Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi Gen nifH
PENAPISAN BAKTERI RHIZOSFER PADI PENGHASIL
NITROGENASE YANG TAHAN KONDISI SALIN DAN
IDENTIFIKASI GEN nifH
SAFIRAH TASA NERVES RATU
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penapisan Bakteri
Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi
Gen nifH adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Safirah Tasa Nerves Ratu
NIM G84100057
ABSTRAK
SAFIRAH TASA NERVES RATU. Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi
Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi Gen nifH.
Dibimbing oleh POPI ASRI KURNIATIN dan DWI NINGSIH
SUSILOWATI.
Penambatan nitrogen oleh bakteri rhizosfer dapat dimanfaatkan untuk
menyiasati dampak salinitas pada tanah sawah pesisir. Kemampuan tersebut
disebabkan oleh adanya aktivitas nitrogenase yang disandikan gen nifH pada
komponen II. Penelitian ini bertujuan menyeleksi sejumlah bakteri rhizosfer
yang dapat menunjukkan aktivitas nitrogenase pada kondisi salin serta
mengidentifikasi gen nifH. Sebanyak 50 isolat bakteri rhizosfer asal tanah
sawah pesisir Daerah Eretan dan Patimban, Jawa Barat telah dianalisis.
Lima isolat menunjukkan aktivitas nitrogenase pada kondisi salin, yaitu Er
B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10 dan Ptb B1 4. Gen nifH kelima isolat
diidentifikasi menggunakan polymerase chain reaction (PCR) menghasilkan
amplikon berukuran ~360 bp. Aktivitas nitrogenase tertinggi berdasarkan
analisis reduksi asetilen (ARA) terdapat pada isolat Er B2 10 sebesar 4,4081
µmol.mL-1jam-1.
Kata kunci: aktivitas nitrogenase, ARA, bakteri rhizosfer, gen nifH, lahan
pesisir
ABSTRACT
SAFIRAH TASA NERVES RATU. Screening of Nitrogenase Producing
and Saline Resistant Rhizosfer Paddy Bacteria and Identification of nifH
Gene. Supervised by POPI ASRI KURNIATIN dan DWI NINGSIH
SUSILOWATI.
The ability of nitrogen fixing by rhizosfer bacteria could be used to
decrease salinity impact in coastal rice field. It was caused by nitrogenase,
encoded by nifH gene in component II. The objectives of this research were
to screen of rhizosfer bacterias that have the nitrogenase activity in saline
condition and identify the presence of nifH gene. The fifty isolates of
rhizosfer bacteri isolated from coastal rice field Eretan and Patimban region,
West Java was analyzed. Five isolates showed the nitrogenase activity under
saline condition, are Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10 dan Ptb B1 4. The
identification of nifH gene from these 5 samples using polymerase chain
reaction (PCR) showed that the size is ~360 bp. The highest activity of
nitrogenase used acetylene reduction assay (ARA) was showed by Er B2 10
is 4,4081 µmol.mL-1hour-1.
Keywords : ARA, coastal soil, nifH gene, nitrogenase activity, rhizosfer
bacteria
PENAPISAN BAKTERI RHIZOSFER PADI PENGHASIL
NITROGENASE YANG TAHAN KONDISI SALIN DAN
IDENTIFIKASI GEN nifH
SAFIRAH TASA NERVES RATU
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iv
Judul Skripsi : Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang
Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi Gen nifH
Nama
: Safirah Tasa Nerves Ratu
NIM
: G84100057
Disetujui oleh
Popi Asri Kurniatin, SSiApt MSi
Pembimbing I
Dwi Ningsih Susilowati, STP MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
ii
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 ini adalah Penapisan
Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan
Identifikasi Gen nifH.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Popi Asri Kurniatin, SSiApt MSi
dan Ibu Dwi Ningsih Susilowati, STP MSi selaku pembimbing yang telah banyak
memberikan pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Bapak Jajang, Ibu Aminah beserta seluruh staf Konservasi
Mikrobiologi BB-Biogen yang telah membantu selama pengumpulan data
penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta
seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk segala doa, kasih sayang
dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Safirah Tasa Nerves Ratu
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
iv
DAFTAR LAMPIRAN
iv
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan alat
2
Metode Penelitian
3
Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
3
Uji Salinitas Nitrogenase
3
Identifikasi Gen nifH dengan Metode PCR
4
Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
5
HASIL
5
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
5
Hasil Uji Salinitas Nitrogenase
6
Amplikon Gen nifH
6
Hasil Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
7
PEMBAHASAN
8
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
8
Hasil Uji Salinitas Nitrogenase
9
Amplikon Gen nifH
11
Hasil Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
12
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
14
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
18
iv
DAFTAR GAMBAR
1 Amplikon gen nifH berukuran ~360 bp
2 Proses pengubahan N2 menjadi NH3 yang dikatalisis nitrogenase
3 Kompleks nitrogenase
7
9
11
DAFTAR TABEL
1 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase pada media NFB semi
padat
2 Hasil uji salinitas terhadap aktivitas nitrogenase pada media salinitas
10% dan 20%
3 Hasil analisis kuantitatif aktivitas nitrogenase dengan metode ARA
6
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Isolat-isolat bakteri rhizosfer yang digunakan dalam penelitian
2 Diagram alir penelitian
3 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase isolat pada media NFB
semi padat
4 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase isolat pada media
salinitas 10% dan 20%
5 Konsentrasi dan kemurnian DNA isolat
6 Isolat yang dilakukan uji ARA dengan kromatografi gas
7 Contoh kromatogram, hasil pengukuran standar etilen yang digunakan
dan contoh perhitungan aktivitas nitrogenase isolat
19
20
21
21
21
22
23
PENDAHULUAN
Peningkatan permukaan air laut sebagai efek dari pemanasan global
merupakan masalah serius yang harus dihadapi sektor pertanian daerah pesisir
Indonesia. Berdasarkan hasil kajian the Intergovernmental Panel on Climate
Change (IPCC 2007) menunjukkan bahwa sejak tahun 1850, tercatat terdapat 12
tahun terpanas berdasarkan data suhu permukaan global. Sebelas dari 12 tahun
terpanas tersebut terjadi dalam waktu 12 tahun terakhir. Kenaikan suhu total dari
tahun 1850−1899 sampai dengan 2001−2005 tercatat mencapai 0,76°C. Permukaan
air laut global juga meningkat dengan laju rata-rata 1,80 mm/tahun dalam kurun
waktu tahun 1961−2003. Kenaikan total permukaan air laut yang berhasil dicatat
pada abad ke-20 diperkirakan mencapai 0,17 m. Dampak paling nyata dari
peningkatan permukaan air laut adalah penciutan lahan pertanian di pesisir pantai
(Jawa, Bali, Sumatera Utara, Lampung, Nusa Tenggara Barat, dan Kalimantan),
kerusakan infrastruktur pertanian, dan peningkatan salinitas yang merusak tanaman
(Las 2007). Hal ini dapat terjadi karena adanya akumulasi garam-garam berupa
NaCl yang dapat menurunkan produktivitas pertanian di daerah pesisir pantai.
Dampak peningkatan permukaan air laut yang demikian besar terhadap sektor
pertanian di daerah pesisir memerlukan upaya aktif untuk mengantisipasinya
melalui strategi mitigasi dan adaptasi lahan salin tersebut (Elza et al. 2010).
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengatasi permasalahan tersebut,
di antaranya penelitian mengenai teknologi identifikasi dan rehabilitasi tanah salin,
pengembangan varietas tanaman tahan kondisi salin serta telah dilakukan pemetaan
salinitas tanah daerah pesisir. Namun demikian, upaya untuk menyiasati adanya
dampak salinitas pada lahan sawah daerah pesisir dari aspek mikrobiologis belum
banyak dilakukan. Salah satu peran mikrobiologis yang dapat dimanfaatkan untuk
menyiasati permasalahan tanah salin daerah pesisir adalah dengan memanfaatkan
keberadaan bakteri yang mampu menyediakan unsur hara utama yang dibutuhkan
oleh tanaman, seperti unsur nitrogen (N) (Elza et al. 2010).
Nitrogen menyusun sekitar 78% dari keseluruhan gas yang ada di atmosfir.
Meskipun keberadaannya sangat melimpah di atmosfir, nitrogen tidak dapat
digunakan langsung oleh tanaman. Pengolahan kimia atau fiksasi alami nitrogen
diperlukan untuk mengkonversi gas nitrogen menjadi bentuk yang dapat digunakan
oleh tanaman. Fiksasi alami nitrogen dari atmosfir dapat dilakukan oleh bakteri
tanah agar ketersediaan unsur nitrogen bagi tanaman tetap tercukupi meskipun
tumbuh di wilayah marjinal dengan kandungan unsur hara yang sangat rendah,
seperti pesisir pantai. Salah satu bakteri yang dapat melakukan penambatan
nitrogen dari atmosfir adalah bakteri rhizosfer (Handayanto dan Hairiah 2007).
Bakteri rhizosfer merupakan bakteri yang hidup di daerah perakaran (rhizosfer)
tanaman yang memiliki kemampuan mengikat N2 bebas di udara dan mereduksinya
menjadi senyawa ammonia. Kemampuan bakteri tersebut untuk melakukan
penambatan nitrogen disebabkan oleh aktivitas nitrogenase (Buchanan et al. 2000).
Nitrogenase merupakan enzim kompleks yang terlibat dalam proses fiksasi
nitrogen. Nitrogenase berperan dalam pengubahan bentuk nitrogen bebas (N2) di
udara menjadi bentuk terikat, amonia (NH3). Nitrogenase terdiri atas dua
komponen, yaitu komponen I (dinitrogenase atau protein Fe-Mo) dan komponen II
(dinitrogenase reduktase atau protein Fe). Nitrogenase dikode oleh sekitar 20 gen
2
nif, yaitu: nifA, nifB, nifZ, nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, nifO, nifU, nifS, nifV,
nifW, nifT, nifY, nifE, nifM, nifF, nifL (Lee et al. 2000) dan di antara 20 gen nif
tersebut, gen nifH merupakan gen terpenting yang dapat digunakan untuk
mendeteksi keberadaan nitrogenase karena mengkodekan sub unit pembentuk
kompleks nitrogenase (Choo et al. 2003). Gen nifH mengkode komponen II pada
nitrogenase yang merupakan homodimer dengan berat molekul 60-70 kilodalton
(kDa) (Chai 2007).
Sebanyak 50 isolat bakteri rhizosfer telah berhasil diisolasi dari tanah sawah
pesisir Daerah Eretan dan Patimban, Jawa Barat. Isolat-isolat bakteri tersebut belum
dilakukan analisis aktivitas nitrogenase dan diidentifikasi keberadaan gen nifH
sehingga penelitian tersebut perlu dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menyeleksi sejumlah bakteri rhizosfer yang menunjukkan aktivitas nitrogenase
pada kondisi salin dan mengidentifikasi subunit pembentuk kompleks nitrogenase,
yaitu gen nifH. Informasi yang akan diperoleh nantinya diharapkan dapat
membantu pemanfaatan bakteri rhizosfer sebagai agen biofertilizer untuk lahan
salin.
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2013 hingga bulan
Februari 2014 di Laboratorium Konservasi Mikroorganisme, Balai Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.
METODE
Bahan dan alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 50 isolat bakteri
rhizosfer asal tanah sawah pesisir Daerah Eretan dan Patimban, Jawa Barat
(Lampiran 8), DL-malic acid, KOH, K2HPO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, NaCl,
CaCl2, Na2MoO4.2H2O, bacto agar, FeSO4.7H2O, Wizard Genomic DNA
Purification KIT Promega, Wizard SV Gel dan PCR Clean-Up System Promega,
bromtimol blue (BTB) 0.5%, agarosa, media lactose broth (LB), etilen diamin tetra
asam asetat (EDTA) 50 mM, bufer tris-EDTA (TE) 0.1x, bufer tris-asetat EDTA
(TAE) 0.5x, ethidium bromida (EtBr), primer universal untuk identifikasi gen nifH:
primer nifHf (5’GGCAAGGGCGGTATCGGCAAGTC’3) dan primer nifHr
(5’CCATCGTGATCGGGTCGGGATG’3), komponen PCR, yaitu: Gotaq DNA
polimerase 2x, loading dyne 6x, nuclease free water, akuades, pendana ukuran 1kb,
dan gas C2H2.
Peralatan yang digunakan adalah sarung tangan karet, tabung reaksi, tabung
ulir, jarum ose, tabung mikro, alat-alat gelas, pipet mikro, microsyringe, coolbox,
ice maker, tip, magnet stirer, shaker IKA KS 260 Basic model KS260B, neraca
analitik Scaltec model SPB31, laminar air flow cabinet ESCO Labculture Class II
model A2, pH meter Cyberscan Cutech Instrument model pH 510, autoklaf
Wiseclave Digital Fuzzy Control System model WAC-47, nanodrop Thermo Fisher
Scientific model 2000c, microwave LG model MC8087AR, inkubator Memmert
model INB 200-500, mikrofus 22R Beckman Coulter model AH025XX, ultra
violet (UV)-transilluminator SCOPE 21, perangkat elektroforesis Biorad Power
PAC 300 model MSMIDI, perangkat polymerase chain reaction (PCR) ESCO
3
Swift Maxi Termal Cycler Block model MX-BLC-7, stiring Barnstead International
model SP131014, waterbath Memmert model WNB 7-45, dan kromotografi gas
Hitachi model 263-50 dengan detektor flame ionization detector (FID).
Metode Penelitian
Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi
Salin dan Identifikasi Gen nifH pada penelitian ini terbagi menjadi 4 tahapan
penting, yaitu analisis kualitatif aktivitas nitrogenase, uji salinitas nitrogenase,
identifikasi gen nifH dengan metode polymerase chain reaction (PCR), dan analisis
kuantitatif aktivitas nitrogenase dengan metode analisis reduksi asetilen (ARA).
Tahapan awal, isolat ditumbuhkan pada media spesifik nitrogen free bromtimol
blue (NFB) semi padat untuk menyeleksi sejumlah isolat yang dapat menunjukkan
adanya aktivitas nitrogenase. Selanjutnya, isolat yang terseleksi diuji kembali
aktivitas nitrogenasenya pada media salinitas 10% dan 20%. Uji ini bertujuan
melihat pengaruh salinitas terhadap aktivitas nitrogenase yang dimiliki isolat.
Setelah dilakukan uji salinitas, tahap selanjutnya dilakukan identifikasi gen
pembentuk kompleks nitrogenase, yaitu gen nifH. Identifikasi gen nifH isolat
dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Tahap terakhir, dilakukan analisis
kuantitatif aktivitas nitrogenase isolat dengan metode ARA menggunakan
kromatografi gas.
Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
Pembuatan Media Nitrogen Free Bromtimol Blue (NFB) padat dan semi
padat. Media NFB padat dan semi padat dibuat dari komposisi bahan-bahan yang
sama. Sebanyak 5 g DL-malic acid, KOH 4 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.1 g,
MnSO4.H2O 0.05 g, NaCl 0.02 g, CaCl2 0.01 g, FeSO4.7H2O 0.05 g,
Na2MoO4.2H2O 0.002 g dan bacto agar 30 g untuk media NFB padat sedangkan
untuk media NFB semi padat ditambahkan bacto agar sebanyak 1.75 g serta
bromtimol blue (BTB) 0.5% sebanyak 2 mL. Semua bahan dilarutkan di dalam
akuades kemudian volumenya ditera hingga mencapai 1000 mL dan dibuat hingga
pH-nya mencapai 6.8. Media kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 1
atm dan suhu 121ºC selama 15 menit (Ding et al. 2005).
Peremajaan dan Permurnian Isolat. Sebanyak 1 ose koloni isolat diambil
dari stok kultur awal kemudian ditumbuhkan pada media NFB padat dengan
metode gores dan diinkubasi pada suhu 250C selama 5 hari (Ding et al. 2005).
Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase. Sebanyak 1 ose koloni isolat
yang dapat tumbuh pada media NFB padat ditumbuhkan kembali pada media NFB
semi padat dan diinkubasi pada suhu 250C selama 5 hari. Tahapan ini dilakukan
triplo (Ding et al. 2005).
Uji Salinitas Nitrogenase
Sebanyak 1 ose koloni isolat diambil dari media NFB padat kemudian
ditumbuhkan pada media salinitas. Media salinitas memiliki komposisi bahan yang
sama dengan media NFB semi padat hanya saja ditambahkan NaCl sebanyak 10 g
(konsentrasi 10%) dan 20 g (konsentrasi 20%) untuk volume 100 mL. Selanjutnya
4
isolat diinkubasi pada suhu 250C selama 14 hari. Tahapan ini dilakukan triplo (Ding
et al. 2005).
Identifikasi Gen nifH dengan Metode PCR
Isolasi DNA Genom. Isolasi DNA genom isolat dilakukan dengan Wizard
Genomic DNA Purification KIT Promega. Kultur isolat yang telah ditumbuhkan
pada media lactose broth (LB) dipindahkan ke tabung mikro sebanyak 1.5 mL dan
disentrifus selama 2 menit pada kecepatan 21.920 g. Pelet yang terbentuk diambil
dan supernatan dibuang. Pelet isolat bakteri gram negatif langsung dilakukan proses
lisis sel sedangkan pelet isolat bakteri gram positif diresuspensikan terlebih dahulu
dengan etilen diamin tetra asam asetat (EDTA) 50 mM sebanyak 480µL,
ditambahkan 120 µL lisozim, diinkubasi pada suhu 370C selama 45 menit dan
disentrifus pada kecepatan 21.920 g selama 2 menit. Pelet yang terbentuk kemudian
diambil dan supernatan dibuang. Tahap selanjutnya dilakukan proses lisis sel.
Sebanyak 600 µL nuclei lysis solution ditambahkan ke dalam isolat dan diinkubasi
pada suhu 800C selama 5 menit. RNase ditambahkan sebanyak 3 µL ke dalam isolat
dan diinkubasi pada suhu 370C selama 45 menit. Sebanyak 200 µL protein
precipitation solution ditambahkan, divorteks kemudian diinkubasi pada suhu 200C selama 5 menit. Setelah diinkubasi, isolat disentrifus pada kecepatan 21.920 g
selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke dalam
tabung mikro baru dan ditambahkan 600 µL isopropanol pada suhu 250C kemudian
divorteks. Isolat disentrifus kembali pada kecepatan 21.920 g selama 2 menit,
supernatan dibuang sedangkan pelet yang terbentuk ditambahkan etanol 70%
sebanyak 600 µL. Sentrifus kembali pada kecepatan 21.920 g selama 2 menit.
Buang supernatan, pelet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara selama
10-15 menit. Tahap terakhir isolat ditambahkan 100 µL rehydration solution dan
diinkubasi pada suhu 650C selama 1 jam (Promega 2010).
Analisis Kuantitatif DNA dengan Metode Nanodrop. Sebanyak 2 μL bufer
tris-EDTA (TE) dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu, tutup nanodrop dan
tekan tombol read blank pada komputer. Sisa bufer TE dibersihkan dengan tisu.
Isolat DNA dimasukkan sebanyak 2 μL ke dalam lubang ukur, kemudian pilih
menu read sample. Hasil pengukuran berupa nilai kemurnian isolat akan muncul
dalam satuan konsentrasi ng/μL. Kemudian DNA dapat dilihat berdasarkan nilai
Å260/Å280 (Thermo Fisher Scientific 2009).
Amplifikasi DNA. Hasil isolasi DNA genom isolat yang telah ditentukan
konsentrasinya selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR ESCO Swift Maxi
Termal Cycler Block model MX-BLC-7. Sebanyak 2 µL DNA (20 ng/µL)
ditambahkan ke dalam coktail PCR. Coktail PCR terdiri dari 12,5 µL GoTaq
master mix 2x (komposisi: laruan PCR bufer pH 8.5, 400µM dATP, 400µM dGTP,
400µM dCTP, 400µM dTTP dan 3mM MgCl), 1 µL primer (1.0µM) foward dan
reverse, dan 8,5 µL nuclease free water. Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi
suhu denaturasi awal 940C selama 3 menit dengan 1 siklus, denaturasi 940C selama
30 detik, penempelan 550C selama 30 detik, dan ekstensi 720C selama 30 detik
dengan 29 siklus, ekstensi akhir 720C selama 5 menit dengan 1 siklus (Poly et al.
2010 a,b).
Pemurnian Hasil PCR dan Visualisasi Amplikon. Hasil PCR selanjutnya
dimurnikan dengan Wizard SV Gel dan PCR Clean-Up System Promega. Hasil
PCR ditambahkan membran binding solution dengan volume yang sama kemudian
5
disaring melalui spin or vacuum (SV) minicolum yang telah dimasukkan ke tabung
mikro baru, inkubasi selama 1 menit. Selanjutnya sentrifus pada kecepatan 21.920 g
selama 1 menit, supernatan yang terbentuk dibuang. Sebanyak 700 µL membran
wash solution ditambahkan melalui saringan SV minicolum, kemudian sentrifus
kembali pada kecepatan dan waktu yang sama, supernatan dibuang kembali.
Sebanyak 500 µL membran wash solution ditambahkan kembali melalui SV
minicolum, sentrifus pada kecepatan 21.920 g selama 5 menit, supernatan dibuang,
lakukan sentrifus kembali pada kecepatan yang sama selama 1 menit. Pindahkan
SV minicolum ke dalam tabung mikro baru. Nuclease free water sebanyak 20 µL
ditambahkan melalui SV minicolum kemudian sentrifus pada kecepatan 21.920 g
selama 1 menit. Selanjutnya, DNA hasil amplifikasi yang telah dimurnikan
divisualisasi melalui elektroforesis dengan gel agarosa 1% (Promega 2010).
Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
Sebanyak satu ose isolat dari media NFB padat yang telah terseleksi dapat
melakukan penambatan nitrogen dan hidup pada kondisi salin, dikulturkan kembali
pada media NFB semi padat. Isolat diinkubasi pada suhu 250C selama 5 hari.
Kultur isolat yang terbentuk selanjutnya digunakan untuk pengujian kuantitatif
aktivitas nitrogenase dengan menggunakan kromatografi gas (Ding et al.2005).
Alat kromatografi gas yang akan digunakan dikondisikan terlebih dahulu
selama ±3 jam sebelum dilakukan penyuntikan isolat. Kromatografi gas diatur suhu
inisial sebesar 1000C, suhu injektor sebesar 1500C, suhu detektor sebesar 2000C dan
suhu akhir sebesar 1000C. Gas pembawa dan aliran gas yang digunakan adalah
nitrogen (40 psi), hidrogen (1.5 kgf.cm-2), dan udara (0.5 kgf.cm-2) (Hawkes 2001).
Kurva standar dibuat dengan menggunakan standar etilen dengan
konsentrasi 0, 50, 100, 150, 175, 200 dan 225 µgram.mL-1. Kromatogram yang
dihasilkan selanjutnya dibaca dan hasil yang diperoleh kemudian diplotkan menjadi
kurva standar etilen hubungan antara konsentrasi dengan luas area standar untuk
mengetahui konsentrasi gas etilen yang terbentuk pada masing-masing isolat yang
diujikan.
Kultur isolat yang telah ditumbuhkan pada media NFB semi padat
sebelumnya diganti tutup kapasnya dengan tutup karet. Gas yang ada di dalam
tabung diambil sebanyak 1 mL dengan microsyringe kemudian ke dalamnya
diinjeksikan gas asetilen (C2H2) dengan volume yang sama. Selanjutnya, isolat
diinkubasi selama 1 jam. Setelah dilakukan inkubasi, gas pada bagian headspace
diambil kembali sebanyak 1 mL untuk diukur konsentrasi etilen (C2H4) yang
terbentuk karena adanya aktivitas nitrogenase dengan teknik kromatografi gas
(Hawkes 2001).
HASIL
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
Sebanyak 50 isolat awal dimurnikan dan diremajakan kembali pada media
NFB padat. Dari 50 isolat awal, 47 isolat dapat tumbuh pada media NFB padat.
Isolat-isolat tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas nitrogenasenya secara kualitatif
6
pada media NFB semi padat. Berdasarkan penelitian yang dilakukan, terseleksi 9
isolat yang dapat menunjukkan adanya aktivitas nitrogenase pada media NFB semi
padat, yaitu isolat Er B1 2, Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10, Ptb B1 4, Ptb B2 5,
Ptb B2 8, dan Ptb B2 10. Adanya aktivitas nitrogenase ditandai dengan
terbentuknya pelikel putih pada media (Lampiran 3).
Tabel 1 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase pada media NFB semi padat
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Isolat
Er B1 2
Er B1 3
Er B1 4
Er B1 9
Er B2 10
Ptb B1 4
Ptb B2 5
Ptb B2 8
Ptb B2 10
Pelikel yang terbentuk
+++
++
++
+++
+++
++
+++
++
+++
Keterangan: + = pelikel tipis, ++ = pelikel tebal, +++ = pelikel sangat tebal
Hasil Uji Salinitas Nitrogenase
Selanjutnya dari 9 isolat yang terseleksi, diuji kembali aktivitas nitrogenase
pada media salinitas 10% dan 20%. Berdasarkan penelitian yang dilakukan
didapatkan hasil, hanya 5 isolat yang terseleksi tetap dapat menunjukkan aktivitas
nitrogenase pada kondisi kadar garam tinggi. Pada media salinitas 10%, yaitu isolat
Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, dan Er B2 10 sedangkan pada media salinitas 20%, yaitu
isolat Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10 dan Ptb B1 4. Adanya aktivitas
nitrogenase ditandai dengan terbentuknya pelikel berwarna putih pada media
(Lampiran 4).
Tabel 2 Hasil uji salinitas terhadap aktivitas nitrogenase pada media salinitas 10%
dan 20%
No
Isolat
1
2
3
4
5
Er B1 3
Er B1 4
Er B1 9
Er B2 10
Ptb B1 4
Pelikel yang terbentuk
Salinitas 10%
Salinitas 20%
+
+
++
++
+++
+++
+++
+++
+
Keterangan: - = tidak terbentuk pelikel, + = pelikel tipis, ++ = pelikel tebal, +++ =
pelikel sangat tebal
Amplikon Gen nifH
Tahap selanjutnya, kelima isolat yang dapat menunjukkan aktivitas
nitrogenase pada kondisi salin diidentifikasi subunit pembentuk kompleks
nitrogenase, yaitu gen nifH. Identifikasi gen nifH dilakukan dengan menggunakan
7
primer spesifik nifHr dan nifHf. Gen nifH diamplifikasi dengan metode PCR dan
menghasilkan pita berukuran ~360 bp (Gambar 1).
M
1
2
3
4
5
12000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
400 bp
~ 360 bp
Gambar 1 Amplikon gen nifH berukuran ~360 bp (Keterangan: M= Marker 1 kb,
1= Er B1 3, 2= Er B1 4, 3= Er B1 9, 4= Er B2 10, dan 5= Ptb B1 4)
Hasil Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
Tahap terakhir dilakukan analisis kuantitatif aktivitas nitrogenase kelima
isolat dengan menggunakan metode ARA. Tahap awal, dilakukan pembuatan kurva
standar hubungan antara konsentrasi gas etilen dengan luas area standar sehingga
didapatkan konsentrasi gas etilen yang terbentuk pada masing-masing isolat. Dari
konsentrasi gas etilen yang terbentuk tersebut selanjutnya dilakukan perhitungan
aktivitas nitrogenase untuk kelima isolat. Aktivitas nitrogenase isolat dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut (Hawkes 2001):
Tabel 3 Hasil analisis kuantitatif aktivitas nitrogenase dengan metode ARA
No
Kode
Isolat
1.
2.
3.
4.
5.
Er B1 3
Er B1 4
Er B1 9
Er B2 10
Ptb B1 4
Luas area
isolat
(unit
luas)
448092
632375
647667
788348
493318
Volume
total
(Vt)
(mL)
15
15
15
15
15
Volume
media
(Vm)
(mL)
8
8
9
8
9
Volume
headpace
(Vt-Vm)
(mL)
7
7
6
7
6
Konsentrasi
gas etilen
yang terbentuk
(µg.mL-1)
10.3016
14.2719
14.6015
17.6325
11.2759
Aktivitas
nitrogenase
(µmol.mL-1jam-1)
2,5754
3,5679
3,1288
4,4081
2,4163
8
PEMBAHASAN
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
Aktivitas nitrogenase pertama kali dianalisis secara kualitatif dengan cara
menguji kemampuan isolat dalam melakukan penambatan nitrogen pada media
spesifik. Di lingkungan, bakteri rhizosfer melakukan penambatan nitrogen dengan
tujuan memenuhi kebutuhannya untuk pembentukan asam nukleat (RNA dan DNA)
bakteri. Saat kebutuhan nitrogen bakteri rhizosfer telah terpenuhi, kelebihan
nitrogen akan dikeluarkan ke dalam tanah sehingga dapat digunakan oleh tanaman
melalui akar (Caton 2007). Bagi tanaman, nitrogen memiliki berbagai peranan
penting, yaitu meningkatkan pertumbuhan tanaman, menunjang pertumbuhan daun,
meningkatkan kadar protein dalam tubuh tanaman, meningkatkan kualitas tanaman,
sintesis asam nukleat (RNA dan DNA) dan sebagai komponen pigmen klorofil
yang diperlukan dalam proses fotosintesis (Choudhury dan Kennedy 2004) akan
tetapi di dalam tanah ketersediaan nitrogen terbatas sehingga proses penambatan
nitrogen dari atmosfir mutlak diperlukan di lingkungan karena pada akhirnya semua
kebutuhan nitrogen tanaman bergantung pada nitrogen yang ditambat dari atmosfir
(Buchanan et al. 2000).
Media spesifik yang digunakan untuk menganalisis aktivitas nitrogenase
isolat pada penelitian ini adalah media nitrogen free bromtimol blue (NFB). Media
NFB merupakan media pertumbuhan yang digunakan untuk menganalisis aktivitas
nitrogenase dalam melakukan penambatan nitrogen karena komposisi media yang
tidak mengandung unsur nitrogen sama sekali serta mampu menyediakan nutrisinutrisi lain yang dibutuhkan oleh isolat (Nurosid et al. 2008). Pada penelitian ini
media NFB yang digunakan memiliki pH sebesar 6.8 yang merupakan pH
pertumbuhan optimum dari isolat bakteri rhizosfer. Bakteri rhizosfer sangat sensitif
terhadap pH rendah sehingga pada pH
NITROGENASE YANG TAHAN KONDISI SALIN DAN
IDENTIFIKASI GEN nifH
SAFIRAH TASA NERVES RATU
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penapisan Bakteri
Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi
Gen nifH adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Mei 2014
Safirah Tasa Nerves Ratu
NIM G84100057
ABSTRAK
SAFIRAH TASA NERVES RATU. Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi
Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi Gen nifH.
Dibimbing oleh POPI ASRI KURNIATIN dan DWI NINGSIH
SUSILOWATI.
Penambatan nitrogen oleh bakteri rhizosfer dapat dimanfaatkan untuk
menyiasati dampak salinitas pada tanah sawah pesisir. Kemampuan tersebut
disebabkan oleh adanya aktivitas nitrogenase yang disandikan gen nifH pada
komponen II. Penelitian ini bertujuan menyeleksi sejumlah bakteri rhizosfer
yang dapat menunjukkan aktivitas nitrogenase pada kondisi salin serta
mengidentifikasi gen nifH. Sebanyak 50 isolat bakteri rhizosfer asal tanah
sawah pesisir Daerah Eretan dan Patimban, Jawa Barat telah dianalisis.
Lima isolat menunjukkan aktivitas nitrogenase pada kondisi salin, yaitu Er
B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10 dan Ptb B1 4. Gen nifH kelima isolat
diidentifikasi menggunakan polymerase chain reaction (PCR) menghasilkan
amplikon berukuran ~360 bp. Aktivitas nitrogenase tertinggi berdasarkan
analisis reduksi asetilen (ARA) terdapat pada isolat Er B2 10 sebesar 4,4081
µmol.mL-1jam-1.
Kata kunci: aktivitas nitrogenase, ARA, bakteri rhizosfer, gen nifH, lahan
pesisir
ABSTRACT
SAFIRAH TASA NERVES RATU. Screening of Nitrogenase Producing
and Saline Resistant Rhizosfer Paddy Bacteria and Identification of nifH
Gene. Supervised by POPI ASRI KURNIATIN dan DWI NINGSIH
SUSILOWATI.
The ability of nitrogen fixing by rhizosfer bacteria could be used to
decrease salinity impact in coastal rice field. It was caused by nitrogenase,
encoded by nifH gene in component II. The objectives of this research were
to screen of rhizosfer bacterias that have the nitrogenase activity in saline
condition and identify the presence of nifH gene. The fifty isolates of
rhizosfer bacteri isolated from coastal rice field Eretan and Patimban region,
West Java was analyzed. Five isolates showed the nitrogenase activity under
saline condition, are Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10 dan Ptb B1 4. The
identification of nifH gene from these 5 samples using polymerase chain
reaction (PCR) showed that the size is ~360 bp. The highest activity of
nitrogenase used acetylene reduction assay (ARA) was showed by Er B2 10
is 4,4081 µmol.mL-1hour-1.
Keywords : ARA, coastal soil, nifH gene, nitrogenase activity, rhizosfer
bacteria
PENAPISAN BAKTERI RHIZOSFER PADI PENGHASIL
NITROGENASE YANG TAHAN KONDISI SALIN DAN
IDENTIFIKASI GEN nifH
SAFIRAH TASA NERVES RATU
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
iv
Judul Skripsi : Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang
Tahan Kondisi Salin dan Identifikasi Gen nifH
Nama
: Safirah Tasa Nerves Ratu
NIM
: G84100057
Disetujui oleh
Popi Asri Kurniatin, SSiApt MSi
Pembimbing I
Dwi Ningsih Susilowati, STP MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
ii
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan November 2013 ini adalah Penapisan
Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi Salin dan
Identifikasi Gen nifH.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Popi Asri Kurniatin, SSiApt MSi
dan Ibu Dwi Ningsih Susilowati, STP MSi selaku pembimbing yang telah banyak
memberikan pengarahan dan saran. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Bapak Jajang, Ibu Aminah beserta seluruh staf Konservasi
Mikrobiologi BB-Biogen yang telah membantu selama pengumpulan data
penelitian. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, serta
seluruh keluarga dan teman-teman Biokimia 47 untuk segala doa, kasih sayang
dan dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Mei 2014
Safirah Tasa Nerves Ratu
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
iv
DAFTAR LAMPIRAN
iv
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan alat
2
Metode Penelitian
3
Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
3
Uji Salinitas Nitrogenase
3
Identifikasi Gen nifH dengan Metode PCR
4
Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
5
HASIL
5
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
5
Hasil Uji Salinitas Nitrogenase
6
Amplikon Gen nifH
6
Hasil Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
7
PEMBAHASAN
8
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
8
Hasil Uji Salinitas Nitrogenase
9
Amplikon Gen nifH
11
Hasil Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
12
SIMPULAN DAN SARAN
13
Simpulan
13
Saran
14
DAFTAR PUSTAKA
14
LAMPIRAN
18
iv
DAFTAR GAMBAR
1 Amplikon gen nifH berukuran ~360 bp
2 Proses pengubahan N2 menjadi NH3 yang dikatalisis nitrogenase
3 Kompleks nitrogenase
7
9
11
DAFTAR TABEL
1 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase pada media NFB semi
padat
2 Hasil uji salinitas terhadap aktivitas nitrogenase pada media salinitas
10% dan 20%
3 Hasil analisis kuantitatif aktivitas nitrogenase dengan metode ARA
6
6
7
DAFTAR LAMPIRAN
1 Isolat-isolat bakteri rhizosfer yang digunakan dalam penelitian
2 Diagram alir penelitian
3 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase isolat pada media NFB
semi padat
4 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase isolat pada media
salinitas 10% dan 20%
5 Konsentrasi dan kemurnian DNA isolat
6 Isolat yang dilakukan uji ARA dengan kromatografi gas
7 Contoh kromatogram, hasil pengukuran standar etilen yang digunakan
dan contoh perhitungan aktivitas nitrogenase isolat
19
20
21
21
21
22
23
PENDAHULUAN
Peningkatan permukaan air laut sebagai efek dari pemanasan global
merupakan masalah serius yang harus dihadapi sektor pertanian daerah pesisir
Indonesia. Berdasarkan hasil kajian the Intergovernmental Panel on Climate
Change (IPCC 2007) menunjukkan bahwa sejak tahun 1850, tercatat terdapat 12
tahun terpanas berdasarkan data suhu permukaan global. Sebelas dari 12 tahun
terpanas tersebut terjadi dalam waktu 12 tahun terakhir. Kenaikan suhu total dari
tahun 1850−1899 sampai dengan 2001−2005 tercatat mencapai 0,76°C. Permukaan
air laut global juga meningkat dengan laju rata-rata 1,80 mm/tahun dalam kurun
waktu tahun 1961−2003. Kenaikan total permukaan air laut yang berhasil dicatat
pada abad ke-20 diperkirakan mencapai 0,17 m. Dampak paling nyata dari
peningkatan permukaan air laut adalah penciutan lahan pertanian di pesisir pantai
(Jawa, Bali, Sumatera Utara, Lampung, Nusa Tenggara Barat, dan Kalimantan),
kerusakan infrastruktur pertanian, dan peningkatan salinitas yang merusak tanaman
(Las 2007). Hal ini dapat terjadi karena adanya akumulasi garam-garam berupa
NaCl yang dapat menurunkan produktivitas pertanian di daerah pesisir pantai.
Dampak peningkatan permukaan air laut yang demikian besar terhadap sektor
pertanian di daerah pesisir memerlukan upaya aktif untuk mengantisipasinya
melalui strategi mitigasi dan adaptasi lahan salin tersebut (Elza et al. 2010).
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengatasi permasalahan tersebut,
di antaranya penelitian mengenai teknologi identifikasi dan rehabilitasi tanah salin,
pengembangan varietas tanaman tahan kondisi salin serta telah dilakukan pemetaan
salinitas tanah daerah pesisir. Namun demikian, upaya untuk menyiasati adanya
dampak salinitas pada lahan sawah daerah pesisir dari aspek mikrobiologis belum
banyak dilakukan. Salah satu peran mikrobiologis yang dapat dimanfaatkan untuk
menyiasati permasalahan tanah salin daerah pesisir adalah dengan memanfaatkan
keberadaan bakteri yang mampu menyediakan unsur hara utama yang dibutuhkan
oleh tanaman, seperti unsur nitrogen (N) (Elza et al. 2010).
Nitrogen menyusun sekitar 78% dari keseluruhan gas yang ada di atmosfir.
Meskipun keberadaannya sangat melimpah di atmosfir, nitrogen tidak dapat
digunakan langsung oleh tanaman. Pengolahan kimia atau fiksasi alami nitrogen
diperlukan untuk mengkonversi gas nitrogen menjadi bentuk yang dapat digunakan
oleh tanaman. Fiksasi alami nitrogen dari atmosfir dapat dilakukan oleh bakteri
tanah agar ketersediaan unsur nitrogen bagi tanaman tetap tercukupi meskipun
tumbuh di wilayah marjinal dengan kandungan unsur hara yang sangat rendah,
seperti pesisir pantai. Salah satu bakteri yang dapat melakukan penambatan
nitrogen dari atmosfir adalah bakteri rhizosfer (Handayanto dan Hairiah 2007).
Bakteri rhizosfer merupakan bakteri yang hidup di daerah perakaran (rhizosfer)
tanaman yang memiliki kemampuan mengikat N2 bebas di udara dan mereduksinya
menjadi senyawa ammonia. Kemampuan bakteri tersebut untuk melakukan
penambatan nitrogen disebabkan oleh aktivitas nitrogenase (Buchanan et al. 2000).
Nitrogenase merupakan enzim kompleks yang terlibat dalam proses fiksasi
nitrogen. Nitrogenase berperan dalam pengubahan bentuk nitrogen bebas (N2) di
udara menjadi bentuk terikat, amonia (NH3). Nitrogenase terdiri atas dua
komponen, yaitu komponen I (dinitrogenase atau protein Fe-Mo) dan komponen II
(dinitrogenase reduktase atau protein Fe). Nitrogenase dikode oleh sekitar 20 gen
2
nif, yaitu: nifA, nifB, nifZ, nifH, nifD, nifK, nifE, nifN, nifX, nifO, nifU, nifS, nifV,
nifW, nifT, nifY, nifE, nifM, nifF, nifL (Lee et al. 2000) dan di antara 20 gen nif
tersebut, gen nifH merupakan gen terpenting yang dapat digunakan untuk
mendeteksi keberadaan nitrogenase karena mengkodekan sub unit pembentuk
kompleks nitrogenase (Choo et al. 2003). Gen nifH mengkode komponen II pada
nitrogenase yang merupakan homodimer dengan berat molekul 60-70 kilodalton
(kDa) (Chai 2007).
Sebanyak 50 isolat bakteri rhizosfer telah berhasil diisolasi dari tanah sawah
pesisir Daerah Eretan dan Patimban, Jawa Barat. Isolat-isolat bakteri tersebut belum
dilakukan analisis aktivitas nitrogenase dan diidentifikasi keberadaan gen nifH
sehingga penelitian tersebut perlu dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk
menyeleksi sejumlah bakteri rhizosfer yang menunjukkan aktivitas nitrogenase
pada kondisi salin dan mengidentifikasi subunit pembentuk kompleks nitrogenase,
yaitu gen nifH. Informasi yang akan diperoleh nantinya diharapkan dapat
membantu pemanfaatan bakteri rhizosfer sebagai agen biofertilizer untuk lahan
salin.
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2013 hingga bulan
Februari 2014 di Laboratorium Konservasi Mikroorganisme, Balai Penelitian dan
Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian, Bogor.
METODE
Bahan dan alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 50 isolat bakteri
rhizosfer asal tanah sawah pesisir Daerah Eretan dan Patimban, Jawa Barat
(Lampiran 8), DL-malic acid, KOH, K2HPO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, NaCl,
CaCl2, Na2MoO4.2H2O, bacto agar, FeSO4.7H2O, Wizard Genomic DNA
Purification KIT Promega, Wizard SV Gel dan PCR Clean-Up System Promega,
bromtimol blue (BTB) 0.5%, agarosa, media lactose broth (LB), etilen diamin tetra
asam asetat (EDTA) 50 mM, bufer tris-EDTA (TE) 0.1x, bufer tris-asetat EDTA
(TAE) 0.5x, ethidium bromida (EtBr), primer universal untuk identifikasi gen nifH:
primer nifHf (5’GGCAAGGGCGGTATCGGCAAGTC’3) dan primer nifHr
(5’CCATCGTGATCGGGTCGGGATG’3), komponen PCR, yaitu: Gotaq DNA
polimerase 2x, loading dyne 6x, nuclease free water, akuades, pendana ukuran 1kb,
dan gas C2H2.
Peralatan yang digunakan adalah sarung tangan karet, tabung reaksi, tabung
ulir, jarum ose, tabung mikro, alat-alat gelas, pipet mikro, microsyringe, coolbox,
ice maker, tip, magnet stirer, shaker IKA KS 260 Basic model KS260B, neraca
analitik Scaltec model SPB31, laminar air flow cabinet ESCO Labculture Class II
model A2, pH meter Cyberscan Cutech Instrument model pH 510, autoklaf
Wiseclave Digital Fuzzy Control System model WAC-47, nanodrop Thermo Fisher
Scientific model 2000c, microwave LG model MC8087AR, inkubator Memmert
model INB 200-500, mikrofus 22R Beckman Coulter model AH025XX, ultra
violet (UV)-transilluminator SCOPE 21, perangkat elektroforesis Biorad Power
PAC 300 model MSMIDI, perangkat polymerase chain reaction (PCR) ESCO
3
Swift Maxi Termal Cycler Block model MX-BLC-7, stiring Barnstead International
model SP131014, waterbath Memmert model WNB 7-45, dan kromotografi gas
Hitachi model 263-50 dengan detektor flame ionization detector (FID).
Metode Penelitian
Penapisan Bakteri Rhizosfer Padi Penghasil Nitrogenase yang Tahan Kondisi
Salin dan Identifikasi Gen nifH pada penelitian ini terbagi menjadi 4 tahapan
penting, yaitu analisis kualitatif aktivitas nitrogenase, uji salinitas nitrogenase,
identifikasi gen nifH dengan metode polymerase chain reaction (PCR), dan analisis
kuantitatif aktivitas nitrogenase dengan metode analisis reduksi asetilen (ARA).
Tahapan awal, isolat ditumbuhkan pada media spesifik nitrogen free bromtimol
blue (NFB) semi padat untuk menyeleksi sejumlah isolat yang dapat menunjukkan
adanya aktivitas nitrogenase. Selanjutnya, isolat yang terseleksi diuji kembali
aktivitas nitrogenasenya pada media salinitas 10% dan 20%. Uji ini bertujuan
melihat pengaruh salinitas terhadap aktivitas nitrogenase yang dimiliki isolat.
Setelah dilakukan uji salinitas, tahap selanjutnya dilakukan identifikasi gen
pembentuk kompleks nitrogenase, yaitu gen nifH. Identifikasi gen nifH isolat
dilakukan dengan menggunakan teknik PCR. Tahap terakhir, dilakukan analisis
kuantitatif aktivitas nitrogenase isolat dengan metode ARA menggunakan
kromatografi gas.
Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
Pembuatan Media Nitrogen Free Bromtimol Blue (NFB) padat dan semi
padat. Media NFB padat dan semi padat dibuat dari komposisi bahan-bahan yang
sama. Sebanyak 5 g DL-malic acid, KOH 4 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4.7H2O 0.1 g,
MnSO4.H2O 0.05 g, NaCl 0.02 g, CaCl2 0.01 g, FeSO4.7H2O 0.05 g,
Na2MoO4.2H2O 0.002 g dan bacto agar 30 g untuk media NFB padat sedangkan
untuk media NFB semi padat ditambahkan bacto agar sebanyak 1.75 g serta
bromtimol blue (BTB) 0.5% sebanyak 2 mL. Semua bahan dilarutkan di dalam
akuades kemudian volumenya ditera hingga mencapai 1000 mL dan dibuat hingga
pH-nya mencapai 6.8. Media kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 1
atm dan suhu 121ºC selama 15 menit (Ding et al. 2005).
Peremajaan dan Permurnian Isolat. Sebanyak 1 ose koloni isolat diambil
dari stok kultur awal kemudian ditumbuhkan pada media NFB padat dengan
metode gores dan diinkubasi pada suhu 250C selama 5 hari (Ding et al. 2005).
Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase. Sebanyak 1 ose koloni isolat
yang dapat tumbuh pada media NFB padat ditumbuhkan kembali pada media NFB
semi padat dan diinkubasi pada suhu 250C selama 5 hari. Tahapan ini dilakukan
triplo (Ding et al. 2005).
Uji Salinitas Nitrogenase
Sebanyak 1 ose koloni isolat diambil dari media NFB padat kemudian
ditumbuhkan pada media salinitas. Media salinitas memiliki komposisi bahan yang
sama dengan media NFB semi padat hanya saja ditambahkan NaCl sebanyak 10 g
(konsentrasi 10%) dan 20 g (konsentrasi 20%) untuk volume 100 mL. Selanjutnya
4
isolat diinkubasi pada suhu 250C selama 14 hari. Tahapan ini dilakukan triplo (Ding
et al. 2005).
Identifikasi Gen nifH dengan Metode PCR
Isolasi DNA Genom. Isolasi DNA genom isolat dilakukan dengan Wizard
Genomic DNA Purification KIT Promega. Kultur isolat yang telah ditumbuhkan
pada media lactose broth (LB) dipindahkan ke tabung mikro sebanyak 1.5 mL dan
disentrifus selama 2 menit pada kecepatan 21.920 g. Pelet yang terbentuk diambil
dan supernatan dibuang. Pelet isolat bakteri gram negatif langsung dilakukan proses
lisis sel sedangkan pelet isolat bakteri gram positif diresuspensikan terlebih dahulu
dengan etilen diamin tetra asam asetat (EDTA) 50 mM sebanyak 480µL,
ditambahkan 120 µL lisozim, diinkubasi pada suhu 370C selama 45 menit dan
disentrifus pada kecepatan 21.920 g selama 2 menit. Pelet yang terbentuk kemudian
diambil dan supernatan dibuang. Tahap selanjutnya dilakukan proses lisis sel.
Sebanyak 600 µL nuclei lysis solution ditambahkan ke dalam isolat dan diinkubasi
pada suhu 800C selama 5 menit. RNase ditambahkan sebanyak 3 µL ke dalam isolat
dan diinkubasi pada suhu 370C selama 45 menit. Sebanyak 200 µL protein
precipitation solution ditambahkan, divorteks kemudian diinkubasi pada suhu 200C selama 5 menit. Setelah diinkubasi, isolat disentrifus pada kecepatan 21.920 g
selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke dalam
tabung mikro baru dan ditambahkan 600 µL isopropanol pada suhu 250C kemudian
divorteks. Isolat disentrifus kembali pada kecepatan 21.920 g selama 2 menit,
supernatan dibuang sedangkan pelet yang terbentuk ditambahkan etanol 70%
sebanyak 600 µL. Sentrifus kembali pada kecepatan 21.920 g selama 2 menit.
Buang supernatan, pelet dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di udara selama
10-15 menit. Tahap terakhir isolat ditambahkan 100 µL rehydration solution dan
diinkubasi pada suhu 650C selama 1 jam (Promega 2010).
Analisis Kuantitatif DNA dengan Metode Nanodrop. Sebanyak 2 μL bufer
tris-EDTA (TE) dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu, tutup nanodrop dan
tekan tombol read blank pada komputer. Sisa bufer TE dibersihkan dengan tisu.
Isolat DNA dimasukkan sebanyak 2 μL ke dalam lubang ukur, kemudian pilih
menu read sample. Hasil pengukuran berupa nilai kemurnian isolat akan muncul
dalam satuan konsentrasi ng/μL. Kemudian DNA dapat dilihat berdasarkan nilai
Å260/Å280 (Thermo Fisher Scientific 2009).
Amplifikasi DNA. Hasil isolasi DNA genom isolat yang telah ditentukan
konsentrasinya selanjutnya diamplifikasi dengan mesin PCR ESCO Swift Maxi
Termal Cycler Block model MX-BLC-7. Sebanyak 2 µL DNA (20 ng/µL)
ditambahkan ke dalam coktail PCR. Coktail PCR terdiri dari 12,5 µL GoTaq
master mix 2x (komposisi: laruan PCR bufer pH 8.5, 400µM dATP, 400µM dGTP,
400µM dCTP, 400µM dTTP dan 3mM MgCl), 1 µL primer (1.0µM) foward dan
reverse, dan 8,5 µL nuclease free water. Proses amplifikasi dilakukan pada kondisi
suhu denaturasi awal 940C selama 3 menit dengan 1 siklus, denaturasi 940C selama
30 detik, penempelan 550C selama 30 detik, dan ekstensi 720C selama 30 detik
dengan 29 siklus, ekstensi akhir 720C selama 5 menit dengan 1 siklus (Poly et al.
2010 a,b).
Pemurnian Hasil PCR dan Visualisasi Amplikon. Hasil PCR selanjutnya
dimurnikan dengan Wizard SV Gel dan PCR Clean-Up System Promega. Hasil
PCR ditambahkan membran binding solution dengan volume yang sama kemudian
5
disaring melalui spin or vacuum (SV) minicolum yang telah dimasukkan ke tabung
mikro baru, inkubasi selama 1 menit. Selanjutnya sentrifus pada kecepatan 21.920 g
selama 1 menit, supernatan yang terbentuk dibuang. Sebanyak 700 µL membran
wash solution ditambahkan melalui saringan SV minicolum, kemudian sentrifus
kembali pada kecepatan dan waktu yang sama, supernatan dibuang kembali.
Sebanyak 500 µL membran wash solution ditambahkan kembali melalui SV
minicolum, sentrifus pada kecepatan 21.920 g selama 5 menit, supernatan dibuang,
lakukan sentrifus kembali pada kecepatan yang sama selama 1 menit. Pindahkan
SV minicolum ke dalam tabung mikro baru. Nuclease free water sebanyak 20 µL
ditambahkan melalui SV minicolum kemudian sentrifus pada kecepatan 21.920 g
selama 1 menit. Selanjutnya, DNA hasil amplifikasi yang telah dimurnikan
divisualisasi melalui elektroforesis dengan gel agarosa 1% (Promega 2010).
Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
Sebanyak satu ose isolat dari media NFB padat yang telah terseleksi dapat
melakukan penambatan nitrogen dan hidup pada kondisi salin, dikulturkan kembali
pada media NFB semi padat. Isolat diinkubasi pada suhu 250C selama 5 hari.
Kultur isolat yang terbentuk selanjutnya digunakan untuk pengujian kuantitatif
aktivitas nitrogenase dengan menggunakan kromatografi gas (Ding et al.2005).
Alat kromatografi gas yang akan digunakan dikondisikan terlebih dahulu
selama ±3 jam sebelum dilakukan penyuntikan isolat. Kromatografi gas diatur suhu
inisial sebesar 1000C, suhu injektor sebesar 1500C, suhu detektor sebesar 2000C dan
suhu akhir sebesar 1000C. Gas pembawa dan aliran gas yang digunakan adalah
nitrogen (40 psi), hidrogen (1.5 kgf.cm-2), dan udara (0.5 kgf.cm-2) (Hawkes 2001).
Kurva standar dibuat dengan menggunakan standar etilen dengan
konsentrasi 0, 50, 100, 150, 175, 200 dan 225 µgram.mL-1. Kromatogram yang
dihasilkan selanjutnya dibaca dan hasil yang diperoleh kemudian diplotkan menjadi
kurva standar etilen hubungan antara konsentrasi dengan luas area standar untuk
mengetahui konsentrasi gas etilen yang terbentuk pada masing-masing isolat yang
diujikan.
Kultur isolat yang telah ditumbuhkan pada media NFB semi padat
sebelumnya diganti tutup kapasnya dengan tutup karet. Gas yang ada di dalam
tabung diambil sebanyak 1 mL dengan microsyringe kemudian ke dalamnya
diinjeksikan gas asetilen (C2H2) dengan volume yang sama. Selanjutnya, isolat
diinkubasi selama 1 jam. Setelah dilakukan inkubasi, gas pada bagian headspace
diambil kembali sebanyak 1 mL untuk diukur konsentrasi etilen (C2H4) yang
terbentuk karena adanya aktivitas nitrogenase dengan teknik kromatografi gas
(Hawkes 2001).
HASIL
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
Sebanyak 50 isolat awal dimurnikan dan diremajakan kembali pada media
NFB padat. Dari 50 isolat awal, 47 isolat dapat tumbuh pada media NFB padat.
Isolat-isolat tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas nitrogenasenya secara kualitatif
6
pada media NFB semi padat. Berdasarkan penelitian yang dilakukan, terseleksi 9
isolat yang dapat menunjukkan adanya aktivitas nitrogenase pada media NFB semi
padat, yaitu isolat Er B1 2, Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10, Ptb B1 4, Ptb B2 5,
Ptb B2 8, dan Ptb B2 10. Adanya aktivitas nitrogenase ditandai dengan
terbentuknya pelikel putih pada media (Lampiran 3).
Tabel 1 Hasil analisis kualitatif aktivitas nitrogenase pada media NFB semi padat
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Isolat
Er B1 2
Er B1 3
Er B1 4
Er B1 9
Er B2 10
Ptb B1 4
Ptb B2 5
Ptb B2 8
Ptb B2 10
Pelikel yang terbentuk
+++
++
++
+++
+++
++
+++
++
+++
Keterangan: + = pelikel tipis, ++ = pelikel tebal, +++ = pelikel sangat tebal
Hasil Uji Salinitas Nitrogenase
Selanjutnya dari 9 isolat yang terseleksi, diuji kembali aktivitas nitrogenase
pada media salinitas 10% dan 20%. Berdasarkan penelitian yang dilakukan
didapatkan hasil, hanya 5 isolat yang terseleksi tetap dapat menunjukkan aktivitas
nitrogenase pada kondisi kadar garam tinggi. Pada media salinitas 10%, yaitu isolat
Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, dan Er B2 10 sedangkan pada media salinitas 20%, yaitu
isolat Er B1 3, Er B1 4, Er B1 9, Er B2 10 dan Ptb B1 4. Adanya aktivitas
nitrogenase ditandai dengan terbentuknya pelikel berwarna putih pada media
(Lampiran 4).
Tabel 2 Hasil uji salinitas terhadap aktivitas nitrogenase pada media salinitas 10%
dan 20%
No
Isolat
1
2
3
4
5
Er B1 3
Er B1 4
Er B1 9
Er B2 10
Ptb B1 4
Pelikel yang terbentuk
Salinitas 10%
Salinitas 20%
+
+
++
++
+++
+++
+++
+++
+
Keterangan: - = tidak terbentuk pelikel, + = pelikel tipis, ++ = pelikel tebal, +++ =
pelikel sangat tebal
Amplikon Gen nifH
Tahap selanjutnya, kelima isolat yang dapat menunjukkan aktivitas
nitrogenase pada kondisi salin diidentifikasi subunit pembentuk kompleks
nitrogenase, yaitu gen nifH. Identifikasi gen nifH dilakukan dengan menggunakan
7
primer spesifik nifHr dan nifHf. Gen nifH diamplifikasi dengan metode PCR dan
menghasilkan pita berukuran ~360 bp (Gambar 1).
M
1
2
3
4
5
12000 bp
2000 bp
1000 bp
500 bp
400 bp
~ 360 bp
Gambar 1 Amplikon gen nifH berukuran ~360 bp (Keterangan: M= Marker 1 kb,
1= Er B1 3, 2= Er B1 4, 3= Er B1 9, 4= Er B2 10, dan 5= Ptb B1 4)
Hasil Analisis Kuantitatif Aktivitas Nitrogenase dengan Metode ARA
Tahap terakhir dilakukan analisis kuantitatif aktivitas nitrogenase kelima
isolat dengan menggunakan metode ARA. Tahap awal, dilakukan pembuatan kurva
standar hubungan antara konsentrasi gas etilen dengan luas area standar sehingga
didapatkan konsentrasi gas etilen yang terbentuk pada masing-masing isolat. Dari
konsentrasi gas etilen yang terbentuk tersebut selanjutnya dilakukan perhitungan
aktivitas nitrogenase untuk kelima isolat. Aktivitas nitrogenase isolat dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut (Hawkes 2001):
Tabel 3 Hasil analisis kuantitatif aktivitas nitrogenase dengan metode ARA
No
Kode
Isolat
1.
2.
3.
4.
5.
Er B1 3
Er B1 4
Er B1 9
Er B2 10
Ptb B1 4
Luas area
isolat
(unit
luas)
448092
632375
647667
788348
493318
Volume
total
(Vt)
(mL)
15
15
15
15
15
Volume
media
(Vm)
(mL)
8
8
9
8
9
Volume
headpace
(Vt-Vm)
(mL)
7
7
6
7
6
Konsentrasi
gas etilen
yang terbentuk
(µg.mL-1)
10.3016
14.2719
14.6015
17.6325
11.2759
Aktivitas
nitrogenase
(µmol.mL-1jam-1)
2,5754
3,5679
3,1288
4,4081
2,4163
8
PEMBAHASAN
Hasil Analisis Kualitatif Aktivitas Nitrogenase
Aktivitas nitrogenase pertama kali dianalisis secara kualitatif dengan cara
menguji kemampuan isolat dalam melakukan penambatan nitrogen pada media
spesifik. Di lingkungan, bakteri rhizosfer melakukan penambatan nitrogen dengan
tujuan memenuhi kebutuhannya untuk pembentukan asam nukleat (RNA dan DNA)
bakteri. Saat kebutuhan nitrogen bakteri rhizosfer telah terpenuhi, kelebihan
nitrogen akan dikeluarkan ke dalam tanah sehingga dapat digunakan oleh tanaman
melalui akar (Caton 2007). Bagi tanaman, nitrogen memiliki berbagai peranan
penting, yaitu meningkatkan pertumbuhan tanaman, menunjang pertumbuhan daun,
meningkatkan kadar protein dalam tubuh tanaman, meningkatkan kualitas tanaman,
sintesis asam nukleat (RNA dan DNA) dan sebagai komponen pigmen klorofil
yang diperlukan dalam proses fotosintesis (Choudhury dan Kennedy 2004) akan
tetapi di dalam tanah ketersediaan nitrogen terbatas sehingga proses penambatan
nitrogen dari atmosfir mutlak diperlukan di lingkungan karena pada akhirnya semua
kebutuhan nitrogen tanaman bergantung pada nitrogen yang ditambat dari atmosfir
(Buchanan et al. 2000).
Media spesifik yang digunakan untuk menganalisis aktivitas nitrogenase
isolat pada penelitian ini adalah media nitrogen free bromtimol blue (NFB). Media
NFB merupakan media pertumbuhan yang digunakan untuk menganalisis aktivitas
nitrogenase dalam melakukan penambatan nitrogen karena komposisi media yang
tidak mengandung unsur nitrogen sama sekali serta mampu menyediakan nutrisinutrisi lain yang dibutuhkan oleh isolat (Nurosid et al. 2008). Pada penelitian ini
media NFB yang digunakan memiliki pH sebesar 6.8 yang merupakan pH
pertumbuhan optimum dari isolat bakteri rhizosfer. Bakteri rhizosfer sangat sensitif
terhadap pH rendah sehingga pada pH