Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos
VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN
KHAMIR PADA SAOS
SKRIPSI
RIZQI FEBRINA
F24070053
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul
Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos adalah
hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing akademis dan belum
diajukan dalam bentuk apapun di perguruan tinggi manapun. Sumber informasi
yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan
dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Juni 2013
Yang membuat pernyataan,
Rizqi Febrina
NIM F240070053
ABSTRACT
Rizqi Febrina. Method Secondary Validation of Mould and Yeast Analysis
Sauce
Food are frequentlycontaminated by mold and yeast. The method used for
analysis of mold on food in Indonesia set by BSN (Badan Standarisasi Nasional)
was using potato dextrose agar (PDA) media. Problems are sometimes occured
when using this media due to the spreading of mold colony that suppress other
colonies to grow, resulting difficulties to asses morphology as well as
enumeration of the mold. Statistifically, the outcome would be less acurate.
Another method that could be used for the analysis of mold and yeast are the
methods of ISO (International Standart Operation). Rose bengal dichloran
chloramphenicol media (DRBC) was found to be a better media for quantative
analysis of mold and yeast since it contains dichloran and rose bengal that could
prevent the growth of spreading colonies. Laboratory experiments was needed to
verify that using of different media can domonstrate the same performance for
method enumeration. Secondary validation conducted for verification, if the
laboratory using standard methods or adopting validated method. This Research
was performed using the method of SNI 01-2897-1992 and ISO (International
Standart Operation). Both of that methods were compared to obtained a valid
methods. Parameters determined on method validation were accuracy precision,
linearity, limit of detection, and limit of quantification. The results showed that all
parameters were in accordance with the acceptance criteria of Internationa
Standart Operation Method Validation. Accuracy was determined SNI method
and ISO method with recovery percentage in range of 84%-109% for SNI and ISO
method. The linearity in the concentration of 10; 100; 1000; and 10.000 cfu/gram
resulted in correlation coefficent of 0,9979–0,9981. limit of detection in this
method was 2cfu/gram and limit of quantification was 4 cfu/gram. For sauce
product, the number of colonies grown in both media of DRBC and PDA were not
significantly diffrent.
Keywords : DRBC, method validation, mould, sauce, yeast
VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN
KHAMIR PADA SAOS
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Oleh
RIZQI FEBRINA
F24070053
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada
Saos
Nama
: Rizqi Febrina
NIM
: F24070053
Menyetujui:
Dosen Pembimbing
Dr. Harsi D Kusumaningrum
NIP 197601312005012001
Mengetahui,
Ketua Departemen
Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc
NIP. 19680526.199303.1.004
Tanggal Ujian :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini adalah validasi metode
analisa dengan judul “Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir
pada Saos”.
Ucapan terimakasih, penulis sampaikan kepada LDITP (Laboratorium
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan) yang telah menyediakan pendanaan
penelitian, Ibu Dr. Harsi D Kusumaningrum sebagi pembimbing, Ibu Dr. Didah
Nurfaridah, S.TP, M.Si dan Ibu Siti Nurjanah, S.TP, M.Si sebagai penguji.
Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada papa, mama, serta seluruh
keluarga, atas doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor,
Juni 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI .................................................................................
DAFTAR TABEL...........................................................................
DAFTAR GAMBAR .....................................................................
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................
PENDAHULUAN.........................................................................
LATAR BELAKANG .............................................................
TUJUAN ...................................................................................
METODOLOGI PENELITIAN ....................................................
WAKTU DAN TEMPAT ..........................................................
BAHAN DAN ALAT ...............................................................
METODE PENELITIAN .........................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
KEMURNIAN KULTUR .......................................................
ANALISA JUMLAH KULTUR .............................................
PARAMETER UJI TERVALIDASI ......................................
VERIFIKASI METODE PADA PRODUK SAOS ...............
KESIMPULAN ..............................................................................
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................
LAMPIRAN ....................................................................................
HALAMAN
iii
iv
v
vi
1
1
2
2
2
3
4
9
9
9
10
17
19
20
22
DAFTAR TABEL
Jumlah awal kultur uji kapang ......................................................
Jumlah awal kultur uji khamir ......................................................
Jumlah awal kultur uji kapang dan khamir ...................................
Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan
perhitungan mengacu pada SNI ...................................................
Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan
perhitunga mengacu pada ISO .....................................................
Jumlah kultur yang tumbuh pada saos berbagai merk ..................
Halaman
10
10
11
13
13
17
DAFTAR GAMBAR
Diagram persiapan media PDA.........................................................
Diagram persiapan media DRBC.......................................................
Diagram persiapan sampel.................................................................
Perhitungan jumlah koloni kapang dan khamir ..................................
Diagram penentuan akurasi, presisisi dan linearitas ...........................
Diaram penentuan LOD dan LOQ......................................................
Diagram verifikasi jumlah kapang dan khamir dengan berbagai merk
Halaman
4
4
5
6
7
8
8
Kultur murni kapang Rhizopus Olighosporus......................................
9
Kultur murni Saccharomyces cerevisiae..............................................
9
Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI..12
Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan
mengacu pada ISO...............................................................................
12
Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada SNI ......................
14
Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada ISO.......................
14
Linearitas dengan perhitungan mengacu pada SNI..............................
16
Linearitas dengan perhitungan mengacu pada ISO ..............................
16
Berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh pada berbagai merk saos .. 17
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Biodata..................................................................................................................22
Rancangan validasi metode...................................................................................23
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pangan merupakan sumber gizi bagi manusia. Pertumbuhan dan
perkembangan mikroorganisme dalam makanan sangat erat hubungannya dengan
kehidupan manusia. Pertumbuhan mikroorganisme dalam pangan dapat
menyebabkan perubahan yang menguntungkan. Selain itu pertumbuham
mikroorganisme dalam pangan juga dapat mengakibatkan perubahan fisik yang
tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut tidak layak dikomsumsi.
Pangan menjadi layak atau tidak dikonsumsi tidak terlepas dari ada tidaknya
mikoorganisme perusak dan patogen pangan. Mikroorganisme tersebut dapat
terkandung di dalam makanan disebabkan karena kontaminasi pada bahan pangan
selama proses pengolahan dan penyimpanan. Kontaminasi yang sering terjadi
pada negara Indonesia yang beriklim tropis adalah kontaminasi disebabkan oleh
kapang dan khamir.
Saos merupakan produk berbentuk pasta dengan aroma khas. Saos biasa
ditambahkan sebagai bahan penyedap dan penambah rasa pada makanan. Saos
adalah produk yang dihasilkan dari campuran bubur atau pasta atau padatan
tomat maupun cabai yang diperoleh dari tomat yang masak, yang diolah dengan
bumbu-bumbu, dengan atau tanpa penambahan bahan pangan lain. Saos seringkali
memiliki masalah pertumbuhan kapang pada saat penyimpanannya.
Metode yang digunakan untuk analisis kapang dan khamir yang ditetapkan
BSN (Badan Srandardisasi Nasional) melalui SNI 01-2897-1992, yaitu tentang
tata cara uji kapang dan khamir menggunakan media potato dextrose agar (PDA).
Namun terdapat kelemahan pada media potato dextrose agar (PDA), yaitu
sulitnya menghitung jumlah kapang dan khamir disebabkan oleh pertumbuhan
kapang yang melebar (spreading) dari satu atau dua jenis kapang tertentu pada
cawan petri yang mengakibatkan tertutupnya koloni kapang dan khamir lain, atau
bahkan terhambatnya pertumbuhan kapang dan khamir lain sehingga tingkat
kepercayaan terhadap hasil menjadi kurang (Indriati dan Herawati 2009).
Metode lain yang dapat digunakan untuk analisis kapang dan khamir adalah
metode ISO (International Standart Operation). Metode ISO (International
Standart Operation) memiliki sensitifitas yang cukup baik karena menggunakan
media dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC) yang merupakan media
yang dapat menekan penyebaran koloni kapang dan khamir (Henson 1981).
Penggunaan media DRBC diketahui dapat menghambat penyebaran koloni pada
kapang dan khamir. Rose bengal adalah salah satu zat pewarna yang dapat
mengatasi masalah yang disebabkan oleh kapang dan khamir yang
pertumbuhannya melebar. Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroaniline), digunakan
sendiri-sendiri atau dikombinasikan dengan rose bengal diketahui sangat efektif
menekan pertumbuhan kapang dan khamir sehingga diameter koloninya tidak
melebar. Dichloran, juga dikenal sebagai dichloronitroaniline (DCNA) adalah
fungisida yang terdaftar untuk mengontrol kapang dan khamir yang bersifat
patogenik (Henson 1981). Penggunaan media DRBC menekan pertumbuhan
kapang dan khamir yang melebar tanpa mempengaruhi germinasi sporanya.
2
Namun, penggunaan media DRBC membutuhkan biaya yang lebih mahal
dibandingkan menggunakan media PDA.
Validasi metode analisa adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (SNI 19-170252000 Klausul 5.4.5.1). Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan
metode analisis baru hasil pengembangan, atau metode yang dimodifikasi
terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika
laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standar yang telah divalidasi
(Sukarno 2005).
Pendeteksian kapang dan khamir pada skripsi ini dilakukan dengan
menggunakan metode yang mengacu pada SNI 01-2897-1992 dan metode ISO
(Iternational Standart Operation) yaitu ISO 21527-1:2008(E). Kedua metode
tersebut dibandingkan hasilnya sehingga didapatkan metode yang valid. Metode
valid diperlukan untuk dapat ditetapkan dengan jelas bidang penerapannya dan
kehandalan mutlak yang diberikannya. Validasi metode pengujian adalah proses
menetapkan dan mengevaluasi sifat atau gambaran dari manfaat, ini merupakan
suatu bagian dari program jaminan mutu (Siregar 2007).
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum
Tujuan umum dari penelitian ini adalah menentukan metode yang tepat
untuk analisis kapang dan khamir.
Tujuan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Melakukan validasi sekunder atau verifikasi metode SNI 01-2897-1992 dan
metode ISO 21527-1:2008(E).
2. Membandingkan hasil analisis kapang dan khamir yang diperoleh dari dua
metode berbeda yaitu metode SNI 01-2897-1992 dan ISO 21527-1:2008(E) .
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan informasi mengenai metode analisa yang tepat untuk digunakan
pada analisis kapang dan khamir.
2. Mendapatkan informasi mengenai tingkat validitas metode yang digunakan.
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan LDITP (Laboratorium
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan). Salah satu syarat laboratorium
terakreditasi adalah implementasi metode uji yang sudah divalidasi dengan
ketentuan pada ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4. Penelitian dilaksanakan di
3
Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan memiliki grade analitik. Media yang digunakan pada
penelitian ini adalah potato dextrose agar (PDA OXOID), dichloran rose bengal
chloramphenicol (DRBC OXOID), pottato dextrose broth (PDB OXOID),
aquadest, chloramphenicol, dan pengencer (0,1% pepton water OXOID). Sampel
yang digunakan adalah saos dengan berbagai merk. Kultur yang digunakan
Rhizopus oligosporus dan Saccharomyces cerevisisae (ATTC 9763).
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri, micro pipet,
erlenmeyer, gelas piala, alumunium foil, tissue, kapas, bunsen, vortex, hockey
stick, sudip, timbangan, kantong plastik steril, wadah pipet, inkubator 25°C,
stomacher, bunsen, outoclaf, laminar flow, oven/alat sterilisasi kering, tabung
reaksi dan tabung reaksi bertutup, oven suhu 30°C.
Metode Penelitian
Persiapan Pengencer
Pada metode ISO dan SNI menggunakan 0,1% pepton water sebagai
pengencer. Pepton water ditimbang sebanyak 1 gr kemudian dicampurkan dengan
1 liter aquadest dalam labu takar. Labu takar digoyang hingga seluruh pepton
water larut dan tercampur dengan aquadest secara merata. Pengencer ditempatkan
di dalam tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10
(1ml atau 1gr contoh dalam 9 ml) dan ditempatkan di dalam erlenmeyer masingmasing berisi 90ml untuk membuat pengenceran 1:10 (10 ml atau 1gr contoh
dalam 90 ml). Pengencer disterilisasi 121° selama 15 menit.
Persiapan Media
Media pottato dextrose broth (PDB) ditimbang sebanyak 6 gram
dicampur dengan 250 ml aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate dan diaduk
hingga larut kemudian dimasukkan ke dalam tabung tertutup masing-masing 7-10
ml. Tabung yang telah berisi media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit
pada suhu 121°C kemudian didinginkan pada suhu 50° C.
Media potato dextrose agar (PDA) ditimbang sebanyak 39 gram dicampur
dengan 1 liter aquadest. Bahan dipanaskan di atas hotplate dan diaduk hingga
larut kemudian disterilisasi pada autoclave 121° C selama 15 menit. Sebelum
digunakan terlebih dahulu didinginkan pada suhu 50°C. Antibiotik kloramfenikol
dilarutkan sebanyak 1 gram dalam 100 ml aquadest steril, kemudian ditambahkan
ke dalam media sebanyak 4 ml. Agar dituangkan ke dalam masing-masing cawan
petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan memadat dan
disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi
terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan spread.
Persiapan media PDAdapat dilihat pada Gambar 1.
4
PDA + aquadest
dipanaskan hingga larut
kloramfenikol
+ aquadest
steril
diterilisasi 121°C, 15menit
dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan
dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml
disimpan pada oven steril suhu 30°C selama
24 jam dengan posisi terbalik hingga
permukaan agar mengering
Gambar 1. Diagram persiapan media PDA
Media dichlorant rose bengal agar (DRBC) yang telah ditimbang sebanyak
31,5 dan dicampur dengan 1 liter aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate
dan diaduk hingga larut. Media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit
pada suhu 121°C dan didinginkan pada suhu 50° C dan ditambahkan dengan 0,1
gr antibiotik kloramfenikol. Kemudian dituangkan ke dalam masing-masing
cawan petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan
memadat dan disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam
dengan posisi terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan
spread. Persiapan media dapat dilihat pada Gambar 2.
DRBC + aquadest
kloramfenikol
dipanaskan hingga larut
diterilisasi 121°C, 15menit
dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan
kloramfenikol
dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml
disimpan pada oven steril suhu 30°C selama
24 jam dengan posisi terbalik hingga
permukaan agar mengering
Gambar 2. Diagram persiapan media DRBC
5
Persiapan Sampel
a. Sampel negatif
Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke
dalam plastik steril berisi 90 ml pengencer. Kemudian sampel dihomogenkan
hingga tercampur merata dengan pengencer dan dibiarkan kurang lebih 15
menit sebelum digunakan.
b. Sampel positif
Sampel ditimbang aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam
kantong plastik steril berisi 90 ml pengencer. Selanjutnya kapang Rhizopus
oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam
sampel masing-masing sebanyak 0,5 ml ke dalam suspensi sampel dan
dihomogenkan. Sampel dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan.
c. Kontrol positif
Kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae
diencerkan ke dalam 0,1% pepton dan dihomogenkan.
Persiapan sampel untuk validasi kapang khamir dapat dilihat pada Gambar 3.
saos +
pepton
saos + pepton water +
kultur
kultur + pepton
dihomogenkan
dihomogenkan
dihomogenkan
Sampel negatif
Sampel positif
Kontrol positif
Gambar 3. Diagram persiapan sampel
Uji Kemurnian Kultur
Sebelum melakukan penelitian terlebih dahulu harus dilakukan persiapan
kultur uji. Kultur murni larutan stok acuan merupakan faktor penting yang harus
diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisa. Untuk memastikan
kemurnian kultur stok acuan diperlukan konfirmasi melalui serangkaian tahap
analisis. Dalam penelitian ini kultur murni yang digunakan adalah kapang
Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae .
Kultur yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan IPB
diperiksa kemurniaannya di bawah mikroskop. Biakan yang telah diperiksa
kemurniannya dapat digunakan sebagai kultur stok dan kultur kerja. Kultur
ditumbuhkan ke dalam media agar miring pottato dextrose agar (PDA) dan
diinkubasi 25°C selama 5 hari untuk dijadikan kltur stok. Sedangkan untuk kultur
kerja diambil satu ose kultur murni dan ditumbuhkan di dalam pottato dextrose
broth (PDB) dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 hari.
Analisa Jumlah Kultur
Kultur kerja yang siap digunakan diencerkan menggunakan pengencer 0,1%
pepton water hingga pengenceran 10-7 agar diketahui jumlah kapang dan khamir
yang tumbuh dalam kultur kerja. Kemudian kultur dimasukkan ke dalam cawan
petri yang telah berisi media padat sebanyak 0,1 ml dan disebar menggunakan
6
hockey stick. Jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan akan
diakumulasikan dan dihitung sebagai jumlah colony forming unit per milliliter
(cfu/ml). Pengenceran yang menunjukkan pertumbuhan sekitar 0, 10, 100, 1000
dan 10.000 CFU/ml akan digunakan sebagai standar penetapan inokulum.
Perhitungan koloni secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 4.
Analisa jumlah koloni kapang dan khamir dilakukan untuk mengetahui
jumlah kultur. Kultur kerja yang akan digunakan terlebih dahulu diketahui
jumlahnya penambahan kultur pada sampel dapat diatur sesuai dengan jumlah
yang diinginkan. Cawan yang masuk ke dalam perhitungan adalah cawan petri
dengan jumlah koloni 10-150 koloni (SNI) dan
KHAMIR PADA SAOS
SKRIPSI
RIZQI FEBRINA
F24070053
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul
Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada Saos adalah
hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen pembimbing akademis dan belum
diajukan dalam bentuk apapun di perguruan tinggi manapun. Sumber informasi
yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan
dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Juni 2013
Yang membuat pernyataan,
Rizqi Febrina
NIM F240070053
ABSTRACT
Rizqi Febrina. Method Secondary Validation of Mould and Yeast Analysis
Sauce
Food are frequentlycontaminated by mold and yeast. The method used for
analysis of mold on food in Indonesia set by BSN (Badan Standarisasi Nasional)
was using potato dextrose agar (PDA) media. Problems are sometimes occured
when using this media due to the spreading of mold colony that suppress other
colonies to grow, resulting difficulties to asses morphology as well as
enumeration of the mold. Statistifically, the outcome would be less acurate.
Another method that could be used for the analysis of mold and yeast are the
methods of ISO (International Standart Operation). Rose bengal dichloran
chloramphenicol media (DRBC) was found to be a better media for quantative
analysis of mold and yeast since it contains dichloran and rose bengal that could
prevent the growth of spreading colonies. Laboratory experiments was needed to
verify that using of different media can domonstrate the same performance for
method enumeration. Secondary validation conducted for verification, if the
laboratory using standard methods or adopting validated method. This Research
was performed using the method of SNI 01-2897-1992 and ISO (International
Standart Operation). Both of that methods were compared to obtained a valid
methods. Parameters determined on method validation were accuracy precision,
linearity, limit of detection, and limit of quantification. The results showed that all
parameters were in accordance with the acceptance criteria of Internationa
Standart Operation Method Validation. Accuracy was determined SNI method
and ISO method with recovery percentage in range of 84%-109% for SNI and ISO
method. The linearity in the concentration of 10; 100; 1000; and 10.000 cfu/gram
resulted in correlation coefficent of 0,9979–0,9981. limit of detection in this
method was 2cfu/gram and limit of quantification was 4 cfu/gram. For sauce
product, the number of colonies grown in both media of DRBC and PDA were not
significantly diffrent.
Keywords : DRBC, method validation, mould, sauce, yeast
VALIDASI SEKUNDER METODE ANALISA KAPANG DAN
KHAMIR PADA SAOS
SKRIPSI
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN
pada
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
Oleh
RIZQI FEBRINA
F24070053
DEPARTEMEN ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir pada
Saos
Nama
: Rizqi Febrina
NIM
: F24070053
Menyetujui:
Dosen Pembimbing
Dr. Harsi D Kusumaningrum
NIP 197601312005012001
Mengetahui,
Ketua Departemen
Dr. Ir. Feri Kusnandar, M.Sc
NIP. 19680526.199303.1.004
Tanggal Ujian :
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya
sehingga skripsi ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2012 ini adalah validasi metode
analisa dengan judul “Validasi Sekunder Metode Analisa Kapang dan Khamir
pada Saos”.
Ucapan terimakasih, penulis sampaikan kepada LDITP (Laboratorium
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan) yang telah menyediakan pendanaan
penelitian, Ibu Dr. Harsi D Kusumaningrum sebagi pembimbing, Ibu Dr. Didah
Nurfaridah, S.TP, M.Si dan Ibu Siti Nurjanah, S.TP, M.Si sebagai penguji.
Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada papa, mama, serta seluruh
keluarga, atas doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor,
Juni 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI .................................................................................
DAFTAR TABEL...........................................................................
DAFTAR GAMBAR .....................................................................
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................
PENDAHULUAN.........................................................................
LATAR BELAKANG .............................................................
TUJUAN ...................................................................................
METODOLOGI PENELITIAN ....................................................
WAKTU DAN TEMPAT ..........................................................
BAHAN DAN ALAT ...............................................................
METODE PENELITIAN .........................................................
HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................
KEMURNIAN KULTUR .......................................................
ANALISA JUMLAH KULTUR .............................................
PARAMETER UJI TERVALIDASI ......................................
VERIFIKASI METODE PADA PRODUK SAOS ...............
KESIMPULAN ..............................................................................
DAFTAR PUSTAKA .....................................................................
LAMPIRAN ....................................................................................
HALAMAN
iii
iv
v
vi
1
1
2
2
2
3
4
9
9
9
10
17
19
20
22
DAFTAR TABEL
Jumlah awal kultur uji kapang ......................................................
Jumlah awal kultur uji khamir ......................................................
Jumlah awal kultur uji kapang dan khamir ...................................
Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan
perhitungan mengacu pada SNI ...................................................
Rata-rata jumlah perolehan kembali kapang dan khamir dengan
perhitunga mengacu pada ISO .....................................................
Jumlah kultur yang tumbuh pada saos berbagai merk ..................
Halaman
10
10
11
13
13
17
DAFTAR GAMBAR
Diagram persiapan media PDA.........................................................
Diagram persiapan media DRBC.......................................................
Diagram persiapan sampel.................................................................
Perhitungan jumlah koloni kapang dan khamir ..................................
Diagram penentuan akurasi, presisisi dan linearitas ...........................
Diaram penentuan LOD dan LOQ......................................................
Diagram verifikasi jumlah kapang dan khamir dengan berbagai merk
Halaman
4
4
5
6
7
8
8
Kultur murni kapang Rhizopus Olighosporus......................................
9
Kultur murni Saccharomyces cerevisiae..............................................
9
Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan mengacu pada SNI..12
Jumlah koloni kapang dan khamir dengan perhitungan
mengacu pada ISO...............................................................................
12
Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada SNI ......................
14
Presisi metode dengan perhitungan mengacu pada ISO.......................
14
Linearitas dengan perhitungan mengacu pada SNI..............................
16
Linearitas dengan perhitungan mengacu pada ISO ..............................
16
Berbagai jenis kapang dan khamir yang tumbuh pada berbagai merk saos .. 17
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Biodata..................................................................................................................22
Rancangan validasi metode...................................................................................23
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Pangan merupakan sumber gizi bagi manusia. Pertumbuhan dan
perkembangan mikroorganisme dalam makanan sangat erat hubungannya dengan
kehidupan manusia. Pertumbuhan mikroorganisme dalam pangan dapat
menyebabkan perubahan yang menguntungkan. Selain itu pertumbuham
mikroorganisme dalam pangan juga dapat mengakibatkan perubahan fisik yang
tidak diinginkan, sehingga bahan pangan tersebut tidak layak dikomsumsi.
Pangan menjadi layak atau tidak dikonsumsi tidak terlepas dari ada tidaknya
mikoorganisme perusak dan patogen pangan. Mikroorganisme tersebut dapat
terkandung di dalam makanan disebabkan karena kontaminasi pada bahan pangan
selama proses pengolahan dan penyimpanan. Kontaminasi yang sering terjadi
pada negara Indonesia yang beriklim tropis adalah kontaminasi disebabkan oleh
kapang dan khamir.
Saos merupakan produk berbentuk pasta dengan aroma khas. Saos biasa
ditambahkan sebagai bahan penyedap dan penambah rasa pada makanan. Saos
adalah produk yang dihasilkan dari campuran bubur atau pasta atau padatan
tomat maupun cabai yang diperoleh dari tomat yang masak, yang diolah dengan
bumbu-bumbu, dengan atau tanpa penambahan bahan pangan lain. Saos seringkali
memiliki masalah pertumbuhan kapang pada saat penyimpanannya.
Metode yang digunakan untuk analisis kapang dan khamir yang ditetapkan
BSN (Badan Srandardisasi Nasional) melalui SNI 01-2897-1992, yaitu tentang
tata cara uji kapang dan khamir menggunakan media potato dextrose agar (PDA).
Namun terdapat kelemahan pada media potato dextrose agar (PDA), yaitu
sulitnya menghitung jumlah kapang dan khamir disebabkan oleh pertumbuhan
kapang yang melebar (spreading) dari satu atau dua jenis kapang tertentu pada
cawan petri yang mengakibatkan tertutupnya koloni kapang dan khamir lain, atau
bahkan terhambatnya pertumbuhan kapang dan khamir lain sehingga tingkat
kepercayaan terhadap hasil menjadi kurang (Indriati dan Herawati 2009).
Metode lain yang dapat digunakan untuk analisis kapang dan khamir adalah
metode ISO (International Standart Operation). Metode ISO (International
Standart Operation) memiliki sensitifitas yang cukup baik karena menggunakan
media dichloran rose bengal chloramphenicol (DRBC) yang merupakan media
yang dapat menekan penyebaran koloni kapang dan khamir (Henson 1981).
Penggunaan media DRBC diketahui dapat menghambat penyebaran koloni pada
kapang dan khamir. Rose bengal adalah salah satu zat pewarna yang dapat
mengatasi masalah yang disebabkan oleh kapang dan khamir yang
pertumbuhannya melebar. Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroaniline), digunakan
sendiri-sendiri atau dikombinasikan dengan rose bengal diketahui sangat efektif
menekan pertumbuhan kapang dan khamir sehingga diameter koloninya tidak
melebar. Dichloran, juga dikenal sebagai dichloronitroaniline (DCNA) adalah
fungisida yang terdaftar untuk mengontrol kapang dan khamir yang bersifat
patogenik (Henson 1981). Penggunaan media DRBC menekan pertumbuhan
kapang dan khamir yang melebar tanpa mempengaruhi germinasi sporanya.
2
Namun, penggunaan media DRBC membutuhkan biaya yang lebih mahal
dibandingkan menggunakan media PDA.
Validasi metode analisa adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (SNI 19-170252000 Klausul 5.4.5.1). Validasi primer dilakukan jika laboratorium menggunakan
metode analisis baru hasil pengembangan, atau metode yang dimodifikasi
terhadap suatu metode standar. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jika
laboratorium menggunakan atau mengadopsi metode standar yang telah divalidasi
(Sukarno 2005).
Pendeteksian kapang dan khamir pada skripsi ini dilakukan dengan
menggunakan metode yang mengacu pada SNI 01-2897-1992 dan metode ISO
(Iternational Standart Operation) yaitu ISO 21527-1:2008(E). Kedua metode
tersebut dibandingkan hasilnya sehingga didapatkan metode yang valid. Metode
valid diperlukan untuk dapat ditetapkan dengan jelas bidang penerapannya dan
kehandalan mutlak yang diberikannya. Validasi metode pengujian adalah proses
menetapkan dan mengevaluasi sifat atau gambaran dari manfaat, ini merupakan
suatu bagian dari program jaminan mutu (Siregar 2007).
Tujuan Penelitian
Tujuan Umum
Tujuan umum dari penelitian ini adalah menentukan metode yang tepat
untuk analisis kapang dan khamir.
Tujuan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Melakukan validasi sekunder atau verifikasi metode SNI 01-2897-1992 dan
metode ISO 21527-1:2008(E).
2. Membandingkan hasil analisis kapang dan khamir yang diperoleh dari dua
metode berbeda yaitu metode SNI 01-2897-1992 dan ISO 21527-1:2008(E) .
Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan informasi mengenai metode analisa yang tepat untuk digunakan
pada analisis kapang dan khamir.
2. Mendapatkan informasi mengenai tingkat validitas metode yang digunakan.
METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan LDITP (Laboratorium
Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan). Salah satu syarat laboratorium
terakreditasi adalah implementasi metode uji yang sudah divalidasi dengan
ketentuan pada ISO/IEC 17025:2005 butir 5.4. Penelitian dilaksanakan di
3
Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan
IPB.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan memiliki grade analitik. Media yang digunakan pada
penelitian ini adalah potato dextrose agar (PDA OXOID), dichloran rose bengal
chloramphenicol (DRBC OXOID), pottato dextrose broth (PDB OXOID),
aquadest, chloramphenicol, dan pengencer (0,1% pepton water OXOID). Sampel
yang digunakan adalah saos dengan berbagai merk. Kultur yang digunakan
Rhizopus oligosporus dan Saccharomyces cerevisisae (ATTC 9763).
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri, micro pipet,
erlenmeyer, gelas piala, alumunium foil, tissue, kapas, bunsen, vortex, hockey
stick, sudip, timbangan, kantong plastik steril, wadah pipet, inkubator 25°C,
stomacher, bunsen, outoclaf, laminar flow, oven/alat sterilisasi kering, tabung
reaksi dan tabung reaksi bertutup, oven suhu 30°C.
Metode Penelitian
Persiapan Pengencer
Pada metode ISO dan SNI menggunakan 0,1% pepton water sebagai
pengencer. Pepton water ditimbang sebanyak 1 gr kemudian dicampurkan dengan
1 liter aquadest dalam labu takar. Labu takar digoyang hingga seluruh pepton
water larut dan tercampur dengan aquadest secara merata. Pengencer ditempatkan
di dalam tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10
(1ml atau 1gr contoh dalam 9 ml) dan ditempatkan di dalam erlenmeyer masingmasing berisi 90ml untuk membuat pengenceran 1:10 (10 ml atau 1gr contoh
dalam 90 ml). Pengencer disterilisasi 121° selama 15 menit.
Persiapan Media
Media pottato dextrose broth (PDB) ditimbang sebanyak 6 gram
dicampur dengan 250 ml aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate dan diaduk
hingga larut kemudian dimasukkan ke dalam tabung tertutup masing-masing 7-10
ml. Tabung yang telah berisi media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit
pada suhu 121°C kemudian didinginkan pada suhu 50° C.
Media potato dextrose agar (PDA) ditimbang sebanyak 39 gram dicampur
dengan 1 liter aquadest. Bahan dipanaskan di atas hotplate dan diaduk hingga
larut kemudian disterilisasi pada autoclave 121° C selama 15 menit. Sebelum
digunakan terlebih dahulu didinginkan pada suhu 50°C. Antibiotik kloramfenikol
dilarutkan sebanyak 1 gram dalam 100 ml aquadest steril, kemudian ditambahkan
ke dalam media sebanyak 4 ml. Agar dituangkan ke dalam masing-masing cawan
petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan memadat dan
disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam dengan posisi
terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan spread.
Persiapan media PDAdapat dilihat pada Gambar 1.
4
PDA + aquadest
dipanaskan hingga larut
kloramfenikol
+ aquadest
steril
diterilisasi 121°C, 15menit
dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan
dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml
disimpan pada oven steril suhu 30°C selama
24 jam dengan posisi terbalik hingga
permukaan agar mengering
Gambar 1. Diagram persiapan media PDA
Media dichlorant rose bengal agar (DRBC) yang telah ditimbang sebanyak
31,5 dan dicampur dengan 1 liter aquadest. Media dipanaskan di atas hotplate
dan diaduk hingga larut. Media disterilisasi ke dalam otoklaf selama 15 menit
pada suhu 121°C dan didinginkan pada suhu 50° C dan ditambahkan dengan 0,1
gr antibiotik kloramfenikol. Kemudian dituangkan ke dalam masing-masing
cawan petri steril sebanyak 15-20 ml. Cawan yang berisi media dibiarkan
memadat dan disimpan di dalam oven steril pada suhu 30°C selama 24 jam
dengan posisi terbalik hingga permukaan media kering dan siap untuk dilakukan
spread. Persiapan media dapat dilihat pada Gambar 2.
DRBC + aquadest
kloramfenikol
dipanaskan hingga larut
diterilisasi 121°C, 15menit
dinginkan hingga suhu 50°C, ditambahkan
kloramfenikol
dituangkan ke dalam cawan petri 15-20ml
disimpan pada oven steril suhu 30°C selama
24 jam dengan posisi terbalik hingga
permukaan agar mengering
Gambar 2. Diagram persiapan media DRBC
5
Persiapan Sampel
a. Sampel negatif
Sampel ditimbang secara aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke
dalam plastik steril berisi 90 ml pengencer. Kemudian sampel dihomogenkan
hingga tercampur merata dengan pengencer dan dibiarkan kurang lebih 15
menit sebelum digunakan.
b. Sampel positif
Sampel ditimbang aseptik sebanyak 10 gr, kemudian dimasukkan ke dalam
kantong plastik steril berisi 90 ml pengencer. Selanjutnya kapang Rhizopus
oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke dalam
sampel masing-masing sebanyak 0,5 ml ke dalam suspensi sampel dan
dihomogenkan. Sampel dibiarkan kurang lebih 15 menit sebelum digunakan.
c. Kontrol positif
Kapang Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae
diencerkan ke dalam 0,1% pepton dan dihomogenkan.
Persiapan sampel untuk validasi kapang khamir dapat dilihat pada Gambar 3.
saos +
pepton
saos + pepton water +
kultur
kultur + pepton
dihomogenkan
dihomogenkan
dihomogenkan
Sampel negatif
Sampel positif
Kontrol positif
Gambar 3. Diagram persiapan sampel
Uji Kemurnian Kultur
Sebelum melakukan penelitian terlebih dahulu harus dilakukan persiapan
kultur uji. Kultur murni larutan stok acuan merupakan faktor penting yang harus
diperhatikan dalam melakukan validasi metode analisa. Untuk memastikan
kemurnian kultur stok acuan diperlukan konfirmasi melalui serangkaian tahap
analisis. Dalam penelitian ini kultur murni yang digunakan adalah kapang
Rhizopus oligosporus dan khamir Saccharomyces cerevisiae .
Kultur yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan IPB
diperiksa kemurniaannya di bawah mikroskop. Biakan yang telah diperiksa
kemurniannya dapat digunakan sebagai kultur stok dan kultur kerja. Kultur
ditumbuhkan ke dalam media agar miring pottato dextrose agar (PDA) dan
diinkubasi 25°C selama 5 hari untuk dijadikan kltur stok. Sedangkan untuk kultur
kerja diambil satu ose kultur murni dan ditumbuhkan di dalam pottato dextrose
broth (PDB) dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 5 hari.
Analisa Jumlah Kultur
Kultur kerja yang siap digunakan diencerkan menggunakan pengencer 0,1%
pepton water hingga pengenceran 10-7 agar diketahui jumlah kapang dan khamir
yang tumbuh dalam kultur kerja. Kemudian kultur dimasukkan ke dalam cawan
petri yang telah berisi media padat sebanyak 0,1 ml dan disebar menggunakan
6
hockey stick. Jumlah koloni yang tumbuh pada masing-masing cawan akan
diakumulasikan dan dihitung sebagai jumlah colony forming unit per milliliter
(cfu/ml). Pengenceran yang menunjukkan pertumbuhan sekitar 0, 10, 100, 1000
dan 10.000 CFU/ml akan digunakan sebagai standar penetapan inokulum.
Perhitungan koloni secara ringkas dapat dilihat pada Gambar 4.
Analisa jumlah koloni kapang dan khamir dilakukan untuk mengetahui
jumlah kultur. Kultur kerja yang akan digunakan terlebih dahulu diketahui
jumlahnya penambahan kultur pada sampel dapat diatur sesuai dengan jumlah
yang diinginkan. Cawan yang masuk ke dalam perhitungan adalah cawan petri
dengan jumlah koloni 10-150 koloni (SNI) dan