisme heterofermentatif dengan
menggunakan heksosa (golongan karbohidrat yang terdiri dari 6 atom karbon)
akan melalui jalur heksosa monofosfat atau pentosa fosfat. Sedangkan
homofermentatif melibatkan aldolase dan heksosa aldolase namun tidak memiliki
fosfoketolase serta hanya sedikit atau bahkan sama sekali tidak menghasilkan
CO2. Jalur metabolisme dari yang digunakan pada homofermentatif adalah
lintasan Embden-Meyerhof-Parnas (Aarnikunnas 2006; Axelsson 2004).
Bakteri asam laktat dalam industri pangan berperan untuk mengawetkan
kualitas nutrisi bahan baku serta menghambat pertumbuhan bakteri pembusuk dan
patogen (Diop et al. 2007). Hal ini karena BAL dapat memproduksi beberapa
metabolit seperti asam organik (asam laktat dan asetat), hidrogen peroksida,
diasetil dan bakteriosin (Ross et al. 2002; Diop et al. 2007; Galvez et al. 2007).
BAL merupakan sumber bermacam-macam enzim seperti enzim malolaktik,
proteolitik, peptidolitik, glikosidase, pendegradasi polisakarida, urease,
fenoloksidase, dan lipase (Matthews 2004).

5
Enzim Protease
Enzim adalah suatu protein yang bertindak sebagai katalis biologis yang
dapat mempercepat reaksi kimia namun tidak ikut bereaksi (Oyeleke dan
Oduwole 2009). Enzim protease merupakan salah satu enzim yang penting dalam
aplikasi bioteknologi. Protease merupakan satu di antara tiga kelompok enzim
komersial yang diperdagangkan dengan nilai mencapai 60% total penjualan enzim
yang aplikasinya sebagai katalisator hayati (Suhartono 2000). Protease adalah
enzim yang mampu menghidrolisis protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih
sederhana seperti peptida kecil dan asam amino.
Berdasarkan mekanisme kerjanya dalam memotong ikatan peptida, enzim
protease dibagi menjadi eksopeptidase dan endopeptidase. Eksopeptidase terdiri
atas karboksi-ekso-peptidase yang memotong peptida dari arah gugus karboksil
terminal dan amino-eksopeptidasedari gugus amino terminal, sedang
endopeptidase memecah ikatan peptida dari dalam (Turk 2006).

Gambar 1 Mekanisme kerja enzim protease
Mikrob sebagai sumber enzim lebih menguntungkan karena
pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada substrat yang murah, lebih mudah
ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan kondisi pertumbuhan (Burhan et al.
2003). Protease mikrob dapat diklasifikasikan sebagai protease serin (E.C. 3.4.21),
protease sulfhydril (E.C.3.4.22), protease asam (E.C.3.4.23) dan metaloprotease
(E.C.3.4.24) (Ward et al. 2009).

Sistem Proteolitik pada Bakteri Aam Laktat
Bakteri asam laktat mempunyai sistem proteolitik yang kompleks yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan BAL itu sendiri dan juga memberi kontribusi yang
nyata pada pembentukan flavour produk fermentasi. Aktivitas proteolitik
S. thermophilus lebih rendah dibandingkan L. casei, L. helveticus, L. rhamnosus,

6

dan Lc. lactis, namun S. thermophilus memproduksi asam lebih cepat. Garabal et
al. (2007), menyatakan bahwa Lactococcus lactis mempunyai aktivitas proteolitik
lebih besar dibandingkan Lactobacilli dan Leuconostoc.

Gambar 2 Sistem proteolitik pada bakteri asam laktat (Savikoji et al. 2006)
Tahap pertama dalam pemanfaatan kasein oleh BAL dilakukan oleh sel
CEPS. Lima jenis enzim yang berbeda dikloning dan dikarakterisasi dari BAL,
meliputi PrtP dari L. lactis dan Lactobacillus paracasei, PrtH dari L. helveticus,
PrtR dari Lactobacillus rhamnosus, PRT dari S. thermophilus, dan PrtB dari L.
bulgaricus (Kok et al.1988;. Holck dan Naes 1992; Gilbert et al. 1996; Pederson
et al. 1999; Siezen 1999; Fernandez-Espla et al. 2000; Pastar et al. 2003). Pada
lactococci, gen PrtP dapat menjadi plasmid, sedangkan CEPS dikarakterisasi dari
lactobacilli. BAL biasanya hanya memiliki satu CEP tetapi adanya dua CEPS
dilaporkan dalam strain L. helveticus dan L. bulgaricus (Stefanitsi et al. 1995;
Pederson et al. 1999). Gen PrtP ditranskripsikan oleh gen yang mengkode
membran terikat pada lipoprotein (PrtM) untuk autokatalitik PrtP (Haandrikman et
al. 1989). CEPS memiliki preferensi yang kuat untuk kasein hidrofobik, protein
paling melimpah dalam susu (Swaisgood 1982). Kasein dibagi ke dalam αs1-,
αs2-, β-, dan -kasein. PrtPs Lactococcus dibagi menjadi enzim PI dan PIII yang
dibedakan berdasarkan spesifisitas substrat untuk αS1-, β-, dan -kasein (Kunji et
al. 1996). PI untuk mendegradasi β-kasein yang lebih dari 100 oligopeptida
menjadi 4-30 residu asam amino (Juillard et al. 1995). Substrat -kasein dapat
didegradasi oleh enzim yang aktivitasnya lebih rendah dari pada enzim PI,
sedangkan PIII mampu mendegradasi αS1-, β-, dan -kasein sama baiknya
(Pritchard dan Coolbear 1993).
Langkah kedua dalam pemanfaatan kasein termasuk transportasi peptida
yang dihasilkan oleh CEP ke dalam sel dari sistem uptake Opp (Doeven et al.

7
2005). Dalam L. lactis MG1363, gen yang mengkode ikatan protein oligopeptida
(Oppa), dua membran terpisahkan (OppB dan OppC) dan ikatan nukleotida
(OppD dan OppF) yang ada di dalam operon (Tynkkynen et al. 1993). Sistem Opp
L. lactis meliputi 18 residu peptida dan sifat peptida ini secara signifikan
mempengaruhi transportasi kinetika yang terlibat (Detmers et al. 1998; Juillard et
al. 1998).
Pepo dan PepF adalah endopeptidases, PepN/ PepC/ PEPP
aminopeptidases, PepX X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase, PepT tripeptidase,
PepQ prolidase, PepR prolinase, Pepi iminopeptidase prolin, dan PepD dan PepV
dipeptidases D dan V adalah enzim pertama yang bertindak atas oligopeptida.
Endopeptidases tidak dapat menghidrolisis kasein secara utuh tetapi memiliki
kemampuan untuk menghidrolisis ikatan peptida dari peptida yang berasal dari
internal kasein. Setelah menjadi asam amino bebas, asam amino rantai cabang
(isoleusin, leusin, dan valin) yang merupakan represor transkripsi Cody yang
menggunakan sisa asam amino sebagai kofaktor Cody untuk merepresi ekspresi
gen yang terdiri dari sistem proteolitik pada L. lactis.

Produksi Enzim Protease
Protease adalah enzim-enzim yang mengkatalisis pemecahan protein.
Enzim protease merupakan enzim yang paling banyak dibutuhkan. Berbagai usaha
telah dilakukan untuk mencari cara yang mudah dan murah dalam produksi enzim
protease dengan aktivitas katalitiknya. Enzim protease banyak diproduksi dari
mikrob diantaranya Bacillus sp. (Puri et al. 2002), Bacillus licheniformis (Soeka
et al. 2011; El Enshasy et al. 2008), bakteri asam laktat (Yusmarini et al. 2010;
Cristian et al. 2010), Lactobacillus plantarum (Margono et al. 2014), Serratia
marcescens B08 (Venil et al. 2009).
Mikroorganisme merupakan salah satu faktor penting dalam usaha produksi
enzim dengan keunggulan diantaranya dapat diproduksi dalam jumlah besar,
produktivitasnya mudah ditingkatkan, mutu lebih seragam, harga lebih murah,
dapat ditumbuhkan dengan cepat, pertumbuhannya mudah diatur, enzim yang
dihasilkan mudah diisolasi. Keunggulan lainnya adalah mikroorganisme dapat
hidup dan berkembang biak dalam media limbah pertanian yang relatif lebih
murah (Stanbury and Whitaker 1984).
Peningkatan produksi protease seiring dengan meningkatnya pertumbuhan
bakteri dan dipengaruhi oleh nutrien, oksigen, potensial oksidasi reduksi dan
adanya zat-zat penghambat (Putri 2012) waktu, suhu, dan pH inkubasi (Soeka et
al. 2011) `

Response Surface Methodology (RSM)
Response surface methodology (RSM) adalah suatu metode pengembangan
dan optimasi proses dalam respon yang dipengaruhi oleh beberapa variabel
dengan menggunakan teknik statistika dan matematika (Bas dan Boyaci 2007).
Ide dasar metode RSM ialah memanfaatkan desain eksperimen berbantuan
statistika untuk mencari nilai optimal dari suatu respon. RSM merupakan teknik

8

yang paling popular untuk studi optimasi. Metode ini memerlukan data yang
tidak terlalu banyak, sehingga kondisi optimum respons dapat diperoleh dengan
waktu yang tidak terlalu lama dan biaya yang minimum (Nuryati dan Salimy
2008).
RSM dapat dipergunakan untuk mencari suatu fungsi pendekatan yang
cocok untuk meramalkan respons yang akan datang, serta menentukan nilai-nilai
dari variabel bebas yang mengoptimumkan respons yang dipelajari. RSM
memiliki variabel-variabel bebas sebagai X1, X2,….Xk yang akan dipelajari.
Variabel-variabel bebas itu diasumsikan merupakan variabel kontinu dan dapat
dikendalikan oleh peneliti tanpa kesalahan, sedangkan respons yang didefinisikan
sebagai variabel tak bebas Y diasumsikan merupakan variabel acak (random
variable).
Tabel 1 Optimasi enzim menggunakan RSM dengan berbagai bakteri
Jenis Bakteri

Faktor Independen

Response

Sumber

Bacillus sp.

Pati, pepton,
waktu inkubasi,
inokulum

Enzim protease
1939 U/mL

Puri et al. (2002)

Lactobacillus
plantarum

Pati,glukosa,
pH, suhu,
waktu inkubasi

Enzim amilase
4022 U/mL

Panda et al.
(2008)

Bacillus
licheniformis

Glukosa, kedelai,
CaCl2, MgCl2,
fosfat anorganik

Enzim protease
2400 U/mL

El Enshasy et al.
(2008)

Serratia
marcescens SB08

pH, agitasi,
waktu inkubasi,
ekstrak khamir

Enzim protease
281,23 U/mL

Venil et al. (2009)

Pediococcus
pentosaceus

Suhu,pH, kasein,
waktu, inkubasi

Enzim protease
0.542 U/mg

Suri et al. (2013)

Keberhasilan penerapan RSM telah dilaporkan pada berbagai penelitian
antara lain senyawa antikapang (asam laktat) yang dihasilkan oleh Lactobacillus
plantarum DR 1-6-2 berhasil dioptimasi dengan RSM (Rohmatussolihat 2013).
Metode RSM dapat digunakan untuk mengoptimasi produksi enzim protease
berbagai variabel (Adinarayana dan Ellaiah 2002). RSM dapat diaplikasikan pada
proses kimia dan biokimia (Bas dan Boyaci 2007).
Penelitian lain mengenai keberhasilan RSM pada enzim protease juga
dilaporkan oleh Zambare et al. (2013) menggunakan Pseudomonas aeruginosa
MCM B327 akan meningkatkan 1.3 kali aktivitasnya. Keberhasilan RSM juga
meningkatkan aktivitas protease sebanyak 2 kali lipat dengan memperhatikan
beberapa variabel ialah glukosa, kedelai, K2HPO4 dan interaksi beberapa variabel
lainnya yang sangat signifikat dalam produksi protease dari Bacillus sp. (Rajshree

9
dan Rajni 2010). Aktivitas enzim protease bersifat alkali tertinggi dengan yield
1939 U.mL-1 pada batch fermentation oleh Bacillus sp. dengan menggunakan
response surface methodology (RSM) dengan 4 variabel meliputi pati, pepton,
waktu inkubasi dan inokulum (Puri et al. 2002).
Tahapan yang perlu dilakukan dalam melakukan optimasi dengan
menggunakan RSM antara lain
1. Screening: berbagai faktor yang diduga berpengaruh diuji untuk diseleksi
faktor mana saja yang benar-benar memberikan dampak besar terhadap sistem.
2. Improvisasi: pengubahan nilai-nilai faktor-faktor secara berulang-ulang
sehingga mendapatkan sekumpulan variasi data yang dapat diolah secara
statistika kemudian dicari nilai optimumnya.
3. Penentuan titik optimum: proses pencarian titik optimum menggunakan
metode regresi orde dua (Bakti 2012).

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2013 hingga Juli 2014 di
Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA dan Departemen
Teknologi Hasil Perairan, FPIK, IPB.

Peremajaan dan Penapisan Isolat Proteolitik
Sebanyak 10 isolat bakteri dengan kode isolat SK (5), SK (15), BP (3), BP
(8), BP (20), NS (9), NS (6), NS (5), BI (2) dan BI (3) yang diisolasi dari bekasam
digoreskan pada media MRSA. Isolat kemudian diinkubasi selama 48 jam pada
suhu 37 °C. Koloni tunggal kemudian ditumbuhkan pada skim milk agar (SMA),
nutrient agar (NA) dan de Man ragoso sharpe agar (MRSA) dengan penambahan
susu skim 1%. Isolat kemudian diinkubasi kembali pada inkubator Merk Yamato
IS900 disimpan dalam keadaan kaleng tertutup pada suhu 37 oC selama 48 jam
(Desniar 2012). Isolat proteolitik ditandai dengan pembentukan zona bening pada
medium SMA, NA, dan MRSA dengan penambahan susu skim 1%. Indeks
protease dihitung menggunakan rumus (A-B).B-1, A adalah diameter zona bening,
B adalah diameter koloni bakteri.
Penapisan isolat juga dilakukan berdasarkan aktivitas enzim ekstrak kasar
protease. Koloni tunggal hasil peremajaan isolat kemudian ditumbuhkan pada
medium MRS dengan penambahan susu skim 1%. Isolat kemudian diinkubasi
dalam Erlenmeyer yang digoyang dengan kecepatan 130 rpm.menit-1 pada suhu
37 °C selama 24 jam (Pranomo et al. 2003; Panda et al. 2008; Cristian et al. 2010;
Margono et al. 2014). Kultur sel kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan
kecepatan 10.000 rpm (Eppendorf MiniSpin dengan rotor jenis F-45-12-11).
Supernatan yang diperoleh merupakan enzim ekstrak kasar yang selanjutnya
diukur aktivitas proteasenya. Isolat yang memiliki aktivitas protease terbaik
ditetapkan sebagai isolat terpilih.

10

Penentuan Kurva Tumbuh dan Produksi Enzim Protease
Sebanyak 2 lup isolat bakteri terpilih ditumbuhkan di medium MRS
ditambahkan 1% susu skim kemudian diinkubasi selama 12 jam dengan kecepatan
130 rpm pada suhu 37 oC. Selanjutnya 1% (8.8 x 108 CFU.mL-1) inokulum
diinokulasi ke medium MRS 100 mL ditambah 1% susu skim dalam Erlenmeyer
250 mL sebagai media produksi dan diinkubasi pada suhu 37 oC dengan
kecepatan 130 rpm (Pranomo et al. 2003; Panda et al. 2008; Cristian et al. 2010;
Margono et al. 2014). Setiap 3 jam dilakukan pengambilan kultur sel untuk diukur
densitas selnya pada panjang gelombang 600 nm yang berlangsung 24 jam lalu
dibandingkan dengan kurva standar sel. Kultur sel yang sama kemudian
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm (Eppendorf
MiniSpin dengan rotor jenis F-45-12-11) pada suhu ruang. Supernatan yang
diperoleh merupakan enzim ekstrak kasar yang selanjutnya diukur aktivitas
proteasenya.

Penentuan Kondisi Produksi Protease
Penentuan kondisi produksi protease menggunakan metode optimasi onevariable-at-a-time (OFAT) perlu dilakukan sebelum melakukan optimasi dengan
menggunakan RSM. Variabel yang akan diuji ialah glukosa dan pepton 6%,
ekstrak khamir 7,5%, inokulum 3 mL dan pH 6 (Adinarayana dan Ellaiah 2002;
Gupta et al. 2010; Cristian et al. 2010). Medium yang digunakan ialah MRSA
dengan komposisi: 1% pepton 0.8% Lab. lemco powder 0.4% ekstrak khamir 2%
glukosa 0.2% K2HPO4, 0.315% natrium asetat, 0.2% diamonium sitrat 0.02%
MgSO4·7H2O 0.005% MnSO4·H2O, 0,1% Tween 80, 0.5% CaCO3 dan 2% agaragar. Penentuan menggunakan lima variabel yang diuji menggantikan komposisi
glukosa, pepton, ekstrak khamir pada MRSA dengan konsentrasi sesuai dengan
Tabel 2 serta pH dan inokulum menyesuaikan. Sedangkan komposisi lain tetap.
Tiap variabel diasumsikan independen satu sama lain. Selanjutnya diuji aktivitas
enzim berdasarkan metode Walter (1984).
Tabel 2 Penentuan kondisi produksi protease
[Glukosa]% [Pepton]%
5
5.5
6
6.5
7
7.5

5
5.5
6
6.5
7
7.5

[Ekstrak
Khamir]%
5
5.5
6
6.5
7
7.5

Inokulum
(mL)
0.5
1
1.5
2
2.5
3

pH
6
6
6
6
6
6

Hasil penentuan kondisi produksi protease yang memiliki aktivitas enzim
optimum dengan menggunakan metode one-variable-at-a-time (OFAT) setiap
variabel dapat digunakan sebagai pertimbangan dalam menentukan center point
yang akan dioptimasi dengan menggunakan RSM.

11
Rancangan untuk Produksi Enzim Protease
Produksi enzim protease pada medium MRS menggunakan respon surface
methodology (RSM) dengan central composite design (CCD) yang dibuat dengan
variabel glukosa, pepton, ekstrak khamir, inokulum (8,8 x 108 CFU/mL) dan pH.
Software statistic „Design-ExpertR 8.0’, Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA
digunakan untuk menganalisa desain percobaan.
Model yang digunakan adalah response surface mengikuti persamaan:

Y adalah aktivitas enzim protease sedangkan X1, X2, …., Xn merupakan
variabel yang diuji dan βo adalah intercept serta βi…., βin adalah koefisien regresi.
Tabel 3 Kode dan variable percobaan dari 5 variabel bebas yang diamati dengan
CCD berdasarkan respon surface methodology
Variabel
a

Glukosa (%)
Pepton (%)a
Ekstrak khamir ( %)b
Inokulasi (mL)b
pHc
a

-2
4
4
5.5
1
4

Kode Tingkat Variabel
-1
0
+1
5
6
7
5
6
7
6.5
7.5
8.5
2
3
4
5
7
6c

+2
8
8
9.5
5
8

Adinarayana dan Ellaiah (2002); bGupta et al. (2010); cCristian et al. (2010)

Isolat BAL terseleksi diinokulasikan ke dalam 50 mL medium MRS
selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 °C selama 48 jam dan selanjutnya dipakai
sebagai inokulasi. Inokulum kemudian ditambahkan ke dalam 50 mL medium
produksi berdasarkan variasi kombinasi yang ditentukan oleh RSM. Kultur
disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (Eppendorf MiniSpin dengan rotor jenis
F-45-12-11) selama 5 menit. Enzim ekstrak kasar yang terdapat dalam supernatan
dianalisis aktivitas protease dengan menggunakan metode Walter (1984).

Prosedur Pengukuran
Pengukuran Aktivitas Protease
Aktivitas protease diukur dengan metode Walter (1984) (Lampiran 1),
Sebanyak 0.25 mL larutan kasein 1 % direaksikan dengan 0.25 mL bufer tris HCL
0.5 M pH 8 dan 0.05 mL ekstrak kasar enzim, kemudian diinkubasi pada suhu
37 °C selama 20 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 1.25 mL larutan
asam trikloroasetat (TCA) 5 mM dan diinkubasi di 37 °C selama 20 menit. Hasil
reaksi disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm (Eppendorf MiniSpin dengan
rotor jenis F-45-12-11) selama 5 menit. Sebanyak 0.375 mL supernatan

12

ditambahkan dengan 1,25 mL Na2CO3 0.5 M dan 0.25 mL Folin Ciocalteu (1:2)
diinkubasi selama 20 menit pada suhu 37 °C. Supernatan diukur absorbansinya
pada panjang gelombang 578 nm dengan menggunakan L-tirosin sebagai standar
(Lampiran 2). Satu unit aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang dapat menghasilkan 1 µmol tirosin per menit pada kondisi optimum
pengukuran.
Pengukuran Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford (1976) menggunakan
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V sebagai standar protein. Masing- masing
tabung reaksi sebanyak 20 µL enzim ditambahkan sebanyak 1 mL pereaksi
Bradford. Blanko dibuat dengan cara mencampurkan 20 µL akuades dan
direaksikan dengan 1 mL pereaksi Bradford. Setelah sekitar 5 menit, masingmasing campuran reaksi diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.
(Lampiran 3).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Penapisan Isolat Bakteri Asam Laktat Penghasil Protease
Penapisan dari 10 isolat bakteri asam laktat diperoleh 8 isolat yang
memiliki aktivitas protease. Isolat SK (5) memiliki aktivitas protease tertinggi
dibandingkan isolat lainnya. Aktivitas enzim kasar dan aktivitas spesifik enzim
protease dari isolat SK (5) dengan medium MRS dan susu skim 1 % masing–
masing sebesar 0.443 U.mL-1 dan 3.615 U.mg-1 protein (Tabel 4).
Tabel 4 Aktivitas protease dari delapan isolat BAL
Kode Isolat
SK (5)
SK (15)
BP (5)
BP (8)
BP (20)
BI (2)
NS (9)
NS (6)

Aktivitas Enzim (U.mL-1)
0.443
0.042
0.192
0.031
0.128
0.024
0.269
0.267

Aktivitas Spesifik (U.mg-1)
3.615
0.282
1.444
0.195
0.951
0.140
1.627
2.508

Zona bening (R) dari isolat SK (5) pada medium skim milk agar, nutrient
agar, dan MRSA dengan penambahan susu skim 1 % masing-masing memiliki R
sebesar 1, 0.44, dan 0.09 (Gambar 3). Semakin besar zona jernih yang dihasilkan

13
berarti semakin besar pula kemampuan isolat tersebut untuk menghasilkan enzim
protease.

A
Gambar 3

B

C

Zona bening di sekeliling koloni bakteri Lactobacillus plantarum
SK (5) pada medium A) skim milk agar, B) nutrient agar; C) MRSA
yang mengandung susu skim 1%

Isolat SK (5) merupakan isolat yang sudah diidentifikasi berdasarkan
penelitian sebelumnya yakni Lactobacillus plantarum 1 (99.9 %) menggunakan
API 50 CHL dan L. plantarum subsp. plantarum NC 8 (93%) dengan
menggunakan 16s rRNA (Desniar 2012).

Kurva Pertumbuhan dan Produksi Protease dari Lactobacillus plantarum
SK (5)

9,4
9,2
9
8,8
8,6
8,4
8,2
8
7,8
7,6
7,4

3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0

3

6

9

12

15

18

21

Aktivitas Enzim spesifik (U/mg)

Jumlah mikroorganisme (log
CFU/mL)

Isolat yang diuji mampu tumbuh pada medium MRS ditambahkan susu
skim 1% pada pH 6.9 dan suhu 37 oC. Pertumbuhan isolat Lactobacillus
plantarum SK (5) meningkat pada 0-12 jam setelah inkubasi dan pertumbuhan
cenderung stabil hingga 24 jam inkubasi.

24

Waktu (jam)

Gambar 4 Pertumbuhan sel (
) dan aktivitas protease ( ) Lactobacillus
plantarum SK (5) pada media MRS ditambahkan 1% susu skim

14

Produksi protease dari isolat ini mulai terlihat pada jam ke-3 inkubasi dan
relatif meningkat hingga jam ke-12. Aktivitas protease tertinggi ditemukan pada
12 jam (Gambar 4).

Penentuan Kondisi Produksi Protease
Pengaruh Konsentrasi Glukosa (%) Terhadap Aktivitas Protease

Aktivitas spesifik (U/mg) protein

Lactobacillus plantarum SK (5) memproduksi enzim protease dengan
aktivitas tertinggi pada konsentrasi glukosa 6%. Pada konsentrasi glukosa kurang
dari 6% aktivitas enzim menjadi menurun. Demikian juga pada saat konsentrasi
glukosa lebih dari 6% aktivitas enzim menurun namun penurunnya tidak terlalu
signifikan (Gambar 5).

1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
5

5,5

6

6,5

7

7,5

[Glukosa] (%)

Gambar 5 Pengaruh konsentrasi glukosa (%)

Penentuan Konsentrasi Pepton (%) Terhadap Aktivitas Protease
Seperti halnya konsentrasi glukosa, pepton juga memiliki dampak terhadap
aktivitas enzim pada Lactobacillus plantarum SK (5). Konsentrasi pepton yang
menghasilkan aktivitas enzim tertinggi ialah konsentrasi pepton 6%. Pada
konsentrasi pepton kurang dari 6% aktivitas enzim menjadi menurun. Demikian
juga pada saat konsentrasi pepton lebih dari 6% aktivitas enzim menurun namun
penurunnya tidak terlalu signifikan (Gambar 6). Sumber pepton yang sedikit
membuat bakteri tidak menangkap pepton sebagai sumber nitrogen sehingga akan
mensekresikan enzim protease untuk mendegradasi sumber nutrisi alternatif lain.

Aktivitas spesifik (U/mg) protein

15

1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
5

5,5

6

6,5

7

7,5

[Pepton] (%)

Gambar 6 Pengaruh konsentrasi pepton (%)

Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Khamir (%) Terhadap Aktivitas Protease

Aktivitas spesifik 9U/mg) protein

Penggunakan ekstrak khamir untuk memproduksi enzim protease semakin
meningkat dari konsentrasi 5% sampai 7.5%. Pada konsentrasi ekstrak khamir
7.5% aktivitas enzim protease paling optimum dibandingkan dengan konsentrasi
ekstrak khamir sebelumnya (Gambar 7).
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
5

5,5

6

6,5

7

7,5

[Ekstrak Khamir] (%)

Gambar 7 Uji pendahuluan konsentrasi ekstrak khamir (%)

Pengaruh Inokulum (mL) Terhadap aktivitas Protease
Pengaruh volum inokulum (mL) juga semakin meningkatkan aktivitas
enzim pada 0.5-3 mL. Aktivitas enzim tertinggi pada volume inokulum 3 mL
(Gambar 7).

Aktivitas spesifik (U/mg) protein

16

1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,5

1

1,5

2

2,5

3

Inokulum (mL)

Gambar 8 Pengaruh inokulum (mL)

Rancangan untuk Produksi Enzim Protease
Produksi enzim protease dilakukan dengan menggunakan variabel 32
percobaan yang dilakukan 6 kali pengulangan pada center point (Lampiran 4).
Hasilnya dianalisis menggunakan Analysis of Variance (ANOVA) dikomputasi
dengan Software statistic „Design-ExpertR 8.0’, Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA.
Analisis pemilihan model dilakukan berdasarkan jumlah kuadrat dari urutan
model (Sequential Model Sum of Squares), pengujian ketidaktepatan model (Lack
of Fit) dan ringkasan model secara statistika (Model Summary Statistics). Model
yang terpilih untuk menjelaskan respon (aktivitas spesifik protease U/mg)
berdasarkan hasil analisis ialah model kuadratik vs 2F1 (Tabel 5).
Tabel 5 Hasil analisi ragam (ANOVA)
Sumber
Model
Glukosa (A)
Pepton (B)
Ekstrak khamir (C)
Inokulasi (D)
pH (E)
A*A
B*B
C*C
D*D
E*E
Residual
Lack of Fit
Pure Eror
Cor Total

Jumlah
Kuadrat
105.85
6.004E-003
1.10
0.36
0.21
7.69
27.96
17.32
1.86
28.21
45.88
4.60
4.08
0.51
110.45

df
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
21
16
5
31

Rata-rata
Kuadrat
10.59
6.004E-003
1.10
0.36
0.21
7.69
27.96
17.32
1.86
28.21
45.88
0.22
0.26
0.10

F
Hitung
48.37
0.027
5.02
1.02
0.94
35.14
127.79
79.13
8.49
128.90
209.64

Nilai p
Prob>F