Transformasi Genetik Padi Indica (Oryza Sativa L. Subsp. Indica) Cv. Kasalath Dengan Gen Mmcu/Zn-Sod Penyandi Superoksida Dismutase.

TRANSFORMASI GENETIK PADI INDICA (Oryza sativa L.
Subsp. Indica) CV. KASALATH dengan GEN MmCu/Zn-SOD
PENYANDI SUPEROKSIDA DISMUTASE

EFA RIANA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Transformasi Genetik
Padi Indica (Oryza sativa L. Subsp. Indica) cv. Kasalath dengan gen MmCu/ZnSOD Penyandi Superoksida Dismutase adalah benar karya bersama saya dengan
komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan
tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang
diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks
dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.

Bogor, November 2015
Efa Riana
NIM G353120201

RINGKASAN
EFA RIANA. Transformasi Genetik Padi Indica (Oryza sativa L. Subsp. Indica)
cv. Kasalath dengan Gen MmCu/Zn-SOD Penyandi Superoksida Dismutase.
Dibimbing oleh SUHARSONO dan UTUT WIDYASTUTI.
Peningkatan produksi padi nasional dapat ditempuh ekstensifikasi lahan
pertanian ke lahan marginal. Permasalahan utama lahan marginal adalah cekaman
abiotik yang menginduksi cekaman oksidatif pada tanaman sehingga
menyebabkan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) secara berlebih. ROS
menyebabkan kerusakan sel karena menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid, dan
degradasi rantai DNA. Superoksida dismutase (SOD) dapat mendetoksifikasi
ROS. Beberapa tanaman transgenik yang mengekspresikan gen MmCu/Zn-SOD
secara berlebihan mempunyai toleransi terhadap cekaman abiotik lebih tinggi
daripada tanaman non-transgenik. Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan
transformasi genetik padi Indica cv. Kasalath dengan gen MmCu/Zn-SOD
penyandi superoksida dismutase.
Biji matang padi Indica cv. Kasalath diinduksi menjadi kalus di media 2N6

yang mengandung 2 mg/l 2.4-D selama 7 hari di ruang gelap. Sebanyak 60 kalus
hasil pemotongan dari 45 kalus direndam dalam suspensi A. tumefaciens
LBA4404 yang membawa plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD. Plasmid pGWBMmCu/Zn-SOD mengandung gen MmCuZn-SOD dibawah kendali promoter 35S
CaMV. Kokultivasi dilakukan di media 2N6-AS yang mengandung 2 mg/l 2.4-D
dan 20 mg/l asetosiringon berlangsung selama 3 hari dalam kondisi gelap. Kalus
hasil transformasi diseleksi di media 2N6KH50 yang mengandung 50 mg/l
higromisin dan diregenerasikan di media N6R yang mengandung 100 mg/L
kinetin.
Efisiensi transformasi padi Indica kultivar Kasalath adalah sebesar 50%.
Sebanyak 4 dari 30 kalus yang tahan higromisin menghasilkan 4 tunas yang
beregenerasi sehingga efisiensi regenerasi pada penelitian ini adalah sebesar
13,3%. Analisis integrasi gen dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk
mendeteksi daerah antara promoter 35S CaMV dan gen MmCu/Zn-SOD
menunjukkan bahwa seluruh tanaman transgenik mengandung gen MmCu/ZnSOD di bawah kendali promoter 35S CaMV. Analisis segregasi pada generasi T1
dan generasi T2 padi cv Kasalath transgenik menunjukkan bahwa resistensi
terhadap higromisin yang disandi oleh gen hpt diwariskan kepada generasi
berikutnya dengan mengikuti pola Mendelian dengan rasio 3 resisten : 1 sensitif.
Rasio segregasi 3:1 mengindikasikan bahwa jumlah gen hpt yang terintegrasi ke
dalam genom padi cv. Kasalath transgenik adalah satu salinan. Karena gen
MmCu/Zn-SOD terpaut dengan gen hpt, maka gen MmCu/Zn-SOD diwariskan

secara stabil kepada generasi berikutnya dan hanya satu salinan yang terintegrasi
di dalam genom padi cv. Kasalath transgenik.
Kata kunci: Transformasi genetik, MmCu/Zn-SOD, transgenik, padi Indica,
segregasi

SUMMARY
EFA RIANA. Genetic Transformation of Indica Rice cv. Kasalath with
MmCu/Zn-SOD Gene Encoding for Superoxide Dismutase. Supervised by
SUHARSONO and UTUT WIDYASTUTI.
Rice production can be increased by extending area of cultivation to the
marginal land. The main problem in marginal land is abiotic stress that induce
oxidative stress in plants which causes over production and accumulation of
reactive oxygen species (ROS). ROS causes cell damage through lipid
peroxidation and DNA cleavage. Superoxide dismutase (SOD) can detoxify ROS.
Several transgenic plants overexpressing MmCu/Zn-SOD genes excessively
increase their tolerance to abiotic stress. The objective of this research is to
transform genetically Indica rice cv. Kasalath by MmCu/Zn-SOD gene encoding
superoxide dismutase.
The formation of callus was induced from mature seeds cultivated on the
2N6 media containing 2 mg/l, 2.4-D for 7 days in dark. A total of 60 calli derived

from 40 initial calli was immersed in the A. tumefaciens LBA4404 suspension
carrying plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD. Plamid pGWB-MmCuZn-SOD
contains MmCu/Zn-SOD under the control of 35S CaMV promoter. Cocultivation
was carried out on 2N6-AS media containing 2 mg/l 2.4-D and 20 mg/l
acetosyringone for 3 days in the dark. Transformed calli were selected on
2N6KH50 media containing 50 mg/l hygromycin and regenerated on N6R media
containing 100 mg/l kinetin.
Transformation efficiency of Indica rice cv. Kasalath was 50%. Four of 30
hygromycin resistant calli successfully regenerated to become 4 shoots, therefor
the efficiency of regeneration was 13.3%. Gene integration analysis by PCR
showed that all transgenic plants contain MmCu/Zn-SOD under control of 35S
CaMV promoter. Segregation analysis in T1 and T2 generation showed that the
resistance to higromycin encoded by hpt gene was stably inherited to the
descendence following Mendelian pattern with 3 resistants : 1 sensitive ratio,
indicates single copy of hpt gene integrated in the genom of transgenic rice cv.
Kasalath. Since MmCu/Zn-SOD gene is linked to hpt gene, it can be concluded
that MmCu/Zn-SOD gene is also stably inherited to the descendence following
Mendelian pattern and only one copy of MmCu/Zn-SOD gene integrated into the
genom of transgenic rice cv. Kasalath.
Keyword:

Genetic transformation, MmCu/Zn-SOD, transgenic, Indica rice,
segregation

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

TRANSFORMASI GENETIK PADI INDICA (Oryza sativa L.
Subsp. Indica) cv. KASALATH dengan GEN MmCu/Zn-SOD
PENYANDI SUPEROKSIDA DISMUTASE

EFA RIANA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Hamim

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga penulis bisa menyelesaikan rangkaian penelitian dan
penulisan tesis yang berjudul “Transformasi Genetik Padi Indica (Oryza sativa L.
Subsp. Indica) cv. Kasalath dengan gen MmCu/Zn-SOD Penyandi Superoksida
Dismutase”. Penelitian ini didanai oleh Proyek Penelitian Desentralisasi Baru
IPB dengan kontrak no:48/IT3.11/LT/2014 atas nama Prof Dr Ir Suharsono, DEA.

Terima kasih penulis sampaikan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan
Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku komisi pembimbing yang telah banyak
memberi perhatian dan bimbingan selama penelitian dan penulisan naskah tesis
ini. Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada Dr Ir Miftahuddin, MSi
selaku Ketua Program Studi Biologi Tumbuhan dan Dr Hamim selaku penguji
atas saran dan masukannya. Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan
kepada Beasiswa Unggulan DIKTI tahun 2012, jajaran teknisi laboran Lab.
Biologi Molekular dan Selular Tanaman dan Lab. BIORIN, PPSHB, IPB,
khususnya Ibu Nia Dahniar, Ibu Pepi Elvavina, Pak Abdul Mulya, dan Pak Adi
Supardi, rekan-rekan mahasiswa yang melakukan penelitian di laboratorium
tersebut dan rekan-rekan mahasiswa Program Studi Biologi Tumbuhan Sekolah
Pascasarjana IPB angkatan 2012, atas segala bantuan dan dukungan kepada
penulis selama masa penelitian dan penyusunan tesis ini.
Ungkapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada
keluarga tercinta, Bapak, Ibu, adik-adik dan suami, atas doa, dukungan dan kasih
sayang yang selalu diberikan kepada penulis. Semoga Allah selalu melimpahkan
RahmatNya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, November 2015

Efa Riana

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Padi (Oryza sativa)
Mekanisme Transformasi Agrobacterium
Superoksida Dismutase

2
2
3
4

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan Penelitian
Metode Penelitian
Induksi kalus embrionik

Infeksi A. tumefaciens dan kokultivasi
Seleksi
Regenerasi
Analisis integrasi transgen MmCu/Zn-SOD generasi T0
Analisis segregasi gen hpt

6
6
7
7
7
7
8
8
8
8

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi Padi Indica cv. Kasalath
Analisis Integrasi Transgen MmCu/Zn-SOD Generasi T0

Analisis Segregasi Gen hpt pada Generasi T1 dan Generasi T2

9
9
12
13

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

15
15
15

DAFTAR PUSTAKA

15

LAMPIRAN

20

RIWAYAT HIDUP

23

DAFTAR TABEL
1 Efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi padi Indica kultivar
Kasalath
2 Pola segregasi biji T1 padi Indica cv. Kasalath transgenik SOD
3 Pola segregasi biji T2 padi Indica cv. Kasalath transgenik SOD

11
14
14

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6

Proses transformasi genetik Agrobacterium tumefaciens ke sel tanaman
Peta daerah T-DNA plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD
Transformasi padi Indica cv. Kasalath
Analisis transgen MmCu/Zn-SOD padi Kasalath generasi T0
Tanaman padi Kasalath transgenik SOD yang menghasilkan biji T1
Analisis resistensi tanaman padi cv Kasalath pada media MS0H50

4
7
10
12
13
13

DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media AB plate
2 Komposisi media dasar N6
3 Komposisi larutan stok media 2NBKCH50

20
21
22

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi (Oryza sativa L.) merupakan salah satu tanaman pangan yang sangat
penting di dunia karena menyuplai kebutuhan pangan pokok hampir setengah
penduduk dunia. Peningkatan jumlah penduduk di Indonesia berbanding lurus
dengan meningkatnya permintaan pangan pokok beras. Untuk memenuhi
kebutuhan tersebut perlu dilakukan peningkatan produksi beras nasional (Deptan
2010). Ekstensifikasi pertanian padi merupakan salah satu cara yang dapat
ditempuh untuk meningkatkan produksi beras, namun akibat tingginya konversi
lahan pertanian menjadi pemukiman penduduk dan kawasan industri
mengharuskan ekstensifikasi dilakukan ke lahan marjinal. Lahan marginal
merupakan lahan yang memiliki mutu rendah karena memiliki faktor pembatas
diantaranya ketersediaan air dan unsur hara (Yuwono 2009). Luas lahan marjinal
potensial untuk budidaya pertanian adalah 76,22 juta ha atau 52% dari total lahan
kering yang ada di Indonesia (Abdurachman et al. 2008). Masalah utama lahan
marjinal adalah cekaman abiotik seperti kekeringan, salinitas, suhu ekstrim,
defisiensi hara dan toksisitas mineral yang membatasi pertumbuhan dan
produktifitas tanaman padi. Cekaman abiotik menginduksi timbulnya cekaman
oksidatif pada tanaman akibat produksi berlebih dan akumulasi spesies oksigen
reaktif (ROS) (Boo dan Jung 1999; Lee et al. 2001; Yammamoto et al. 2001; Kuo
dan Kao 2003; Sharma dan Dubey 2005; Chawla dan Jain 2012).
Spesies oksigen reaktif (ROS) merupakan bentuk oksigen yang tereduksi
oleh elektron dan memiliki sifat yang sangat reaktif. Tingginya kadar ROS
memberikan resiko terhadap modifikasi protein, kerusakan sel akibat peroksidasi
lipid, degradasi untai DNA dan toksisitas metal, sehingga berpengaruh terhadap
kelangsungan hidup organisme (Bowler et al. 1992). Kondisi ini tidak
mendukung pertumbuhan padi secara maksimal sehingga perakitan padi toleran
cekaman abiotik khususnya padi Indika perlu dilakukan. Padi Indika
dibudidayakan di daerah tropis.
Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan yang mampu
menetralkan radikal bebas dengan mengkatalisis radikal superoksida menjadi
molekul O2 dan H2O2 sehinggga SOD menjadi sistem pertahanan terhadap radikal
superoksida dari spesies oksigen reaktif (Bowler et al. 1992; Fridovic 1995; Tseng
et al. 2008). Gen penyandi SOD telah diisolasi dari jagung (Cannon et al. 1987),
tomat (Perl-Treves et al. 1988), Nicotiana plumbaginigolia (Alscher et al. 2002)
dan Melastoma malabatricum L (Hannum 2011).
Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa tanaman transgenik yang mengekspresikan gen SOD secara
berlebihan mengalami peningkatan toleransi terhadap cekaman abiotik, contohnya
tembakau toleran temperatur tinggi (Sen Gutpa et al. 1993), padi toleran salinitas
(Tanaka et al. 1999) dan cabe toleran cekaman kekeringan (Chatzidimitriadou et
al. 2009).
Gen utuh MmCu/Zn-SOD penyandi superoksida dismutase cuprum/zink
(copper/zinc) sitosolik dari tanaman toleran aluminium, Melastoma malabatricum
telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi. Vektor ekspresi biner pGWB5 yang
mengandung gen MmCu/Zn-SOD di bawah kendali promoter kuat 35S CaMV

2
untuk mengendalikan ekspresi gen MmCu/Zn-SOD telah berhasil dikonstruksi
(Hannum 2011). Transformasi genetik padi dengan gen MmCu/Zn-SOD dari
Melastoma malabatricum diharapkan dapat menghasilkan tanaman transgenik
yang lebih toleran terhadap cekaman abiotik.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan tanaman padi Indica cv.
Kasalath transgenik yang mengandung gen penyandi superoksida dismutase
(MmCu/Zn-SOD) dari Melastoma malabactricum melalui transformasi genetik
dengan perantara Agrobacterium tumefaciens.

Manfaat Penelitian
Padi transgenik yang diperoleh dari penelitian ini dapat ditanam di lahan
marginal sehingga dapat meningkatkan produksi secara nasional. Gen MmCu/ZnSOD yang terdapat di dalam tanaman padi cv. Kasalath transgenik dapat
dipindahkan ke tanaman padi yang mempunyai sifat unggul melalui persilangan
konvensional untuk menghasilkan padi unggul yang dapat ditanam di lahan
marginal.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Padi (Oryza sativa)
Padi merupakan tanaman pangan yang paling luas dibudidayakan di dunia
dan menyuplai kebutuhan pangan pokok hampir setengah penduduk dunia. Total
konsumsi beras dunia pada tahun 2014 sebesar 415.5 juta ton. FAO (2014)
menerbitkan data produksi padi dunia mengalami penurunan sebesar 0.4% lebih
rendah dari tahun 2013 dikarenakan kondisi cuaca yang tidak menentu seperti
musim hujan yang disertai banjir atau musim kering dalam waktu yang lama.
Kondisi ini menyebabkan sebagian besar negara produsen utama dibagian utara
mengalihkan lahan untuk penanaman palawija. Rekayasa genetika tanaman padi
dengan gen target penyandi resistensi terhadap cekaman biotik maupun abiotik
bisa menjadi solusi untuk meningkatkan produksi padi dalam waktu singkat
(Ignacimuthu et al 2000).
Padi merupakan tanaman serealia semusim yang tergolong kedalam ordo
Oryzeae, famili Poaceae yang terdiri atas 12 genus. Oryza merupakan salah satu
genus yang paling banyak dibudidayakan. Genus Oryza diperkirakan terdiri atas
22 spesies, 20 diantaranya merupakan spesies liar dan dua lainnya, Oryza
glaberrima dan Oryza sativa adalah spesies yang dibudidayakan. Oryza sativa
didomestikasi dari tetua padi liar Oryza rufipogon dan O.nivara yang berasal dari
Asia. Oryza sativa terdeferensiasi menjadi dua kelompok ekogenetik yaitu
subspecies Indica dan japonica (Vaughan et al. 2003).

3
Oryza sativa didomestikasi pertamakali di Asia Tenggara, India dan Cina
antara 8000 hingga 150000 tahun yang lalu (Normile 2004). Padi ditanam oleh
lebih dari 110 negara. Padi Indica tersebar didaerah tropis sedangkan padi
japonica tumbuh dengan baik di iklim sub tropis. Luas areal pertanian padi
sebesar 10% dari total lahan pertanian dunia (144 juta ha). Berdasarkan sistem
budidaya, padi dikelompokkan kedalam empat ekosistem yaitu padi gogo
(upland), padi sawah irigasi (submerged rice), padi sawah tadah hujan (lowland)
dan padi rawan banjir (floodprone) (Khush 1997).
Mekanisme Transformasi Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens banyak dimanfaatkan oleh ahli biologi tanaman
pada studi genetika molekuler untuk mengintroduksi DNA ke sel tanaman. Sel
tanaman ditransformasi dengan Agrobacterium tumefaciens dengan memindahkan
potongan DNA dari plasmid Ti (tumor inducing) (Gambar 1). Plasmid Ti
ditemukan hanya dalam persentase kecil pada populasi A.tumefaciens yang ada di
tanah. Potongan DNA merupakan segmen salinan yang disebut T-DNA
(transferred DNA). T-DNA dibatasi oleh 25 pasang basa berulang yang mengapit
T-DNA. Secara alami T-DNA menyandi enzim untuk sintesis zat pengatur
tumbuh tanaman, menghasilkan senyawa penyebab terbentuknya tumor, dan
mensintesis opin. Opin mampu merangsang konjugasi plamid Ti sehingga
meningkatkan populasi bakteri yang bisa memanfaatkan opin (Greene dan
Zambryski 1993). Opin merupakan senyawa turunan asam amino yang digunakan
secara ekslusif oleh A. tumefaciens sebagai sumber nitrogen (Tzfira dan Citovski
2006).
Proses transfer T-DNA ke genom tanaman dimediasi oleh protein-protein
yang disandi daerah virulensi (vir) (Stachel dan Nester 1986). Gen-gen virulensi
yang terlibat dalam proses transformasi diatur secara ketat sehingga ekspresi
terjadi hanya pada daerah sel tumbuhan yang luka akibat infeksi A. tumefaciens.
Ekspresi gen dikontrol oleh gen VirA dan VirG, dua protein yang berperan dalam
sistem regulasi. Protein dari virA ini akan menginduksi fosforilasi produk dari
virG (Zupan dan Zambrysk 1995). Pada proses penginderaan sinyal, histidin
kinase VirA mengaktifkan protein VirG dengan mentransfer fosfat ke asprartat
VirG. VirG yang terfosforilasi berikatan spesifik dengan segment promoter gen
vir berukuran 12 bp sehingga mengaktifkan VirG sebagai faktor transkripsi
(Brencic dan Winans 2005). Senyawa fenol seperti asetosiringon dan gula
berfungsi untuk induksi gen vir (Shimoda et al. 1990). Induksi gen vir
mengawali proses transfer utas sekuen T-DNA dari plasmid Ti. Utas sekuen TDNA akan dikenali dan dipotong oleh protein VirDI dan VirD2 yang memiliki
aktivitas endonuklease. Protein VirD2 tetap terikat kovalen pada ujung 5’ utas TDNA setelah pemotongan dari plasmid Ti. VirD2 berperan melindungi T-DNA
dari aktivitas endonuklease dan menentukan batas ujung 5’ T-DNA yang akan
ditransfer kedalam sel tanaman (de la Riva et al. 1998).
Proses pemindahan T-DNA ke nukleus sel tumbuhan dimediasi oleh
sinyal lokasi inti atau nucleus location signals (NSL) pada VirD2 dan VirE2
mengarahkan kompleks T-DNA ke nukleus. Tahap terakhir adalah integrasi
T-DNA ke dalam genom tanaman inang melalui kompleks pori nukleus atau
nuclear- pore complex (NPC) (de la Riva et al. 1998). T-DNA masuk ke dalam

4
sel inti melibatkan peran VirE2 yang mengandung dua daerah NSL sebagai DNA
transorporter transmembran (Duckely et al, 2005 ; Tzfira dan Citovsky 2006).
Mekanisme molekuler intergrasi T-DNA ke sel inti tanaman inang belum
dideskripsikan secara jelas. Integrasi terjadi kemungkinan melalui rekombinasi
antara utas ganda T-DNA dengan genom sel inang (Tzfira dan Citovsky 2005).

4. Transfer T-DNA oleh T4SS
5. Impor nuclear
3.Sintesis T-DNA
6.Integrasi T-DNA

2. Aktivasi VirA/G
1.Sinyal dari tumbuhan

.
Gambar 1 Proses transformasi genetik Agrobacterium tumefaciens ke sel tanaman
1) Bagian sel yang terluka mengelurkan senyawa fenolik yang
ditangkap oleh Vir A 2) Vir A mengaktifkan Vir G yang mengaktivasi
gen gen Vir lainnya 3) Sintesis T-DNA dan ekspresi gen vir di
Agrobacterium 4) T-DNA dan protein Vir ditransfer ke sel tanaman
melalui bakteri T4SS (type IV secretion system) untuk membentuk
kompleks protein T-DNA 5) kompleks T-DNA ditransfer ke nucleus
sel tanaman 6) T-DNA terintegrasi kedalam kromosom (Pitzschke dan
Hirt 2010)

Superoksida Dismutase
Pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) memberikan dampak terhadap
kerusakan sel tanaman. Spesies oksigen reaktif (ROS) diinisiasi dari berbagai
cekaman lingkungan diantaranya suhu ekstrim, intensitas cahaya yang tinggi,
kekeringan, salinitas tinggi, logam berat, dan berbagai racun dari herbisida.
Sistem pertahanan tumbuhan dalam menangkal ROS adalah dengan meningkatkan
aktivitas antioksidan baik berupa sistem antioksidan enzimatik maupun non
enzimatik (Alscher et al. 2002). Antioksidan enzimatik meliputi semua enzim

5
yang memiliki aktivitas antioksidatif diantaranya superoksida dismutase (SOD),
askorbat peroksidase (APX), katalase (CAT), glutation peroksidase (GPX), dan
glutationin S-transferase (GST) (Mittler 2002).
Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan yang ada di
seluruh organisme aerob. SOD tersebar di kompartemen subseluler tempat ROS
diproduksi. Produksi ROS meningkat melalui berbagai variasi cekaman ekstrim
yang mengubah ROS menjadi molekul radikal bebas. Enzim SOD berperan
menetralkan radikal bebas senyawa ROS dengan cara mengkatalisis reaksi ion
superoksida menjadi oksigen (O2) dan hidrogen peroksida (H2O2). Aktivitas SOD
diinduksi oleh berbagai bentuk cekaman. Cekaman diasumsikan sebagai mediator
utama dalam regulasi gen SOD. Pengaruh cekaman tertentu terhadap ekspresi gen
SOD diatur oleh situs subseluler dimana cekaman oksidatif dihasilkan (Bowler et
al.1992). Penelitian pada Nicotiana plumbaginifolia, menunjukkan respon
MnSOD mitokondria meningkat terhadap pembentukan radikal di mitokondria,
sedangkan respon FeSOD kloroplas meningkat terhadap radikal bebas yang terjadi
di kloroplas (Tsang et al. 1991, Bowler et al. 1989). Induksi ekspresi SOD
memerlukan faktor transkripsi tunggal.
Protein OxyR pada Salmonella
typhimurium merupakan regulator transkripsi hidrogen peroksida yang
menginduksi aktivasi gen SOD pada saat teroksidasi (Greenberg et al. 1990)
Superoksida dismutase dikelompokkan kedalam tiga tipe berdasarkan
kofaktornya yaitu : copper/zinc (Cu/Zn-SOD), Mangan (Mn-SOD) and besi (FeSOD). Setiap tipe terletak di kompartemen seluler yang berbeda. Fe-SOD
terdapat di kloroplas, Mn-SOD terdapat di mitokondria dan peroksisom, dan
Cu/Zn-SOD terdapat di kloroplas, sitosol dan kemungkinan diruang ekstraseluler
(Mittler 2002). Metaloenzim SOD merupakan enzim intraseluler yang terdapat
hampir disemua kompartemen subseluler organisme aerob.
Superoksida
dismutase rentan terhadap cekaman oksidatif yang diinisiasi dari berbagai bentuk
cekaman lingkungan. Superoksida dismutase merupakan antioksidan utama
dalam sistem pertahanan organisme dari efek keracunan dan peningkatan
konsentrasi ROS (Gill dan Tuteja 2010).
Induksi SOD terhadap respon perubahan kondisi lingkungan yang
beragam memperlihatkan bahwa SOD memainkan peranan penting dalam
mekanisme pertahanan tumbuhan terhadap cekaman lingkungan. Fenomena ini
memberikan prospek terhadap pengembangan agronomi tanaman melalui
rekayasa genetik. Untuk melihat peran dari enzim ini, gen SOD harus
diekspresikan dan aktivitas enzim harus ditingkatkan. Teknologi antisense dan
rekayasa promoter diperlukan dalam rekayasa tanaman trasgenik (Bowler et al.
1992). Beberapa tanaman transgenik dengan ekspresi berlebih gen SOD telah
berhasil dikembangkan dalam rangka meningkatkan toleransi ketahanan terhadap
cekaman oksidatif yang disebabkan oleh ozon, suhu dingin, kekeringan dan
cekaman aluminium (Van Camp et al. 1994; McKersie et al. 1996; McKersie et
al. 1999; Basu et al. 2001). Beberapa studi menunjukkan adanya korelasi antara
aktivitas enzim antioksidan dan toleransi cekaman oksidatif, dimana ekspresi
berlebih gen SOD dapat memacu toleransi terhadap stress oksidatif jika satu atau
lebih enzim antioksidan seperti APX, dehidroaskormat reduktase dan
monodehidrosiaskorbat reduktase juga ada dalam kosentrasi tinggi (Foyer et al.
1994; Slooten et al. 1995). Aktivitas superoksida dismutase dan guaiacol

6
peroksidase ditemukan sebagai kunci utama dalam mengelola cekaman oksidatif
pada padi gogo yang disebabkan oleh kekeringan (Srivalli et al. 2003).
Ekspresi berlebih SOD mampu meningkatkan sistem pertahanan terhadap
cekaman yang spesifik. Ekspresi berlebih aktivitas Mn-SOD pada kloroplas daun
tembakau mampu melindungi daun dari kerusakan akibat cekaman oksidatif yang
disebabkan ozon (Van Camp et al. 1994). Dua klon alfalfa (Medicago sativa)
yang ditansformasi dengan Mn-SOD yang ditargetkan ke mitokondria
memperlihatkan peningkatan aktivitas Mn-SOD terhadap cekaman musim dingin
dibandingkan dengan aktivitas Cu/Zn-SOD pada mitokondria (McKersie et al.
1999). Pengamatan terhadap tanaman tomat yang ditransfer gen Cu/Zn-SOD pada
kloroplas dan sitosol, menunjukkan bahwa gen Cu/Zn-SOD pada sitosol
memperlihatkan ekspresi toleransi lebih tinggi dibandingkan gen Cu/Zn-SOD
pada kloroplas (Perl et al. 1993). Tanaman alfalfa transgenik (Medicago sativa)
Mn-SOD memperlihatkan toleransi signifikan terhadap cekaman kekeringan
setelah 3 tahun uji coba lapangan (McKersie et al. 1996). Peningkatan aktivitas
mangan superoksida dismutase juga terlihat pada akar tanaman gandum (Triticum
aestivum) transgenik yang dipapar dengan 100 µM aluminium (Basu et al. 2001).
Aktivitas isozim superoksida dismutase dapat diketahui dengan
identifikasi berdasarkan sensitivitas terhadap KCN dan H2O2. Setiap kelompok
SOD memiliki sensitivitas yang berbeda untuk kedua inhibitor tersebut.
Kelompok Mn-SOD memiliki aktivitas yang resisten terhadap kedua inhibitor,
Cu/Zn-SOD sensitif terhadap kedua inhibitor, sedangkan Fe-SOD sensitif
terhadap inhibitor H2O2 dan resisten terhadap KCN (Gill dan Tuteja 2010). Gen
utuh penyandi copper/zinc superoksida dismutase sitosolik dari tanaman
pengakumulasi aluminium (Melastoma malabactricum) telah berhasil diisolasi.
Gen MmCuZn-SOD memiliki ukuran 824 pb, terdiri dari 459 pb open reading
frame (ORF) yang menyandi 152 asam amino. Gen MmCuZn-SOD diekspresikan
pada jaringan akar, batang dan daun (Hannum 2011).
Aktivitas SOD pada tanaman transgenik akan mengubah keseimbangan
.
O2 /H202 didalam sel, dan ini akan menambah atau mengurangi pembentukan
OH·. Hal ini selanjutnya akan menentukan apakah perubahan rekayasa genetika
gen SOD menguntungkan atau merugikan bagi tanaman. Jika pertahanan tanaman
terhadap stress oksidatif dapat diperkuat dengan introduksi gen baru dan semua
komponen fisiologi terjaga seimbang, toleransi terhadap cekaman kemungkinan
akan meningkat (Bowler 1992). Manipulasi sistem pertahanan terhadap cekaman
sebaiknya dilakukan disemua komponen enzim antioksidan untuk memperoleh
pertahanan terhadap cekaman yang kuat (Shaaltiel dan Gressel 1986).

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret 2013 hingga Oktober 2014 di
laboratorium Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB)

7
LPPM IPB Bogor dan Laboratorium Biotechnology Research Indonesia–The
Netherlands (BIORIN).
Bahan Penelitian
Benih padi yang digunakan adalah padi Indica cv. Kasalath koleksi
laboratorium BIORIN IPB. Bakteri yang digunakan untuk transformasi adalah
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang membawa plasmid pGWBMmCu/Zn-SOD. Plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD mengandung MmCu/Zn-SOD
dibawah kendali promoter 35S CaMV di dalam daerah T-DNA. Peta T-DNA di
plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD disajikan pada Gambar 2 (Hannum 2011).

Gambar 2. Peta daerah T-DNA yang terdapat di plasmid pGWB-MmCu/Zn-SOD.
RB=right border, Pnos::NPTII = gen marka seleksi neomycin
phosphotransferase II; P-35S= promoter konstitutif 35S CaMV;
MmCu/Zn-SOD= gen penyandi superoksida dismutase; AttB1 dan
AttB2= situs rekombinasi sistem gateway; sGFP= gen green
flourescent protein; Tnos= Terminator nopaline synthase ; 35S::HPT
= gen hygromycim phosphotransferase dibawah kendali promoter 35S
CaMV; LB= left border (Hannum 2011)

Metode Penelitian
Induksi kalus embrionik
Gabah padi dikupas lalu bijinya dicelupkan ke dalam etanol 70% selama 1
menit, kemudian dibilas dengan akuades steril sebanyak 2 kali. Selanjutnya biji
padi direndam dalam larutan sodium hipoklorit (NaOCl) 2% yang dicampur 1
tetes tween-20 selama 60 menit sambil digoyang. Biji padi dibilas dengan
akuades steril sebanyak lima kali, dan ditiriskan di tisu steril. Biji padi ditanam di
media induksi kalus 2N6 (garam dan vitamin N6, 0.1 g/l myo-inositol, 30 g/l
sukrosa, 0.5 g/l casamino acid, 0.5 g/l prolin, 2 mg/l 2.4-D, 4 g/l gelrite, dan pH
5.8) selama 7 hari di ruang gelap dengan suhu 28 oC (Hiei dan Komari 2008).
Kalus yang diperoleh dipisahkan dari biji dan tunas yang terbentuk. Kalus yang
berdiameter lebih dari 1 cm dipotong menjadi 2 atau 4 bagian. Kalus selanjutnya
ditanam di media 2N6 baru selama 3 hari pada suhu 28 0C dalam kondisi terang
sebelum ditransformasi.
Infeksi A. tumefaciens dan kokultivasi
Bakteri A.tumefaciens LBA4404 yang membawa plasmid pGWBMmCu/Zn-SOD disebar pada media AB plate (Lampiran 1) yang mengandung
antibiotik 50 mg/l higromisin, 50 mg/l kanamisin, 50 mg/l streptomisin. Kultur
bakteri diinkubasi selama 3 hari pada suhu 28 0C dalam kondisi gelap. Satu ose
koloni yang dihasilkan disuspensikan dalam 20 ml media MSLA (MS, vit Kao

8
dan Michayluk, sukrosa 20 g/l, asetosiringon 20 mg/l), hingga suspensi inokulum
mencapai nilai 0.01 pada OD600. Kalus yang berukuran 0.5–1 mm direndam
dalam suspensi A.tumefaciens selama 10 menit. Selanjutnya kalus ditanam di
media kokultivasi 2N6-AS (N6, 20 g/l sukrosa, 10 g/l glukosa, 0.5 g/l casamino
acid, 2 mg/l 2.4-D, 20 mg/l asetosiringon, 4 g/l gelrite, dan pH 5.8) selama 3 hari
pada suhu 25 0C dalam kondisi gelap. Komposisi media dasar N6 disajikan pada
Lampiran 2.
Seleksi
Kalus hasil kokultivasi dicuci dengan akuades steril sebanyak 5 kali,
kemudian kalus direndam di dalam akuades steril yang mengandung 200 mg/l
cefotaximee selama 15 menit. Kalus ditiriskan di tisu steril, kemudian kalus
ditanam di media seleksi 2N6KCH50 (Lampiran 3) selama 14 hari pada suhu 28
0
C dalam kondisi terang (3000 lux). Kalus disubkultur setiap 7 hari ke media
seleksi segar (Hiei dan Komari 2008).
Efisiensi transformasi dihitung
menggunakan rumus :
Efisiensi Transformasi =

Jumlah kalus resisten higromisin
x100%
Jumlah kalus yang diinfeksi A.tumefaciens

Regenerasi
Kalus embrionik yang bertahan di media seleksi dipindahkan ke media
regenerasi N6R (20 g sukrosa, 30 g sorbitol, dan 1 g vitamin casamino acid,
10ml/L FeDTA 100x, 10xN6 major salt, 100xN6 minor salt, 100 mg/L kinetin, 4
gr/L gelrite, pH 5.8). Kalus dikultur selama 4 minggu pada suhu 28 0C dalam
kondisi terang. Kalus disubkultur setiap 2 minggu ke media yang sama hingga
terbentuk tunas dan akar. Planlet dipindahkan ke media pengakaran MS0 (30 g/l
sukrosa, 3 gr/l gelrite, pH 5.8) dan ditumbuhkan selama 2 minggu, dalam kondisi
terang (3000 lux) pada suhu 28 0C. Tanaman transgenik putatif generasi T0 yang
diperoleh kemudian diaklimatisasi sebelum dipindah ke tanah. Efisiensi regenerasi
dihitung menggunakan rumus :
Efisiensi Regenerasi =

Jumlah tunas yang beregenerasi
x100%
Jumlah kalus resisten higromisin

Analisis integrasi transgen MmCu/Zn-SOD generasi T0
DNA tanaman padi Kasalath transgentik putatif diisolasi dari daun muda
menggunakan metode cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) (Suharsono &
Widyastuti 2006). Analisis polymerase chain reaction (PCR) menggunakan
primer spesifik untuk transgen MmCu/Zn-SOD dibawah kendali promoter
35S CaMV yaitu primer 35sF (forward): 5’-AAA CCT CCT CGG ATT CCA TT3’ dan primer MmSOD R2 (reserve): 5’-CAT CTC CAA CGG TGA CAT TG-3’
(Hannum 2011).
Analisis segregasi gen hpt
Tanaman Kasalath transgenik SOD generasi T0 yang membawa gen
MmCu/Zn-SOD ditanam di polibag dan dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri

9
hingga menghasilkan biji T1. Analisis segregasi dilakukan dengan menumbuhkan
biji T1 yang telah disterilisasi di media MS0 padat yang mengandung 50 mg/l
higromisin, pH 5.8 pada suhu 25 0C. Tanaman yang tumbuh dari biji T1 resisten
higromisin ditanam di polibag dan dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri
hingga menghasilkan biji T2. Biji T2 dipanen terpisah untuk setiap individu. Pola
segregasi gen hpt pada biji T2 ditentukan dengan menumbuhkan biji T2 di media
MS0 mengandung 50 mg/l higromisin.
Pengamatan resistensi terhadap
higromisin dilakukan 10 hari setelah tanam. Keturunan dari tanaman transgenik
heterozigot yang mengandung satu salinan gen hpt yang terintegrasi ke dalam
genomnya, bersegregasi dengan perbandingan 3 resisten : 1 sensitif. Perbandingan
3:1 digunakan sebagai dasar uji chi square (χ2) dengan derajat bebas (df=n-1) dan
nilai kesalahan 0.05. Nilai χ2 dihitung menggunakan rumus:

Keterangan :
Oi= nilai pengamatan fenotipe ke-i
Ei= nilai harapan fenotipe ke-i
n = jumlah genotipe
Jika nilai nilai χ2 hitung lebih kecil dari nilai χ2 tabel, maka populasi tersebut
bersegrasi mengikuti perbandingan 3:1, dan sebaliknya.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Transformasi Padi Indica cv. Kasalath
Proses tranformasi genetik padi dilakukan melalui beberapa tahap, dari
induksi kalus dari biji di media 2N6 hingga aklimatisasi tanaman transgenik
(Gambar 3). Pembengkakan daerah skutelum pada embrio terjadi 2–3 hari setelah
biji dikulturkan di media 2N6. Skutelum selanjutnya berkembang menjadi kalus
primer embrionik. Kalus embrionik dipisahkan dari biji dan tunas. Kalus yang
terbentuk memiliki bentuk globular berwarna putih kekuningan berdiameter 0.5 –
1 cm (Hiei dan Komari 2008; Lestari dan Yunita 2008; Noor et al. 2011). Kalus
yang berdiameter lebih dari 1 cm dipotong menjadi 2 atau 4 bagian kalus (Hiei
dan Komari 2008). Kalus embrionik hasil pemotongan ditransformasi melalui
perantara A.tumefaciens. Konsentrasi suspensi A.tumefaciens yang rendah (0,01
pada OD600) dalam 20 ml media MSLA mengandung 20 mg/l asetosiringon serta
kokultivasi di media 2N6-AS mengurangi kerusakan pada kalus selama diinfeksi
A.tumefaciens (Carlos et al. 2004). Penambahan asetosiringon pada media
kokultivasi berfungsi untuk menginduksi gen vir yang berperan dalam
mentransfer gen yang terdapat di daerh T-DNA dari A.tumefaciens ke sel tanaman
(Hiei et al. 1994; Tyagi et al. 2007).

10

1 cm

1 cm

1 cm

(A)

(B)

1 cm

1 cm

(D)

(C)

1 cm

(E)

(F)

Gambar 3 Tahapan transformasi genetik padi Indica cv. Kasalath. (A)= Induksi
kalus embrionik dari biji matang, (B)= Kalus di media seleksi
nN6CH50, (C)= Kokultivasi, (D)= Titik-titik hijau calon tunas
muncul dari kalus (umur 2 minggu di media regenerasi), (E)= Planlet
padi umur 4 minggu di media regenerasi, (F)= Aklimatisasi tanaman
Kasalath transgenik putatif yang mengandung gen MmCu/Zn-SOD
Kalus hasil kokultivasi dicuci dengan akuades steril mengandung antibiotik
200 mg/l cefotaxime sebelum ditanam ke media seleksi yang mengandung 50
mg/l higromisin. Cefotaxime berperan dalam mengeliminasi A. tumefaciens yang
berpengaruh terhadap efisiensi transformasi dan regenerasi (Tang et al. 2004).
Efisiensi transformasi kalus embrionik diperoleh sebanyak 50% (Tabel 1).
Efisiensi transformasi ditentukan berdasarkan rasio jumlah kalus yang tahan
higromisin terhadap jumlah kalus yang ditransformasi. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa padi Indica memiliki variasi pada efisiensi transformasi di
antaranya 22% (Rashid et al.1995), 5.6-6.2% (Arockiasamy dan Ignacimuthu
2007), 2.0-7.6% (Nandakumar et al. 2007), 29% (Fitriah 2010), 14%
(Mulyaningsih et al. 2010), dan 9.3% (Karthikeyan et al. 2011).
Efisiensi transformasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu pemilihan
jaringan kultur, kondisi medium kultur, kondisi kokultivasi, dan regulasi antara
faktor genetik dan faktor fisiologis (Hiei et al. 1994; Katiyar 1999; Saika dan Toki
2010). Pemilihan jenis jaringan yang akan ditransformasi merupakan langkah
awal untuk mendapatkan keberhasilan persentase tinggi pada proses transformasi.
Skutela biji padi matang merupakan material paling baik untuk ditransformasi
dengan perantara Agrobaterium (Hiei et al. 1994). Perkembangan kalus
embrionik untuk dapat bergenerasi dipengaruhi oleh konsentrasi 2.4-D dan
komposisi agen pemadat. Konsentrasi 2.4-D paling baik digunakan untuk
memacu proliferasi kalus yang efektif pada regenerasi adalah 2-2.5 mg/l. Agen

11
pemadat (gelrite) yang optimum untuk pembentukan dan perkembangan kalus
adalah berkisar 3-4 mg/l (Kumar et al. 2005). Konsentrasi 2.4-D yang rendah
menyebabkan perkembangbiakan kalus terhambat, sedangkan konsentrasi 2.4-D
yang tinggi menyebabkan sel kalus mengalami nekrosis (Karthikeyan et al. 2011).
Keberhasilah transformasi juga ditentukan dari penambahan asetosiringon pada
media kokultivasi dan pengaturan suhu kultur antara 22 0C dan 28 0C.
Asetosiringon merupakan senyawa yang berperan dan menginduksi gen vir untuk
mentransfer T-DNA ke genom tanaman target (Godwin et al. 1992; Hiei et al.
1994; Tyagi et al. 2007).
Tabel 1. Efisiensi transformasi dan efisiensi regenerasi padi Indica
kultivar Kasalath
Kultivar
Pengamatan
Kasalath
Jumlah kalus yang di infeksi Agrobacterium (A)
60
Jumlah kalus resisten higromisin (B)
30
Jumlah tunas yang beregenerasi (D)
4
Efisiensi transformasi (B/A) (%)
50
Efisiensi regenerasi (D/B) (%)
13
Pembentukan tunas dari kalus yang tahan higromisin mulai teramati sejak
minggu pertama di media regenerasi. Pembentukan tunas diawali dengan
munculnya titik-titik hijau pada kalus. Titik hijau membesar membentuk tunas
dan akar setelah 4 minggu. Planlet dipindah ke media MS selama 2 minggu tanpa
zat pengatur tumbuh untuk pembesaran tanaman. Tanaman padi diaklimatisasi
sebelum ditanam di media tanah.
Sebanyak 4 dari 30 kalus tahan higromisin menghasilkan 4 tunas yang
beregenerasi sehingga diperoleh efisiensi regenerasi sebesar 13% (Tabel 1). Hal
ini tidak jauh berbeda dengan hasil efisiensi regenerasi yang diperoleh dari
penelitian sebelumnya yaitu 6.06% (Fitriah 2010), 14-29% (Mulyaningsih et al.
2010) dan 40- 60% (Saika dan Toki 2010). Efisiensi regenerasi ditentukan
berdasarkan rasio jumlah kalus yang beregenerasi membentuk tunas terhadap
jumlah kalus yang tahan higromisin (Saika dan Toki 2010). Efisiensi regenerasi
pada padi yang ditransformasi dengan menggunakan media Agrobacterium
dipengaruhi beberapa faktor di antaranya pemilihan eksplan, komposisi hormon
pada media yang digunakan, ketersediaan nutrisi, suhu, durasi kokultivasi,
virulensi Agrobacterium, OD bakteri yang digunakan, konsentrasi antibiotik
sebagai marker seleksi dan periode kultur jaringan (Katiyar et al. 1999; Carlos at
al. 2004; Pipatpanukul et al. 2004; Saharan et al. 2004; Tyagi et al. 2007).
Sebanyak 2 dari 4 tunas yang beregenerasi berhasil diaklimatisasi. Sebanyak 2
tanaman Kasalath transgenik yang diperoleh masing-masing dinamai OSK-SOD1
(Oryza sativa cv. Kasalath SOD 1) dan OSK-SOD2 (Oryza sativa cv. Kasalath
SOD 2).
Resistensi padi cv. Kasalath transgenik terhadap higromisin yang ditentukan
oleh adanya gen hpt yang terpaut dengan gen MmCu/Zn-SOD didalam genom
tanaman. Gen hpt diisolasi dari bakteri Escherichia coli. Gen hpt menyandi
ketahanan terhadap higromisin. Higromisin merupakan bagian dari antibiotik

12
aminosiklitol. Resistensi terhadap higromisin ditentukan oleh ekspresi gen am
yang terletak berdekatan dengan gen hpt dengan cara mengubah antibiotik dan
struktural terkait higromisin. Keberadaan aminosiklitol fosfotransferase di
Escherichia coli menyebabkan bakteri ini resisten terhadap higromisin (Rao et al.
1983).

Analisis Integrasi Transgen MmCu/Zn-SOD Generasi T0
Identifikasi tanaman transgenik melalui deteksi keberadaan transgen
MmCu/Zn-SOD pada tanaman hasil transformasi dilakukan dengan PCR.
Pasangan primer yang digunakan adalah 35S-F dan MmCu/Zn-SOD-R2 dengan
ukuran fragmen DNA sebesar 633 pasang basa (pb) yang berasal dari amplifikasi
bagian ujung 3’ promoter 35S CaMV (363 pb) dan bagian ujung 3’ daerah
penyandi gen MmCu/Zn-SOD (270 pb). Hasil PCR menunjukkan keberadaan
transgen MmCu/Zn-SOD pada dua tanaman transgenik putatif generasi T0
(Gambar 4). Analisis PCR ini mendukung hasil seleksi kalus yang resisten di
media selektif yang mengandung higromisin. Ekspresi gen MmCu/Zn-SOD
dibawah kendali promoter 35S CaMV efektif untuk meningkatkan ekspresi gen
pada transformasi padi (Hiei et al. 1994).
M

1

2

3

633 pb
1 cm
1 cm

Gambar 4 Analisis integrasi MmCu/Zn-SOD padi Kasalath generasi T0 dengan
PCR DNA. M = marka DNA 1 KB, 1 = Kasalath nontransgenik, 2=
OSK-SOD1, 3 = OSK-SOD2.
Padi cv. Kasalath transgenik generasi T0 yang terintergrasi dengan gen
MmCu/Zn-SOD ditanam di polibag dan dibiarkan menyerbuk sendiri hingga
menghasilkan biji T1 (Gambar 5). Biji T1 digunakan untuk analisis segregasi gen
hpt di media MS0 yang mengandung 50 mg/l higromisin. Generasi T0 pada
tanaman transgenik setara dengan generasi F1 pada persilangan konvensional dan
generasi T1 pada tanaman transgenik setara dengan generasi F2 pada persilangan
konvensional. Oleh sebab itu, tanaman T1 akan mengalami segregasi.

13

1 cm

Gambar 5 Tanaman padi Kasalath transgenik SOD yang menghasilkan biji T1

Analisis Segregasi Gen hpt pada Generasi T1 dan Generasi T2
Biji T1 padi cv Kasalath transgenik OSK-SOD1 dan OSK-SOD2 hasil
penyerbukan sendiri dievalusi untuk ketahanan higromisin. Biji T1 yang resisten
dan sentitif dibedakan secara jelas pada media seleksi yang terdiri dari MS0 yang
mengandung 50 mg/l higromisin. Tanaman transgenik menunjukkan pertumbuhan
normal, sedangkan tanaman nontransgenik mati setelah 10 hari di media seleksi
(Gambar 6).

1 cm

Gambar 6

(A)

1 cm

(B)

Analisis resistensi tanaman padi cv Kasalath pada media MS0H50
yang mengandung 50 mg/l higromisin. (A)= Biji padi Kasalath
nontrangenik, (B)= Biji T1 padi Kasalath transgenik SOD

Uji chi-square dengan tingkat kesalahan α=0.05, menunjukkan bahwa
segregasi biji generasi T1 bersegregasi mengikuti pewarisan mendelian dengan
rasio 3 resisten :1 sensitif (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa jumlah gen hpt
yang tersisip ke dalam genom tanaman transgenik adalah satu salinan. Hasil
segregasi dengan rasio 3:1 juga diperoleh pada padi Indica cv IR50 transgenik
P5CS (Anoop dan Gupta 2003) dan padi Indica cv. ADT 43 transgenik P5CS
(Karthikeyan et al. 2011).

14
Tabel 2 Pola segregasi biji T1 padi Indica cv. Kasalath transgenik SOD
Tumbuh
Tidak
Biji T1
Σ Resisten Σ Sensitif Rasio
tumbuh
higromisin higromisin
OSK-SOD1
99
15
60
24
3:1
OSK-SOD2
82
13
49
20
3:1
χ²tabel (db); α= χ²(1);0.05=3,841
Jumlah
biji

X2
0.56
0.57

Untuk memperoleh transgenik homozigot, biji generasi T1 Kasalath
transgenik OSK-SOD1 dan OSK-SOD2 yang resisten higromisin ditanam di
pobilag dan dibiarkan melakukan penyerbukan sendiri hingga menghasilkan biji
T2. Homozigositas atau heterosigositas pada generasi T2 dianalisis dengan uji
ketahanan higromisin. Dari tiga tanaman transgenik, satu tanaman yaitu OSKSOD12 menghasilkan keturunan T2 yang semuanya resisten higromisin (Tabel 3).
Hal ini menunjukkan bahwa OSK-SOD12 adalah homozigot. Tanaman transgenik
homosigot sangat penting untuk perbanyakan tanaman transgenik melalui biji.
Semua biji hasil penyerbukan sendiri dari tanaman transgenik ini adalah
transgenik, sehingga tidak memerlukan transgenik. Selain itu, tanaman transgenik
homosigot dapat disilangkan dengan tanaman non-transgenik dalam rangka
perakitan varietas hybrid tanpa melalui seleksi. Gen yang terdapat di tanaman
transgenik homosigot lebih mudah dipindahkan ke tanaman lain daripada yang
terdapat di tanaman transgenik heterosigot.
Tabel 3 Pola segregasi biji T2 padi Indica cv. Kasalath transgenik SOD

Biji T2
OSK-SOD11
OSK-SOD12
OSK-SOD25

Jumlah
biji
150
12
55

Tidak
tumbuh
21
0
13

Tumbuh
Rasio
X2
Σ Resisten
Σ Sensitif
higromisin higromisin
90
39
3:1
1.69
12
0
Homozigot
3
30
12
3:1
0.27

χ²tabel (db); α= χ²(1);0.05=3,841

Transgen hpt telah diwariskan secara stabil sampai dengan generasi T2. Hal
ini menunjukkan bahwa gen hpt telah terintegrasi pada genom tanaman padi
Kasalath transgenik. Karena gen MmCu/Zn-SOD terpaut dengan gen hpt pada
daerah T-DNA dan terletak di antara RB dan gen hpt (Gambar 2), maka
keberadaan gen hpt di dalam genom padi Kasalath transgenik selalu diikuti gen
MmCu/Zn-SOD. Proses transfer gen yang terdapat di daerah T-DNA oleh A.
tumefaciens dimulai dari RB, sehingga jika gen hpt yang terletak lebih jauh
terintegrasi ke dalam genom tanaman transgenik, maka gen MmCu/Zn-SOD yang
terletak lebih dekat dengan RB juga terintegrasi di dalam genom tanaman
transgenik. Gen hpt yang terintegrasi di dalam genom berjumlah satu salinan,
sehingga gen MmCu/Zn-SOD yang terintegrasi di dalam genom tanaman padi
Kasalath trasgenik juga berjumlah satu salinan.

15

5 SIMPULAN
Simpulan
Transformasi genetik padi Indica cv. Kasalath dengan gen penyandi
superoksida dismutase (MmCu/Zn-SOD) dari Melastoma malabatricum
menghasilkan 2 tanaman transgenik. Analisis pewarisan gen hpt ada generasi T1
dan generasi T2 dari padi Indica cv. Kasalath transgenik menunjukkan bahwa gen
hpt diwariskan secara stabil kepada generasi selanjutnya, mengikuti hukum
Mendel dengan satu salinan gen yang terintegrasi ke dalam genom. Gen
MmCu/Zn-SOD terpaut dengan gen hpt, maka inetgrasi dan pewarisannya juga
seperti pada gen hpt.
Saran
Efisiensi regenerasi dapat ditingkatkan dengan menggunakan media
regenerasi tanpa penambahan antibiotik. Fungsi gen MmCu/Zn-SOD terhadap
ketahanan cekaman abiotik dapat dianalisis dengan uji tantang pada galur tanaman
transgenik SOD dengan menggunakan transgenik homozigot.

DAFTAR PUSTAKA

Abdurachman A, Dariah A, Mulyani A. 2008. Strategi dan teknologi pengelolaan
lahan kering mendukung pengadaan pangan nasional. Jurnal Litbang
Pertanian. 2: 43-49.
Alscher RG, Erturk N, Healt LS. 2002. Role of superoxidase dismutase (SODs) in
controlling oxidative stress in plants. J Exp Bot. 53:1331-1341.
Anoop N, Gupta AK. 2003. Transgenic Indica rice cv IR-50 overexpressing
Vigna aconitifolia d(1)-pyrroline-5-carboxylate synthetase cDNA shows
tolerance to high salt. J Plant Biochem Biotechnol. 12:109–116.
Arockiasamy S. Ignacimuthu S. 2007. Regeneration of transgenic plants from
two Indica rice (Oryza sativa L.) cultivars using shoot apex explants. Plant
Cell Rep. 26: 1745-1753.
Basu U, Good AG, Taylor GJ. 2001. Transgenic Brassica napus plants
overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide
dismutase cDNA are resistant to aluminium. Plant Cell Environ.
24:1269–1278.
Boo YJ, Jung J. 1999. Water dificit-induce oxidative stress and antioxidative
defenses in rice plants. J Plant Physiol. 155:255-261.
Bowler C, Montagu MV, Inze D. 1992. Superoxide dismutase and stress tolerance.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 43:83-116.
Bowler C, Alliotte T, De Loose M, Van Montagu M, Inze D . 1989. The induction
of manganese superoxide dismutase in response to stress in Nicotiana
plumbaginifolia. EMBO J. 8:3 1-38.

16
Brencic A, Winans SC. 2005. Detection of response to signals involved in hostmicrobe interactions by plant-associated bacteria. Microbiol Mol Biol Rev.
69: 155–19.
Cannon RE, White JA, Scandalios JG. 1987. Cloning of cDNA for maize
superoxide dismutase 2 (SOD2). Genetic. 84:179-183.
Carlos Henrique SC, Usha BZ, Nilupa G, Joseph A, Halina HK, Thomas KH,
John DA. 2004. Agrobacterium-mediated transformation of sorghum;
factors that affect transformation efficiency. Genet Mol Biol. 27:259–269.
Chatzidimitriadou K, Nianiou–Obeidat I, Madesis P, Perl–Treves R. 2009.
Expression of SOD transgene in pepper confer stress tolerance and
improve shoot regeneration. Electron J Biotechnol. 12: 1 – 9.
Chawla S, Jain V. 2012. Salinity induced oxidative stress and antioxidant system
in salt tolerant and salt sensitive cultivars of rice (Oryza sativa L.) J Plant
Biochem Biotechnol. 1:1-10.
de la Riva GA, González-Cabrera L, Vázquez-Padrón R, Ayra-Pardo C. 1998.
Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation.
Electron J Biotechnol. 1: 118–133.
[Deptan] Departemen Pertanian (ID). 2010. Roadmap Peningkatan Produksi Beras
Nasional (P2BN) Menuju Surplus Beras 10 Juta Ton pada Tahun 2014.
[diunduh 2013 Maret 23].
http://tanamanpangan.deptan.go.id/doc_upload/44_BAB%20I%20dan%20
II.pdf
Duckely M, Oomen C, Axthelm F, Van Gelder P, Waksman G, Engel A. 2005.
The VirE1VirE2 complex of Agrobacterium tumefaciens interacts with
single-stranded DNA and forms channels. Mol Microbiol. 58: 1130–1142.
[FAO] Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2014. FAO
Cereal
Supply
and
Demand
Brief.
[terhubung
berkala]
http://www.fao.org/worldfoodsituation/csdb/en/. [25 Desember 2014]
Fitriah N. 2010. Transformasi genetik padi (Oryza sativa L.) dengan gen penyandi
metallothionein tipe II dari Melastoma malabathtricum (MaMt2)
menggunakan perantara Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor:
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Foyer CH, Descourvieres GP, Kunert KJ. 1994. Protection against oxygen
radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants.
Plant Cell Environ. 17: 507–523.
Fridovich l. 1995. Superoxide dismutase. Annu Rev Biochem. 44:147-159.
Gill SS,Tuteja N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in
abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiol Biochem. 48: 909-930.
Godwin ID, Ford-Lloyd BV, Newbury H. 1992. In vitro approaches to extending
the host-range of Agrobacterium for plant transformation. Aust J Bot .
40:751–763.
Greenberg JT, Monach P, Chou JH, Josephy PD, Demple B. 1990. Positive
control of a global antioxidant defense regulon activated by superoxide
generating agents in Escherichia coli. Proc Nall Acad Sci. 87: 81-85
Greene EA, Zambryski, PC. 1993. Agrobacteria mate in opine dens. Curr Biol.
3: 507-509.
Hannum S. 2011. Isolasi, pengklonan dan analisis ekpresi gen penyandi copper
zinc superoxidace dismutase (CuZn –SOD) dari Melastoma

17
malabathricum [disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian
Bogor.
Hiei Y, Komari T. 2008. Agrobacterium mediated transformation of rice using
immature embryos or calli induced from mature seed. Nat Protoc. 3: 824834.
Hiei YS, Ohta, Komari T, Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice
(Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of