Identifikasi Enzim Dengan Aktivitas Karbon-Sulfur Liase Pada Bifidobacterium Longum

IDENTIFIKASI ENZIM DENGAN AKTIVITAS KARBONSULFUR LIASE PADA Bifidobacterium longum

RIZFI FARIZ PARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi Enzim dengan
Aktivitas Karbon-Sulfur Liase pada Bifidobacterium longum adalah benar karya
saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk
apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau
dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah
disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis
ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2016

Rizfi Fariz Pari
NIM P051140031

RINGKASAN
RIZFI FARIZ PARI. Identifikasi Enzim dengan Aktivitas Karbon-Sulfur Liase
pada Bifidobacterium longum. Dibimbing oleh DJUMALI MANGUNWIDJAJA
dan PRAYOGA SURYADARMA.
Bifidobakteria merupakan bakteri anaerob Gram positif yang hidup dalam
usus besar manusia sejak bayi. Pertumbuhan bakteri ini terbukti mendukung
kesehatan manusia. Informasi mengenai interaksi bifidobakteria dengan usus besar
manusia masih terbatas terutama mengenai metabolisme asam amino yang
mengandung sulfur sebagai bagian terpenting dari bakteri usus. Rendahnya
efisiensi transformasi dan lambatnya pertumbuhan bakteri inilah yang
menyebabkan perkembangan informasi metabolismenya terhambat.
Bifidobacterium longum 105-A memiliki efisiensi transformasi tertinggi
dibandingkan bifidobakteria lainnya, sekitar 104 sampai 106 transforman untuk
setiap µg DNA. B. longum 105-A juga memiliki pertumbuhan yang cukup cepat,
OD600nm 1 setelah 12 jam. Kunci dari metabolisme asam amino sulfur adalah jalur

transsulfurasi, dengan enzim karbon-sulfur (C-S) liase yang berperan untuk
menentukan arah jalur ini, sehingga analisa terhadap C-S liase dilakukan.
Target enzim C-S liase dipilih dengan metode BLAST. BL105A_1451 dan
BL105A_1761 terpilih sebagai target. Pengambilan gen target dilakukan dengan
metode PCR menggunakan primer spesifik. Gen target disisipkan kedalam pET15b dan ditransformasikan kedalam E. coli DH5α sebagai vektor kloning dan E.
coli BL21 sebagai vektor ekspresi. Transformasi dan ekspresi kedua protein pada
E. coli berhasil dilakukan yang dibuktikan pada elektroforesis gel agarose dan gel
poliakrilamid sodium dodecyl sulfat (SDS-PAGE).
Aktivitas C-S liase yang terukur dengan metode 5,5-dithio-bis-(2nitrobenzoic acid) (DTNB) pada substrat sistationin, menunjukkan hanya ekstrak
bebas sel dari E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 yang beraktivitas sebagai C-S
liase. Aktivitas enzim ini sangat tinggi, melebihi aktivitas ekstrak bebas sel E. coli
BL21/pET-15b dan E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1761. Aktivitas enzim yang
tinggi juga ditunjukkan pada substrat L-sistin. Hasil ini menunjukkan
BL105A_1451 yang mengekspresikan putative aminotransferase mengenali gugus
L-sisteina pada substrat sistationin dan L-sistin, sehingga enzim ini juga dapat
bekerja sebagai sisteina desulfidrase. Enzim putative aminotransferase bekerja
sebagai sistationin -liase pada substrat sistationin, sehingga kemungkinan
terekspresi pada kodisi L-sisteina sebagai sumber sulfur tunggal.
Untuk membuktikan ekspresi C-S liase, dilakukan kultivasi pada B. longum
105-A di bifidobacterial minimal media (BMM) tanpa L-sisteina dan BMM dengan

L-sisteina. Hasilnya menunjukkan B. longum 105-A tidak mampu tumbuh tanpa Lsisteina, namun tumbuh baik dengan L-sisteina sebagai sumber sulfurnya. Ekstrak
bebas sel dari B. longum 105-A yang ditumbuhkan pada media BMM dengan Lsisteina menunjukkan aktivitas C-S liase terhadap sistationin. Hal ini membuktikan
kesamaan aktivitas antara ekstrak bebas sel E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451
dengan B. longum 105-A. Hasil-hasil ini membuktikan bahwa C-S liase
diekspresikan dalam kondisi L-sisteina sebagai sumber sulfur pada B. longum 105A
Kata kunci: B. longum 105-A, jalur transsulfurasi, aktivitas C-S liase.

SUMMARY
RIZFI FARIZ PARI. Identification of Enzyme Having Carbon-Sulfur Lyase
Activity
in
Bifidobacterium
longum.
Supervised
by
DJUMALI
MANGUNWIDJAJA and PRAYOGA SURYADARMA
Bifidobacteria is an anaerobic Gram-positive bacteria which live in human
gut since newborn. The growth of this bacteria exert human health. However, the
information about interaction between bifidobacteria and gut was still unclear,

especially the amino acid containing sulfur metabolism. Low of transformation
efficiency and slow bacterial growth were hinder the development of metabolism
knowledge.
Bifidobacterium longum 105-A represent the highest transformation
efficiency among other bifidobacteria, about 104 to 106 transformant per µg DNA.
B. longum 105-A shows high bacterial growth, OD600nm 1 after 12 hours cultivation.
Transsulfuration pathway was the key of amino acid containing sulfur metabolism
and Carbon-Sulfur (C-S) lyase play the main role to determine the pathway
direction, so anayzing C-S lyase will be done here.
The target enzyme with C-S lyase activity was chosen based on BLAST.
BL105A_1451 and BL105A_1761 were selected as the target. The genes were taken
by PCR using specific primers. Each of the genes were inserted into pET-15b and
were transformed to E. coli DH5α as cloning vector and E. coli BL21 as expression
vector. Transformation and expression of the gene in E. coli were successfully done
proven in agarose gel electrophoresis and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide
gel electrophoresis (SDS-PAGE).
C-S lyase activity measured by 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)
method in cystathionine as substrate indicates that only cell-free extract of E. coli
BL21/pET-15b/BL105A_1451 shows C-S lyase activity. The enzyme activity was
higher than the cell-free extract of E. coli BL21/pET-15b and E. coli BL21/pET15b/BL105A_1761. High of enzyme activity was also shown in L-cystine substrate.

This results indicate that the BL105A_1451 which expressed putative
aminotransferase recognize L-cysteine site in both cystathionine and L-cystine
substrate, so this enzyme also work as cysteine desulfhydrase. Putative
aminotransferase works as cystathionine -lyase in cystathionine substate, so it
might work in L-cysteine as sole sulfur source conditions.
To prove the C-S lyase expression in L-cysteine as sole sulfur source
conditions, B. longum 105-A was growth in bifidobacterial minimal media (BMM)
without L-cysteine and BMM with L-cysteine. B. longum 105-A unable to grew in
media without L-cysteine addition, but it grew well in L-cysteine as sole sulfur
source conditions. The cell-free extract of B. longum 105-A in BMM with Lcysteine shows degradation activity towards cystathionine substrate. This is the
indication of similar activity between cell-free extract of E. coli BL21/pET15b/BL105A_1451 and B. longum 105-A. All of this results were proving that B.
longum 105-A express C-S lyase in L-cysteine as sole sulfur source conditions.
Keywords: B. longum 105-A, transsulfuration pathway, C-S lyase activity

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindung Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutip tersebut tidak merugikan kepentingan IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

IDENTIFIKASI ENZIM DENGAN AKTIVITAS KARBONSULFUR LIASE PADA Bifidobacterium longum

RIZFI FARIZ PARI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada Program Studi
Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof Dr Anja Meryandini, MS

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Subhanahu Wa Ta’ala atas
limpahan rahmat dan segala karunia-Nya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan.
Penelitian dan penulisan tesis dengan judul “Identifikasi Enzim dengan Aktivitas
Karbon-Sulfur Liase pada Bifidobacterium longum” ini dilaksanakan sejak bulan
Oktober 2015 sampai Agustus 2016.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir Djumali
Mangunwidjaja, DEA selaku ketua komisi pembimbing dan Dr. Prayoga
Suryadarma, STp, MT selaku anggota komisi pembimbing yang telah membimbing
dan banyak memberi saran. Terima kasih penulis sampaikan kepada penguji luar
komisi, Prof. Dr. Anja Meryandini, MS, yang telah menguji dan memberi saran. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada program Fostering Frontiers
of Practical Solutions in Population-Activities-Resources-Environments Chain
(program PARE) dan Dr. Masaru Wada dari Laboratorium Fisologi Mikroba,
Hokkaido University, Japan selaku supervisor dalam program PARE yang telah
memfasilitasi penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada
Nanae Matsumoto, Kana Shibano, Tori Sato dan seluruh anggota Laboratorium
Fisiologi Mikroba, Hokkaido University, Japan atas bantuan dan sarannya dalam
penelitian ini. Terima kasih kepada Dr. Fariz Pari, MFils, Dra. Elvy Fitasari, MM
psikolog dan Razaf Pari atas saran dan kritiknya. Kepada Farhanah, Astya

Nilamsari MSi, serta teman-teman Program Studi Bioteknologi, IPB atas doa dan
dukungan moralnya.
Akhir kata, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang
telah membantu dalam penyusunan tesis ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2016
Rizfi Fariz Pari

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis
2 TINJAUAN PUSTAKA
Bifidobacterium longum 105-A
C-S Liase pada Bakteri

3 BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Waktu dan Tempat Penelitian
Prosedur Penelitian
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Kloning Gen
Aktivitas C-S Liase pada Ekstrak Bebas Sel E. coli Rekombinan
Aktivitas Enzim C-S Liase Murni
Spesifisitas Enzim C-S Liase
Aktivitas C-S Liase pada B. longum 105-A
5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

xii
xii
xiii
1

1
2
2
2
3
3
3
6
6
7
7
10
10
14
16
17
19
21
21
21

DAFTAR TABEL
1
2
3

Strain dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini
Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen target yang potensial.
Konsentrasi protein pada ekstrak bebas sel dan enzim murni

7
8
14

DAFTAR GAMBAR
Skema kerja C-S liase pada jalur transsulfurasi (Manders et al. 2013)
Hasil HPLC untuk SBD-sisteina (a); SBD homosistein (b); SBD
sisteamin (c); SBP-glutation (d); dan SBD-N-asetilsisteina (e) pada darah
dan plasma (Toyo’oka & Imai 1λ8γ)
3 Reaksi C-S liase yang mengenali gugus L-sisteina pada substrat
sistationin (a); L-sistin (b) dan L-sisteina (c) (Wada & Takagi 2006)
4 Hasil gradient PCR dengan PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit dari
TAKARA (A) dan KAPATaq EXTRA PCR Kit (B). Lajur 1 sampai 8
menunjukkan hasil PCR pada suhu 520C, 540C, 56,40C, 58,80C, 61,20C,
63,60C, 660C, dan 680C.
5 Hasil elektroforesis proses pembuatan bakteri rekombinan untuk ekspresi
gen BL105A_1451 (A) dan BL105A_1761 (B) dari B. longum 105-A,
yang terdiri atas: perbanyakan gen target dari genom B. longum 105-A
dengan PCR (1); pemotongan pada situs restriksi untuk gen target (2) dan
plasmid pET-15b kosong (3); PCR koloni pada vektor kloning (4);
pembuktian keberhasilan ligasi plasmid dengan isolasi plasmid (5) dan
restriksi plasmid (6); dan PCR koloni pada vektor ekspresi (7).
6 Hasil visualisasi ekspresi protein dengan SDS-PAGE pada ekstrak bebas
sel dari E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1761 (1); ekstrak bebas sel dari
E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 (2); ekstrak bebas sel dari E. coli
BL21/pET-15b (3).
7 Perubahan konsentrasi gugus sulfidril yang terbentuk dari substrat
sistationin (A) dan aktivitas enzim C-S liase (B) dari ekstrak bebas sel E.
coli BL21 rekombinan.
8 Perubahan konsentrasi gugus sulfidril yang terbentuk dari substrat Lsistin (A) dan aktivitas enzim C-S liase (B) dari ekstrak bebas sel E. coli
BL21 rekombinan.
9 Pengukuran dan konfirmasi ekspresi protein (1) putative
aminotransferase murni dan ekstrak bebas sel dari (2) E. coli BL21/pET15b/BL105A_1451.
10 Perubahan konsentrasi gugus sulfidril yang terbentuk dari substrat
sistationin dan L-sistin (A) dan aktivitas enzim C-S liase (B) dari enzim
putative aminotransferase murni.
11 Puncak-puncak yang dihasilkan oleh senyawa standar L-sisteina,
homosistein dan sistationin (A) digunakan sebagai acuan untuk
1
2

4

5
6

11

12

13

15

15

16

17

menentukan hasil reaksi putative aminotransferase terhadap substrat
sistationin (B)
12 Aktivitas ekstrak bebas sel B. longum 105-A dan E. coli rekombinan pada
substrat sistationin dengan metode DTNB
13 Skema jalur metabolisme B. longum 105-A.

18
19
21

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Bifidobacterial Minimal Media (BMM) dan BMM+Cys Media
Media SOC
PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit
KAPATaq EXtra PCR Kit
MinElute PCR Purification Kit
MinElute Reaction Cleanup Kit
Ligation High Ver. 2
QIAprep Spin Miniprep KIT dan Mikrosentrifus
SDS-PAGE Kit
Kurva Standar BSA

27
27
28
28
29
30
31
31
33
33

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Bifidobakteria tergolong sebagai bakteri anaerob Gram-positif yang hidup di
dalam usus besar manusia, sebanyak 90% pada bayi (Fanaro et al. 2003). Dengan
pertumbuhannya yang dapat mendukung kesehatan tubuh, bifidobakteria dikenal
sebagai probiotik (Xiao et al. 2003). Pada orang dewasa, keberadaan bakteri ini
menurun sekitar 30% seiring dengan bertambahnya usia karena berubahnya asupan
makanan (Mueller et al. 2006). Konsumsi bifidobakteria melalui mulut telah
terbukti dapat mengurangi keberadaan Enterotoxigenic Bacteroides fragilis
(ETBF), bakteri yang menyebabkan penyakit diare akut, radang usus dan kanker
kolorektal (Odamaki et al. 2012). Oleh karenanya, menjaga keberadaan
bifidobakteria di dalam tubuh dapat meningkatkan kekebalan tubuh terhadap
bakteri patogen. Nutrisi untuk penunjang hidup bakteri di dalam usus besar terbatas,
karena telah diserap usus halus. Oleh karena itu, mempelajari kemungkinan sumber
nutrisi dan metabolisme dari bifidobakteria dalam bertahan hidup menjadi sangat
penting.
Pengetahuan mengenai perolehan dan metabolisme asam amino oleh
mikrobiota usus masih sangat terbatas, dibandingkan dengan pengetahuan
mengenai metabolisme karbon yang sudah banyak diketahui (Pokusaeva et al.
2011). Terutama metabolisme asam amino yang mengandung sulfur, sebagai nutrisi
penting bagi bakteri usus (Brosnan & Brosnan 2006). Informasi mengenai
metabolisme pemanfaatan sulfur dan pembentukan asam amino yang mengandung
sulfur sebagai penunjang hidup bakteri usus masih belum ditemukan pada
bifidobakteria.
Dalam usus besar, sulfur tersedia dalam bentuk protein (L-sisteina,
methionine, taurin, sulfomusin) (Ahlman et al. 1993) dan senyawa anorganik (sulfat
dan sulfid) (Lewis & Cohcrane 2007). Sediaan sulfur ini merupakan sisa-sisa
metabolisme usus kecil. Bakteri usus dapat mensintesa sediaan sulfur ini dalam
jalur metabolik untuk pembentukan asam amino tertentu sebagai penunjang
hidupnya (Carbonero et al. 2012). Salah satunya adalah jalur transsulfurasi yang
berhubungan dengan metabolisme sisteina dan metionin pada bakteri. L-sisteina
dan L-metionin merupakan asam amino yang berhubungan dengan ikatan disulfida
dalam pembentukan situs aktif dan pelipatan protein (Stipanuk & Ueki 2011). Lsisteina dikenal sebagai sumber sulfur utama untuk bifidobakteria (Ferrario et al.
2015). Metabolisme sisteina dan metionin dalam jalur transsulfurasi bergantung
pada aktivitas enzim karbon-sulfur (C-S) liase (Hwang et al. 2002).
Pada jalur transsulfurasi, C-S liase berperan dalam menentukan arah jalur
metabolsime L-sisteina dan L-metionin. C-S liase yang berperan untuk
metabolisme sisteina adalah sistationin -liase (CBL), sedangkan untuk
metabolisme metionin adalah sistationin -liase (CGL). Dalam jalur transsulfurasi,
CBL bekerja untuk jalur L-sisteina sebagai sumber asam amino sulfur tunggal
untuk pembentukan L-metionin, sebaliknya CGL bekerja untuk biosintesis Lsisteina dari L-metionin (Hesse & Hoefgen 2008). Oleh karena itu, identifikasi

2

terhadap aktivitas C-S liase pada bifidobakteria dapat menjadi pembuka dalam
mempelajari probiotik ini.
Dalam menganalisa metabolisme asam amino suatu bakteri, dapat dilakukan
melalui dua pendekatan, yaitu pendekatan langsung dengan metode gen knockedout dan pendekatan tidak langsung melalui overekspresi gen target pada bakteri
lain. Efisiensi transformasi bifidobakteria yang rendah menyebabkan metode
knocked-out sulit untuk dilakukan (Fukiya et al. 2011) karena hingga saat ini
metode dan plasmid yang efektif masih dalam pengembangan (Sakanaka et al.
2014). Pendekatan overekspresi lebih mudah dilakukan, oleh karena itu pendekatan
ini yang akan dilakukan untuk identifikasi C-S liase pada bifidobakteria.
Dari sekian galur bifidobakteria, Bifidobacterium longum 105-A
menunjukkan potensi paling besar sebagai model untuk mempelajari metabolisme
asam amino. B. longum 105-A memiliki efisiensi transformasi tertinggi
dibandingkan bifidobakteria lainnya, sekitar 104 sampai 106 transforman untuk
setiap µg DNA (Kaneseki et al. 2014), namun lebih rendah dari E. coli yang
efisiensi transformasinya lebih dari 106 (Liu X et al. 2014). B. longum 105-A juga
memiliki pertumbuhan yang cukup cepat, OD600nm 1 setelah 12 jam (Matsumura et
al. 2014). Galur ini potensial untuk menjadi model dalam mempelajari metabolisme
bifidobakteria.

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi enzim C-S liase yang
bekerja pada jalur transsulfurasi di B. longum 105-A. Secara praktis, kajian ini
dilakukan untuk mempelajari cara B. longum bertahan hidup di usus besar dalam
pemanfaatan sumber sulfur.

Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah secara teoritis diperolehnya informasi
metabolisme asam amino sulfur dalam jalur transsulfurasi B. longum 105-A, dalam
rangka mempelajari B. longum 105-A sebagai model untuk memahami
bifidobakteria. Secara praktis untuk menjaga keberadaan probiotik dalam usus
besar sehingga terhindar dari bakteri patogen.

Hipotesis
Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah enzim C-S liase dari
Bifidobacterium longum 105-A yang bekerja pada jalur transsulfurasi dapat
diidentifikasi dengan melakukan kloning dan transformasi pada E. coli terhadap gen
target yang ditentukan berdasarkan hasil BLAST.

3

2

TINJAUAN PUSTAKA
Bifidobacterium longum 105-A

Bifidobakteria secara umum bermanfaat baik untuk kesehatan fisik dan
patologi manusia. Keberadaan bakteri ini sejak bayi menandakan manfaat baiknya
bagi tubuh (Fanaro et al. 2003). Perubahan asupan makanan dan pola hidup
merubah susunan mikrobiota pada usus, sehingga terjadi penyusutan presentasi
bifidobakteria. Selain bermanfaat untuk menekan pertumbuhan ETBF, B. longum
khususnya memiliki efek paling baik terhadap infeksi yang disebabkan oleh
enterohemorhagic E. coli (EHEC) (Fukuda et al. 2011). Keberadaan B. longum
pada tubuh manusia memberikan manfaat yang baik, sehingga mempelajari cara
bakteri ini bertahan hidup pada usus manusia menjadi kunci untuk mempertahankan
keberadaannya pada usus besar.
B. longum 105-A merupakan salah satu bakteri anaerob Gram-positif yang
diisolasi dari usus besar bayi dan ditemukan juga pada usus besar manusia.
Bifidobakteria dikenal sulit untuk dilakukan manipulasi, terutama dengan metode
knockout karena efisiensi transformasinya rendah (Brancaccio et al. 2013).Pada B.
longum 105-A, metode knockout sudah mulai berkembang dengan berhasilnya
transformasi plasmid termodifikasi (Hirayama et al. 2012) Bakteri ini memiliki
efisiensi transformasi yang cukup tinggi, sekitar 104 sampai 106 transforman untuk
setiap µg DNA (Fukiya et al. 2011). Selain itu, pertumbuhannya juga cukup cepat
dan baik dibandingkan bifidobakteria lainnya, yaitu OD600nm 0,8 setelah 24 jam
pada chemical design media (CDM) yang kaya nutrisi (Ferrario et al. 2015).
Dalam pengembangannya sebagai model untuk identifikasi metabolisme
bifidobakteria, Sakaguchi et al. (2013) melakukan pengembangan media minimum
untuk mempelajari pertumbuhan dan daya tahan hidup bifidobakteria dalam
menghadapi perubahan lingkungan. Media minimum juga bermanfaat sebagai alat
untuk mempelajari bakteri bertahan hidup dengan memproduksi kebutuhan
metabolismenya sendiri. Kebutuhan dasar setiap bakteri berbeda, sehingga
komposisi media minimum juga berbeda. B. longum 105-A tumbuh denga baik
pada media MRS dan media Briggs (Matsumura et al. 2014), yang merupakan
media kaya untuk bakteri Gram-positif. Bifidobacteria minimum media (BMM)
merupakan hasil media modifikasi dari media MRS yang dikembangkan oleh tim
ini Sakaguchi et al. (2013).

C-S Liase pada Bakteri
Enzim C-S liase bekerja untuk memotong ikatan antara karbon dengan sulfur.
Terdapat berbagai jenis enzim C-S liase pada bakteri yang bekerja dengan berbagai
kondisi dan jalur metabolisme. Enzim dengan aktivitas C-S liase telah banyak
ditemukan pada bakteri. Aktivitas enzim C-S liase pada bakteri berbeda-beda dan
dapat diukur dengan mereaksikan substrat sistationin, L-sistin, asam DL-djenkolik,
dan lantationin (Auger et al. 2002).
Aktivitas enzim C-S liase dapat diukur menggunakan kolorimetri, metode
5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB). Aktivitas enzim dihitung berdasarkan

4

pembentukan 2-nitrobenzoic acid (TNB2-). Senyawa TNB2- terbentuk akibat
terbentuknya molekul sulfidril pada hasil reaksi enzim C-S liase. Senyawa TNB2menghasilkan warna kuning pada larutan reaksi dengan koefisien molar serapan
sebesar 14150 (M/cm)-1 pada panjang gelombang 412nm (Riddles et al. 1979).
Berbagai jenis C-S liase yang bekerja pada jalur transsulfurasi telah diukur dengan
metode ini.
C-S liase pada jalur transsulfurasi merupakan enzim yang diukur dengan
metode DTNB. C-S liase ini tergolong sebagai enzim yang bergantung pada
pyridoxal 5’phospate (PLP dependent enzyme) dalam aktivitasnya. Oleh karena itu,
enzim ini tidak dapat bekerja tanpa keberadaan PLP (Marienhagen et al. 2005).
Sistationin -liase (CBL) dan sistationin -liase (CGL) merupakan enzim yang
aktivitasnya bergantung pada PLP. Kedua enzim ini bekerja pada jalur
transsulfurasi, bergantung pada nutrisi asam amino sulfur yang tersedia. CBL
terekspresi pada kondisi L-sisteina sebagai sumber sulfur, sedangkan CGL
terekspresi pada kondisi L-metionin sebagai sumber sulfur tunggal (Ohmori et al.
1992; Manders et al. 2013). Gambar 1 menunjukkan skema kerja dari kedua enzim
ini dalam metabolisme sisteina dan metionin. Hasil pemotongan sistationin oleh
CBL adalah homosistein, sedangkan pemotongan oleh CGL menghasilkan Lsisteina. Kedua produk dari enzim-enzim ini memiliki komponen sulfidril. Oleh
karena itu, metode DTNB tidak dapat digunakan untuk menentukan kerja enzim
sebagai CBL atau CGL.

Gambar 1 Skema kerja C-S liase pada jalur transsulfurasi (Manders et al. 2013)

5

Situs pemotongan dari enzim C-S liase terhadap substrat sistationin dapat
ditentukan dengan high pressure liquid chromatography (HPLC). Reaksi antara CS liase dengan substrat cystathionie menghasilkan senyawa thiol yang dapat di
derivatisasi dengan menggunakan 7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulphonate
(SBD-F). Toyo’oka & Imai (1983) menggunakan metode ini untuk mengukur kadar
L-sisteina, homosistein, sisteamin, glutation, dan N-asetilsisteina dalam darah dan
plasma. Senyawa-senyawa tersebut dipisahkan pada kolom HPLC dan keluar pada
rentang waktu retensi tertentu (Gambar 2). Dari senyawa SBD-F, gugus fluoro
digantikan oleh senyawa sulfidril yang terdapat pada sampel, sehingga senyawasenyawa ini menjadi SBD-sisteina, SBD homosistein, SBD sistationin.

Gambar 2 Hasil HPLC untuk SBD-sisteina (a); SBD homosistein (b); SBD
sisteamin (c); SBP-glutation (d); dan SBD-N-asetilsisteina (e) pada
darah dan plasma (Toyo’oka & Imai 1983)
Bifidobakteria dikenal sebagai bakteri yang bergantung pada sisteina sebagai
sumber sulfurnya (Ferrario et al. 2015). Dalam makanan, L-sisteina terkandung
dalam ayam, telur, yogurt, bawang putih, bawang merah, paprika, dan brokoli
(Wootan & Phillips 2010). Oleh karena itu, secara teoritis C-S liase yang bekerja
adalah CBL. Aktivitas enzim CBL seperti MalY dari E. coli dalam mendegradasi
sistationin adalah 644 µmol min-1(mg protein)-1 (Zdych et al. 1995). Pada B.
subtilis, terdapat dua enzim yang bekerja sebagai CBL, yaitu MetC dan PatB.
Aktivitas keduanya sangat berbeda, MetC dapat mendegradasi L-sistin dan
sistationin masing-masing sekitar 16,2 µmol min-1(mg protein)-1 dan 4,3 µmol min1
(mg protein)-1 (Auger et al. 2002). Enzim-enzim ini bekerja sebagai CBL, namun
juga bisa mendegradasi L-sistin karena bagian yang dikenal pada substrat adalah
bagian L-sisteina.
Seperti yang terlihat pada Gambar 1, struktur sistationin terdiri atas L-sisteina
dan homosistein. Sebagai enzim yang menghasilkan homosistein dari sistationin,
terdapat dua kemungkinan bagian yang dikenali oleh enzim CBL. CBL yang
mengenali bagian situs L-sisteina dapat memotong asam amino lain yang memiliki
komponen L-sisteina didalamnya, seperti L-sistin, asam DL-djenkolik, dan
lantationin. Aktivitas ini disebut dengan sisteina desulfidrase, karena
menghilangkan sulfid pada substrat L-sisteina (Gambar 3c). Enzim-enzim CBL
yang disebutkan sebelumnya merupakan C-S liase yang juga memiliki aktivitas
sebagai sisteina desulfidrase karena memiliki aktivitas terhadap L-sistin. CBL dari
Corynebacterium diphtheriae tidak memiliki aktivitas sisteina desulfidrase
(Astegno et al. 2013). L-sistin dan sistationin memiliki komponen L-sisteina

6

didalamnya, sehingga bisa dipotong oleh enzim yang memiliki aktivitas sisteina
desulfidrase, ditunjukkan pada Gambar 3. Kelompok sisteina desulfidrase
merupakan enzim-enzim yang digunakan dalam produksi L-sisteina secara in vitro
(Wada et al. 2002).

Gambar 3 Reaksi C-S liase yang mengenali gugus L-sisteina pada substrat
sistationin (a); L-sistin (b) dan L-sisteina (c) (Wada & Takagi 2006)

3

BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan

Alat
PCR menggunakan dua jenis mesin yaitu mesin Gradient PCR untuk
menentukan suhu annealing optimum dan mesin PCR. Hasilnya divisualisasi pada
mesin elektroforesis dan UV transluminator pada microtube. Spektrofotometer
digunakan untuk mengukur konsentrasi dan OD600nm. Alat elektroporasi untuk kejut
listrik dan water bath untuk kejut panas. Sentrifus untuk kuantifikasi dan
pemisahan. Pengukuran konsentrasi enzim dan aktivitas enzim dengan mesin
absorpsi UV-vis spektrofotometer Beckman DU-800. Inkubator goyang suhu ruang
dan inkubator hibridisasi untuk inkubasi protein pada gel. Alat saring dengan
vakum beserta membran untuk pembuatan fasa gerak. Mesin High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) untuk analisa. Sonikator dan Beadbeater untuk
disrupsi sel.
Strain dan Media Kultivasi
Bakteri dan plasmid yang digunakan tertera pada Tabel 1. E. coli
ditumbuhkan pada media lysogeny broth (LB) yang berisi 10 g/L tripton, 5 g/L yeast
extract, dan 10 g/L NaCl. B. longum 105-A (dari koleksi Laboratorium Fisiologi
Mikroba, Hokkaido University) ditumbuhkan pada bifidobacterial minimum media

7

(BMM) (Sakaguchi et al. 2013) dan BMM+L-sisteina (Lampiran 1). Media SOC
untuk transformasi (Lampiran 2) 10% dan 30% gliserol masing-masing digunakan
untuk pembuatan kompeten sel dan stok gliserol. Antibiotik ampisilin (Amp)
dan/atau kloramfenikol (Cm) ditambahkan dengan konsentrasi akhir 50 µg/ml.
Media padat disiapkan dengan menambahkan 2% Agar. Ekspresi gen diinduksi
dengan 0,02 mM/L isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (IPTG).
Bahan
Untuk PCR, amplifikasi menggunakan dua jenis PCR kit, yaitu
PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit dari TAKARA (Lampiran 3) dan KAPATaq
EXTRA PCR Kit (Lampiran 4). Elektroforesis menggunakan 1% gel Agarose
dengan 1X bufer TAE dan diwarnai dengan EtBr. Hasil PCR dimurnikan dengan
MinElute PCR Purification Kit (Lampiran 5). Enzim restriksi NdeI, BclI dan
BamHI, serta Antartic phosphatase dari New Englands Biolabs. Gen terpotong
dibersihkan dengan MinElute Reaction Cleanup Kit (Lampiran 6). Ligasi dengan
Ligation High Ver. 2 dari Toyobo (Lampiran 7). Plasmid diisolasi dengan Plasmid
DNA Purification menggunakan QIAprep Spin Miniprep KIT dan mikrosentrifus
(Lampiran 8). L-sistin, L-sisteina, sistationin dan L-homosistein sebagai substrat
dan standar. SDS-PAGE kit (Lampiran 9).
Tabel 1 Strain dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini
Strain
E. coli
DH5α
DH5α pET-15b/BL105A_1451
DH5α/pET-15b/BL105A_1761
BL21
BL21/pET-15b
BL21/pET-15b/BL105A_1451
BL21/pET-15b/BL105A_1761
B. longum 105-A

Genotipe

Sumber

BL105A_1451
BL105A_1761
pET-15b
BL105A_1451
BL105A_1761
-

Stok Laboratorium
Dalam penelitian ini
Dalam penelitian ini
Stok Laboratorium
Dalam penelitian ini
Dalam penelitian ini
Dalam penelitian ini
Stok Laboratorium

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Mikroba, Fakultas
Pertanian, Hokkaido University, Jepang pada bulan Oktober 2015 sampai Februari
2016, kemudian dilanjutkan di Laboratorium Bioindustri, Departemen Teknologi
Industri Pertanian, Institut Pertanian Bogor pada bulan Maret 2016 sampai Agustus
2016.

Prosedur Penelitian
Pemilihan Gen Target
Berdasarkan hasil BLAST pada C-S liase yang telah teridentifikasi pada
bakteri lain, BL105A_1451 dan BL105A_1761 pada B. longum 105-A menunjukkan
kemiripan sebagai C-S liase. Kedua protein tersebut menunjukkan kemiripan
sebesar 34% dengan MetC dari C. glutamicum, 30% dengan MalY dari E. coli, dan

8

31% dengan PatB dari B. subtilis. BL105A_1451 menganotasikan enzim putatif
aminotransterase PLP-dependent dan BL105A_1761 menganotasikan enzim
bifungsional PLP-dependent.
Konstruksi dan Overekspresi Gen Target pada E. coli
Target gen diambil dari genom B. longum 105-A (dari koleksi Laboratorium
Fisiologi Mikroba, Hokkaido University) menggunakan teknik polymerase chain
reaction (PCR). Primer yang digunakan tertera pada Tabel 2. Untuk menentukan
suhu annealing dan PCR polimerase kit yang paling baik, dilakukan gradient PCR.
Kondisi PCR yang digunakan terlampir pada Lampiran 3 dan Lampiran 4. Produk
hasil amplifikasi PCR diidentifikasi dengan menggunakan elektroforesis,
dipurifikasi dengan menggunakan MinElute PCR Purification Kit dengan metode
sesuai dengan protokol dari kit.
Plasmid pET-15b digunakan sebagai vector. Produk PCR dimasukkan
diantara situs restriksi NdeI dan BamHI. Plasmid yang sudah diligasikan
dimasukkan ke dalam E. coli DH5α sebagai vektor kloning menggunakan metode
heat shock. E. coli DH5α dikultivasi pada media seleksi LB+Amp cairan dan Agar.
Akumulasi plasmid dalam vektor kloning diekstraksi dan dipurifikasi. Ukuran
plasmid diklarifikasi dengan memotong plasmid pada satu situs restriksi untuk
melinearkan plasmid. Tatanan basa pada plasmid juga diklarifikasi dengan
sequencing. Plasmid hasil purifikasi dimasukkan ke vektor ekspresi E. coli BL21
dengan teknik elektroporasi. E. coli BL21 ditumbuhkan pada media seleksi
LB+Amp+Cm cairan dan Agar. Koloni yang tumbuh diklarifikasi dengan koloni
PCR menggunakan primer.
Tabel 2 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen target yang potensial.
Nama primer
BL105A_1451 R
BL105A_1451 F
BL105A_1761 R
BL105A_1761 F

Urutas basa primer
(TTATGGATCCGTTTACGCGTTGAATACGTATTGGTCAAG)
(GCATCATATGACGTACGATTTCACGTCGATTATG)
(CAATTGATCATTCTACAACAGCCCGTCCGCCTC)
(GCACCATATGAGCATGAACAACATTCCCCAGTC)

Kultivasi dan Pembuatan Enzim Ekstrak Kasar E. coli
Satu koloni bakteri dari media padat dimasukkan ke dalam media prekultivasi yang berisi 5 ml LB-Cm-Amp selama 12 jam pada suhu 370C dengan
kecepatan 120 rpm. Selanjutnya, melakukan kultivasi dengan menambahkan 500
µl pre-kultivasi dalam 50 ml LB-Cm-Amp. Setelah penambahan IPTG (OD660nm
0,2-0,3), kultivasi dilanjutkan semalam. Hasil kultivasi dipanen dan dilakukan
sentrifugasi sebanyak dua kali menggunakan 0,8% sodium klorida pada sentrifugasi
kedua. Pelet disimpan pada suhu -200C. Pelet dilarutkan dalam bufer EEK,
kemudian didisrupsi dengan sonikasi dan presipitasi dengan sentrifugasi. Dari sini,
EEK didapat. Ukuran protein diidentifikasi dengan SDS-PAGE.
Pemurnian Enzim
Purifikasi menggunakan fast protein liquid chromatography (FPLC).
Purifikasi dilakukan pada suhu 0-4 0C. Bufer elusi dan bufer pengikat mengandung
20 mM Tris-HCl, 10mM PLP, 500 mM NaCl, 0,1 mM dithiotreitol dan 20 mM
(untuk bufer pengikat) atau 500 mM (untuk bufer elusi) imidazole. Sebelum
memasuki kolom purifikasi, sampel dan bufer disaring menggunakan filter 0,45

9

µm. Sampel diinjeksikan menggunakan suntikan. Proses purifikasi dilanjutkan
dengan dialisis.
Pengukuran Aktivitas C-S Liase
Sebelum pengukuran aktivitas, konsentrasi protein yang terkandung didalam
sampel diukur dengan metode Bradford. Kurva standar Bradford dibuat dengan
membuat larutan bovine serum albumin (BSA) dengan konsentrasi 0; 0,2; 0,4; 0,6;
dan 0,8 mg/ml. Sebanyak 10 µl dari masing-masing larutan tersebut dicampurkan
kedalam 1 ml larutan Bradford, langsung dicampurkan dengan vortex. Selanjutnya
diukur dengan spektrofotometer 595nm. Angka yang didapat diplot menjadi kurva
standar. Sampel diukur dengan mencampurkan sebanyak 10 µl sampel kedalam
larutan Bradford. Hasil pengukuran sampel pada spektrofotometer 595nm
dimasukkan ke dalam persamaan linear kurva standar, sehingga didapat konsentrasi
protein pada sampel.
Aktivitas enzim diukur menggunakan 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)
(DTNB) kolorimetrik dengan mengikuti prosedur pada protokol DTNB. EEK
direaksikan dengan sistationin dan L-sistin sebagai substrat dalam bufer yang berisi
50 mM Tris-HCl, 20mM PLP and 0,2 mM DTNB. Kondisi pengukuran diatur pada
panjang gelombang 412 nm, suhu 370C selama 5 menit. Laju perubahan absorbansi
digunakan untuk menghitung aktivitas enzim. 0,4 N HCl digunakan sebagai
pengganti sampel untuk negatif kontrol. Aktivitas C-S liase menghasilkan Senyawa
TNB2- yang memberikan warna pada larutan reaksi dengan koefisien molar serapan
sebesar 14150 (M/cm)-1 pada panjang gelombang 412nm (Riddles et al. 1979).
Aktivitas enzim dari absorbansi diukur dengan menggunakan persamaan berikut:
Sulfidril bebas mM =

Abs

ax

− Abs
,

i

faktor pengenceran
dAbs⁄min
×
konsentrasi protein
mM

Penentuan Spesifisitas Aktivitas Enzim
HPLC digunakan untuk menentukan spesifisitas enzim terhadap substrat,
dengan menggunakan reagen fluorogenik dan ammonium 7-fluorobenzo-2-oxa1,3-diazole-4-sulphonate (SBD-F) untuk derivatisasi (Toyo’oka & Imai 1λ8γ).
Substrat yang digunakan adalah sistationin.
Campuran 0,1 M asam asetat dan 0,1 M natrium asetat dengan pH 4 dan pH
6, digunakan sebagai larutan pembawa. Filtrasi dan sonikasi digunakan untuk
menghilangkan gelembung dari larutan pembawa. L-sisteina dan homosistein
digunakan sebagai standar untuk menentukan hasil reaksi berdasarkan waktu
paruhnya.
Kultivasi dan Pembuatan Ekstrak Bebas Sel B. longum 105-A
B. longum 105-A dikultivasi pada kondisi anaerob dengan media kultivasi
BMM dan BMM+Sisteina selama 24 jam. Hasil kultivasi kemudian dibuat menjadi
ekstrak bebas sel (cell-free extract) dengan sentrifugasi kultur pada suhu 4 0C
selama 10 menit pada kecepatan 8000 rpm. Bufer ekstrak bebas sel (20 mM TrisHCl, 1mM EDTA dan 20µM PLP) digunakan untuk melarutkan pellet. Larutan
kemudian didisrupsi selnya dengan menambahkan 0,5 gram beads 0,1 mm pada
tube 1,5 ml. Beadbeater mendisrupsi sel selama 840 detik dengan kekuatan
2500rpm pada rentang nyala 60 detik dan jeda 60 detik. Ekstrak bebas sel

10

dipisahkan dari bead dan pengotor dengan sentrifugasi selama 15 menit pada suhu
4 0C, 15000 rpm. Dari sini, ekstrak bebas sel B. longum 105-A didapatkan.

4

HASIL DAN PEMBAHASAN
Kloning Gen

Penelitian ini diawali dengan perbanyakan gen target yang dilakukan dengan
cara overekspresi gen pada E. coli. Protein BL105A_1451 dan BL105A_1761 pada
B. longum 105-A menunjukkan kemiripan dengan enzim C-S liase dari bakteri
lainnya berdasarkan hasil BLAST. Kedua protein ini diambil dengan metode PCR
dari genom B. longum 105-A menggunakan primer spesifik. Primer yang digunakan
terdiri atas 20 basa situs spesifik dari gen target, 6 basa situs restriksi, dan 7-13 basa
sebagai ekor. Sebelum gen diambil, dilakukan gradient PCR untuk menentukan
suhu annealing optimum dan melihat kecocokan kit polimerase dengan primer
(Gambar 4). Pada awalnya, BL105A_1451 dan BL105A_1761 diamplifikasi
menggunakan PCR Kit yang sama, yaitu PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit.
Amplifikasi pada gen BL105A_1451 berhasil dilakukan dengan baik, namun pada
gen BL105A_1761 tidak baik. Hal ini dikarenakan BL105A_1761 memiliki
kandungan GC yang lebih tinggi pada primer (52%) dibandingkan dengan
BL105A_1451 (41%). Kandungan GC berfungsi untuk menstabilkan primer dengan
batas antara 40-60%, namun terlalu tingginya kandungan GC menyebabkan
kegagalan amplifikasi. Kandungan GC pada BL105A_1761 masih didalam ambang
batas, akan tetapi penggunaan polimerase yang tidak tepat menyebabkan smear
pada elektroforesis. PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit menggunakan DNA
polimerase KOD yang memiliki aktivitas amplifikasi lebih baik daripada DNA
polimerase Taq (Sato et al. 2010), namun DNA polimerase Taq masih lebih unggul
dalam mengamplifikasi primer dan template DNA yang kaya kandungan GC
(McDowell et al. 1998; Mammedov et al. 2008). Oleh karena itu, gen
BL105A_1761 diamplifikasi oleh KAPATaq EXTRA PCR Kit. Hasilnya
menunjukkan polimerisasi gen BL105A_1451 baik untuk dilakukan dengan
PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit pada suhu annealing 58,80C, sedangkan
BL105A_1761 menggunakan KAPATaq EXTRA PCR Kit pada suhu annealing
650C.
Suhu annealing yang terpilih berdasarkan Gambar 4 tersebut digunakan untuk
amplifikasi gen target dengan lama waktu ekstensi 1 menit 30 detik untuk setiap
siklus PCR. Waktu ekstensi ditentukan berdasarkan ukuran dari gen target, yaitu
1231 pasang basa (bp) untuk BL105A_1451 dan 1273 bp untuk BL105A_1761.
Penentuan lama waktu ekstensi dipilih untuk meminimalkan resiko gen target yang
teramplifikasi kurang dari ukutan gen target, sehingga didapatkan pita dengan
ukuran sekitar 1300 bp. Primer yang digunakan memiliki barisan situs restriksi
NdeI, BamHI dan BclI, sehingga lama waktu ekstensi juga dimanfaatkan untuk
perpanjangan gen dari primer. Ukuran ini terkonfirmasi pada Lajur 1 Gambar 5.
Hasil PCR gen target dibersihkan dari bufer dan pengotor lainnya dengan PCR
cleanup kit. Pengotornya adalah dNTPs, primer, Taq dan Mg2+ yang sebelumnya

11

digunakan sebagai komponen-komponen penting dalam PCR, namun akan menjadi
pengotor untuk proses pemotongan situs restriksi atau sequencing (Kheyrodin &
Ghazvinian 2012). Proses ini menghasilkan gen target dengan konsentrasi 279 ng/µl
BL105A_1451 dan 306 ng/µl BL105A_1761, terukur dengan spektrofotometer.

Gambar 4 Hasil gradient PCR dengan PrimeSTAR®HS DNA PCR Kit dari
TAKARA (A) dan KAPATaq EXTRA PCR Kit (B). Lajur 1 sampai 8
menunjukkan hasil PCR pada suhu 520C, 540C, 56,40C, 58,80C, 61,20C,
63,60C, 660C, dan 680C.
Gen target yang didapat kemudian dipotong dengan menggunakan enzim
restriksi untuk membentuk ujung lengket pada kedua ujung gen target dan plasmid.
Enzim restriksi yang digunakan adalah NdeI dan BamHI untuk BL105A_1451 dan
pET-15b, sedangkan untuk BL105A_1761 menggunakan NdeI dan BclI. Perbedaan
enzim restriksi yang digunakan dikarenakan ditemukannya situs BamHI pada
BL105A_1761 sehingga digunakan situs restriksi BclI. Penggunaan dua jenis enzim
restriksi merupakan cara untuk mencegah terjadinya ligasi sendiri dan kesalahan
arah orientasi penyisipan gen target pada plasmid (Schleif 1993). Antartic
phosphatase juga ditambahkan pada sampel pET-15b untuk menghilangkan gugus
fosfat pada ujung 5’ sebagai pencegahan terjadinya ligasi dengan dirinya sendiri
(Rina et al. 2000). Plasmid yang awalnya berbentuk sirkular dirubah menjadi linear
karena pemotongan pada situs restriksi. Sampel kemudian dibersihkan dengan
DNA cleanup kit untuk membersihkan gen dari enzim restriksi dan bufer-bufer
lainnya. Pemotongan dan pembersihan menghasilkan DNA dengan konsentrasi 12
ng/µl pET-15b, 18 ng/µl BL105A_1451, dan 15 ng/µl BL105A_1761 dan ukuran
1239 bp untuk BL105A_1451 (lajur 2 Gambar 5A), 1281 bp untuk BL105A_1761
(lajur 2 Gambar 5B) dan 5700 bp untuk pET-15b (lajur 3 Gambar 5).
Ujung-ujung runcing potongan dari enzim restriksi pada gen target dan pET15b memudahkan proses ligasi. Untuk pET-15b dan BL105A_1451, ligasi terjadi
antara ujung runcing NdeI (5’TA) dan BamHI (5’GATC) dari masing-masing gen.
Untuk pET-15b dan BL105A_1761 ujung runcing BclI akan terligasi dengan ujung
runcing BamHI dari pET-15b. Hal ini dapat terjadi karena BclI menyisakan ujung
runcing 5’GATC sehingga dapat terligasi dengan ujung runcing BamHI. Proses ini

12

dilanjutkan dengan transformasi pada vektor kloning E. coli DH5α dengan metode
heatshock. E. coli DH5α merupakan galur yang dirancang sebagai vektor kloning
karena sudah dilemahkan degradasi endonuclease-nya dan direduksi kemungkinan
terjadinya rekombinasi homolog, sehingga lebih stabil untuk menerima materi
asing (Kawashima et al. 1984). Hal ini dilakukan untuk mengamplifikasi plasmid
yang berhasil terligasi dan menguji ekspresi dari plasmid, karena plasmid
mengandung gen resisten ampisilin sehingga seleksi ekspresi resisten ampisilin
pada koloni hasil transformasi sebagai identifikasi plasmid akan lebih
memudahkan. Pada media Agar LB yang dilengkapi dengan antibiotik ampisilin,
koloni yang tumbuh cukup banyak, sehingga diambil 96 koloni untuk identifikasi
keberhasilan sisipan gen target pada plasmid dengan PCR koloni. Berdasarkan hasil
elektroforesis dari PCR koloni, didapat 44 koloni yang berhasil tertransformasi
dengan 15 koloni untuk BL105A_1451 dan 29 koloni untuk BL105A_1761 (lajur 4
Gambar 5) yang digunakan untuk memperbanyak plasmid.

Gambar 5 Hasil elektroforesis proses pembuatan bakteri rekombinan untuk
ekspresi gen BL105A_1451 (A) dan BL105A_1761 (B) dari B. longum
105-A, yang terdiri atas: perbanyakan gen target dari genom B. longum
105-A dengan PCR (1); pemotongan pada situs restriksi untuk gen target
(2) dan plasmid pET-15b kosong (3); PCR koloni pada vektor kloning
(4); pembuktian keberhasilan ligasi plasmid dengan isolasi plasmid (5)
dan restriksi plasmid (6); dan PCR koloni pada vektor ekspresi (7).
Plasmid yang sudah diperbanyak didalam vektor kloning kemudian diisolasi
(Lanjur 5 Gambar 5). Hasil isolasi plasmid menunjukkan 3 pita pada gel. Pita-pita
ini menunjukkan plasmid berbentuk sirkular, sehingga perpindahannya pada gel
agarose dipengaruhi oleh bentuk lipatannya yaitu nicked, linear, dan superkoil
(Brown 2010). Untuk memastikan ukuran dari plasmid, dilakukan pemotongan
pada satu situs restriksi, yaitu NdeI. Gen target yang berhasil tersisip pada plasmid
menunjukkan ukuran 6939 bp untuk pET-15b/BL105A_1451 dan 6981 untuk pET15b/BL105A_1761. Lajur 6 pada Gambar 5 menunjukkan pita dengan ukuran
diantara 6000 bp sampai 8000 bp, sehingga dipastikan cocok dengan ukuran
plasmid yang dikonstruksi. Untuk lebih meyakinkan lagi, dilakukan sequencing
pada masing-masing 2 koloni dari pET-15b/BL105A_1451 dan pET15b/BL105A_1761. Hasilnya menunjukkan koloni pET-15b/BL105A_1451 dan

13

pET-15b/BL105A_1761 mimiliki 100% kemiripan susunan basa dengan desain,
sehingga plasmid dapat digunakan untuk diekspresikan pada vektor ekspresi.
Plasmid pET-15b, pET-15b/BL105A_1451 dan pET-15b/BL105A_1761
ditransformasikan ke dalam vektor ekspresi E. coli BL21 dengan metode kejut
listrik. Setelah transformasi, E. coli BL21 diseleksi dengan cara ditumbuhkan pada
media Agar LB yang dilengkapi dengan antibiotik kloramfenikol dan ampisilin. E.
coli BL21 yang digunakan tahan terhadap kloramfenikol. Transformasi plasmid
berhasil dilakukan dengan baik, terbukti dari banyaknya koloni yang muncul pada
media seleksi. Dari koloni-koloni yang tumbuh, diambil masing-masing 16 koloni
dari masing-masing plasmid untuk diidentifikasi melalui PCR koloni. Hasilnya
menunjukkan, hanya 3 dari 16 koloni E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 yang
menunjukkan pita pada PCR koloni, sedangkan pada E. coli BL21/pET-15b
/BL105A_1761 16 koloni yang diambil menunjukkan pita.
Dari koloni-koloni yang teridentifikasi melalui PCR koloni, diambil masingmasing 2 koloni untuk dikultivasi pada media seleksi cair dari LB yang
ditambahkan ampisilin dan kloramfenikol. Kultivasi dilakukan untuk memproduksi
protein pada sel, terutama protein dari gen target. Hal ini dilakukan dalam rangka
pengujian ekspresi gen target pada vektor ekspresi. Hasil kultivasi kemudian dibuat
menjadi ekstrak kasar dengan cara melakukan disrupsi sel. E. coli merupakan
bakteri gram negatif, sehingga dinding selnya bisa didisrupsi dengan cara sonikasi,
bead vortex, freeze-thaw, atau inkubasi dengan lisozime. Cara yang paling cepat,
murah dan hasil protein intraseluler yang tinggi adalah dengan sonikasi (Shrestha
et al. 2012). Setelah sonikasi, sel dipisahkan dengan sentrifugasi. Bagian pellet
merupakan sel, sedangkan bagian supernatan mengandung ekstrak kasar dari
protein yang berada di sitoplasma. Supernatan selanjutnya disebut sebagai ekstrak
bebas sel (cell-free extract).

Gambar 6 Hasil visualisasi ekspresi protein dengan SDS-PAGE pada ekstrak
bebas sel dari E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1761 (1); ekstrak bebas
sel dari E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 (2); ekstrak bebas sel dari
E. coli BL21/pET-15b (3).
Keberhasilan ekspresi gen target pada E. coli ditinjau dengan melakukan
SDS-PAGE pada ekstrak bebas sel. E. coli berhasil mengekspresikan proteinprotein dari gen target dengan baik, yang ditunjukkan dengan pita tebal pada lajur
1 dan lajur 2 di Gambar 6 diatas pita penanda 42400 Dalton. Pita sejajar juga
ditunjukkan pada ekstrak bebas sel E. coli BL21/pET-15b (lajur 3 Gambar 6)
sebagai kontrol negatif, akan tetapi pita tersebut lebih tipis dibandingkan dengan

14

pita pada ekstrak bebas sel dari E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 dan E. coli
BL21/pET-15b/BL105A_1761. Hal ini membuktikan bahwa E. coli juga
mengekspresikan protein dengan ukuran yang mirip dengan gen target. Pada
penelitian yang dilakukan oleh Awano et al. (2003), protein dengan ukuran serupa
adalah triptopanase yang bekerja sebagai sisteina desulfidrase. Oleh karena itu,
dilakukan pengukuran aktivitas enzim C-S liase pada ekstrak bebas sel dari E. coli
rekombinan.

Aktivitas C-S Liase pada Ekstrak Bebas Sel E. coli Rekombinan
Aktivitas enzim diukur dengan menggunakan ekstrak bebas sel. Aktivitas
enzim bergantung pada konsentrasi enzim yang terkandung didalam sampel, karena
jika konsentrasi enzim tinggi, maka aktivitasnya akan semakin tinggi juga. Oleh
karena itu, sebelum dilakukan pengukuran aktivitas, konsentrasi protein yang
terkandung didalam sampel harus diketahui terlebih dahulu. Pada penelitian ini,
konsentrasi protein diukur dengan metode Bradford. Kurva standar BSA dibuat
setiap kali, sebelum melakukan pengukuran konsentrasi pada sampel (Lampiran
10). Konsentrasi protein yang diperoleh pada Tabel 3 digunakan untuk menentukan
aktivitas enzim.
Tabel 3 Konsentrasi protein pada ekstrak bebas sel dan enzim murni
Enzim ekstrak kasar
Konsentrasi protein (mg/ml)
BL21/pET-15b
0.317±0.048
BL21/pET-15b/BL105A_1451
0.427±0.103
BL21/pET-15b/BL105A_1761
3.037±0.113
Data rata-rata, ±standar deviasi
Gen BL105A_1451 pada genebank dianotasikan dapat mengekspresikan
putative aminotransferase, sedangkan gen BL105A_1761 dianotasikan dapat
mengekspresikan bifunctional PLP-dependent enzyme. Keduanya merupakan
enzim yang bekerja dengan PLP sebagai koenzim dan memiliki kemiripan sekitar
30% dengan enzim yang memiliki aktivitas sebagai CBL pada bakteri lain.
Berdasarkan anotasi dan kemiripannya dengan bakteri lain, maka dilakukan
pengujian aktivitas enzim terhadap substrat sistationin. Aktivitas enzim diukur
dengan metode DTNB yang mengukur produk dengan kandungan gugus sulfidril,
hasil pemotongan ikatan karbon – sulfur (C-S) pada substrat sistationin. Hasil
pengukuran dan perhitungan aktivitas terhadap sistationin tertera pada Gambar 7.
Ekstrak bebas sel dari E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 memiliki aktivitas
yang jauh lebih tinggi dari ekstrak bebas sel dari E. coli BL21/pET-15b terhadap
substrat sistationin. Sebaliknya, aktivitas enzim pada ekstrak bebas sel dari E. coli
BL21/pET-15b/BL105A_1761 lebih kecil dari ekstrak bebas sel dari E. coli
BL21/pET-15b. Aktivitas enzimatik pada ketiga E. coli rekombinan ini sangat
berbeda. Tidak terlihatnya aktivitas yang tinggi pada rekombinan E. coli
BL21/pET-15b/BL105A_1761 dan E. coli BL21/pET-15b telah membuktikan
bahwa terjadi peningkatan aktivitas C-S liase pada ekstrak bebas sel dari E. coli
BL21/pET-15b/BL105A_1451 yang disebabkan oleh terekspresinya putative
aminotransferase.

15

1

A)
Abs (-)

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0

20

40

60

80

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Waktu (detik)

Aktivitas enzim (µmol min-1 (mg protein)-1)
E. coli BL21/pET-15b
▲0,041±0.003
E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1451 ■ 0,663±0.001
E. coli BL21/pET-15b/BL105A_1761 ● 0,008±0.001
Data rata-rata, ±standar deviasi
Gambar 7 Perubahan konsentrasi gugus sulfidril yang terbentuk dari substrat
sistationin (A) dan aktivitas enzim C-S liase (B) dari ekstrak bebas sel
E. coli BL21 rekombinan.
B)

Sebagai C-S liase yang dapat menghasilkan sulfidril pada substrat sistationin,
putative aminotransferase juga berpotensi besar memiliki aktivitas sebagai sisteina
desulfidrase. Untuk membuktikan potensi sebagai sisteina desulfidrase, dilakukan
pengujian aktivitas enzim dengan substrat L-sistin. Gambar 8 menunjukkan
aktivitas terhadap L-sistin. Serupa dengan hasil aktivitas pada substrat sisstationin,
pada substrat L-sistin hanya ekstrak bebas sel dari E. coli BL21/pET15b/BL105A_1451 yang menunjukkan aktivitas sangat tinggi. Hal ini
menunjukkan bahwa putative aminotransferase juga memiliki aktivitas sisteina
desulfidrase. Enzim C-S liase yang memiliki aktivitas sisteina desulfidrase
berpotensi untuk dimanfaatkan sebagai enzim untuk produksi L-sisteina pada
industri. Perubahan aktivitas C-S liase pada E. coli rekombinan ini perlu
diklarifikasi lebih lanjut untuk lebih memastika