Seleksi Dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam Sebagai Probiotik

SELEKSI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
ASAL BEKASAM SEBAGAI PROBIOTIK

ASTRI NURNAAFI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Seleksi dan Karakterisasi
Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam sebagai Probiotik” adalah benar karya saya
dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun
kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari
karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2016

Astri Nurnaafi
NIM C351120141

RINGKASAN
ASTRI NURNAAFI. Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam
sebagai Probiotik. Dibimbing oleh IRIANI SETYANINGSIH dan DESNIAR.
Bekasam merupakan salah satu produk fermentasi ikan Indonesia. Produk
fermentasi mengandung bakteri asam laktat (BAL) dan beberapa diantaranya
berpotensi sebagai probiotik. Bekasam terbuat dari ikan air tawar, misalnya ikan
sepat dan nila, memiliki bentuk seperti ikan segar namun daging ikan lebih kenyal,
rasa asam, asin dan aroma yang khas. Penelitian produk fermentasi ikan di
Indonesia masih sangat kurang khususnya bekasam. Bakteri asam laktat telah
diisolasi dari bekasam dan menghasilkan 62 isolat BAL, tiga isolat diantaranya
telah diteliti potensinya sebagai probiotik, namun baru sebagai kandidat dan masih
terdapat 59 jenis isolat yang belum diketahui potensinya sebagai probiotik.
Berdasarkan hal tersebut maka perlu diteliti lebih lanjut mengenai BAL probiotik
pada bekasam. Tujuan penelitian ini adalah menseleksi isolat BAL asal bekasam,
menentukan karakteristik BAL yang berpotensi sebagai probiotik, dan identifikasi
isolat BAL probiotik.
Penelitian dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama yaitu seleksi BAL

sebagai probiotik. Lima isolat BAL asal bekasam yaitu BP(25), NS(5), SS(3), BP(8)
dan NS(6) diseleksi berdasarkan pH lambung (pH 2.0), pH usus (pH 7.2), garam
empedu (0.5% oxgal), aktivitas antibakteri, kemampuan penempelan pada usus
tikus (ileum) secara in vitro. Tahap kedua yaitu karakterisasi BAL probiotik
meliputi pewarnaan Gram dan spora, pengamatan sifat fisiologis meliputi motilitas,
katalase, uji tipe fermentasi, amilolitik, lipolitik, serta pengamatan pertumbuhan
pada suhu, pH dan kadar NaCl yang berbeda, dan identifikasi menggunakan API
50 CHL.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat NS(5), SS(3) dan BP(8) dapat
bertahan pada pH 2.0, 7.2 dan garam empedu (oxgal), memiliki aktivitas antibakteri
terhadap Salmonella typhimurium ATCC 14028 dan Escherichia coli, memiliki
kapasitas penempelan pada permukaan usus (ileum) 10.43–15.40%. Pembuktian
penempelan dengan pembuatan preparat histopat menunjukkan ketiga bakteri dapat
melekat pada sel epitel usus. Ketiga isolat memiliki karakteristik bakteri Grampositif, berbentuk batang (NS(5) dan SS(3)) dan bulat (BP(8)), non-endospora,
katalase negatif, homofermentatif, non motil, memiliki aktivitas amilolitik dan
lipolitik, dapat tumbuh pada 30oC–37oC, kadar NaCl 2%-7% dan pH 4.4–9.6. Isolat
NS(5) adalah Lactobacillus plantarum 1 (99.9% ID), SS(3) adalah L. pentosus
(99.9% ID), dan BP(8) adalah Pediococcus pentosaceus 1 (99.9% ID). Isolat
BP(25) dan NS(6) tidak termasuk probiotik karena tidak dapat bertahan pada
kondisi pH lambung, pH usus dan garam empedu (oxgal).

Kata kunci : bekasam, bakteri asam laktat (BAL), probiotik

SUMMARY
ASTRI NURNAAFI Selection and Characterization of Lactic Acid Bacteria from
Bekasam as Probiotic. Supervised by IRIANI SETYANINGSIH and DESNIAR.
Bekasam is one of the fermented fish from Indonesia. The fermented
products contain lactic acid bacteria (LAB) and several of them have potential
probiotic with beneficial effects for human health. Bekasam is made from
freshwater fish such as gouramy and tilapia, has a shape like of fresh fish with
loamy meat, sour, salty and unique flavor. Lactic acid bacteria was isolated from
bekasam and obtained as much as 62 of LAB isolates. Three out of those have been
known as probiotic candidates and there are still 59 remaining isolates which
potential probiotic is unknown. Based on this, it is necessary to conduct further
research related to probiotic potential. The aims of this study were to select LAB
isolate of bekasam, to characterize LAB isolate of bekasam as probiotic and to
identify probiotic LAB isolate.
The research was divided into two stages. In the first stage selected LAB
isolates as probiotic. Five LAB isolates of bekasam namely BP(25), NS(5), SS(3),
BP(8) and NS(6) were tested based on the resistance to gastric pH (pH 2.0),
intestinal pH (pH 7.2), and bile salts (0.5% oxgal), the antibacterial activity, and in

vitro adhesion on intestinal (ileum). In the second stage consist of probiotic LAB
characterization include Gram and spores staining, observation of physiological
properties such as motility and catalase, observation of fermentation type,
amylolytic and lipolytic, observation of growth on the different level of temperature,
pH and NaCl, and identification of probiotic LAB isolate using API 50 CHL.
The result showed that NS(5), SS(3) and BP(8) isolates survived at pH 2.0,
pH 7.2 and bile salts (oxgal), had antibacterial activity against Salmonella
typhimurium ATCC 14028 and Escherichia coli and had adhesion capacity on the
intestine (ileum) surface 10.43 to 15.40%. The adhesion verification using histopat
preparat showed that those three isolates could adhere on intestinal epithelial cells.
The characteristics of the isolates were as follow: Gram-positive bacteria,
rod-shaped (NS(5) and SS(3)), coccus (BP(8)), non-endospore producer, negative
catalase, homofermentative, non motil, have amylolytic and lipolytic activity,
be able to grow at 30oC–37oC, NaCl 2%-7% and pH 4.4–9.6. NS(5), SS(3) and
BP(8) isolates were Lactobacillus plantarum 1 (99.9% ID), L. Pentosus (99.9% ID),
and Pediococcus pentosaceus 1 (99.9% ID). Otherwise BP(25) and NS(6) isolate
were not probiotic candidate because they were not able to survive at gastric,
intestinal pH and bile salts (oxgal) condition.
Keywords: bekasam, lactic acid bacteria (LAB), probiotic

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

SELEKSI DAN KARAKTERISASI BAKTERI ASAM LAKTAT
ASAL BEKASAM SEBAGAI PROBIOTIK

ASTRI NURNAAFI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Teknologi Hasil Perairan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisis Pada Ujian Tesis: Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi

Judul Tesis : Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam
sebagai Probiotik
Nama
: Astri Nurnaafi
NIM
: C351120141

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS
Ketua

Dr Desniar, SPi MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Teknologi Hasil Perairan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Wini Trilaksani, MSc

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 4 Februari 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya kepada penulis sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan
dengan tema “Seleksi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam
sebagai Probiotik” dalam memperoleh gelar Master pada Program Teknologi Hasil
Perairan Sekolah Pascasarjana IPB Bogor.
Penulisan tesis ini penulis banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak,
baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, perkenankan penulis
menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang tidak terhingga kepada:
1

Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS selaku ketua komisi pembimbing dan Dr Desniar,
SPi MSi sebagai anggota komisi pembimbing yang telah membimbing penulis
dengan penuh kesabaran dan telah memberikan bantuan dana penelitian
melalui proyek program penelitian unggulan perguruan tinggi 2014 DIKTI.
2 Dr Tati Nurhayati, SPi MSi selaku wakil program studi sebagai gugus
pengendali mutu (GKM) yang telah meluangkan waktunya untuk memberikan
kritik dan saran kepada penulis.
3 Dr Kustiariyah Tarman, SPi MSi selaku dosen penguji yang telah meluangkan
waktunya untuk menguji dan memberikan masukan kepada penulis.
4 Dr Ir Wini Trilaksani, MSc selaku ketua Program Studi Teknologi Hasil
Perairan yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menempuh

pendidikan master.
5 Muh. Adam Saleh dan Hj. Nurwiah N orang tua penulis yang tak henti-hentinya
mendo’akan, memberikan dukungan dan kasih sayangnya kepada penulis.
6 Robin Bahari, SPi MSi suami tercinta yang telah banyak memberikan bantuan,
dukungan dan kasih sayang, serta putriku Alifah Fauzya Bahari dan calon
adiknya yang menjadi semangat dan pelita hati penulis.
7 Prof Okky S Dharmaputra selaku kepala bagian Laboratorium Mikologi
Departemen Biologi yang telah mengizinkan penulis menggunakan alat
laboratorium, Mas Sepri, Mas Aldi laboran IPBCC dan Ivan Permana, MSi
yang telah banyak membantu penulis selama penelitian.
8 Aisyah Saridu SPi, Annisa Saskia, Titin, Tika dan Ahadiyah adik-adik S1 THP
dan Biologi yang telah banyak memberikan bantuan.
9 Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu
penulis dalam hal apapun selama penulis kuliah di Bogor, terima kasih semoga
Allah SWT membalas kebaikan kalian semua.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan keterbatasan dalam
penyelesaian tulisan ini. Oleh karena itu sangat diharapkan kritik dan saran untuk
penyempurnaan tesis ini. Semoga tesis ini dapat bermanfaat untuk Indonesia dan
bagi yang membacanya.
Bogor, Mei 2016

Astri Nurnaafi

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vii
DAFTAR GAMBAR
vii
DAFTAR LAMPIRAN
vii
1 PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Perumusan Masalah
2
Tujuan Penelitian
3
Manfaat Penelitian
3
Ruang Lingkup Penelitian

3
2 METODE
4
Waktu dan Tempat
4
Bahan dan Alat
4
Prosedur Penelitian
4
Seleksi BAL yang Berpotensi sebagai Probiotik
5
Ketahanan hidup isolat BAL pada pH lambung (pH 2.0) dan pH usus
(pH 7.2)
5
Pengujian ketahanan terhadap garam empedu
6
Pengujian aktivitas antibakteri
6
Pengujian penempelan BAL pada usus tikus secara in vitro
6
Karakterisasi dan Identifikasi Isolat BAL Probiotik
7
Karakterisasi isolat BAL
7
Pewarnaan Gram
7
Pewarnaan spora
8
Uji motilitas
8
Uji katalase
8
Uji tipe fermentasi
8
Uji aktivitas amilolitik
8
Uji aktivitas lipolitik
8
Pertumbuhan BAL pada suhu, pH dan kadar NaCl yang berbeda
8
Identifikasi isolat BAL terpilih
9
Analisis Data
9
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
9
Bakteri Asam Laktat yang Berpotensi sebagai Probiotik
10
Ketahanan BAL pada pH Lambung (pH 2.0) dan pH Usus (pH 7.2)
10
Ketahanan BAL pada Garam Empedu
12
Aktivitas Antibakteri
14
Penempelan BAL pada Usus Tikus Secara in Vitro
15
Karakteristik dan Identifikasi Isolat BAL Probiotik
20
5 SIMPULAN DAN SARAN
25
Simpulan
25
Saran
25
DAFTAR PUSTAKA
25
LAMPIRAN
31
RIWAYAT HIDUP
37

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6

Ketahan hidup isolat BAL pada pH lambung dan pH usus
Ketahanan hidup BAL pada garam empedu
Aktivitas antibakteri isolat BAL NS(5), SS(3) dan BP(8)
Penempelan BAL pada usus tikus secara in vitro
Karakteristik isolat NS(5), SS(3) dan BP (8)
Hasil fermentasi gula isolat BAL asal bekasam

10
12
14
16
21
24

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4

Roadmap penelitian bakteri probiotik asal bekasam
Diagram alir tahapan penelitian
Penurunan populasi BAL pada pH lambung dan pH usus
Penempelan
isolat
BAL
pada
permukan
ileum
isolat A. NS(5), B. SS(3) dan C. BP(8)
5 Bentuk Isolat BAL: A. NS(5), SS(3) dan BP(8)

3
5
11
tikus
19
20

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Persetujuan perlakuan atas etik penggunaan tikus percobaan
Studi awal pengenalan ileum tikus
Pengujian penempelan BAL pada usus tikus secara in vitro
Hasil fermentasi gula isolat BAL menggunakan API KIT 50 CHL

33
34
34
35

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia memiliki banyak produk tradisional fermentasi ikan. Proses
fermentasi yang dilakukan umumnya untuk memperpanjang masa simpan karena
sifat ikan yang cepat busuk. Salah satu produk tradisional fermentasi ikan adalah
bekasam yang difermentasi dengan penambahan garam dan sumber karbohidrat
dalam kondisi anaerob.
Bekasam yang dihasilkan memiliki karakteristik bentuk ikan seperti ikan
segar namun daging ikan lebih kenyal, rasa asam, asin dan aroma yang khas.
Bekasam mirip dengan beberapa produk fermentasi ikan yang dijumpai di beberapa
negara lainnya antara lain burong isda, burong bangus (Philipina), pla-ra,
pla-chom, som-fak (Thailand), heshiko dan nakazuke (Jepang) (Wikandari et al.
2012). Bekasam pada awalnya diolah oleh penduduk yang bermukim di Muara
Sungai Bengawan Solo dan Surabaya, kemudian menyebar ke Jawa Tengah,
Sumatera Selatan dan Kalimantan Tengah (Irianto dan Giyatmi 2009).
Penggaraman dalam pembuatan bekasam membantu menyeleksi populasi
bakteri penyebab pembusuk dan mencegah pembusukan. Bakteri yang dominan
terdapat dalam produk fermentasi ikan adalah bakteri asam laktat (BAL)
(Ostergaard et al. 1998). Desniar et al. (2011) menyatakan bahwa dalam bekasam
mengandung banyak BAL yang menghasilkan senyawa organik yang berfungsi
memperpanjang masa simpan bekasam.
Bakteri asam laktat merupakan bakteri Gram-positif penghasil asam laktat
yang memiliki banyak manfaat bagi kesehatan manusia. Chandra et al. (2007)
melaporkan bahwa BAL yang berkembang dalam produk fermentasi menghambat
pertumbuhan mikroorganisme alam yang bersifat patogen. Bakteri tersebut juga
memiliki sifat fungsional yang menguntungkan bagi kesehatan manusia yaitu
sebagai probiotik. Collado et al. (2007) melaporkan bahwa probiotik yang biasa
digunakan pada produk pangan adalah bakteri asam laktat (BAL) terutama galur
Lactobacillus, Bifidobacterium, dan beberapa dari Propionibacterium.
Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup yang bila dikonsumsi
dalam jumlah cukup, mampu memberikan manfaat kesehatan bagi inangnya
(FAO/WHO 2006). Furrie et al. (2006) menjelaskan bahwa probiotik adalah
suplemen dari mikroba hidup yang dapat mengganti komposisi dan atau mengganti
aktivitas metabolik mikrobiota alami usus atau mengatur reaktivitas sistem imun
yang bermanfaat bagi kesehatan.
Efek kesehatan probiotik bagi manusia diantaranya (1) menurunkan risiko
lactose intolerance, (2) meningkatkan respon sistem imun, (3) melindungi dari
inflamasi/arthritis, (4) mencegah hipertensi, (5) mencegah kanker (Parvez et al.
2006), (6) mencegah kejadian diare (Lu dan Walker 2001; Arief et al. 2010;
Astawan et al. 2011).
Kesadaran konsumen akan pangan fungsional dan fakta probiotik yang dapat
memberikan manfaat terhadap kesehatan menyebabkan peningkatan permintaan
konsumen terhadap makanan yang mengandung probiotik di seluruh dunia
(Granato et al. 2010; Karthikeyan et al. 2014). Pasar global probiotik dalam bentuk
bahan (bakteri), suplemen dan makanan mencapai $14.9 milyar pada tahun 2007,

2
dengan pertumbuhan tiap tahun sebesar 4.3% (compound annual growth rate
(CAGR)) (Food Processing 2008). Transparancy Market Research (2015)
melaporkan bahwa pertumbuhan pasar probiotik secara global diperkirakan
meningkat sebesar 7.40% dari tahun 2014-2020 berdasarkan CAGR. Pasar global
probiotik mencapai USD 62.6 Milyar pada tahun 2014 dan diperkirakan akan
mencapai USD 96 Milyar pada tahun 2020, didorong oleh naiknya permintaan
konsumen terutama dari Asia dan Eropa.
Seiring peningkatan permintaan konsumen terhadap probiotik mendorong
para peneliti melakukan perluasan sumber BAL. Beberapa penelitian yang telah
dilakukan terkait BAL asal bekasam yaitu starter BAL dalam pembuatan bekasam
(Murtini et al.1997), bakteriosin dari BAL asal bekasam (Desniar et al. 2011b),
bekasam sebagai sumber angiotensin I converting enzyme inhibitor
(Wikandari et al. 2011), parameter kimia dan mikrobiologi serta isolasi BAL pada
bekasam (Desniar et al. 2012a), antimikroba yang dihasilkan oleh BAL asal
bekasam (Desniar et al. 2012b), dan karakteristik BAL pada bekasam
(Wikandari et al. 2012). Desniar et al. (2013) mengisolasi BAL asal bekasam dan
menghasilkan 62 isolat BAL, tiga isolat diantaranya telah diteliti potensinya sebagai
probiotik oleh Syafiqoh (2014), namun baru sebagai kandidat dan masih terdapat
59 jenis isolat yang belum diketahui potensinya sebagai probiotik. Berdasarkan hal
tersebut maka perlu diteliti mengenai BAL probiotik pada produk fermentasi
bekasam guna mendapatkan BAL probiotik dengan karakteristik tertentu.

Perumusan Masalah
Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang umum digunakan sebagai
probiotik, namun tidak semua BAL termasuk bakteri probiotik. Umumnya bakteri
tidak tahan terhadap kondisi pencernaan yang ekstrim dan bakteri harus dapat
berkolonisasi pada bagian usus untuk dapat dikategorikan sebagai probiotik.
Bakteri probiotik memiliki kemampuan dan karakteristik yang berbeda-beda.
Berdasarkan hal tersebut dalam penelitian ini dilakukan pengujian BAL asal
bekasam terhadap kondisi pencernaan, pengujian penempelan pada usus secara in
vitro, karakterisasi dan identifikasi untuk mendapatkan dan mengetahui genus
bakteri probiotik asal bekasam.

Tujuan Penelitian
Tujuan dilaksanakannya penelitian ini adalah :
1 Mendapatkan isolat BAL yang memiliki kemampuan sebagai probiotik
2 Menentukan karakteristik dan jenis BAL probiotik asal bekasam

3
Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi bahwa bakteri asam
laktat asal bekasam dapat dimanfaatkan sebagai probiotik, serta isolat BAL yang
diperoleh dapat diaplikasikan pada bahan pangan sehingga meningkatkan nilai gizi
dan nilai jual produk pangan, serta mengurangi ketergantungan impor bakteri
probiotik.

Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian BAL asal bekasam sebagai probiotik belum pernah dilakukan.
Kajian yang dilakukan pada penelitian ini meliputi seleksi isolat BAL asal bekasam
(BP(25), NS(5), SS(3), BP(8) dan NS(6)) yang memiliki kemampuan sebagai
probiotik. Bakteri asam laktat yang terseleksi sebagai probiotik selanjutnya
dikarakterisasi dan diidentifikasi. Roadmap penelitian bakteri probiotik asal
bekasam dapat dilihat pada Gambar 1.
Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
Bekasam

Desniar et al. (2011)
Bakteriosin dari BAL

Wikandari et al. (2011)
Inhibitor ACE dari bekasam

Desniar et al. (2013)
Karakteristik & antimikroba
dari BAL

Desniar et al. (2012)
Parameter kimia, mikrobiologi &
antimikroba dari BAL

62 Isolat BAL

3 isolat (SK(5), BP(10) dan NS(9))
telah terdeteksi sebagai kandidat
probiotik (Syafiqoh 2014)

Masih terdapat 59 isolat
yang belum diketahui
potensinya sebagai
PROBIOTIK

Penelitian yang dilakukan untuk tesis
Isolat BAL asal bekasam
(BP(25), NS(5), SS(3),
BP(8) & NS(6))

- Seleksi bakteri probiotik
- Karakterisasi dan identifikasi

Gambar 1 Roadmap penelitian bakteri probiotik asal bekasam

4

2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2014 sampai Juli 2015,
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan Departemen Teknologi
Hasil Perairan (THP) Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian
Bogor (IPB), Laboratorium Mikologi Departemen Biologi IPB, Rumah Sakit
Hewan IPB dan Laboratorium Histopatologi Departemen Klinik Reproduksi dan
Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.

Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan meliputi isolat BAL BP(25), NS(5), SS(3),
BP(8) dan NS(6) koleksi Desniar et al. (2013) yang diisolasi dari bekasam asal
pengolah lokal di Indralaya Kabupaten Ogan Ilir dan Desa Sungai Pasir, Kabupaten
Ogan Komiring Ilir. Sumatra Selatan.
Bahan yang digunakan untuk pengujian BAL yaitu Escherichia coli,
Salmonella typhimurium ATCC 14028, phosphate buffer saline (PBS) (Oxoid,
England), HCl 0.1 N, NaOH 0.1 N (Merck, Germany), buffer pepton water (BPW)
(Oxoid, England), de man rogosa sharp broth (MRSB) (Oxoid, England), de man
rogosa sharp agar (MRSA) (Oxoid, England), oxgal (Merck, Germany), mueller
hinton agar (MHA) (Oxoid, England), nutrient agar (NA) (Difco, USA), nutrient
broth (NB) (Difco, USA), CaCO3 1 %, alkohol, kristal violet, lugol, safranin,
minyak imersi, malachite, H2O2 3 %, spirtus, lemak nabati (mentega) 1% dan
indikator neutral red.
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih konvensional
(Rattus norvegicus) jenis Sprague Dawley berumur enam minggu berjenis kelamin
jantan sebanyak 6 ekor dengan kisaran bobot 100-120 g per ekor yang diperoleh
dari Biofarmaka IPB Bogor.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat-alat gelas, pH
meter (Eutech, Singapore), mikro pipet (Gilson, France), jarum ose, inkubator
(Yamato, Japan), sentrifus (Jouan, France), autoklaf (Yamato SM 52 Autoclave),
spektrofotometer (Hitachi u-2800, Japan), wadah inkubasi kedap udara, laminaran,
cling wrap, vortex (Velp scientifica, Europe), refrigerator, aluminium foil, plastik
tahan panas, API 50 CHL, software API system (Bio-Mereux, France), timbangan
analitik, penggaris, lilin dan korek api.

Prosedur Penelitian
Penelitian ini dilakukan dua tahap yaitu : (1) Seleksi sifat probiotik BAL asal
bekasam yang meliputi pengujian ketahanan pada pH 2.0 dan 7.2, pengujian
ketahanan pada garam empedu (0.5% oxgal), pengujian aktivitas antibakteri dan uji
penempelan BAL pada usus tikus secara in vitro. (2) Karakterisasi dan identifikasi
BAL asal bekasam yang berpotensi sebagai probiotik, tahap ini meliputi ; morfologi
koloni (bentuk dan warna), morfologi sel (bentuk sel, pewarnaan Gram dan spora),

5
pengamatan sifat fisiologis meliputi motilitas, katalase, oksidase, uji tipe fermentasi,
amilolitik, lipolitik, pengamatan kondisi pertumbuhan pada suhu, NaCl dan pH
yang berbeda dan identifikasi (API 50 CHL). Diagram alir tahapan penelitian dapat
dilihat pada Gambar 2.

Isolat BAL
Tahap I. Seleksi BAL probiotik
1 Uji ketahanan pada pH 2.0 dan 7.2
2 Uji ketahanan terhadap garam empedu
3 Uji aktivitas antibakteri
4 Uji penempelan pada usus tikus
(uji in vitro dan histopat)

Isolat BAL probiotik

Tahap II. Karakterisasi dan identifikasi
1 Karakterisasi (morfologi sel, koloni,
fisiologi dan pertumbuhan)
2 Identifikasi (API 50 CHL)

BAL probiotik
teridentifikasi
Gambar 2 Diagram alir tahapan penelitian
Seleksi BAL yang Berpotensi sebagai Probiotik
Ketahanan hidup isolat BAL pada pH lambung (pH 2.0) dan pH usus (pH 7.2)
(Lin et al. 2006)
Ketahanan terhadap tingkat keasaman yang tinggi merupakan sifat yang
pertama yang harus dipenuhi sebagai probiotik pada saat akan melakukan seleksi
isolat probiotik (Tuomola et al. 2001).
Satu mL kultur BAL umur 24 jam dicampurkan ke dalam 9 mL phosphate
buffer saline (PBS) steril pH 2.0 dan pH 7.2 dan diinkubasi (Yamato, Japan) pada
suhu 37°C selama tiga jam. Bakteri asam laktat yang tumbuh dihitung dengan
pengenceran pada buffer pepton water (BPW) dan media pemupukan pada media
man rogosa sharpe agar (MRSA) dalam kondisi anaerobik pada suhu 37°C selama
48 jam. Populasi awal BAL umur 24 jam juga dihitung. Ketahanan terhadap pH
rendah dihitung berdasarkan perbandingan populasi BAL yang tumbuh pada pH
perlakuan dengan populasi awal. Percobaan ini dilakukan dengan dua kali ulangan
secara duplo.

6
Pengujian ketahanan terhadap garam empedu (Modifikasi Argyri et al. 2013)
Satu mL kultur BAL umur 24 jam dimasukkan ke dalam 9 mL media
man rogosa sharpe broth (MRSB) yang mengandung 0.5% garam empedu (oxgal)
dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 4 jam. Populasi awal BAL dihitung
sebelum diinokulasikan ke media MRSB dengan 0.5 % garam empedu. Jumlah
BAL dihitung pada media MRSA dengan metode tuang dan diinkubasi pada kondisi
anaerobik pada suhu 37°C selama 48 jam. Nilai ketahanan hidup ditunjukkan
dengan persentase populasi yang tumbuh pada media garam empedu 0.5%
dibandingkan dengan populasi awal. Percobaan ini dilakukan dengan dua kali
ulangan secara duplo.
Pengujian aktivitas antibakteri (Modifikasi Savadogo et al. 2004)
Isolat BAL diinokulasikan ke dalam MRSB dan diinkubasikan pada suhu
37°C selama 20 jam. Supernatan bebas sel dipanen melalui sentrifugasi
(Jouan, France) 10 000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Supernatan bebas sel
diuji aktivitas antimikrobanya menggunakan metode difusi agar. Bakteri uji yang
digunakan, yaitu Salmonella typhimurium ATCC 14028 dan Escherichia coli. Dua
ose bakteri uji diinokulasikan ke dalam tabung berisi media nutrient broth (NB) dan
diinkubasi selama 24 jam. Kultur bakteri uji diukur kekeruhannya hingga mencapai
OD 0.5-0.8. Bakteri uji dimasukkan ke dalam media MHA steril sebanyak 20 μL
dan dibekukan dalam cawan petri. Dua puluh μL supernatan BAL dimasukkan ke
dalam sumur yang telah dibuat pada media dalam cawan petri. Seluruh cawan
diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Zona hambat yang terbentuk di sekitar
sumur diamati dan diukur diameternya dengan memakai penggaris. Percobaan ini
dilakukan sebanyak dua kali ulangan secara duplo.
Pengujian penempelan BAL pada usus tikus secara in vitro (Modifikasi Kos et
al. 2003 dan Anggraeni 2010)
Setelah bakteri dapat melewati kondisi lambung dan usus yang ekstrim,
bakteri harus dapat berkolonisasi pada bagian usus untuk dapat dikategorikan
sebagai probiotik (FHO/WHO 2002).
Penelitian ini telah mendapat persetujuan atas perlakuan etik terhadap hewan
percobaan dari Rumah Sakit Hewan IPB (Lampiran 1). Hewan percobaan yang
digunakan adalah tikus putih konvensional (Rattus norvegicus) jenis Sprague
Dawley berumur enam minggu berjenis kelamin jantan sebanyak 6 ekor dengan
kisaran bobot 100-120 g per ekor yang diperoleh dari Biofarmaka IPB Bogor. Studi
awal pengenalan bagian usus halus tikus dilakukan untuk mengetahui bagian ileum
usus yang akan digunakan dalam percobaan (Lampiran 2).
1) Pemeliharaan tikus
Tikus dipelihara dalam kandang individu dan diadaptasikan selama 10 hari
dengan pemberian ransum standar. Tikus dianestesi lalu dibedah untuk
memperoleh organ usus halus sebagai sampel pengujian penempelan bakteri asam
laktat (Lampiran 3).
2) Persiapan suspensi BAL (Nitisinprasert et al. 2006)
Isolat BAL ditumbuhkan 24 jam dalam media MRSB, kemudian kultur
bakteri dipanen dengan cara disentrifugasi pada 5 000 g selama 15 menit. Endapan
yang diperoleh dicuci dengan larutan PBS kemudian disuspensikan ke dalam
larutan PBS sampai mencapai minimal 9 log cfu/mL.

7
3) Uji penempelan BAL pada usus tikus
Usus halus (Ileum) dipotong dengan ukuran ± 1 cm2. Sampel dicuci tiga kali
lalu direndam dalam larutan PBS pada suhu 4oC selama 30 menit. Sampel usus
diinkubasi ke dalam cawan petri yang berisi 10 mL larutan suspensi bakteri
(9 log cfu/mL) dalam PBS pada suhu 37 oC selama 60 menit kemudian dibilas
dengan PBS sebanyak dua kali. Kontrol dipersiapkan, yaitu usus tidak diinkubasi
dengan suspensi BAL. Penghitungan populasi BAL yang menempel pada
permukaan usus dengan metode tuang menggunakan media MRSA dengan 0.5%
CaCO3. Jumlah BAL yang menempel pada permukaan usus dihitung dengan cara
menghitung selisih populasi BAL yang menempel pada permukaan usus pada
perlakuan inkubasi dengan suspensi BAL indigenus dibandingkan populasi BAL
pada kontrol. Percobaan ini dilakukan secara duplo dan dua kali ulangan.
4) Pembuatan preparat histologis usus (Analisis histologis) (Suntoro 1983)
Pembuatan preparat histologis untuk membuktikan masing-masing isolat
bakteri asam laktat yang dapat bertahan di jaringan usus halus dengan melihat
kemampuan sifat penempelan bakteri asam laktat.
Kemampuan penempelan BAL pada mukosa usus halus dilakukan dengan
analisa histologis. Semua sampel ileum ukuran 1 cm2 untuk evaluasi histologis
difiksasi dalam paraformaldehid 4%. Sampel kemudian didehidrasi dengan larutan
alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut I, II, III, kemudian dijernihkan
dengan larutan xylol I, II, III, selanjutnya sampel diinfiltrasi dengan parafin I, II,
III dan diblok dengan parafin. Proses selanjutnya blok dipotong dengan ketebalan
4-5 Sm menggunakan mikrotom dan diwarnai dengan pewarnaan HematoxylinEosin (HE) dan siap dievaluasi.
Karakterisasi dan Identifikasi Isolat BAL Probiotik
Karakterisasi isolat BAL
Karakterisasi isolat BAL terpilih meliputi morfologi koloni dan morfologi
sel yang terdiri dari bentuk sel, pewarnaan Gram dan spora, pengamatan sifat
fisiologis meliputi motilitas, katalase, uji tipe fermentasi, amilolitik, lipolitik, serta
pengamatan pertumbuhan pada suhu, pH dan kadar NaCl yang berbeda.
1) Pewarnaan Gram (Waluyo 2010)
Bakteri terlebih dahulu difiksasi dengan cara sebagai berikut: 1 ose isolat
bakteri disebarkan tipis dan merata diatas kaca objek dan dipanaskan pada api kecil
secara tidak langsung (fiksasi) kemudian diangin-anginkan di udara hingga kering
dan membentuk lapisan kultur yang kering dan merata.
Pewarnaan Gram dilakukan dengan cara meneteskan pewarna kristal violet
secara merata di atas kultur pada kaca objek dan didiamkan selama 1 menit,
membilas dengan air mengalir kecil secara hati-hati. Sisa air diserap dengan
menggunakan kertas hisap. Larutan lugol diteteskan pada sampel dan didiamkan
selama 1 menit dan dibilas dengan alkohol dan aquades lalu dikeringkan. Sampel
diteteskan larutan safranin dan didiamkan selama 10 detik dan dibilas dengan air
mengalir dengan cepat, kemudian dikeringkan dengan tissue. Pengamatan
dilakukan dengan mikroskop menggunakan lensa objektif (100 x). Bakteri
Gram-positif berwarna ungu sedangkan bakteri Gram-negatif berwarna merah.

8
2) Pewarnaan spora (Waluyo 2010)
Bakteri digoreskan pada gelas objek yang bersih dan difiksasi. Sampel
diteteskan malachite green dan dipanaskan di atas bunsen tetapi tidak sampai
mendidih atau mengering. Setiap kali pewarna menjadi kering meneteskan lagi
pewarna baru lalu dibilas dengan air selama beberapa detik dan dikeringkan dengan
menggunakan kertas tissue. Sampel diteteskan larutan safranin selama 30 detik dan
dibilas dengan air mengalir/kran dengan cepat, lalu dikeringkan dengan kertas
tissue. Hasil pewarnaan diamati, spora bakteri akan terlihat berwarna hijau
sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah.
3) Uji motilitas (Tiwari et al. 2009)
Bakteri diinokulasikan secara vertikal pada media sulfide indol motility
(SIM) dan di inkubasi selama 24 jam. Moltilitas bakteri ditunjukkan dengan adanya
pertumbuhan pada permukaan medium dan tidak ada bekas pada tusukan. Bakteri
non motil tumbuh sepanjang tusukan.
4) Uji katalase (Fardiaz 1989)
Satu ose isolat diambil dari media pertumbuhan MRSA dan diletakkan pada
gelas obyek yang bersih. Sampel diteteskan pereaksi H2O2 3% serta dibiarkan
beberapa saat. Uji positif ditandai dengan terbentuknya gelembung. Hasil uji
negatif menunjukkan ciri bakteri probiotik.
5) Uji tipe fermentasi (Suryani et al. 2010)
Pengujian tipe fermentasi dilakukan dengan uji produksi gas. Kultur isolat
dimasukkan ke dalam media MRSB dalam tabung reaksi yang diberi tabung
durham dalam keadaan terbalik untuk menangkap gas yang dihasilkan oleh BAL
selama dalam pertumbuhannya. Inkubasi selama 2-3 hari pada suhu 30oC. Bakteri
asam laktat tersebut dinyatakan sebagai heterofermentasi, sedangkan isolat yang
tidak menghasilkan atau memproduksi gas disebut homofermentatif.
6) Uji aktivitas amilolitik (Fardiaz 1989)
Bakteri asam laktat yang telah ditumbuhkan pada media miring MRSA
selama 24 jam diambil menggunakan jarum tanam lalu dititikkan ke dalam media
NA yang mengandung 1% pati tapioka, dan diinkubasi selama 24 jam. Zona bening
yang terbentuk diamati dengan menambahkan larutan iodin pada koloni bakteri.
7) Uji aktivitas lipolitik (Fardiaz 1989)
Bakteri asam laktat yang telah ditumbuhkan pada media miring MRSA
selama 24 jam diambil menggunakan jarum tanam lalu dititikkan ke dalam media
NA yang mengandung 1% lemak nabati (mentega) dan indikator neutral red
sebagai substrat. Inkubasi dilakukan selama 24 jam.
Koloni yang dapat menghidrolisa lemak menjadi gliserol dan asam lemak
menyebabkan penurunan pH medium sehingga menyebabkan terbentuknya warna
merah pada bagian bawah koloni. Indikator neutral red akan tetap berwarna kuning
jika lemak di dalam medium tidak dihidrolisa sehingga pH tetap mendekati netral.
8) Pertumbuhan BAL pada suhu, pH dan kadar NaCl yang berbeda (Tanasupawat
et al. 1998)
Isolat BAL diinokulasikan ke dalam MRSB dan diinkubasikan pada suhu
37°C selama 18-20 jam. Kultur BAL sebanyak 1 mL diinokulasikan ke dalam 9 mL
MRSB. Media pengujian pertumbuhan pada pH yang berbeda menggunakan
MRSB dengan nilai pH 2, 4.4, 6.8 dan 9.6. Media pengujian pertumbuhan BAL
pada kadar NaCl berbeda menggunakan MRSB yang telah di tambah NaCl 2%, 4%,
7%, 10% dan 15%. Sampel diinkubasi selama 18-20 jam. Inkubasi pada suhu 10oC,

9
30oC, 37oC dan 45oC untuk pengujian pertumbuhan pada suhu yang berbeda.
Inkubasi pada suhu 37°C untuk pengujian pertumbuhan pada pH dan kadar NaCl.
OD diukur pada panjang gelombang 660 nm.
Identifikasi isolat BAL terpilih
Identifikasi dilakukan dengan menggunakan API 50 CHL. Kultur BAL
digores pada media MRSA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Kultur
BAL dipanen dan dimasukkan ke dalam media API 50 CHL dan dihomogenkan
dengan vortex. Penyiapan kit dilakukan dengan memasukkan air steril pada sumur
kit dengan menggunakan mikropipet untuk mengkondisikan suasana tetap lembab.
Memasukkan strips pada kit dengan urutan strip biru diletakkan pada baris pertama
dan kedua pada kit, strips hijau baris ketiga dan keempat dan strips merah
diletakkan pada baris terakhir pada kit. Media API 50 CHL yang telah
dihomogenkan dengan BAL dimasukkan kedalam sumuran strips dengan
mikropipet, menutup sumuran strips dengan mineral oil untuk memberikan
lingkungan anaerob dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC. Parameter uji
adalah perubahan warna setelah diinkubasi selama 24 jam. Hasil pengamatan diolah
menggunakan software ApiwebTM.

Analisis Data
Data kuantitatif yang diperoleh dari hasil pengujian disajikan dalam bentuk
rata-rata dan standar deviasi. Data-data kualitatif diolah dengan melihat ada atau
tidaknya suatu komponen dalam sampel. Data yang telah diolah selanjutnya
dianalisis secara deskriptif.

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat probiotik harus dapat melewati kondisi ekstrim dengan keasaman
yang tinggi di lambung serta mampu bertahan pada kondisi garam empedu di
saluran pencernaan. Ketahanan terhadap tingkat keasaman yang tinggi merupakan
sifat yang pertama yang harus dipenuhi sebagai probiotik pada saat akan melakukan
seleksi isolat probiotik (Tuomola et al. 2001). Probiotik juga harus mampu
menempel pada sel epitel usus, mampu membentuk kolonisasi pada saluran
pencernaan, mampu menghasilkan zat antimikroba dan memberikan pengaruh yang
menguntungkan inangnya. Syarat lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman
jika dikonsumsi (Prado et al. 2008).
Isolat BAL asal bekasam yang telah diisolasi oleh Desniar et al. (2013)
sebanyak 62 isolat, 23 isolat diantaranya diketahui memiliki kemampuan
menghambat lima jenis bakteri patogen (Escherichia coli, Salmonella typhimurium
ATCC 14028, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Listeria monocytogenes)
dan 3 isolat telah diketahui potensinya sebagai kandidat probiotik. Dua puluh isolat
BAL yang belum diteliti potensinya sebagai probiotik, dipilih isolat yang belum
pernah dipakai pada penelitian lain. Duabelas isolat yang ditumbuhkan pada media
MRSA dipilih isolat yang memiliki pertumbuhan bagus yaitu koloni tumbuh baik

10
dan tidak terkontaminasi, maka diperoleh 5 isolat yang diteliti potensinya sebagai
probiotik yaitu BP(25), NS(5), SS(3), NS(6) dan BP(8).

Bakteri Asam Laktat yang Berpotensi sebagai Probiotik
Ketahanan BAL pada pH Lambung (pH 2.0) dan pH Usus (pH 7.2)
Faktor utama penentu ketahanan bakteri melewati lambung sampai dengan
usus halus adalah pH lambung. Makanan yang masuk berperan sebagai bufer dan
merupakan tekanan awal BAL masuk ke dalam tubuh manusia adalah terpapar asam
lambung, dengan tingkat pH yang sangat rendah yaitu sekitar 2.0 pada kondisi
lambung kosong dan sekitar 3.0 pada kondisi lambung berisi (Minellia et al. 2004).
Hasil pengujian ketahanan BAL asal bekasam pada pH lambung (pH 2.0) dan pH
usus (pH 7.2) dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Ketahanan hidup isolat BAL asal bekasam pada pH lambung (pH 2.0) dan
pH usus (pH 7.2)
Kode
Isolat
BP(25)
NS(5)
SS(3)
BP(8)
NS(6)

Populasi
awal
(log cfu/mL)
7.42
9.84
7.08
8.87
8.41

pH 2.0
Populasi
akhir
(log cfu/mL)
8.90
6.72
7.75
7.36

Ketahanan
hidup (%)
90.49±1.43
94.95±0.44
87.36±1.01
87.55±1.92

pH 7.2
Populasi
akhir
(log cfu/mL)
8.75
6.70
7.82
7.12

Ketahanan
hidup (%)
88.99±2.06
94.68±1.63
88.14±0.11
84.67±0.71

Keterangan: - = jumlah koloni 3-6 mm berarti aktivitas antimikroba sedang dan diameter zona hambat
>6 mm menunjukkan aktivitas antimikroba tinggi. Diameter zona hambat yang
dihasilkan oleh isolat NS(5), SS(3) dan BP(8) adalah >6 mm sehingga dapat
dikatakan memiliki aktivitas antimikroba yang tinggi, kecuali SS(3) zona hambat
terhadap bakteri E. coli sebesar 5.5 mm sehingga termasuk kategori aktivitas
antimikroba sedang.

15
Aktivitas antibakteri setiap isolat BAL berbeda terhadap bakteri patogen
disebabkan oleh komponen antibakteri yang dihasilkan