Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah (Psidium guajava L.)
INDUKSI KALUS DAN EMBRIO SOMATIK
TANAMAN JAMBU BIJI MERAH (Psidium guajava L.)
REZA RAMDAN RIVAI
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Induksi Kalus dan
Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah (Psidium guajava L.) adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Reza Ramdan Rivai
NIM A24090018
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada kerja sama yang terkait.
2
ABSTRAK
REZA RAMDAN RIVAI. Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu
Biji Merah (Psidium guajava L.). Dibimbing oleh AGUS PURWITO dan ALI
HUSNI.
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh protokol yang tepat dalam
menginduksi kalus dan embrio somatik tanaman jambu biji merah. Penelitian ini
dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor pada bulan September
2012 sampai dengan bulan Maret 2013. Penelitian tersusun atas dua percobaan
yaitu induksi kalus dan induksi embrio somatik. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa media induksi kalus dengan komposisi zat pengatur tumbuh R2 (MS + 5
mg l-1 2.4-D), R4 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP) dan R5 (MS + 2.5 mg l-1
2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) merupakan perlakuan terbaik untuk menginduksi kalus
kompak pada 4 minggu setelah tanam (MST), sedangkan untuk menginduksi
kalus remah didapatkan media dengan perlakuan zat pengatur tumbuh terbaik
yaitu R6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP). Embrio somatik primer terbentuk
pada perlakuan KR1E4 (kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D dipindahkan ke
media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) dan perlakuan KR6E4 (kalus dari
media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dipindahkan ke media 1 mg l-1 2.4-D +
2 mg l-1 2-iP) masing-masing pada 12 dan 16 MST.
Kata kunci: embrio somatik, jambu biji merah, kalus, zat pengatur tumbuh
ABSTRACT
REZA RAMDAN RIVAI. Callus and Somatic Embryo Induction of Guava
(Psidium guajava L.). Supervised by AGUS PURWITO and ALI HUSNI.
The objective of the research was to get the best protocol for callus and
somatic embryo induction of guava. The experiment was conducted at Tissue
Culture Laboratory, Department of Agronomy and Horticulture, Faculty of
Agriculture, Bogor Agricultural University from September 2012 until March
2013. The research was arranged into two experiments, that were callus induction
and somatic embryo induction. The results showed that media with plant growth
regulator composition treatments R2 (MS + 5 mg l-1 2.4-D), R4 (MS + 5 mg l-1
2.4-D + 1 mg l-1 BAP) and R5 (MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) were the
best treatments for inducting compact callus in 4 weeks after culture (WAC). In
while, the friable callus can be induced at media with plant growth regulator
composition treatment R6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP). The primary
somatic embryos can be induced at the treatment KR1E4 (callus from MS + 2.5
mg l-1 2.4-D was moved into MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) and the
treatment KR6E4 (callus from MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP was moved into
MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) in 12 and 16 WAC for each treatment.
Keywords: callus, guava, plant growth regulator, somatic embryo
3
INDUKSI KALUS DAN EMBRIO SOMATIK
TANAMAN JAMBU BIJI MERAH (Psidium guajava L.)
REZA RAMDAN RIVAI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Agronomi dan Hortikultura
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
4
5
Judul Skripsi : Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah
(Psidium guajava L.)
Nama
: Reza Ramdan Rivai
NIM
: A24090018
Disetujui oleh
Dr Ir Agus Purwito, MScAgr
Pembimbing I
Dr Ir Ali Husni, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Agus Purwito, MScAgr
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
6
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
Penelitian tentang Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah
(Psidium guajava L.) telah dilaksanakan sejak bulan September 2012 hingga
bulan Maret 2013 di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penulis juga mengucapakan terima kasih kepada Dr Ir Agus Purwito,
MScAgr dan Dr Ir Ali Husni, MSi selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, koreksi dan masukan dalam pembuatan skripsi ini.
Ucapan terima kasih juga saya sampaikan kepada keluarga, teman-teman dan
semua pihak yang turut membantu dalam pembuatan skripsi ini. Semoga skripsi
ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
Reza Ramdan Rivai
7
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN .......................................................................................
Latar Belakang ....................................................................................
Tujuan .................................................................................................
Hipotesis .............................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................
Tanaman Jambu Biji ...........................................................................
Budidaya Tanaman Jambu Biji ...........................................................
Kultur Jaringan Tanaman ..................................................................
Zat pengatur tumbuh ...........................................................................
Eksplan ................................................................................................
Embriogenesis Somatik .....................................................................
Media Kultur Jaringan Tanaman .......................................................
Kultur Jaringan Tanaman Jambu Biji ................................................
BAHAN DAN METODE ...........................................................................
Tempat dan Waktu ..............................................................................
Bahan dan Alat ..................................................................................
Metode Percobaan ..............................................................................
Analisis Data .......................................................................................
Pelaksanaan Percobaan .......................................................................
Pembuatan Media Tanam ..........................................................
Sterilisasi Eksplan .....................................................................
Penanaman Eksplan ...................................................................
Pengamatan .........................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................
Percobaan 1: Induksi Kalus ................................................................
Persentase Eksplan Berkalus .....................................................
Tipe Kalus .................................................................................
Percobaan 2: Induksi Embrio Somatik ...............................................
Kalus Berakar ............................................................................
Eksplan Berkecambah ...............................................................
Kalus Embriogenik ....................................................................
Embrio Somatik .........................................................................
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................
Kesimpulan .........................................................................................
Saran ...................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
1
1
1
2
3
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
7
7
8
9
9
9
9
9
10
11
12
13
12
13
13
17
17
20
20
20
21
8
DAFTAR TABEL
1 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap persentase eksplan
berkalus ............................................................................................
2 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap sifat kalus pada
4 MST ..............................................................................................
3 Rata-rata pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh
terhadap persentase kalus berakar ....................................................
4 Rata-rata pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh
terhadap persentase eksplan awal berkecambah ..............................
5 Rata-rata pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh
terhadap persentase kalus embriogenik dan jumlah embrio somatik
11
12
15
16
19
DAFTAR GAMBAR
1 Buah jambu biji merah ...................................................................
2 A. Buah jambu biji merah ± 1 bulan setelah antesis
B. Eksplan biji muda jambu biji merah (10 eksplan per botol)
3 Rata-rata persentase kultur steril pada 8 MST
4 A. Embrio zigotik berkecambah pada perlakuan KR5E5 12 MST
B. Embrio zigotik berkecambah pada perlakuan KR5E5 14 MST
C. Tunas mikro jambu biji merah perlakuan KR5E5 16 MST…
D. Kalus embriogenik pada perlakuan KR6E3 14 MST .................
E. Embrio somatik primer pada perlakuan KR1E4 12 MST ..........
F. Embrio somatik primer pada perlakuan KR6E4 16 MST ..........
G. Embrio zigotik pada perlakuan KR6E1 12 MST ........................
H. Embrio somatik sekunder pada perlakuan KR6E1 16 MST .......
I. Embrio somatik sekunder pada perlakuan KR1E3 14 MST .......
3
7
7
10
14
14
14
14
14
14
14
14
14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi larutan stok media MS (Murashige and Skoog)
2 Sidik ragam pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap
persentase eksplan berkalus ..............................................................
3 Sidik ragam pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap
persentase tipe kalus
4 Hasil uji kontras pengaruh komposisi sitokinin terhadap persentase
eksplan berkalus
23
24
24
25
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jambu biji merah merupakan salah satu komoditas hortikultura penting
yang dapat dikonsumsi dalam bentuk segar maupun dalam bentuk olahan.
Kandungan gizi jambu biji merah sangat tinggi terutama sumber vitamin C
dibandingkan dengan buah lainnya. Selain itu, jambu biji merah mengandung
serat, pektin, dan tanin yang bermanfaat bagi kesehatan (Cahyono 2010).
Jambu biji merah lokal Indonesia kurang mampu bersaing dengan jambu
biji merah dari negara lain seperti Thailand karena kualitas buahnya yang relatif
lebih rendah. Jumlah biji buah jambu biji merah lokal Indonesia umumnya lebih
banyak sehingga daya saingnya lemah di pasar global. Perlu dilakukan pemuliaan
jambu biji merah untuk meningkatkan kualitas buahnya.
Pemuliaan konvensional untuk mendapatkan kualitas buah yang lebih baik
seperti buah tanpa biji relatif lama dan sulit dilakukan. Menurut Chandra et al.
(2004) perakitan tanaman jambu biji merah tanpa biji dengan memanfaatkan
teknik kultur jaringan khususnya penggunaan embrio somatik yang dimutasikan
merupakan salah satu alternatif teknologi yang dapat digunakan. Sebelum
dilakukan mutasi, perlu adanya protokol yang tepat untuk meregenerasikan
tanaman jambu biji merah secara in vitro. Menurut Damayanti et al. (2007)
regenerasi tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui beberapa cara di
antaranya embriogenesis somatik dan organogenesis. Kelebihan metode
embriogenesis somatik yaitu mampu menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak
dengan waktu relatif singkat.
Menurut Lestari (2007) zat pengatur tumbuh merupakan salah satu faktor
penting dalam induksi kalus dan penentuan arah regenerasi kalus menjadi
tanaman. Evans et al. (2003) menyatakan bahwa zat pengatur tumbuh paling
penting yang terlibat dalam arah regenerasi kalus menjadi tanaman pada kultur in
vitro adalah auksin, sitokonin dan giberelin eksogen yang terkandung dalam
media.
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh protokol yang tepat dalam
menginduksi kalus dan embrio somatik tanaman jambu biji merah. Penelitian ini
tersusun atas dua percobaan yaitu percobaan pertama merupakan induksi kalus
dan percobaan kedua merupakan induksi embrio somatik. Keseluruhan percobaan
menggunakan komposisi zat pengatur tumbuh yang berbeda sebagai faktor
percobaan.
Tujuan
Tujuan keseluruhan penelitian ini adalah untuk memperoleh protokol yang
tepat dalam menginduksi kalus dan embrio somatik tanaman jambu biji merah.
Percobaan pertama bertujuan untuk mendapatkan komposisi zat pengatur tumbuh
yang tepat dalam induksi kalus. Sedangkan percobaan kedua bertujuan untuk
mendapatkan asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh yang tepat dalam
induksi embrio somatik tanaman jambu biji merah.
2
Hipotesis
1. Terdapat komposisi zat pengatur tumbuh yang tepat dalam induksi kalus
tanaman jambu biji merah.
2. Terdapat asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh yang tepat dalam
induksi embrio somatik tanaman jambu biji merah.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Jambu Biji
Jambu biji (Psidium guajava L.) merupakan jenis tanaman perdu dengan
cabang yang banyak. Tanaman ini berasal dari Amerika Tengah khususnya Brazil
yang dapat tumbuh di dataran rendah maupun dataran tinggi. Daunnya berbentuk
bulat telur, kasar, dan kusam. Bunganya relatif kecil dan berwarna putih. Bunga
jambu biji berkelompok dengan jumlah bunga dua sampai dengan tiga setiap
kelompok. Jambu biji dapat menyerbuk sendiri dan menyerbuk silang (Nurjanah
2007).
Menurut Cahyono (2010) tanaman jambu biji termasuk kedalam ordo
Myrtales, famili Myrtaceae, genus Psidium serta spesies Psidium guajava L.
Masyarakat Indonesia mengenal jambu biji dengan sebutan lain seperti jambu
kulutuk maupun jambu batu (Gambar 1).
Nurjanah (2007) menyatakan bahwa jenis jambu biji di Indonesia ada dua
macam, yaitu jambu biji merah dan jambu biji putih. Permintaan dan harga jambu
biji merah lebih tinggi dibandingkan dengan jambu biji putih. Hal ini terjadi
karena mewabahnya penyakit demam berdarah. Hasil penelitian Prabawati (2005)
menunjukkan bahwa sari buah jambu biji merah dapat meningkatkan kadar
trombosit darah.
Gambar 1 Buah jambu biji merah
Budidaya Tanaman Jambu Biji
Tanaman jambu biji toleran terhadap kondisi cekaman lingkungan, seperti
kekeringan, lahan berbatu, dan pH rendah. Namun tanaman jambu biji dapat mati
oleh kebekuan (frost) (Cahyono 2010). Tanaman jambu biji dapat tumbuh pada
suhu lingkungan antara 15-45 °C, namun produktivitas terbaik diperoleh pada
suhu lingkungan 23-28 °C. Suhu kurang dari 23 °C atau lebih dari 28 °C selama
pembungaan dapat mengurangi fruit set secara signifikan. Tanaman jambu biji
dapat beradaptasi pada jenis tanah apapun. Tanaman dapat tumbuh pada lahan
yang kurang subur, namun produktivitasnya rendah. Tanah yang memiliki
kandungan bahan organik yang tinggi, berdrainase baik, dan pH diantara 5-7
memberikan respon baik terhadap pertumbuhan tanaman jambu biji. Curah hujan
yang optimum untuk budidaya jambu biji yaitu pada kisaran 1000-2000 mm per
tahun (Nakasone dan Paull 1998).
4
Waktu yang diperlukan jambu biji dari antesis sampai dengan panen
beragam antara 120 sampai lebih dari 220 hari, salah satunya targantung pada
suhu lingkungan selama perkembangan buah. Setiap jenis jambu biji pun
memiliki keragaman periode pematangan buahnya (Nurjanah 2007).
Perbanyakan tanaman jambu biji dapat dilakukan dengan biji, cangkok,
okulasi, dan penempelan mata tunas (Cahyono 2010). Kultur jaringan tanaman
belum banyak dikembangkan untuk perbanyakan maupun perbaikan varietas
tanaman jambu biji di Indonesia.
Kultur Jaringan Tanaman
Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode untuk memisahkan bagian
tanaman seperti sel, jaringan atau organ serta menumbuhkannya dalam
lingkungan tertentu dalam keadaan aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi membentuk tanaman (Lestari 2007). Kultur
jaringan disebut juga kultur in vitro yang berarti kultur di dalam wadah gelas.
Konsep yang mendasari kultur jaringan adalah teori totipotensi. Totipotensi
merupakan kemampuan sel untuk membentuk tanaman lengkap bila berada dalam
lingkungan yang sesuai, karena di dalam masing-masing sel tumbuhan
mengandung informasi genetik yang lengkap (Yuwono 2006).
Menurut Kosmiatin et al. (2005) perbanyakan melalui kultur in vitro dapat
dilakukan melalui tiga cara, yaitu pembentukan tunas adventif, proliferasi tunas
lateral, dan embriogenesis somatik. Proliferasi tunas lateral dapat dilakukan
dengan cara mengulturkan tunas aksilar atau tunas terminal ke dalam media yang
mempunyai komposisi yang sesuai untuk proliferasi tunas sehingga diperoleh
penggandaan tunas dengan cepat. Setiap tunas yang dihasilkan dapat dijadikan
sebagai sumber untuk penggandaan tunas selanjutnya sehingga diperoleh tunas
yang banyak dalam waktu yang relatif lebih singkat. Laju perbanyakan dengan
teknik kultur in vitro jauh lebih tinggi dibandingkan dengan cara konvensional.
Selain itu, teknologi ini juga lebih menjamin keseragaman, bebas penyakit, dan
biaya pengangkutan yang lebih murah.
Menurut Yuwono (2006) kultur jaringan tanaman memerlukan beberapa
komponen utama, yaitu bahan awal (starting materials), medium yang sesuai, dan
tempat kultivasi. Bahan awal yang dapat digunakan dalam metode ini bermacammacam, seperti batang, daun, tunas apikal, tunas aksilar, akar, biji, anter, dan lainlain. Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal kultur jaringan tanaman
disebut dengan eksplan. Menurut Zulkarnain (2009) pada umumnya tanaman
berkayu sulit melakukan regenerasi melalui embriogenesis somatik sehingga
diperlukan manipulasi di dalam media tumbuhnya supaya eksplan mampu
melakukan regenerasi membentuk tanaman utuh.
Zat Pengatur Tumbuh
Zat pengatur tumbuh (ZPT) memiliki peran penting dalam mengendalikan
pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Menurut Yuwono (2006) zat pengatur
tumbuh dibutuhkan untuk menginduksi pembelahan sel dan morfogenesis.
Penggunaan senyawa tersebut tergantung pada tujuan penelitian. Interaksi dan
5
perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang
diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan suatu kultur.
Terdapat beberapa kelompok ZPT yang biasa digunakan dalam kultur
jaringan, di antaranya yaitu auksin, sitokinin, giberelin, dan asam absisat (ABA).
Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang
pertumbuhan kalus, suspensi sel dan organ seperti akar. Sitokinin berfungsi untuk
mengatur pembelahan sel dan merangsang munculnya tunas. Tujuan dari
penggunaan giberelin adalah untuk memacu pertumbuhan jaringan tanaman ke
arah pemanjangan dan memecahkan dormansi pada saat benih dikecambahkan.
Sedangkan ABA disintesis pada jaringan-jaringan yang mengalami cekaman.
Senyawa ini jarang digunakan dalam kultur jaringan, namun memiliki aplikasi
yang spesifik seperti merangsang perkembangan embrioid dari kalus. Peranan
ABA kemungkinan berkaitan dengan kemampuannya memodifikasi sintesis
sitokinin dan sebagai senyawa antagonis terhadap giberelin (Abidin 1982).
Eksplan
Eksplan merupakan bahan untuk inisiasi kultur yang diambil dari bagian
suatu tanaman (Gunawan 1992). Keberhasilan morfogenesis kultur in vitro
dipengaruhi oleh eksplan yang dikulturkan, baik jenis, umur, dan ukuran eksplan.
Bagian tanaman yang masih muda (juvenile) merupakan bagian tanaman yang
paling baik untuk dijadikan eksplan hampir pada semua tanaman (Dafalla et al.
2011).
Setiap jenis eksplan memiliki ukuran optimum untuk dikulturkan.
Semakin kecil ukuran eksplan maka akan semakin kecil juga kemungkinan
terjadinya kontaminasi baik secara internal maupun eksternal, namun laju
kehidupan pun akan rendah. Semakin besar ukuran eksplan maka akan semakin
besar juga kemungkinan untuk berhasilnya proliferasi, namun kemungkinan untuk
terjadinya kontaminasi pun akan semakin besar (Zulkarnain 2009).
Embriogenesis Somatik
Embriogenesis somatik merupakan proses berkembangnya sel-sel somatik
(haploid maupun diploid), berkembang membentuk tumbuhan baru melalui
tahapan perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet. Jalur yang
dilalui terdiri atas pembentukan kalus (pada embriogenesis tidak langsung), tahap
pendewasaan dan tahap pengecambahan (pembentukan benih somatik) (Yuwono
2006).
Regenerasi melalui embriogenesis somatik memberikan banyak
keuntungan, antara lain waktu perbanyakan lebih cepat, pencapaian hasil dalam
mendukung program perbaikan tanaman lebih cepat dan jumlah bibit yang
dihasilkan tidak terbatas jumlahnya (Rai et al. 2007). Embriogenesis somatik
mempunyai ciri struktur bipolar dengan dua calon meristem, yaitu meristem akar
dan meristem tunas. Perbanyakan melalui embrio somatik akan lebih
menguntungkan daripada pembentukan tunas adventif yang unipolar, mengingat
pembentukan tunas adventif pada tanaman tertentu memerlukan tahap perakaran
(Rai et al. 2010).
6
Menurut Zulkarnain (2009) sama seperti embrio zigotik yang berkembang
dari penyatuan gamet jantan dan gamet betina, embrio somatik pun tumbuh dan
berkembang melewati tahapan-tahapan yang sama. Tahapan-tahapan tersebut
adalah globular, hati, torpedo, dan kotiledon.
Media Kultur Jaringan Tanaman
Media yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman mengandung
beberapa komponen utama, yaitu senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat
pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Zulkarnain 2009). Jenis dan konsentrasi
sumber karbon pada media kultur jaringan tanaman dapat memberikan respon
berbeda terhadap perkembangan eksplan yang ditanam (Roostika et al. 2008).
Penambahan arang aktif pada media sering kali dilakukan untuk mengurangi
pencoklatan pada eksplan yang ditanam. Arang aktif mengurangi proses
pencoklatan dengan menyerap dan mengoksidasi fenol serta menonaktifkan
peroksidase (Hutami 2008).
Media kultur jaringan dapat berupa media padat, semi padat, ataupun cair.
Media padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi
untuk membentuk tanaman yang lengkap, sedangkan media cair biasanya
digunakan untuk kultur sel. Pada umumnya, pemilihan jenis media tergantung
pada tujuan dan spesies tanaman yang dikulturkan (Yuwono 2006).
Menurut Zulkarnain (2009) kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur
jaringan yang optimal bervariasi antar spesies ataupun antar varietas. Bahkan
jaringan yang berasal dari bagian tanaman yang berbeda pun akan berbeda
kebutuhan nutrisinya. Oleh karena itu, tidak ada satu pun media dasar yang
berlaku universal untuk semua jenis jaringan dan organ.
Kultur Jaringan Tanaman Jambu Biji
Menurut Moura dan Motoike (2009) penggunaan sitokinin dan auksin
pada media MS secara bersamaan dapat memacu terbentuknya kalus embriogenik
pada biji muda tanaman jambu biji varietas Paluma yang berasal dari Brazil.
Persentase terbesar pembentukan kalus embriogenik terdapat pada media MS + 1
mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP.
Hasil penelitian Rai et al. (2007) menunjukkan bahwa media terbaik untuk
menginduksi embrio somatik yang menggunakan eksplan biji muda tanaman
jambu biji varietas banarasi lokal yang berasal dari India adalah media MS + 1 mg
l-1 2.4-D + 5% sukrosa. Rai et al. (2008) melanjutkan penelitiannya dengan
menguji pengaruh konsenterasi sukrosa dan ABA terhadap daya berkecambah
benih sintetik yang berasal dari embrio somatik tanaman jambu biji. Media
terbaik yang dapat menghasilkan daya berkecambah benih sintetik yang berasal
dari embrio somatik tanaman jambu biji tertinggi adalah media MS + 1 mg l-1
ABA + 10% sukrosa. Pada tahun berikutnya, Rai et al. (2009a) menyatakan
bahwa penambahan asam amino glutamin dan prolin serta PEG (polyethylene
glycol) pada media MS dapat meningkatkan efektifitas proses pendewasaan dan
perkecambahan embrio somatik tanaman jambu biji.
7
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen
Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2012 sampai dengan bulan
Maret 2013.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah biji muda dari buah jambu biji merah
berumur ± 1 bulan setelah antesis yang berasal dari Pusat Studi Biofarmaka IPB
(Gambar 2). Bahan sterilisasi eksplan yang digunakan adalah deterjen, antiseptik,
Na-hipoklorit 5.25% dan alkohol 96%. Media kultur yang digunakan pada
percobaan ini adalah media dasar MS (Murashige and Skoog), sukrosa, prolin,
agar (bahan pemadat), aquades, arang aktif, zat pengatur tumbuh yang berasal dari
golongan auksin yaitu 2.4-D (2.4-dichlorophenox acetic acid) dan NAA
(naphthalene acetic acid), golongan sitokinin yaitu BAP (6-benzyl amino purine)
dan 2-iP (N6-2-isopentenyl adenine) serta dari golongan giberelin yaitu GA3.
Alat yang digunakan terdiri atas peralatan gelas (botol kultur, botol ukur,
gelas piala, cawan petri, gelas ukur, dan corong gelas), kompor, autoklaf, laminar
air flow cabinet, peralatan diseksi seperti pinset, gunting, dan scalpel. Pada saat
kultur tanaman diperlukan rak dan ruang kultur bersuhu 18-21°C.
A
B
)
Gambar 2 A) Buah jambu biji merah ± 1 bulan setelah antesis. B)
Eksplan biji muda jambu biji merah (10 biji per botol).
Metode Percobaan
Penelitian ini tersusun atas dua percobaan. Percobaan pertama yaitu
induksi kalus menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor yaitu
komposisi zat pengatur tumbuh. Terdapat enam taraf komposisi zat pengatur
tumbuh yaitu: (R1) MS + 2.5 mg l-1 2.4-D, (R2) MS + 5 mg l-1 2.4-D, (R3) MS +
2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP, (R4) MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP, (R5)
MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP, dan (R6) MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1
8
2-iP. Terdapat lima ulangan untuk masing-masing perlakuan sehingga terdapat 30
satuan percobaan (botol kultur). Tiap satuan percobaan terdiri atas 10 eksplan,
sehingga terdapat 300 satuan amatan. Model rancangan yang digunakan adalah :
Yik = μ + αi + εik
Yik = respon pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i pada ulangan ke k
μ = rataan umum
αi = pengaruh perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i
εik = galat pada perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i pada ulangan
ke-k
i = 1,2,3,4,5,6
k = 1,2,3,4,5
Percobaan kedua yaitu induksi embrio somatik menggunakan rancangan
acak lengkap faktorial dua faktor. Faktor pertama adalah kalus yang berasal dari
media pada percobaan induksi kalus. Terdapat enam taraf kalus yang berasal dari
media awal yaitu: (KR1) kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D, (KR2) kalus
dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D, (KR3) kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D +
1 mg l-1 BAP, (KR4) kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP, (KR5)
kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP, dan (KR6) kalus dari
media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP. Faktor kedua adalah komposisi zat
pengatur tumbuh pada media subkultur dengan lima taraf yaitu: (E1) MS + 1 mg l1
2.4-D, (E2) MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 NAA, (E3) MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1
mg l-1 BAP, (E4) MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dan (E5) MS + 1 mg l-1 2.4D + 1 mg l-1 GA3. Terdapat 30 kombinasi perlakuan dengan lima ulangan untuk
masing-masing perlakuan sehingga terdapat 150 satuan percobaan (botol kultur).
Tiap satuan percobaan terdiri atas dua eksplan sehingga terdapat 300 satuan
amatan. Model rancangan yang digunakan adalah:
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + εijk
Yijk = respon pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i dan asal kalus
taraf ke-j pada ulangan ke-k
μ
= rataan umum
αi
= pengaruh perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i
βj
= pengaruh perlakuan asal kalus taraf ke -j
(αβ)ij = pengaruh interaksi antara komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i dan
asal kalus taraf ke-j
εijk = galat pada perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i dan asal
kalus taraf ke-j pada ulangan ke-k.
i
= 1,2,3,4,5,6
j
= 1,2,3,4,5
k
= 1,2,3,4,5
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode deskriptif serta analisis
ragam dengan uji F pada taraf nyata 5%. Jika uji F berpengaruh nyata maka nilai
tengah diuji lanjut dengan uji jarak berganda Duncan (Duncan Multiple Range
Test/ DMRT) pada taraf nyata 5%.
9
Pelaksanaan Percobaan
Pembuatan Media Tanam
Pembuatan media MS dilakukan dengan mengambil larutan dari setiap
larutan stok media (A, B, C, D, E, F, myoinositol, vitamin dan asam amino prolin)
yang telah dibuat sesuai dengan volume yang diperlukan serta ditambah dengan
zat pengatur tumbuh sesuai dengan perlakuan masing-masing. Setelah semua
larutan dimasukkan ke dalam labu takar ditambahkan gula yang telah dilarutkan
dengan konsentrasi 30 g l-1. Lalu ditera sampai tanda tera dengan aquades. Setelah
itu dilakukan pengukuran pH dengan kertas lakmus sampai pH media 5.8. Larutan
media yang telah diukur pH dimasukkan kedalam panci lalu ditambahkan agar
dengan konsentrasi 7 g l-1 dan arang aktif sebanyak 2 g l-1. Larutan media dimasak
sampai mendidih. Larutan media lalu dimasukkan ke dalam botol kultur sekitar 25
ml per botol. Semua media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan
tekanan 17.5 Psi selama 25-30 menit.
Sterilisasi Eksplan
Buah jambu biji merah direndam dalam larutan deterjen dan antiseptik
selama 10 menit, kemudian dicuci dan disikat bersih dibawah air yang mengalir.
Buah yang telah bersih dipindahkan ke laminar air flow cabinet dan dibilas
menggunakan aquades. Buah direndam dan dikocok dalam larutan Na-hipoklorit
5.25% selama 5 menit lalu dibilas menggunakan aquades sebanyak tiga kali.
Buah dibakar di atas bunsen sebelum dipindahkan ke cawan petri.
Penanaman Eksplan
Penanaman eksplan dilakukan di dalam laminar air flow cabinet yang
telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol 96%. Buah jambu biji merah yang
telah disterilisasi dipindahkan ke cawan petri, dibelah melintang kemudian
diekstraksi bijinya serta ditanam pada media yang telah disiapkan. Satu botol
terdiri atas 10 eksplan. Kultur disimpan dalam ruang kultur yang gelap dan
bertemperatur 18-21°C.
Pengamatan
Peubah yang diamati pada percobaan pertama (induksi kalus) yaitu
persentase kultur steril, jumlah dan persentase eksplan berkalus serta tipe kalus.
Peubah yang diamati pada percobaan kedua (induksi embrio somatik) yaitu
jumlah dan persentase kalus berakar, jumlah dan persentase eksplan awal
berkecambah, jumlah dan persentase kalus embriogenik serta jumlah embrio
somatik.
10
HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan 1: Induksi Kalus
Penelitian yang terdiri atas dua percobaan, diawali dengan percobaan
untuk menentukan media dengan komposisi zat pengatur tumbuh terbaik dalam
menginduksi kalus dari eksplan biji muda. Penelitian pendahuluan dilakukan
untuk menentukkan taraf 2.4-D yang digunakan. Hasil penelitian pendahuluan
menunjukkan bahwa konsentrasi 2.4-D terbaik untuk menginduksi kalus adalah di
antara 2.5 – 5 mg l-1. Pada percobaan ini taraf 2.4-D yang didapat dikombinasikan
dengan jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh lainnya.
Peubah yang diamati pada percobaan pertama ini adalah persentase kultur
steril. Persentase kultur steril pada media R1 sebesar 100% dari 50 satuan amatan
(eksplan yang ditanam setiap perlakuan) pada umur kultur 8 minggu setelah tanam
(MST). Kultur steril pada media R2, R3, R4, R5, dan R6 berturut-turut adalah
92%, 86%, 86%, 94%, dan 92%. Secara umum tingkat kultur steril cukup tinggi,
karena lebih dari 85% (Gambar 3).
Gambar 3 Rata-rata persentase kultur steril umur 8 MST (%)
Keterangan: R1 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; R2 = MS + 5 mg l-1 2.4-D;
R3 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; R4 = MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1
mg l-1 BAP; R5 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; R6 = MS + 5 mg l-1
2.4-D + 2 mg l-1 2-iP.
Selaras dengan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Rai et al. (2007)
tingkat kontaminasi yang rendah pada semua media perlakuan disebabkan eksplan
yang digunakan adalah biji. Secara morfologi posisi biji jambu biji merah terletak
di dalam dan terlindungi oleh daging buah yang tebal sehingga terhindar dari
kontak langsung dengan sumber kontaminan.
11
Eksplan Berkalus
Eksplan biji muda yang dikulturkan pada setiap media perlakuan mulai
menunjukkan respon pembentukan kalus pada 1 MST. Tabel 1 menunjukkan
komposisi zat pengatur tumbuh berpengaruh nyata terhadap persentase eksplan
berkalus pada dua minggu pertama setelah penanaman. Eksplan yang ditanam
pada media dengan perlakuan zat pengatur tumbuh R2, R4 dan R6 memiliki
persentase pembentukan kalus lebih tinggi dibandingkan eksplan yang ditanam
pada media R1, R3 dan R5.
Tabel 1 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap jumlah dan persentase
eksplan berkalus (%)
a
Komposisi zat
pengatur
tumbuh
R1
(29/48)*.. 60.5
b
(36/48)* ..74.5
R2
(50/50)* 100.0
a
R3
(27/46)*.. 59.0
R4
R5
R6
Eksplan berkalus (%)
1 MST
2 MST
3 MST
4 MST
b
(46/48)*.. 95.5
(46/48)* ..95.5
(50/50)* 100.0
a
(50/50)* 100.0
(50/50)* 100.0
b
(34/46)* ..74.6
b
(43/46)*.. 94.0
(43/46)* ..94.0
(42/48)*.. 87.0
a
(44/48)* ..91.5
a
(48/48)* 100.0
(48/48)* 100.0
(23/49)*.. 46.8
b
(35/49)* ..71.2
b
(48/49)*.. 97.6
(49/49)* 100.0
(45/50)*.. 90.0
a
(50/50)* 100.0
a
(50/50)* 100.0
(50/50)* 100.0
Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada hasil uji lanjut DMRT taraf 5%. R1 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; R2 = MS + 5
mg l-1 2.4-D; R3 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; R4 = MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1
BAP; R5 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; R6 = MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; MST
= Minggu setelah tanam; *= Jumlah eksplan berkalus per jumlah total eksplan yang dikulturkan.
Media R2, R4, dan R6 mengandung zat pengatur tumbuh golongan auksin
(2.4-D) yang lebih tinggi dibandingkan media R1, R3, dan R5. Menurut Yuwono
(2006) zat pengatur tumbuh yang memiliki peran dominan dalam proses
pembentukan kalus adalah auksin dibandingkan dengan sitokinin. Pemberian
senyawa 2.4-D pada media kultur jaringan selain akan meningkatkan kecepatan
pembentukan kalus juga akan menekan organogenesis.
Persentase eksplan berkalus pada semua perlakuan komposisi zat pengatur
tumbuh pada umur kultur 3-4 MST tidak berbeda nyata berdasarkan hasil
pengujian sidik ragam. R2 merupakan media paling efisien dalam penggunaan zat
pengatur tumbuh yang memberikan respon terbaik terhadap persentase
pembentukan kalus pada 1-2 MST. Sedangkan pada umur kultur 3-4 MST, R1
merupakan media paling efisien dalam penggunaan zat pengatur tumbuh yang
memberikan respon terbaik terhadap persentase pembentukan kalus. Tingkat
efisiensi penggunaan zat pengatur tumbuh ditinjau dari segi biaya.
Hasil uji kontras menunjukkan, perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin
yang dikandung oleh media R2, R4, dan R6 memengaruhi persentase kalus yang
terbentuk pada saat umur kultur 1-2 MST. Sedangkan pada umur kultur 3-4 MST
perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin yang dikandung oleh media R2, R4, dan
R6 tidak memengaruhi persentase kalus yang terbentuk. Sama halnya dengan
perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin yang dikandung oleh media R1, R3, dan
R5 ternyata persentase kalus yang terbentuk tidak berbeda nyata pada umur kultur
2-4 MST (lampiran 4).
12
Tipe Kalus
Kalus merupakan kumpulan sel yang tidak terorganisir dan terjadi karena
pembelahan yang sangat aktif. Rangsangan dari hormon endogen atau zat
pengatur tumbuh yang ditambahkan (eksogen) menyebabkan metabolisme sel
menjadi aktif, dalam keadaan demikian jaringan dikatakan sedang mengalami
dediferensiasi. Keadaan ini terus berlangsung selama proliferasi kalus (Wetter dan
Constabel 1991).
Terdapat dua tipe kalus yang terlihat pada percobaan ini. Tipe pertama
yaitu kalus putih kehijauan yang memiliki ciri-ciri struktur kalusnya kompak dan
tumbuh secara berkelompok di salah satu sisi eksplan (kalus kompak). Kalus tipe
dua berwarna putih kecoklatan (krem), struktur kalusnya remah dan menyebar di
seluruh permukaan eksplan (kalus remah).
Perbedaan sifat kalus dipengaruhi oleh komposisi zat pengatur tumbuh
yang terkandung dalam media kultur jaringan. Hasil uji DMRT pada Tabel 2
menunjukkan bahwa media dengan komposisi zat pengatur tumbuh pada
perlakuan R2 (MS + 5 mg l-1 2.4-D), R4 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP) dan
R5 (MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) merupakan media terbaik untuk
menginduksi kalus kompak pada umur kultur 4 MST. Sedangkan media dengan
perlakuan zat pengatur tumbuh R6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP)
merupakan media terbaik untuk menginduksi kalus remah.
Tabel 2 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap tipe kalus pada 4 MST
Komposisi zat
Tipe kalus (%)
pengatur tumbuh
Kompak
-1
R1 (MS + 2.5 mg l 2.4-D)
-1
R2 (MS + 5 mg l 2.4-D)
-1
-1
R3 (MS + 2.5 mg l 2.4-D + 1 mg l BAP)
-1
-1
R4 (MS + 5 mg l 2.4-D + 1 mg l BAP)
-1
-1
R5 (MS + 2.5 mg l 2.4-D + 2 mg l 2-iP)
-1
-1
R6 (MS + 5 mg l 2.4-D + 2 mg l 2-iP)
a
Remah
(33/48)*.. 68.0
b
(13/48)* 27.5
b
(50/50)* 100.0
a
(0/50)*… 0.0
c
(32/47)*.. 62.4
b
(15/47)* 31.6
b
(48/48)* 100.0
a
(0/48)*… 0.0
c
(50/50)* 100.0
a
(0/50)*… 0.0
c
(20/50)*.. 40.0
c
(30/50)* 60.0
a
Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada hasil uji lanjut DMRT taraf 5%; *= Jumlah kalus kompak atau remah per
jumlah total eksplan yang dikulturkan.
Menurut Rai et al. (2007) kalus yang berasal dari eksplan biji muda jambu
biji varietas lokal Banarasi (India) memiliki dua tipe kalus, tipe pertama kalus
putih yang jika dilihat di bawah mikroskop selnya terlihat memanjang dan saling
bertumpukan menyatu, dari kumpulan kalus tipe ini tidak pernah ada yang
berkembang menjadi embrio somatik. Kalus kompak dengan ciri-ciri tersebut
berpotensi untuk berkembang ke arah organogenesis. Tipe kedua terdiri atas selsel bulat berwarna coklat terang hingga coklat gelap dan friable (remah).
Kumpulan sel tipe ini seringkali ditemukan berasosiasi dengan embrio somatik.
13
Percobaan 2: Induksi Embrio Somatik
Percobaan kedua merupakan percobaan yang menggunakan kalus yang
terbentuk pada percobaan pertama. Seluruh kalus hasil percobaan pertama
dipindahkan ke media yang berbeda, dengan lima taraf komposisi zat pengatur
tumbuh pada umur kultur 8 MST.
Proses regenerasi tanaman secara in vitro dipengaruhi oleh dua faktor
utama yaitu komponen media dan sumber eksplan (Rai et al. 2009b). Komponen
media yang memengaruhi proses regenerasi tanaman secara in vitro salah satunya
adalah komposisi zat pengatur tumbuh (Taji et al. 2002). Morfogenesis kalus
tergantung pada keseimbangan auksin dan sitokinin di dalam media. Interaksi
antara zat pengatur tumbuh endogen tanaman dan zat pengatur tumbuh eksogen
yang diserap dalam media akan menentukan arah perkembangan kalus (Asnawati
et al. 2002).
Kalus Berakar
Kultur kalus yang dikembangkan dari eksplan dapat diregenerasikan
sehingga membentuk tanaman yang lengkap. Proses pembentukan organ-organ
tanaman seperti akar dan tunas maupun tanaman yang lengkap dari kultur sel atau
jaringan disebut dengan organogenesis (Yuwono 2006). Hasil kalus berakar yang
didapatkan pada percobaaan ini tidak diharapkan. Kalus berakar lebih sulit
diregenerasikan menjadi tanaman (Zulkarnain 2009).
Hasil pengamatan pada Tabel 3 menunjukkan persentase kalus berakar
(KA) pada umur kultur 12, 14, dan 16 MST. Terdapat empat perlakuan asal kalus
dan zat pengatur tumbuh yang menginduksi terbentuknya kalus berakar. Semua
perlakuan yang menghasilkan kalus berakar mengandung komposisi zat pengatur
tumbuh tunggal yaitu auksin, baik itu 2.4-D maupun NAA. Perlakuan KR2E2
(kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D
+ 1 mg l-1 NAA) dapat menghasilkan persentase tertinggi kalus berakar pada umur
kultur 12-16 MST. Menurut Wetter dan Constabel (1991) pembentukan organ
(organogenesis) pada kultur in vitro tanaman dipengaruhi oleh ketersediaan
senyawa-senyawa tertentu dalam media. Pembentukan tunas dan akar ditentukan
oleh konsentrasi auksin dan sitokinin yang digunakan. Dominasi auksin yang
lebih tinggi dibandingkan dengan sitokinin dapat menginduksi terbentuknya akar.
Eksplan Awal Berkecambah
Kecambah yang muncul pada percobaan ini merupakan kecambah yang
berasal dari embrio zigotik. Eksplan yang berasal dari biji muda memiliki potensi
untuk berkecambah pada media yang tepat. Hasil pengamatan pada Tabel 4
menunjukkan terdapat enam perlakuan asal kalus dan zat pengatur tumbuh yang
menginduksi terbentuknya eksplan berkecambah. Persentase eksplan
berkecambah pada keenam perlakuan (KR1E5, KR2E5, KR3E5, KR4E5, KR5E5,
dan KR6E5) relatif tinggi ≥ 80% pada umur kultur 16 MST.
Semua perlakuan yang menginduksi munculnya kecambah mengandung
komposisi zat pengatur tumbuh 1 mg l-1 GA3. Secara umum peranan giberelin di
dalam tanaman adalah untuk meningkatkan perkecambahan biji dan menginduksi
pemanjangan ruas. Selain itu giberelin dapat dimanfaatkan untuk menginduksi
pembentukan embrio dari kalus (Zulkarnain 2009). Namun pada percobaan ini
14
kalus yang disubkultur pada media yang mengandung giberelin tidak terinduksi
untuk membentuk embrio melainkan terinduksi untuk berkecambah dari eksplan
awal berupa biji. Gambar 4A, 4B, dan 4C menunjukkan perkembangan proses
perkecambahan embrio zigotik pada media dengan perlakuan zat pengatur tumbuh
KR5E5 (kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dipindahkan ke
media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 GA3) pada saat umur kultur 12, 14, dan 16
MST.
A
B
C
)
)
)
D
E
F
)
)
)
G
H
)
)
i
ii
I
)
Gambar 4 A) Embrio zigotik yang berkecambah pada perlakuan KR5E5 12 MST. B)
Embrio zigotik yang berkecambah pada perlakuan KR5E5 14 MST. C)
Tunas mikro jambu biji merah pada perlakuan KR5E5 16 MST. D) Kalus
embriogenik pada perlakuan KR6E3 14 MST. E) Embrio somatik primer
pada perlakuan KR1E4 12 MST. F) Embrio somatik primer pada perlakuan
KR6E4 16 MST. G) Embrio zigotik pada perlakuan KR6E1 12 MST. H)
Embrio somatik sekunder pada perlakuan KR6E1 16 MST. I) (i) Embrio
zigotik dan (ii) embrio somatik sekunder pada perlakuan KR1E3 14 MST.
15
Tabel 3 Pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh terhadap jumlah dan
persentase kalus berakar
Kalus dari
media awal
KR1
KR2
KR3
KR4
KR5
KR6
a
Media
subkultur
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
12 MST
KA (%)
(1/10)* 10.0
(2/10)* 20.0
0.0
0.0
0.0
(3/9)*.. 33.3
(5/10)* 50.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
14 MST
KA (%)
(3/10)* 30.0
(5/9)*.. 55.6
0.0
0.0
0.0
(5/9)*.. 55.6
(6/10)* 60.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
16 MST
KA (%)
(5/9)*. 55.6
(6/9)* 66.7
0.0
0.0
0.0
(6/9)*.. 66.7
(8/10)* 80.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
KR1= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; KR2= Kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D;
KR3= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR4= Kalus dari media MS + 5 mg l-1
2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR5= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; KR6= Kalus dari
media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; E1= MS + 1 mg l-1 2.4-D; E2= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l1
NAA; E3= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; E4= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; E5= MS + 1
mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 GA3; KA= Persentase eksplan berakar; MST= Minggu setelah tanam; *= Jumlah
kalus berakar per jumlah eksplan yang dikulturkan.
16
Tabel 4 Pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh terhadap jumlah
dan persentase eksplan awal (embrio zigotik) berkecambah
Kalus dari
media awal
KR1
KR2
KR3
KR4
KR5
KR6
a
Media
subkultur
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
12 MST
KK (%)
0.0
0.0
0.0
0.0
(3/9)* 33.3
0.0
0.0
0.0
0.0
(5/10)* 50.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(3/10)* 30.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(2/9)* 22.2
0.0
0.0
0.0
0.0
(4/9)* 44.4
0.0
0.0
0.0
0.0
(3/10)* 30.0
14 MST
KK (%)
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(9/10)* 90.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(6/9)* 66.7
0.0
0.0
0.0
0.0
(7/9)* 77.8
0.0
0.0
0.0
0.0
(7/9)* 77.8
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/10)* 80.0
16 MST
KK (%)
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(9/10)* 90.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(9/9)* 100.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/10)* 80.0
KR1= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; KR2= Kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D;
KR3= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR4= Kalus dari media MS + 5 mg
l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR5= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; KR6= Kalus
dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; E1= MS + 1 mg l-1 2.4-D; E2= MS + 1 mg l-1 2.4-D
+ 1 mg l-1 NAA; E3= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; E4= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP;
E5= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 GA3; KK= Persentase eksplan awal (embrio zigotik)
berkecambah; MST= Minggu setelah tanam; *= Jumlah eksplan awal (embrio zigotik) berkecambah
per jumlah total eksplan yang dikulturkan.
17
Kalus Embriogenik
Eksplan dapat ditumbuhkan sebagai kalus yang selanjutnya dikembangkan
untuk menghasilkan embrio somatik. Embrio somatik dapat diinduksi sehingga
berkecambah dan akhirnya menjadi plantlet. Kalus yang memiliki sifat untuk
dikembangkan menjadi embrio disebut dengan kalus embriogenik. Proses
pembentukan embrio dari sel somatik seperti kalus disebut dengan embriogenesis
somatik (Evans et al. 2003). Gambar 4D menunjukkan contoh kalus embriogenik
pada perlakuan KR6E3 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP
dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP) pada umur kultur 14
MST.
Hasil pengamatan pada Tabel 5 menunjukkan terdapat enam perlakuan
asal kalus dan zat pengatur tumbuh yang menginduksi terbentuknya kalus yang
bersifat embriogenik. Peran sitokinin baik itu BAP maupun 2-iP berpengaruh
terhadap terbentuknya kalus embriogenik. Kalus embriogenik tidak terbentuk
pada media dengan zat pengatur tunggal auksin. Namun, pada media subkultur E1
(MS + 1 mg l-1 2.4-D) terbentuk kalus embriogenik disebabkan oleh adanya
pengaruh kalus yang berasal dari media awal yang mengandung zat pengatur
tumbuh sitokinin yaitu KR6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP). Perlakuan
KR6E4 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dipindahkan ke
media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) merupakan perlakuan yang memiliki
persentase kalus embriogenik tertinggi pada umur kultur 12-16 MST yaitu sekitar
60%.
Menurut Moura dan Motoike (2009) penggunaan sitokinin dan auksin
pada media MS secara bersamaan dapat memacu terbentuknya kalus embriogenik
pada biji muda tanaman jambu biji varietas Paluma yang berasal dari Brazil. Hasil
penelitian mereka menunjukkan persentase terbesar pembentukan kalus
embriogenik terdapat pada media MS yang ditambah dengan 1 mg l-1 2.4-D + 2
mg l-1 2-iP, selaras dengan hasil yang didapat pada Tabel 5.
Embrio Somatik
Keberhasilan pembentukan embrio somatik secara in vitro ditentukan oleh
jenis tanaman, eksplan, media, dan lingkungan fisik. Kalus yang memenuhi syarat
untuk terbentuknya embrio somatik adalah kalus yang bersifat embriogenik, yaitu
selnya berukuran kecil, berwarna kuning mengkilat, dan sitoplasmanya padat
(Lestari 2007). Kalus embriogenik yang terbentuk memiliki potensi untuk
menghasilkan embrio somatik baik secara langsung (embrio somatik primer)
maupun secara tidak langsung (embrio somatik sekunder). Embrio somatik primer
merupakan embrio somatik yang dihasilkan langsung dari kalus yang bersifat
embriogenik, sedangkan embrio somatik sekunder merupakan embrio somatik
yang terbentuk di atas permukaan embrio zigotik yang berasal dari eksplan biji
muda yang ditanam.
Menurut Zulkarnain (2009) sama seperti embrio zigotik yang berkembang
dari penyatuan gamet jantan dan gamet betina, embrio somatik pun tumbuh dan
berkembang melewati tahapan-tahapan yang sama. Tahapan-tahapan tersebut
adalah globular, hati, torpedo, dan kotiledon. Embrio somatik mempunyai ciri
struktur bipolar dengan dua calon meristem, yaitu meristem akar dan meristem
tunas.
18
Embrio somatik primer terbentuk pada dua perlakuan yaitu KR1E4 dan
KR6E4. Perlakuan KR1E4 (kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D dipindahkan
ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) dapat menginduksi terbentuknya
dua embrio somatik primer (fase globular dan fase hati) pada umur kultur 12 MST
(Gambar 4E). Perlakuan KR6E4 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1
2-iP dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) dapat
menginduksi terbentuknya 32 embrio somatik primer (enam fase globular, empat
fase hati, 17 fase torpedo dan lima fase kotiledon) pada umur kultur 16 MST
(Gambar 4F).
Embrio somatik sekunder terbentuk pada dua perlakuan yaitu KR6E1 dan
KR1E3. Perlakuan KR6E1 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP
dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D) dapat menginduksi terbentuknya
embrio zigotik pada umur kultur 12 MST (Gambar 4G) dan embrio somatik
sekunder terbentuk pada umur kultur 16 MST (Gambar 4H). Perlakuan KR1E3
(kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4D + 1 mg l-1 BAP) dapat menginduksi terbentuknya embrio somatik sekunder
pada umur kultur 14 MST. Kalus yang berada pada perlakuan KR1E3 merupakan
kalus kompak yang tidak bersifat embriogenik, namun karena eksplan awal yang
digunakan merupakan biji sehingga muncul embrio zigotik ya
TANAMAN JAMBU BIJI MERAH (Psidium guajava L.)
REZA RAMDAN RIVAI
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Induksi Kalus dan
Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah (Psidium guajava L.) adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Reza Ramdan Rivai
NIM A24090018
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak
luar IPB harus didasarkan pada kerja sama yang terkait.
2
ABSTRAK
REZA RAMDAN RIVAI. Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu
Biji Merah (Psidium guajava L.). Dibimbing oleh AGUS PURWITO dan ALI
HUSNI.
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh protokol yang tepat dalam
menginduksi kalus dan embrio somatik tanaman jambu biji merah. Penelitian ini
dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor pada bulan September
2012 sampai dengan bulan Maret 2013. Penelitian tersusun atas dua percobaan
yaitu induksi kalus dan induksi embrio somatik. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa media induksi kalus dengan komposisi zat pengatur tumbuh R2 (MS + 5
mg l-1 2.4-D), R4 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP) dan R5 (MS + 2.5 mg l-1
2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) merupakan perlakuan terbaik untuk menginduksi kalus
kompak pada 4 minggu setelah tanam (MST), sedangkan untuk menginduksi
kalus remah didapatkan media dengan perlakuan zat pengatur tumbuh terbaik
yaitu R6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP). Embrio somatik primer terbentuk
pada perlakuan KR1E4 (kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D dipindahkan ke
media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) dan perlakuan KR6E4 (kalus dari
media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dipindahkan ke media 1 mg l-1 2.4-D +
2 mg l-1 2-iP) masing-masing pada 12 dan 16 MST.
Kata kunci: embrio somatik, jambu biji merah, kalus, zat pengatur tumbuh
ABSTRACT
REZA RAMDAN RIVAI. Callus and Somatic Embryo Induction of Guava
(Psidium guajava L.). Supervised by AGUS PURWITO and ALI HUSNI.
The objective of the research was to get the best protocol for callus and
somatic embryo induction of guava. The experiment was conducted at Tissue
Culture Laboratory, Department of Agronomy and Horticulture, Faculty of
Agriculture, Bogor Agricultural University from September 2012 until March
2013. The research was arranged into two experiments, that were callus induction
and somatic embryo induction. The results showed that media with plant growth
regulator composition treatments R2 (MS + 5 mg l-1 2.4-D), R4 (MS + 5 mg l-1
2.4-D + 1 mg l-1 BAP) and R5 (MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) were the
best treatments for inducting compact callus in 4 weeks after culture (WAC). In
while, the friable callus can be induced at media with plant growth regulator
composition treatment R6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP). The primary
somatic embryos can be induced at the treatment KR1E4 (callus from MS + 2.5
mg l-1 2.4-D was moved into MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) and the
treatment KR6E4 (callus from MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP was moved into
MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) in 12 and 16 WAC for each treatment.
Keywords: callus, guava, plant growth regulator, somatic embryo
3
INDUKSI KALUS DAN EMBRIO SOMATIK
TANAMAN JAMBU BIJI MERAH (Psidium guajava L.)
REZA RAMDAN RIVAI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Pertanian
pada
Departemen Agronomi dan Hortikultura
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
4
5
Judul Skripsi : Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah
(Psidium guajava L.)
Nama
: Reza Ramdan Rivai
NIM
: A24090018
Disetujui oleh
Dr Ir Agus Purwito, MScAgr
Pembimbing I
Dr Ir Ali Husni, MSi
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir Agus Purwito, MScAgr
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
6
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan
anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik.
Penelitian tentang Induksi Kalus dan Embrio Somatik Tanaman Jambu Biji Merah
(Psidium guajava L.) telah dilaksanakan sejak bulan September 2012 hingga
bulan Maret 2013 di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penulis juga mengucapakan terima kasih kepada Dr Ir Agus Purwito,
MScAgr dan Dr Ir Ali Husni, MSi selaku dosen pembimbing yang telah
memberikan bimbingan, koreksi dan masukan dalam pembuatan skripsi ini.
Ucapan terima kasih juga saya sampaikan kepada keluarga, teman-teman dan
semua pihak yang turut membantu dalam pembuatan skripsi ini. Semoga skripsi
ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
Reza Ramdan Rivai
7
DAFTAR ISI
PENDAHULUAN .......................................................................................
Latar Belakang ....................................................................................
Tujuan .................................................................................................
Hipotesis .............................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA .............................................................................
Tanaman Jambu Biji ...........................................................................
Budidaya Tanaman Jambu Biji ...........................................................
Kultur Jaringan Tanaman ..................................................................
Zat pengatur tumbuh ...........................................................................
Eksplan ................................................................................................
Embriogenesis Somatik .....................................................................
Media Kultur Jaringan Tanaman .......................................................
Kultur Jaringan Tanaman Jambu Biji ................................................
BAHAN DAN METODE ...........................................................................
Tempat dan Waktu ..............................................................................
Bahan dan Alat ..................................................................................
Metode Percobaan ..............................................................................
Analisis Data .......................................................................................
Pelaksanaan Percobaan .......................................................................
Pembuatan Media Tanam ..........................................................
Sterilisasi Eksplan .....................................................................
Penanaman Eksplan ...................................................................
Pengamatan .........................................................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................
Percobaan 1: Induksi Kalus ................................................................
Persentase Eksplan Berkalus .....................................................
Tipe Kalus .................................................................................
Percobaan 2: Induksi Embrio Somatik ...............................................
Kalus Berakar ............................................................................
Eksplan Berkecambah ...............................................................
Kalus Embriogenik ....................................................................
Embrio Somatik .........................................................................
KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................
Kesimpulan .........................................................................................
Saran ...................................................................................................
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................
1
1
1
2
3
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
7
7
8
9
9
9
9
9
10
11
12
13
12
13
13
17
17
20
20
20
21
8
DAFTAR TABEL
1 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap persentase eksplan
berkalus ............................................................................................
2 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap sifat kalus pada
4 MST ..............................................................................................
3 Rata-rata pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh
terhadap persentase kalus berakar ....................................................
4 Rata-rata pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh
terhadap persentase eksplan awal berkecambah ..............................
5 Rata-rata pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh
terhadap persentase kalus embriogenik dan jumlah embrio somatik
11
12
15
16
19
DAFTAR GAMBAR
1 Buah jambu biji merah ...................................................................
2 A. Buah jambu biji merah ± 1 bulan setelah antesis
B. Eksplan biji muda jambu biji merah (10 eksplan per botol)
3 Rata-rata persentase kultur steril pada 8 MST
4 A. Embrio zigotik berkecambah pada perlakuan KR5E5 12 MST
B. Embrio zigotik berkecambah pada perlakuan KR5E5 14 MST
C. Tunas mikro jambu biji merah perlakuan KR5E5 16 MST…
D. Kalus embriogenik pada perlakuan KR6E3 14 MST .................
E. Embrio somatik primer pada perlakuan KR1E4 12 MST ..........
F. Embrio somatik primer pada perlakuan KR6E4 16 MST ..........
G. Embrio zigotik pada perlakuan KR6E1 12 MST ........................
H. Embrio somatik sekunder pada perlakuan KR6E1 16 MST .......
I. Embrio somatik sekunder pada perlakuan KR1E3 14 MST .......
3
7
7
10
14
14
14
14
14
14
14
14
14
DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi larutan stok media MS (Murashige and Skoog)
2 Sidik ragam pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap
persentase eksplan berkalus ..............................................................
3 Sidik ragam pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap
persentase tipe kalus
4 Hasil uji kontras pengaruh komposisi sitokinin terhadap persentase
eksplan berkalus
23
24
24
25
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Jambu biji merah merupakan salah satu komoditas hortikultura penting
yang dapat dikonsumsi dalam bentuk segar maupun dalam bentuk olahan.
Kandungan gizi jambu biji merah sangat tinggi terutama sumber vitamin C
dibandingkan dengan buah lainnya. Selain itu, jambu biji merah mengandung
serat, pektin, dan tanin yang bermanfaat bagi kesehatan (Cahyono 2010).
Jambu biji merah lokal Indonesia kurang mampu bersaing dengan jambu
biji merah dari negara lain seperti Thailand karena kualitas buahnya yang relatif
lebih rendah. Jumlah biji buah jambu biji merah lokal Indonesia umumnya lebih
banyak sehingga daya saingnya lemah di pasar global. Perlu dilakukan pemuliaan
jambu biji merah untuk meningkatkan kualitas buahnya.
Pemuliaan konvensional untuk mendapatkan kualitas buah yang lebih baik
seperti buah tanpa biji relatif lama dan sulit dilakukan. Menurut Chandra et al.
(2004) perakitan tanaman jambu biji merah tanpa biji dengan memanfaatkan
teknik kultur jaringan khususnya penggunaan embrio somatik yang dimutasikan
merupakan salah satu alternatif teknologi yang dapat digunakan. Sebelum
dilakukan mutasi, perlu adanya protokol yang tepat untuk meregenerasikan
tanaman jambu biji merah secara in vitro. Menurut Damayanti et al. (2007)
regenerasi tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui beberapa cara di
antaranya embriogenesis somatik dan organogenesis. Kelebihan metode
embriogenesis somatik yaitu mampu menghasilkan tanaman dalam jumlah banyak
dengan waktu relatif singkat.
Menurut Lestari (2007) zat pengatur tumbuh merupakan salah satu faktor
penting dalam induksi kalus dan penentuan arah regenerasi kalus menjadi
tanaman. Evans et al. (2003) menyatakan bahwa zat pengatur tumbuh paling
penting yang terlibat dalam arah regenerasi kalus menjadi tanaman pada kultur in
vitro adalah auksin, sitokonin dan giberelin eksogen yang terkandung dalam
media.
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh protokol yang tepat dalam
menginduksi kalus dan embrio somatik tanaman jambu biji merah. Penelitian ini
tersusun atas dua percobaan yaitu percobaan pertama merupakan induksi kalus
dan percobaan kedua merupakan induksi embrio somatik. Keseluruhan percobaan
menggunakan komposisi zat pengatur tumbuh yang berbeda sebagai faktor
percobaan.
Tujuan
Tujuan keseluruhan penelitian ini adalah untuk memperoleh protokol yang
tepat dalam menginduksi kalus dan embrio somatik tanaman jambu biji merah.
Percobaan pertama bertujuan untuk mendapatkan komposisi zat pengatur tumbuh
yang tepat dalam induksi kalus. Sedangkan percobaan kedua bertujuan untuk
mendapatkan asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh yang tepat dalam
induksi embrio somatik tanaman jambu biji merah.
2
Hipotesis
1. Terdapat komposisi zat pengatur tumbuh yang tepat dalam induksi kalus
tanaman jambu biji merah.
2. Terdapat asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh yang tepat dalam
induksi embrio somatik tanaman jambu biji merah.
3
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Jambu Biji
Jambu biji (Psidium guajava L.) merupakan jenis tanaman perdu dengan
cabang yang banyak. Tanaman ini berasal dari Amerika Tengah khususnya Brazil
yang dapat tumbuh di dataran rendah maupun dataran tinggi. Daunnya berbentuk
bulat telur, kasar, dan kusam. Bunganya relatif kecil dan berwarna putih. Bunga
jambu biji berkelompok dengan jumlah bunga dua sampai dengan tiga setiap
kelompok. Jambu biji dapat menyerbuk sendiri dan menyerbuk silang (Nurjanah
2007).
Menurut Cahyono (2010) tanaman jambu biji termasuk kedalam ordo
Myrtales, famili Myrtaceae, genus Psidium serta spesies Psidium guajava L.
Masyarakat Indonesia mengenal jambu biji dengan sebutan lain seperti jambu
kulutuk maupun jambu batu (Gambar 1).
Nurjanah (2007) menyatakan bahwa jenis jambu biji di Indonesia ada dua
macam, yaitu jambu biji merah dan jambu biji putih. Permintaan dan harga jambu
biji merah lebih tinggi dibandingkan dengan jambu biji putih. Hal ini terjadi
karena mewabahnya penyakit demam berdarah. Hasil penelitian Prabawati (2005)
menunjukkan bahwa sari buah jambu biji merah dapat meningkatkan kadar
trombosit darah.
Gambar 1 Buah jambu biji merah
Budidaya Tanaman Jambu Biji
Tanaman jambu biji toleran terhadap kondisi cekaman lingkungan, seperti
kekeringan, lahan berbatu, dan pH rendah. Namun tanaman jambu biji dapat mati
oleh kebekuan (frost) (Cahyono 2010). Tanaman jambu biji dapat tumbuh pada
suhu lingkungan antara 15-45 °C, namun produktivitas terbaik diperoleh pada
suhu lingkungan 23-28 °C. Suhu kurang dari 23 °C atau lebih dari 28 °C selama
pembungaan dapat mengurangi fruit set secara signifikan. Tanaman jambu biji
dapat beradaptasi pada jenis tanah apapun. Tanaman dapat tumbuh pada lahan
yang kurang subur, namun produktivitasnya rendah. Tanah yang memiliki
kandungan bahan organik yang tinggi, berdrainase baik, dan pH diantara 5-7
memberikan respon baik terhadap pertumbuhan tanaman jambu biji. Curah hujan
yang optimum untuk budidaya jambu biji yaitu pada kisaran 1000-2000 mm per
tahun (Nakasone dan Paull 1998).
4
Waktu yang diperlukan jambu biji dari antesis sampai dengan panen
beragam antara 120 sampai lebih dari 220 hari, salah satunya targantung pada
suhu lingkungan selama perkembangan buah. Setiap jenis jambu biji pun
memiliki keragaman periode pematangan buahnya (Nurjanah 2007).
Perbanyakan tanaman jambu biji dapat dilakukan dengan biji, cangkok,
okulasi, dan penempelan mata tunas (Cahyono 2010). Kultur jaringan tanaman
belum banyak dikembangkan untuk perbanyakan maupun perbaikan varietas
tanaman jambu biji di Indonesia.
Kultur Jaringan Tanaman
Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode untuk memisahkan bagian
tanaman seperti sel, jaringan atau organ serta menumbuhkannya dalam
lingkungan tertentu dalam keadaan aseptik sehingga bagian-bagian tersebut dapat
memperbanyak diri dan beregenerasi membentuk tanaman (Lestari 2007). Kultur
jaringan disebut juga kultur in vitro yang berarti kultur di dalam wadah gelas.
Konsep yang mendasari kultur jaringan adalah teori totipotensi. Totipotensi
merupakan kemampuan sel untuk membentuk tanaman lengkap bila berada dalam
lingkungan yang sesuai, karena di dalam masing-masing sel tumbuhan
mengandung informasi genetik yang lengkap (Yuwono 2006).
Menurut Kosmiatin et al. (2005) perbanyakan melalui kultur in vitro dapat
dilakukan melalui tiga cara, yaitu pembentukan tunas adventif, proliferasi tunas
lateral, dan embriogenesis somatik. Proliferasi tunas lateral dapat dilakukan
dengan cara mengulturkan tunas aksilar atau tunas terminal ke dalam media yang
mempunyai komposisi yang sesuai untuk proliferasi tunas sehingga diperoleh
penggandaan tunas dengan cepat. Setiap tunas yang dihasilkan dapat dijadikan
sebagai sumber untuk penggandaan tunas selanjutnya sehingga diperoleh tunas
yang banyak dalam waktu yang relatif lebih singkat. Laju perbanyakan dengan
teknik kultur in vitro jauh lebih tinggi dibandingkan dengan cara konvensional.
Selain itu, teknologi ini juga lebih menjamin keseragaman, bebas penyakit, dan
biaya pengangkutan yang lebih murah.
Menurut Yuwono (2006) kultur jaringan tanaman memerlukan beberapa
komponen utama, yaitu bahan awal (starting materials), medium yang sesuai, dan
tempat kultivasi. Bahan awal yang dapat digunakan dalam metode ini bermacammacam, seperti batang, daun, tunas apikal, tunas aksilar, akar, biji, anter, dan lainlain. Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal kultur jaringan tanaman
disebut dengan eksplan. Menurut Zulkarnain (2009) pada umumnya tanaman
berkayu sulit melakukan regenerasi melalui embriogenesis somatik sehingga
diperlukan manipulasi di dalam media tumbuhnya supaya eksplan mampu
melakukan regenerasi membentuk tanaman utuh.
Zat Pengatur Tumbuh
Zat pengatur tumbuh (ZPT) memiliki peran penting dalam mengendalikan
pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Menurut Yuwono (2006) zat pengatur
tumbuh dibutuhkan untuk menginduksi pembelahan sel dan morfogenesis.
Penggunaan senyawa tersebut tergantung pada tujuan penelitian. Interaksi dan
5
perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang
diproduksi oleh sel secara endogen menentukan arah perkembangan suatu kultur.
Terdapat beberapa kelompok ZPT yang biasa digunakan dalam kultur
jaringan, di antaranya yaitu auksin, sitokinin, giberelin, dan asam absisat (ABA).
Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang
pertumbuhan kalus, suspensi sel dan organ seperti akar. Sitokinin berfungsi untuk
mengatur pembelahan sel dan merangsang munculnya tunas. Tujuan dari
penggunaan giberelin adalah untuk memacu pertumbuhan jaringan tanaman ke
arah pemanjangan dan memecahkan dormansi pada saat benih dikecambahkan.
Sedangkan ABA disintesis pada jaringan-jaringan yang mengalami cekaman.
Senyawa ini jarang digunakan dalam kultur jaringan, namun memiliki aplikasi
yang spesifik seperti merangsang perkembangan embrioid dari kalus. Peranan
ABA kemungkinan berkaitan dengan kemampuannya memodifikasi sintesis
sitokinin dan sebagai senyawa antagonis terhadap giberelin (Abidin 1982).
Eksplan
Eksplan merupakan bahan untuk inisiasi kultur yang diambil dari bagian
suatu tanaman (Gunawan 1992). Keberhasilan morfogenesis kultur in vitro
dipengaruhi oleh eksplan yang dikulturkan, baik jenis, umur, dan ukuran eksplan.
Bagian tanaman yang masih muda (juvenile) merupakan bagian tanaman yang
paling baik untuk dijadikan eksplan hampir pada semua tanaman (Dafalla et al.
2011).
Setiap jenis eksplan memiliki ukuran optimum untuk dikulturkan.
Semakin kecil ukuran eksplan maka akan semakin kecil juga kemungkinan
terjadinya kontaminasi baik secara internal maupun eksternal, namun laju
kehidupan pun akan rendah. Semakin besar ukuran eksplan maka akan semakin
besar juga kemungkinan untuk berhasilnya proliferasi, namun kemungkinan untuk
terjadinya kontaminasi pun akan semakin besar (Zulkarnain 2009).
Embriogenesis Somatik
Embriogenesis somatik merupakan proses berkembangnya sel-sel somatik
(haploid maupun diploid), berkembang membentuk tumbuhan baru melalui
tahapan perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet. Jalur yang
dilalui terdiri atas pembentukan kalus (pada embriogenesis tidak langsung), tahap
pendewasaan dan tahap pengecambahan (pembentukan benih somatik) (Yuwono
2006).
Regenerasi melalui embriogenesis somatik memberikan banyak
keuntungan, antara lain waktu perbanyakan lebih cepat, pencapaian hasil dalam
mendukung program perbaikan tanaman lebih cepat dan jumlah bibit yang
dihasilkan tidak terbatas jumlahnya (Rai et al. 2007). Embriogenesis somatik
mempunyai ciri struktur bipolar dengan dua calon meristem, yaitu meristem akar
dan meristem tunas. Perbanyakan melalui embrio somatik akan lebih
menguntungkan daripada pembentukan tunas adventif yang unipolar, mengingat
pembentukan tunas adventif pada tanaman tertentu memerlukan tahap perakaran
(Rai et al. 2010).
6
Menurut Zulkarnain (2009) sama seperti embrio zigotik yang berkembang
dari penyatuan gamet jantan dan gamet betina, embrio somatik pun tumbuh dan
berkembang melewati tahapan-tahapan yang sama. Tahapan-tahapan tersebut
adalah globular, hati, torpedo, dan kotiledon.
Media Kultur Jaringan Tanaman
Media yang digunakan untuk kultur jaringan tanaman mengandung
beberapa komponen utama, yaitu senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat
pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Zulkarnain 2009). Jenis dan konsentrasi
sumber karbon pada media kultur jaringan tanaman dapat memberikan respon
berbeda terhadap perkembangan eksplan yang ditanam (Roostika et al. 2008).
Penambahan arang aktif pada media sering kali dilakukan untuk mengurangi
pencoklatan pada eksplan yang ditanam. Arang aktif mengurangi proses
pencoklatan dengan menyerap dan mengoksidasi fenol serta menonaktifkan
peroksidase (Hutami 2008).
Media kultur jaringan dapat berupa media padat, semi padat, ataupun cair.
Media padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi
untuk membentuk tanaman yang lengkap, sedangkan media cair biasanya
digunakan untuk kultur sel. Pada umumnya, pemilihan jenis media tergantung
pada tujuan dan spesies tanaman yang dikulturkan (Yuwono 2006).
Menurut Zulkarnain (2009) kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur
jaringan yang optimal bervariasi antar spesies ataupun antar varietas. Bahkan
jaringan yang berasal dari bagian tanaman yang berbeda pun akan berbeda
kebutuhan nutrisinya. Oleh karena itu, tidak ada satu pun media dasar yang
berlaku universal untuk semua jenis jaringan dan organ.
Kultur Jaringan Tanaman Jambu Biji
Menurut Moura dan Motoike (2009) penggunaan sitokinin dan auksin
pada media MS secara bersamaan dapat memacu terbentuknya kalus embriogenik
pada biji muda tanaman jambu biji varietas Paluma yang berasal dari Brazil.
Persentase terbesar pembentukan kalus embriogenik terdapat pada media MS + 1
mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP.
Hasil penelitian Rai et al. (2007) menunjukkan bahwa media terbaik untuk
menginduksi embrio somatik yang menggunakan eksplan biji muda tanaman
jambu biji varietas banarasi lokal yang berasal dari India adalah media MS + 1 mg
l-1 2.4-D + 5% sukrosa. Rai et al. (2008) melanjutkan penelitiannya dengan
menguji pengaruh konsenterasi sukrosa dan ABA terhadap daya berkecambah
benih sintetik yang berasal dari embrio somatik tanaman jambu biji. Media
terbaik yang dapat menghasilkan daya berkecambah benih sintetik yang berasal
dari embrio somatik tanaman jambu biji tertinggi adalah media MS + 1 mg l-1
ABA + 10% sukrosa. Pada tahun berikutnya, Rai et al. (2009a) menyatakan
bahwa penambahan asam amino glutamin dan prolin serta PEG (polyethylene
glycol) pada media MS dapat meningkatkan efektifitas proses pendewasaan dan
perkecambahan embrio somatik tanaman jambu biji.
7
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen
Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2012 sampai dengan bulan
Maret 2013.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah biji muda dari buah jambu biji merah
berumur ± 1 bulan setelah antesis yang berasal dari Pusat Studi Biofarmaka IPB
(Gambar 2). Bahan sterilisasi eksplan yang digunakan adalah deterjen, antiseptik,
Na-hipoklorit 5.25% dan alkohol 96%. Media kultur yang digunakan pada
percobaan ini adalah media dasar MS (Murashige and Skoog), sukrosa, prolin,
agar (bahan pemadat), aquades, arang aktif, zat pengatur tumbuh yang berasal dari
golongan auksin yaitu 2.4-D (2.4-dichlorophenox acetic acid) dan NAA
(naphthalene acetic acid), golongan sitokinin yaitu BAP (6-benzyl amino purine)
dan 2-iP (N6-2-isopentenyl adenine) serta dari golongan giberelin yaitu GA3.
Alat yang digunakan terdiri atas peralatan gelas (botol kultur, botol ukur,
gelas piala, cawan petri, gelas ukur, dan corong gelas), kompor, autoklaf, laminar
air flow cabinet, peralatan diseksi seperti pinset, gunting, dan scalpel. Pada saat
kultur tanaman diperlukan rak dan ruang kultur bersuhu 18-21°C.
A
B
)
Gambar 2 A) Buah jambu biji merah ± 1 bulan setelah antesis. B)
Eksplan biji muda jambu biji merah (10 biji per botol).
Metode Percobaan
Penelitian ini tersusun atas dua percobaan. Percobaan pertama yaitu
induksi kalus menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor yaitu
komposisi zat pengatur tumbuh. Terdapat enam taraf komposisi zat pengatur
tumbuh yaitu: (R1) MS + 2.5 mg l-1 2.4-D, (R2) MS + 5 mg l-1 2.4-D, (R3) MS +
2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP, (R4) MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP, (R5)
MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP, dan (R6) MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1
8
2-iP. Terdapat lima ulangan untuk masing-masing perlakuan sehingga terdapat 30
satuan percobaan (botol kultur). Tiap satuan percobaan terdiri atas 10 eksplan,
sehingga terdapat 300 satuan amatan. Model rancangan yang digunakan adalah :
Yik = μ + αi + εik
Yik = respon pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i pada ulangan ke k
μ = rataan umum
αi = pengaruh perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i
εik = galat pada perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i pada ulangan
ke-k
i = 1,2,3,4,5,6
k = 1,2,3,4,5
Percobaan kedua yaitu induksi embrio somatik menggunakan rancangan
acak lengkap faktorial dua faktor. Faktor pertama adalah kalus yang berasal dari
media pada percobaan induksi kalus. Terdapat enam taraf kalus yang berasal dari
media awal yaitu: (KR1) kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D, (KR2) kalus
dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D, (KR3) kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D +
1 mg l-1 BAP, (KR4) kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP, (KR5)
kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP, dan (KR6) kalus dari
media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP. Faktor kedua adalah komposisi zat
pengatur tumbuh pada media subkultur dengan lima taraf yaitu: (E1) MS + 1 mg l1
2.4-D, (E2) MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 NAA, (E3) MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1
mg l-1 BAP, (E4) MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dan (E5) MS + 1 mg l-1 2.4D + 1 mg l-1 GA3. Terdapat 30 kombinasi perlakuan dengan lima ulangan untuk
masing-masing perlakuan sehingga terdapat 150 satuan percobaan (botol kultur).
Tiap satuan percobaan terdiri atas dua eksplan sehingga terdapat 300 satuan
amatan. Model rancangan yang digunakan adalah:
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + εijk
Yijk = respon pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i dan asal kalus
taraf ke-j pada ulangan ke-k
μ
= rataan umum
αi
= pengaruh perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i
βj
= pengaruh perlakuan asal kalus taraf ke -j
(αβ)ij = pengaruh interaksi antara komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i dan
asal kalus taraf ke-j
εijk = galat pada perlakuan komposisi zat pengatur tumbuh taraf ke-i dan asal
kalus taraf ke-j pada ulangan ke-k.
i
= 1,2,3,4,5,6
j
= 1,2,3,4,5
k
= 1,2,3,4,5
Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis menggunakan metode deskriptif serta analisis
ragam dengan uji F pada taraf nyata 5%. Jika uji F berpengaruh nyata maka nilai
tengah diuji lanjut dengan uji jarak berganda Duncan (Duncan Multiple Range
Test/ DMRT) pada taraf nyata 5%.
9
Pelaksanaan Percobaan
Pembuatan Media Tanam
Pembuatan media MS dilakukan dengan mengambil larutan dari setiap
larutan stok media (A, B, C, D, E, F, myoinositol, vitamin dan asam amino prolin)
yang telah dibuat sesuai dengan volume yang diperlukan serta ditambah dengan
zat pengatur tumbuh sesuai dengan perlakuan masing-masing. Setelah semua
larutan dimasukkan ke dalam labu takar ditambahkan gula yang telah dilarutkan
dengan konsentrasi 30 g l-1. Lalu ditera sampai tanda tera dengan aquades. Setelah
itu dilakukan pengukuran pH dengan kertas lakmus sampai pH media 5.8. Larutan
media yang telah diukur pH dimasukkan kedalam panci lalu ditambahkan agar
dengan konsentrasi 7 g l-1 dan arang aktif sebanyak 2 g l-1. Larutan media dimasak
sampai mendidih. Larutan media lalu dimasukkan ke dalam botol kultur sekitar 25
ml per botol. Semua media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan
tekanan 17.5 Psi selama 25-30 menit.
Sterilisasi Eksplan
Buah jambu biji merah direndam dalam larutan deterjen dan antiseptik
selama 10 menit, kemudian dicuci dan disikat bersih dibawah air yang mengalir.
Buah yang telah bersih dipindahkan ke laminar air flow cabinet dan dibilas
menggunakan aquades. Buah direndam dan dikocok dalam larutan Na-hipoklorit
5.25% selama 5 menit lalu dibilas menggunakan aquades sebanyak tiga kali.
Buah dibakar di atas bunsen sebelum dipindahkan ke cawan petri.
Penanaman Eksplan
Penanaman eksplan dilakukan di dalam laminar air flow cabinet yang
telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol 96%. Buah jambu biji merah yang
telah disterilisasi dipindahkan ke cawan petri, dibelah melintang kemudian
diekstraksi bijinya serta ditanam pada media yang telah disiapkan. Satu botol
terdiri atas 10 eksplan. Kultur disimpan dalam ruang kultur yang gelap dan
bertemperatur 18-21°C.
Pengamatan
Peubah yang diamati pada percobaan pertama (induksi kalus) yaitu
persentase kultur steril, jumlah dan persentase eksplan berkalus serta tipe kalus.
Peubah yang diamati pada percobaan kedua (induksi embrio somatik) yaitu
jumlah dan persentase kalus berakar, jumlah dan persentase eksplan awal
berkecambah, jumlah dan persentase kalus embriogenik serta jumlah embrio
somatik.
10
HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan 1: Induksi Kalus
Penelitian yang terdiri atas dua percobaan, diawali dengan percobaan
untuk menentukan media dengan komposisi zat pengatur tumbuh terbaik dalam
menginduksi kalus dari eksplan biji muda. Penelitian pendahuluan dilakukan
untuk menentukkan taraf 2.4-D yang digunakan. Hasil penelitian pendahuluan
menunjukkan bahwa konsentrasi 2.4-D terbaik untuk menginduksi kalus adalah di
antara 2.5 – 5 mg l-1. Pada percobaan ini taraf 2.4-D yang didapat dikombinasikan
dengan jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh lainnya.
Peubah yang diamati pada percobaan pertama ini adalah persentase kultur
steril. Persentase kultur steril pada media R1 sebesar 100% dari 50 satuan amatan
(eksplan yang ditanam setiap perlakuan) pada umur kultur 8 minggu setelah tanam
(MST). Kultur steril pada media R2, R3, R4, R5, dan R6 berturut-turut adalah
92%, 86%, 86%, 94%, dan 92%. Secara umum tingkat kultur steril cukup tinggi,
karena lebih dari 85% (Gambar 3).
Gambar 3 Rata-rata persentase kultur steril umur 8 MST (%)
Keterangan: R1 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; R2 = MS + 5 mg l-1 2.4-D;
R3 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; R4 = MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1
mg l-1 BAP; R5 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; R6 = MS + 5 mg l-1
2.4-D + 2 mg l-1 2-iP.
Selaras dengan hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Rai et al. (2007)
tingkat kontaminasi yang rendah pada semua media perlakuan disebabkan eksplan
yang digunakan adalah biji. Secara morfologi posisi biji jambu biji merah terletak
di dalam dan terlindungi oleh daging buah yang tebal sehingga terhindar dari
kontak langsung dengan sumber kontaminan.
11
Eksplan Berkalus
Eksplan biji muda yang dikulturkan pada setiap media perlakuan mulai
menunjukkan respon pembentukan kalus pada 1 MST. Tabel 1 menunjukkan
komposisi zat pengatur tumbuh berpengaruh nyata terhadap persentase eksplan
berkalus pada dua minggu pertama setelah penanaman. Eksplan yang ditanam
pada media dengan perlakuan zat pengatur tumbuh R2, R4 dan R6 memiliki
persentase pembentukan kalus lebih tinggi dibandingkan eksplan yang ditanam
pada media R1, R3 dan R5.
Tabel 1 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap jumlah dan persentase
eksplan berkalus (%)
a
Komposisi zat
pengatur
tumbuh
R1
(29/48)*.. 60.5
b
(36/48)* ..74.5
R2
(50/50)* 100.0
a
R3
(27/46)*.. 59.0
R4
R5
R6
Eksplan berkalus (%)
1 MST
2 MST
3 MST
4 MST
b
(46/48)*.. 95.5
(46/48)* ..95.5
(50/50)* 100.0
a
(50/50)* 100.0
(50/50)* 100.0
b
(34/46)* ..74.6
b
(43/46)*.. 94.0
(43/46)* ..94.0
(42/48)*.. 87.0
a
(44/48)* ..91.5
a
(48/48)* 100.0
(48/48)* 100.0
(23/49)*.. 46.8
b
(35/49)* ..71.2
b
(48/49)*.. 97.6
(49/49)* 100.0
(45/50)*.. 90.0
a
(50/50)* 100.0
a
(50/50)* 100.0
(50/50)* 100.0
Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada hasil uji lanjut DMRT taraf 5%. R1 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; R2 = MS + 5
mg l-1 2.4-D; R3 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; R4 = MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1
BAP; R5 = MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; R6 = MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; MST
= Minggu setelah tanam; *= Jumlah eksplan berkalus per jumlah total eksplan yang dikulturkan.
Media R2, R4, dan R6 mengandung zat pengatur tumbuh golongan auksin
(2.4-D) yang lebih tinggi dibandingkan media R1, R3, dan R5. Menurut Yuwono
(2006) zat pengatur tumbuh yang memiliki peran dominan dalam proses
pembentukan kalus adalah auksin dibandingkan dengan sitokinin. Pemberian
senyawa 2.4-D pada media kultur jaringan selain akan meningkatkan kecepatan
pembentukan kalus juga akan menekan organogenesis.
Persentase eksplan berkalus pada semua perlakuan komposisi zat pengatur
tumbuh pada umur kultur 3-4 MST tidak berbeda nyata berdasarkan hasil
pengujian sidik ragam. R2 merupakan media paling efisien dalam penggunaan zat
pengatur tumbuh yang memberikan respon terbaik terhadap persentase
pembentukan kalus pada 1-2 MST. Sedangkan pada umur kultur 3-4 MST, R1
merupakan media paling efisien dalam penggunaan zat pengatur tumbuh yang
memberikan respon terbaik terhadap persentase pembentukan kalus. Tingkat
efisiensi penggunaan zat pengatur tumbuh ditinjau dari segi biaya.
Hasil uji kontras menunjukkan, perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin
yang dikandung oleh media R2, R4, dan R6 memengaruhi persentase kalus yang
terbentuk pada saat umur kultur 1-2 MST. Sedangkan pada umur kultur 3-4 MST
perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin yang dikandung oleh media R2, R4, dan
R6 tidak memengaruhi persentase kalus yang terbentuk. Sama halnya dengan
perbedaan jenis dan konsentrasi sitokinin yang dikandung oleh media R1, R3, dan
R5 ternyata persentase kalus yang terbentuk tidak berbeda nyata pada umur kultur
2-4 MST (lampiran 4).
12
Tipe Kalus
Kalus merupakan kumpulan sel yang tidak terorganisir dan terjadi karena
pembelahan yang sangat aktif. Rangsangan dari hormon endogen atau zat
pengatur tumbuh yang ditambahkan (eksogen) menyebabkan metabolisme sel
menjadi aktif, dalam keadaan demikian jaringan dikatakan sedang mengalami
dediferensiasi. Keadaan ini terus berlangsung selama proliferasi kalus (Wetter dan
Constabel 1991).
Terdapat dua tipe kalus yang terlihat pada percobaan ini. Tipe pertama
yaitu kalus putih kehijauan yang memiliki ciri-ciri struktur kalusnya kompak dan
tumbuh secara berkelompok di salah satu sisi eksplan (kalus kompak). Kalus tipe
dua berwarna putih kecoklatan (krem), struktur kalusnya remah dan menyebar di
seluruh permukaan eksplan (kalus remah).
Perbedaan sifat kalus dipengaruhi oleh komposisi zat pengatur tumbuh
yang terkandung dalam media kultur jaringan. Hasil uji DMRT pada Tabel 2
menunjukkan bahwa media dengan komposisi zat pengatur tumbuh pada
perlakuan R2 (MS + 5 mg l-1 2.4-D), R4 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP) dan
R5 (MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) merupakan media terbaik untuk
menginduksi kalus kompak pada umur kultur 4 MST. Sedangkan media dengan
perlakuan zat pengatur tumbuh R6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP)
merupakan media terbaik untuk menginduksi kalus remah.
Tabel 2 Pengaruh komposisi zat pengatur tumbuh terhadap tipe kalus pada 4 MST
Komposisi zat
Tipe kalus (%)
pengatur tumbuh
Kompak
-1
R1 (MS + 2.5 mg l 2.4-D)
-1
R2 (MS + 5 mg l 2.4-D)
-1
-1
R3 (MS + 2.5 mg l 2.4-D + 1 mg l BAP)
-1
-1
R4 (MS + 5 mg l 2.4-D + 1 mg l BAP)
-1
-1
R5 (MS + 2.5 mg l 2.4-D + 2 mg l 2-iP)
-1
-1
R6 (MS + 5 mg l 2.4-D + 2 mg l 2-iP)
a
Remah
(33/48)*.. 68.0
b
(13/48)* 27.5
b
(50/50)* 100.0
a
(0/50)*… 0.0
c
(32/47)*.. 62.4
b
(15/47)* 31.6
b
(48/48)* 100.0
a
(0/48)*… 0.0
c
(50/50)* 100.0
a
(0/50)*… 0.0
c
(20/50)*.. 40.0
c
(30/50)* 60.0
a
Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak
berbeda nyata pada hasil uji lanjut DMRT taraf 5%; *= Jumlah kalus kompak atau remah per
jumlah total eksplan yang dikulturkan.
Menurut Rai et al. (2007) kalus yang berasal dari eksplan biji muda jambu
biji varietas lokal Banarasi (India) memiliki dua tipe kalus, tipe pertama kalus
putih yang jika dilihat di bawah mikroskop selnya terlihat memanjang dan saling
bertumpukan menyatu, dari kumpulan kalus tipe ini tidak pernah ada yang
berkembang menjadi embrio somatik. Kalus kompak dengan ciri-ciri tersebut
berpotensi untuk berkembang ke arah organogenesis. Tipe kedua terdiri atas selsel bulat berwarna coklat terang hingga coklat gelap dan friable (remah).
Kumpulan sel tipe ini seringkali ditemukan berasosiasi dengan embrio somatik.
13
Percobaan 2: Induksi Embrio Somatik
Percobaan kedua merupakan percobaan yang menggunakan kalus yang
terbentuk pada percobaan pertama. Seluruh kalus hasil percobaan pertama
dipindahkan ke media yang berbeda, dengan lima taraf komposisi zat pengatur
tumbuh pada umur kultur 8 MST.
Proses regenerasi tanaman secara in vitro dipengaruhi oleh dua faktor
utama yaitu komponen media dan sumber eksplan (Rai et al. 2009b). Komponen
media yang memengaruhi proses regenerasi tanaman secara in vitro salah satunya
adalah komposisi zat pengatur tumbuh (Taji et al. 2002). Morfogenesis kalus
tergantung pada keseimbangan auksin dan sitokinin di dalam media. Interaksi
antara zat pengatur tumbuh endogen tanaman dan zat pengatur tumbuh eksogen
yang diserap dalam media akan menentukan arah perkembangan kalus (Asnawati
et al. 2002).
Kalus Berakar
Kultur kalus yang dikembangkan dari eksplan dapat diregenerasikan
sehingga membentuk tanaman yang lengkap. Proses pembentukan organ-organ
tanaman seperti akar dan tunas maupun tanaman yang lengkap dari kultur sel atau
jaringan disebut dengan organogenesis (Yuwono 2006). Hasil kalus berakar yang
didapatkan pada percobaaan ini tidak diharapkan. Kalus berakar lebih sulit
diregenerasikan menjadi tanaman (Zulkarnain 2009).
Hasil pengamatan pada Tabel 3 menunjukkan persentase kalus berakar
(KA) pada umur kultur 12, 14, dan 16 MST. Terdapat empat perlakuan asal kalus
dan zat pengatur tumbuh yang menginduksi terbentuknya kalus berakar. Semua
perlakuan yang menghasilkan kalus berakar mengandung komposisi zat pengatur
tumbuh tunggal yaitu auksin, baik itu 2.4-D maupun NAA. Perlakuan KR2E2
(kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D
+ 1 mg l-1 NAA) dapat menghasilkan persentase tertinggi kalus berakar pada umur
kultur 12-16 MST. Menurut Wetter dan Constabel (1991) pembentukan organ
(organogenesis) pada kultur in vitro tanaman dipengaruhi oleh ketersediaan
senyawa-senyawa tertentu dalam media. Pembentukan tunas dan akar ditentukan
oleh konsentrasi auksin dan sitokinin yang digunakan. Dominasi auksin yang
lebih tinggi dibandingkan dengan sitokinin dapat menginduksi terbentuknya akar.
Eksplan Awal Berkecambah
Kecambah yang muncul pada percobaan ini merupakan kecambah yang
berasal dari embrio zigotik. Eksplan yang berasal dari biji muda memiliki potensi
untuk berkecambah pada media yang tepat. Hasil pengamatan pada Tabel 4
menunjukkan terdapat enam perlakuan asal kalus dan zat pengatur tumbuh yang
menginduksi terbentuknya eksplan berkecambah. Persentase eksplan
berkecambah pada keenam perlakuan (KR1E5, KR2E5, KR3E5, KR4E5, KR5E5,
dan KR6E5) relatif tinggi ≥ 80% pada umur kultur 16 MST.
Semua perlakuan yang menginduksi munculnya kecambah mengandung
komposisi zat pengatur tumbuh 1 mg l-1 GA3. Secara umum peranan giberelin di
dalam tanaman adalah untuk meningkatkan perkecambahan biji dan menginduksi
pemanjangan ruas. Selain itu giberelin dapat dimanfaatkan untuk menginduksi
pembentukan embrio dari kalus (Zulkarnain 2009). Namun pada percobaan ini
14
kalus yang disubkultur pada media yang mengandung giberelin tidak terinduksi
untuk membentuk embrio melainkan terinduksi untuk berkecambah dari eksplan
awal berupa biji. Gambar 4A, 4B, dan 4C menunjukkan perkembangan proses
perkecambahan embrio zigotik pada media dengan perlakuan zat pengatur tumbuh
KR5E5 (kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dipindahkan ke
media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 GA3) pada saat umur kultur 12, 14, dan 16
MST.
A
B
C
)
)
)
D
E
F
)
)
)
G
H
)
)
i
ii
I
)
Gambar 4 A) Embrio zigotik yang berkecambah pada perlakuan KR5E5 12 MST. B)
Embrio zigotik yang berkecambah pada perlakuan KR5E5 14 MST. C)
Tunas mikro jambu biji merah pada perlakuan KR5E5 16 MST. D) Kalus
embriogenik pada perlakuan KR6E3 14 MST. E) Embrio somatik primer
pada perlakuan KR1E4 12 MST. F) Embrio somatik primer pada perlakuan
KR6E4 16 MST. G) Embrio zigotik pada perlakuan KR6E1 12 MST. H)
Embrio somatik sekunder pada perlakuan KR6E1 16 MST. I) (i) Embrio
zigotik dan (ii) embrio somatik sekunder pada perlakuan KR1E3 14 MST.
15
Tabel 3 Pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh terhadap jumlah dan
persentase kalus berakar
Kalus dari
media awal
KR1
KR2
KR3
KR4
KR5
KR6
a
Media
subkultur
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
12 MST
KA (%)
(1/10)* 10.0
(2/10)* 20.0
0.0
0.0
0.0
(3/9)*.. 33.3
(5/10)* 50.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
14 MST
KA (%)
(3/10)* 30.0
(5/9)*.. 55.6
0.0
0.0
0.0
(5/9)*.. 55.6
(6/10)* 60.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
16 MST
KA (%)
(5/9)*. 55.6
(6/9)* 66.7
0.0
0.0
0.0
(6/9)*.. 66.7
(8/10)* 80.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
KR1= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; KR2= Kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D;
KR3= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR4= Kalus dari media MS + 5 mg l-1
2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR5= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; KR6= Kalus dari
media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; E1= MS + 1 mg l-1 2.4-D; E2= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l1
NAA; E3= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; E4= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; E5= MS + 1
mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 GA3; KA= Persentase eksplan berakar; MST= Minggu setelah tanam; *= Jumlah
kalus berakar per jumlah eksplan yang dikulturkan.
16
Tabel 4 Pengaruh asal kalus dan komposisi zat pengatur tumbuh terhadap jumlah
dan persentase eksplan awal (embrio zigotik) berkecambah
Kalus dari
media awal
KR1
KR2
KR3
KR4
KR5
KR6
a
Media
subkultur
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
E1
E2
E3
E4
E5
12 MST
KK (%)
0.0
0.0
0.0
0.0
(3/9)* 33.3
0.0
0.0
0.0
0.0
(5/10)* 50.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(3/10)* 30.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(2/9)* 22.2
0.0
0.0
0.0
0.0
(4/9)* 44.4
0.0
0.0
0.0
0.0
(3/10)* 30.0
14 MST
KK (%)
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(9/10)* 90.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(6/9)* 66.7
0.0
0.0
0.0
0.0
(7/9)* 77.8
0.0
0.0
0.0
0.0
(7/9)* 77.8
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/10)* 80.0
16 MST
KK (%)
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(9/10)* 90.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/9)* 88.9
0.0
0.0
0.0
0.0
(9/9)* 100.0
0.0
0.0
0.0
0.0
(8/10)* 80.0
KR1= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D; KR2= Kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D;
KR3= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR4= Kalus dari media MS + 5 mg
l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; KR5= Kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; KR6= Kalus
dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP; E1= MS + 1 mg l-1 2.4-D; E2= MS + 1 mg l-1 2.4-D
+ 1 mg l-1 NAA; E3= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP; E4= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP;
E5= MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 GA3; KK= Persentase eksplan awal (embrio zigotik)
berkecambah; MST= Minggu setelah tanam; *= Jumlah eksplan awal (embrio zigotik) berkecambah
per jumlah total eksplan yang dikulturkan.
17
Kalus Embriogenik
Eksplan dapat ditumbuhkan sebagai kalus yang selanjutnya dikembangkan
untuk menghasilkan embrio somatik. Embrio somatik dapat diinduksi sehingga
berkecambah dan akhirnya menjadi plantlet. Kalus yang memiliki sifat untuk
dikembangkan menjadi embrio disebut dengan kalus embriogenik. Proses
pembentukan embrio dari sel somatik seperti kalus disebut dengan embriogenesis
somatik (Evans et al. 2003). Gambar 4D menunjukkan contoh kalus embriogenik
pada perlakuan KR6E3 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP
dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 1 mg l-1 BAP) pada umur kultur 14
MST.
Hasil pengamatan pada Tabel 5 menunjukkan terdapat enam perlakuan
asal kalus dan zat pengatur tumbuh yang menginduksi terbentuknya kalus yang
bersifat embriogenik. Peran sitokinin baik itu BAP maupun 2-iP berpengaruh
terhadap terbentuknya kalus embriogenik. Kalus embriogenik tidak terbentuk
pada media dengan zat pengatur tunggal auksin. Namun, pada media subkultur E1
(MS + 1 mg l-1 2.4-D) terbentuk kalus embriogenik disebabkan oleh adanya
pengaruh kalus yang berasal dari media awal yang mengandung zat pengatur
tumbuh sitokinin yaitu KR6 (MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP). Perlakuan
KR6E4 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP dipindahkan ke
media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) merupakan perlakuan yang memiliki
persentase kalus embriogenik tertinggi pada umur kultur 12-16 MST yaitu sekitar
60%.
Menurut Moura dan Motoike (2009) penggunaan sitokinin dan auksin
pada media MS secara bersamaan dapat memacu terbentuknya kalus embriogenik
pada biji muda tanaman jambu biji varietas Paluma yang berasal dari Brazil. Hasil
penelitian mereka menunjukkan persentase terbesar pembentukan kalus
embriogenik terdapat pada media MS yang ditambah dengan 1 mg l-1 2.4-D + 2
mg l-1 2-iP, selaras dengan hasil yang didapat pada Tabel 5.
Embrio Somatik
Keberhasilan pembentukan embrio somatik secara in vitro ditentukan oleh
jenis tanaman, eksplan, media, dan lingkungan fisik. Kalus yang memenuhi syarat
untuk terbentuknya embrio somatik adalah kalus yang bersifat embriogenik, yaitu
selnya berukuran kecil, berwarna kuning mengkilat, dan sitoplasmanya padat
(Lestari 2007). Kalus embriogenik yang terbentuk memiliki potensi untuk
menghasilkan embrio somatik baik secara langsung (embrio somatik primer)
maupun secara tidak langsung (embrio somatik sekunder). Embrio somatik primer
merupakan embrio somatik yang dihasilkan langsung dari kalus yang bersifat
embriogenik, sedangkan embrio somatik sekunder merupakan embrio somatik
yang terbentuk di atas permukaan embrio zigotik yang berasal dari eksplan biji
muda yang ditanam.
Menurut Zulkarnain (2009) sama seperti embrio zigotik yang berkembang
dari penyatuan gamet jantan dan gamet betina, embrio somatik pun tumbuh dan
berkembang melewati tahapan-tahapan yang sama. Tahapan-tahapan tersebut
adalah globular, hati, torpedo, dan kotiledon. Embrio somatik mempunyai ciri
struktur bipolar dengan dua calon meristem, yaitu meristem akar dan meristem
tunas.
18
Embrio somatik primer terbentuk pada dua perlakuan yaitu KR1E4 dan
KR6E4. Perlakuan KR1E4 (kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D dipindahkan
ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) dapat menginduksi terbentuknya
dua embrio somatik primer (fase globular dan fase hati) pada umur kultur 12 MST
(Gambar 4E). Perlakuan KR6E4 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1
2-iP dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP) dapat
menginduksi terbentuknya 32 embrio somatik primer (enam fase globular, empat
fase hati, 17 fase torpedo dan lima fase kotiledon) pada umur kultur 16 MST
(Gambar 4F).
Embrio somatik sekunder terbentuk pada dua perlakuan yaitu KR6E1 dan
KR1E3. Perlakuan KR6E1 (kalus dari media MS + 5 mg l-1 2.4-D + 2 mg l-1 2-iP
dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4-D) dapat menginduksi terbentuknya
embrio zigotik pada umur kultur 12 MST (Gambar 4G) dan embrio somatik
sekunder terbentuk pada umur kultur 16 MST (Gambar 4H). Perlakuan KR1E3
(kalus dari media MS + 2.5 mg l-1 2.4-D dipindahkan ke media MS + 1 mg l-1 2.4D + 1 mg l-1 BAP) dapat menginduksi terbentuknya embrio somatik sekunder
pada umur kultur 14 MST. Kalus yang berada pada perlakuan KR1E3 merupakan
kalus kompak yang tidak bersifat embriogenik, namun karena eksplan awal yang
digunakan merupakan biji sehingga muncul embrio zigotik ya