Transformasi genetik pada indica dengan gen cryIA(b) dan cryIB menggunakan Agrobacterium tumefaciens untuk ketahanan terhadap hama penggerek tanaman kuning (Scirpophaga incertulas Walker.)

TSZANSFQRMASE GENETlEK PAD1 INUICA
DENGAN GEN cryUl(b) DAN crylB MENGGUNAKAN
Agmbacterium fumefackns UNTUK KmAHANAN
"FEWADAP HAUA PENGGEREK BATANG KUNEPXG
(5*cirpophagainartuXasWalker.)

Qleh :
MAFTUCHAH

M A F T U C W , TRAlYSFQRMASI GENETIK PAD1 INDICA DENGAN GEM
oyU(b) DAN exylB MEPJGGUNAKAPI Agrobaerium turnfirW U K
K E T W A N TEMMUAP HAMA PElYGGElREK BATANG KUNKNG
(Scippkaga iaem@fmWalker.) (Di bawtlh birnbiian Hajrial M d l n n o o r , Inez
Hartense S. W i n , Edi Guhnrdja dnn Aunu Rauf)

Saangkaian pmelitim telah dil*
dengin atjuan untuk mendapatkan padi
india yang tshan t d a d q hama p"ggemk batang melalui introduksi gen crywb)dm
cviB kc dalam kalus embriogaik d q a n mmggw&n teknik Agrobacferium
turnefncien,~.Paefitim ini tmdiri dari mpat takq kegiatm, y& : 1) optimasi
regenmi pada kufm in vitro padi indica s&gai target @ausf&

melalui
Agrobacteriurn tumefuccins, 2) pgujian &&a@
phmid vektar dan m&e
transfomwsi md&ui Agrobacterium hunefacr'em p d a padi in&%
3) konsmksi
plasmid &ombinan p b a w gw crylA@)dan cryIB ymg sesuai wruk tmmfomzisi
gene& meralui Agrobucterium fumeJaciemdm 4) transforlnasi g m ctyIA(b) dm cryEB
pa& padi hdica melahi Agrobacterium tumefacims u n e M a n a n t d a d q hama
penggerek b-g
padi lcuning (Sciporphga irocertdas Walker.).
Elas2 penelitian r n m u x ~jdnth
j ~ kaXus hijay j d a h kdus beregmemi dan
j d & planlet tabanyak diperoieh dsrri komposisi hormoa O,I mg4 IAA dan Q,7 mgll
BAP pada mad& regenmi LS dm diapai efisiensi regenerasi s e k w 26,67 %.
PWgkatan kmsentrasi mtibiotik higomisin dalwn m d a tdukzi mm-bat
pmtumbulran dm perkembangan kdus embriogd p& Cisadaue, sejlingga pada
konsmtrasi higramisin 100 mg!l pmatase kaxw mtti m a w f OO % setelah 28 h i .
Sehjutnya konsmtrasi antibioa higromisb 100
d
i d a m media

~
penyeleksi pada proses traxlsfumssi gmetik pa& CisadmePa& tahap ipditian metode transhrmasi dm j a i s v&r, p w k m vakum
y m g diikuti infeksi AgroAacrerium denplasmid vektor gCambia 1303
menghasilkm 4si-si msfomuisi sebesiw 9,33 %, &siensi regenmi 10,6 1 %,
dengan eksprcsi gus pada Wus leb& bsik daripada perhkuan lainnya dm persenme
dam positif gsrs 66,7 %. Per1dmm biolistik baik dmgan p h k e l emas mttujm tanpa
par&& yang d i h t i infeksi Agrobcte~urnm e n d m jumlah Mus hidup, egsi-1
regmemi mupun efisimsi m f a m i .
Lebh tanjut d & m kegiam penelitian. k i k m y a telah khasif dikonstdai dm
plastnid rekombinsln yang sesuai untuk. transfomasi genet& melalui Agrubucterr*~~m
tum@aciens, y& pCsmbia 1303 - cryIA(b) yang ixmkum 16.526 bp dibawah kmd&
promotor konstitutif ubiqut'tin dan p w b i a 1303 - cryIB y m g berukuran 15.461 bp
dengan promotor terinduksi plukm MPi.
Pada tahap transformasi pCrmrbia 1303-cry1Afb) dm pCambia X 303-cryXB ke
d d m tanaman padi indim cv Cisadme, tef& dipuleh dua @ur tanaman tmmgaiik
yang mmgandung gm clytA(b) dm h a galm tamm a m g & ymg mmgmdung
gen cryIB. Uji immasbip m e n u n j h tin@ ekspresi protein cryIA(b) macapai 320
ngm1 pada kedua gdur tmmm padi b.ansgenik ynng magandung gen @A@).
Efektifias gen ctyIA@) dm cy1B dievalwi mefatui uji @an dengm atenglarva p g w & batrrng padi h i n g (Sciporplaaga incertufas Walker.) y m g
Ibandingkm dengan XNftivar Cisadme Aagai kontrol @a. Ehprai protein myIAfb)

mengakibatkan tin#at mortalitas Iarva penggaek b-g
padi kuning menu@

ma

~

83,70% pada galur crylA(b) 4 1 1 dm 74,82 % pada gafur crylA(b) I X 2, Galw-gafur padi
ymg rnmgmdung gea cryIB mwunjuMran tingkat mortalitas Xarva lebih
mdah. Pada g&w cry1B 46 1 tingkat martditas larva wbesar 48,15 %. Ditwmdingb
kontml Mtivar Cisadme, tasraman padx @ansg& mmurunkan mta-mta baht basah
tma pqgerek: batang gadi laming hingga 52,49 % pada 5 ha3 setelah i n a W i ,
semmtara posisi bbatang tidak berpengmzh tdxdap tirrgkat k d n n d m bbt Xarva

m
s
@

penggerek batang kuning

M A F T U C W . GENETZC TRARiSFORMATlUN OF IP3DXCA RlCE BY
eryIA(b) AND myXB GENES USING Agrobam*um fumfa&m TO OBTAIN
YELWW STEM BURER RESISTANCE (Schpopkagc1 bw&tlas Walker,)
(Supwised by Hajjrial Aswidinnour, Inex Hodawe S. Loedh, Edi Guhardja and
Aunu Rauf )
A series of experiment was done to obtain irrdica Tim r e s h w to stem b r a by
cryl*)
and cryIB gma were introdued into rice embryogenic d l i using
Agrobucferiurn fumefaciem technique. The mar& consisted of four steps : 1)
opthation of in-vitro culture regmeration of india riw as trasfodian target via
Agrobacterium &mefaciens32) study of several vectors and trrmsforrrmtim m&ods via
Agrab~~cteriurn
turnefaciens of indica rice, 3) cuns@uhns of reurnbinant plasmids
containing crylA(b)and ctyIB genes which suitable for Agrobacterium trmsfo&on,
md 4) transfomation of recombinant plasmids csrrying cryIA(b) md myfB genes to
indica rice wing Agrobacterium &m.faciens to obtain ydow stan bora resistan=
(Scr*rpophagaincerfulas Walkex.).
The result showed &at the highest nmM of green dli, rqm& calli and the
number of pldets were o b d on tfie regeneratiaft media suplmatad with 0.I
of XAA and 0.7 mgh of BAP, where regeneration eficiency mch& 26,67 %. The

increasing of hygrramycin w n d o n in madim showing idiiiition of growth and
developmat of epzlbryagenic &, so in 100 rn@ of hygramycin corwntmtion the
percentage of lethal cdi m h e d 100 % at 28 days. Based on &is d
t
,
100 @I
fiygromicinwas us& as a selection medium for genetic transformation process of Wca

ma

lice.

In the experiment of &ansformation method md vector, vacam treatments
fallowed by Agrobacten'um infection with pCambia 1303 vector plasmid produced the

highest: &ciency of trmsfmtiws (9.33 %I, 10,61% dEciency of regendon, with
gus qrmsion at dfi biter than mother &-eats
and the percentage of gtrs positive
at I& 66,7%. The bidistic tramat both by gold particle or without particle with
Agrobacrerium infection decreasing number of living calli, efficiency of regeneration

and dl5ciency of tmsfomtion.
Furthermore, h m subsequmt experiment, two recombinant plasmids which
suitable for Agrohacterium tmsfomation have been recon&wted : pCambia X 303cg4tl(b) 16.526 bp size with ubiquitivr constitutive promoter and pCambis 1303-c~IB
I 5.461 bp size with MPi wound inducible promoter.
Transformation of the new gene and vector into indica rim cv. Cisadme, two
lines of tmsgmic plant carried cvIA@) gene md Gve k e plant carried cyIB gene
have beat obbined. Immunos~ptest showed that tfre level of cryXNb) protein reached
320 n g / d in the two line of cryIA(b) transgenic rice plants. The effwtivmess of the
genes were evaluated through feeding assay agmst yellow stem borer (Sc2rphophaga
incertulas Walker,) compared with nan trsnsfomed Cisadanf: as suswptible check
varieties. The expression of ~ y l A ( b endotoxin
)
dthe mortality rate of yellow stem
borer populations up to 83,70 % in cryIA&) 4 11 transgenic line, ?4,82 % in clyIA(b)
1 I2 @amgenicline and 48,15 % in cryTB 461 tmwgaic plant. Campared to Cisadane,

&msgdc rice: plants were daease the weight of b a e 52,49 O/o in 5 day after
inoculation, while the position of stem did not influence the mortality rate and w&@t of
yellow stem borer larvae.

K y words : genetic transfornation, indica rice, Agrobac~en'um,cr)lfA(b) gene, cryIB
gene, rice stem borer.

W g a n hi saya mmymkm b&w &semi bqudul "TRANSFORMASZ
PAD1

LNDJCA

MENGGUNAKAM

Agroba-m

GENETPEC:

DENGAN

GEM

#mmfa&m

cryIA(lb)
UWUK:

DAN

e@S

ICETAHANAN

TERElIADAP U M A PENGGEREK SATANG KUMXYG (St@rphagu i n e m l a
Walker.)* addah

be~naf m q a k a n

dipublikasikan. Semua sum&

secaraj e h dm dapat dip-

hasir karya saya sendiri dm beium pan&

data dm informasi yang digwkm tehh dhyatakan

k h q a

TMNSEORMASL GENETXK PAD1 ENDICA
DENGAN GEN wylA(b) DAN cryIB HENGGUNAKAN
Agm&a&rr'um tumefaiens UNTUK KETAHANAN
ERHADAP HAMA PENGGEREK BATANG KUNIIYG
(Scirpophagainaitulas Walker.)

Judul Ihmwi

: TRANSFORMAS1 GENETIK PAD1 INDlCA DENGAN GEN
cayIA,jfi) DAN q I t B MENf*EWAKAN AgrohzeW~rrr
arn@inciens UMTUK KKTAHANAN TERHADAP HAMA
PENIZEREK HATANG KUMING (Scipotpkriga incet$utm
Waiker*).

Dr. Xr, f l a i r i d Aswidinnoor, MSG.
Ketua

FroE Dr.Edi t i d i a , MSc.
J4W60b

~ek&l&
Pasmarjana IPB

e

Dr. lr. MalriJ AsWadinooorrMSc.

Dr. Ir. \nm Martense S. Lodin
Angi~h

Pen& difthirkan di Bojomgoro p d a -al

12 Mxet 1968, menrpakm pubi

kedw dari lima baudara dari kdwga Drs Masdoekie.
PmdidiEran dasac sampai dmgm SLTA diseI&an

1990 penulis mempof& geztr wjana pamian

di S d a y a . Pada tahun

dari FWtrrs Permim, Univasitas

Brawijaya, m g . Pmdidih pascal M
a
w disefkkm pads tahun 1993 di. Program

Paca Sarjana, Unjvmitas G a d j h d a , Yogyakark Sejak a m 1592 penas menjadi
st& peagtjar K o p d s Wdayah VII ymg dipdmtukan pads Fakultas Pertmian,

Univmitas Muhmmadxyah Mdmg

Pada tahun 1994 penulis me&&

dengm k. Axis W h q a MSi, d

w m g putra Muhammad Syauqi A1 MsgMmb pa& Demnber 2001.

m dhnmiai

PRAKATA
B m h r a h m ~AU& SWT peridis @at

m e n y e t d m penulim di-i

yang

marprPkan sdah rn syarat penyelaaim Program Strata Tiga (5-3)pad& Pro-

Pasea Sarjam, Instiht Pertanhi Bogor,
Pa& kesempatm hi, pen&

menyampakm terirna kasih dan pnghrgaan

kepada :
1. Dr. Ir. Hajijrial Aswidinnoor MSc. s e l h ketua komisi pmbimbing dan Dr, Xnm
Hortense S. M i n , Prof. Dr. Edi W d j a MSc., serh Prof. Dr,Aunu Rauf MSc.,

selaku anggota komisi pembhbhg, atas bimbingan, p g m h m dan, sarannya
setam p e n u 3 . i ~usuIan penlitian, pada saat pet-

selwinya pexsdisan desert&. Dr. In. Agus -to
L)r.

B w g Abddlafi wlaku pen~jujiatas segala

pexrelitian dm sampai
MSc., Dr.M, H m a n serta

dan m a s h p g t&

diberikan.
2. Tim M m j m t m Program Doktor (ThWD) DiQa DKTI, Ikpdihm, atas bmtuan

B d s w a Pendidikan Strtrta-3 ymg Mah&b&m keprtda peaufis.
3. The R~ckef&m FoUIIdd~ll, 3llddG R m &

Grant

dari hbTIl&011al

Biotechn~logyPxagram atas nama Dr. ha Harkme S. Losdin atas ban-

h p a

baha-bahan pmduk:uagpelitian.
4. Dirjen Pembinaan Pmelitian dm Pengabdim Pada Masy~rak-wt- D e p d h ,

am

d h g a n h a penelitian melalui Proyek PeneIitian Hibah Beming Pergunmi

Tinggi IX T&m 200 1-2UU3.
5. Kepala Pusst PeneXitian B i a ~ o l o g -i

LIPX, Cibinong dan Kepala Laburionurn

MoleInrler Tanaman, Pustit B i o t ~ o f o g-~ LIP1 ymg telafi m m W a n ijin
pemkam fasilitas peralatan dm b a h a n - b selama pelaksanaan peflefitian.

6 . Centre for Applr'cation of MolemIar Biology to Ip1femfiunal Agriculture
(CAMMA), Canbmq Australia atas bantuan -pa

v&or pCambia ymg

dipergunakan &am pehtim ini.
7. Dr. Satoto dan &. S u m o dari Mai Pen.&an Padi (BALffPA) SuXramandi serta

Pimpinan BALITPA Muara, Bogor, atas h t u a n bmpa b
penyedim lama

d padi Cisadme,

bamg kuning, serta saran-saran yang *1ah diberih

mhlk p l & B # m p e h .

8. Seam &usus uwrm k r h a W dismpib kepsd8 bapak Prof. M&c Fadjar
MSG, Dr. Unmg Moerdijatmo (PPPGI, Pasunran), Prof. I)r. Umar An-

Jeaie

(PAU B i a ~ o l o g jUGMJ
,
serta Prof. Dr. Barnbang Guriwo (Univ. Brawijaya) am
segala d h g a n , pengarahan dan bimbingm yang selalu diberikan.

9. Pxmpimn Universitas M u h m d i y a b M a h g , atas kesempatan dan segala bantuBn
ymg telah dibaikm kepsda pulis mark:mdwnjutIrm pendidkm.

10, Wdur IPB, Direlrtur P r o m Pwsca Sarjana fPB dan s e g a p staf p j a r ymg

tdah m

m

mk

~

q kepahpmuxis
m
uotuk: menxghh program stmta tie

11. Seluruh staf peneliti @a Moratorium Mulhler T-

Puslit Biutdmologi -

LIPL Cihong, W1uswya : Dra. Syamsidah Rtihmma MSi, Dr. Amy Mati,

Enung SM, MS.,Drs. Agm Rachmat, Dr, Sukrna dm Drs, Edy Yusuf, atas
penydiaan waktu mtuk diskmi dan saran-saran t W s yang telah d i M a n .
12. f3@

Dr, S u d m n o atas s@a

kritik dm masukan ymg tel& dibdkm. Kepada

tman-tmm pmeiiti cfari BALITBIU Bogor, Pusbang Biot&ologi UMM, w t a
man-tanan $ o m Uxliversitas Bnwijays Malang, atas dukwgan, saran, serta

msisukm yang d i l x d m .

13. T&a

Icasih yang tidak terhmgga unmk t

asisten di Lab. Molehler T

~

- kdampk
t
~
PmI,dan selunrh

-

m Puslit Bi~teknolagi LfPI, terubma : Carb

Frieda Pantaw S.Si, Anky 2hnati S.Si dm Dadang atas kd-

dm banha

teknis ymg telah d i b d a n selma pelitim k I m g a q . Bapak Eman Sulaeman,

Alvian dm Taufiq atas bantuan pemeiihamm tanmum di nunah k m khusus
&maman ~g~

Bapak Jitno Riyadi &as b a n W m

bfiatl

-bar-gmbw

mtuk dokumentasi pmelitim.

f4. Sectira lcbusus uapan mima kasih, pen*

sampaixraa kepada ibunda dan, ayahan&

Drs. Masdo& atas do'% pendidkm, trimlingan, serta @a
selalu dibmhu. T&B

k a i b kq&

pengadan y m g

suami Xr. Aris Whys MSi atas =gala

keikhhn dm d h g m ymg dibmih. Demiki~n.pula k@a

keluarga k

bapk Drs. Atmg Suwam~i smta kdustrga hew di Smbaya atas

sew

ddmgamya.

IS. Semua pihak ymg tidak &pat pmulis s&utiran ram p a t u ymg telab membantu,
memberikan domgan moral, d h g m tenaga, dana, pikiran

serta

da'a b@

keMassSilan studi pendis.
Akhimya penufis menyampakan pamintam maaf atas segala ke:Mafm dan

kekmmgm selama studi, pelaksmum pmelitim dm penpunan desertasi hi.Smoga
h i 1 penelititin ini dapt membcdm d i k i t manfaat ba@ pengembangan ilmu
pengetahuaa.

Bagor,

September 2003

DAFTAR IS1
PRAKATA ...................................................................................................................
DAFTAR IS1 ................................................................................................................
DAFTAR TABEL ........................................................................................................
DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................
DAFPrAR LAMPIRAN ................................................................................................

Transfomasi Genetk T a m a n Padi MdaIui Agrobacterium ~meftaciens.....

Kegmemi In Vitro Padi Indim S&a& Target Transfomasi MdaJui
Agrobacteriurn fumefacieras ....................... ,
.
.
..,.. .,.. ..................................

.

.

Rekombmas~DNA .......................,
.
...................................................................

111. OPTIMASX REGENERASI KULTUR IN VITRU PADI INDICA SEBAEAI
TARGET TRANSF O W Sl MELALW Agrobacteriurn turnej4aciem

1V. PENGUJIAPJ BERBAGM PLASMID VEKTOR DAN METODE
TRANSFORMASX MELALUf A.turn@aciens PADA PAD1 W I C A

V. RONSTRUIKSX PLASMID REKOMBINAN PEMBAWA GEN cryXA(b) DAN
c@B YANG SESUM W U K WNSFURMAS MELALIE Agrobacierium

VI. 'fRANSFORh.IIASXGEN cryIA(b) DAN cryB PADA PAD1 MDfCA MELALUI
Agrabacten'um tumefaciem UlULK K E Y M A N ERHADAP HAMA
PENGGEREK BATANG

Kesimpulan ..........................................................................................................
120
VII. PEMBAEjASAN UMUM
'

A Qptimasi Regenemi Pada Kultur In Vr'rroPadi Iodica Set>@ Target Tcansformasi
melalui Agrobacterierm ...............................................................
.....,..**................ 122

B . fengujian Bertragai Plasmid Vektor dm T W Transfmai Mdalui
Agrobacferiumhrmefucjens Pada Padi Indica .......................................................

125

LAMP1RAN-LAMPIRAW .......................................................,.

............................

147

4.7. Rata-mbj d a h . kdus positif GUS di d i a ko Mtivasi pada berbagai
Perlslkuan metude dm vektor transfomasi meldui Agrobncferium..,..,......,.. ,..,... 62

4.8. Rata-ratsj d a h kalw positif GUS d m kordisi ekspmi di media selebi f
d m media ~ l e k sI1i pada babgai
metode dm vetor transformasi

~~
melaJui Agrobacterjum...... .. ... ,...........,..,...,*,
...
,

,, ,

,

*,

,

... ....,......,...,..,.,.,..,...,...,....,. 62
.*.

4.9. Rata-mta judatr Mtls misten, MUS
beregenmi, efisiemi regenmi, m t a
j d a h tunas pada mas&-masing kdus @a berbagai perlakuan metode dm
v e h transformasi melalui Agrobacterium di d i a regenemi . .. .,,.., .. ... ... . 65

. .. . . . .

4-10. Rata-rah jwnM kalus hegenemi, jumlah planlet, jumfah tamman d e w
dan efisiensi transfarmasi berbgai metode dm plasmid vebor trmsfami

meMui Agrobacterium mmfaciens di media regenerasi .....,...,......

......-. 65

metode dm
4.11. Rata-mta persentme d m jumlah dam positif Gus pi&
pfasmid v e h r transformasi me'tafuiA. tumefaciens ............,...... ,..,..,.......,. ...,..,.... 67

6.1. Kondisi R&i

AmplifLasi PCR UIXW
gm cr~.'lA(b)
,.....................,..,.................. 102

6.2. Kondisi R d a i Ampfifhsi PCR untuk gen cryB..........,............ ............ .. . . .. 102
6.3. Kondisi R&i

Amplifikasi PCR

gen hpt...... ...................,
........................., 102

6.4, P a *
MUS
embriogmik dari benih rnasak padi Cisadme pa& media
LS dengrtn penamMan 2,s mg/l hornon 2,443,..,....,........ .............. .... . . ... .

. 104

6.7.%sil uji gus druz uji resistensi higomisin dam padi C i s h e ....... ..........,,. ...,+.,...,.. 108

8.9. Persentaw h a mati, larva hidup dm berat Xarva hidup pafa uji m d m
Hama penggerek ~~~g kuning .......................,........................................... .......,.. 1 19

2.5. Alur Pmelitietn "Transformasi Genet& Psldi India dengan C m ctyIA(b) dm
cryIB Maggudcan A .tumefaeiens Untuk K e t & m Thd Penggwek &mg ........ 30
3.1 . Berbrtgai tipe murfulagi jaringm Wus padi Cisadme.........................

.....................

3.2. J d a h kalus b m hpdi Ciadane pesdrr pcddctm b e r m k o m m s i
h o r n IAA d m BAP ddmrnediaregenmi.....................................................

38

38

4.1. Tipe ekspresi gm gus pada kalus Cisadme &itbat ~ & ~ I a kbeu&&n
m&ode
dm jenis v&m txansformasi mefalui A .trimc$aciens .........................
..,.. ......... 63
4.2. Eksprmi gm gus pada daun padl Cisadme............................................................. 67
5.1. Peta plasmid DNA %-cry

LA@) ...............
.,,.,

................................................... 72

5.2. Peta plasmid DNA MPi-ctyIB ........................... .,.

...,,. ..................................
72

5.3.AIw Pmelitian 4cKon.mksiplasmid rekombinruz p"bawa g a cry IBftt) dm
crylB ymg seswi unmk transfomasi m e l d i A g r o I r a ~ f e ~lumef&een
m
............ 81
S A. Hasit uji dehoforesis pemotongtm pCwmbial3031-Wind$11dm fmgmen

gen clylA(b) .................................
.
,
.
.......................................................................82

5.5 . Has2 uji elektrofmis panotangan pGem4lcg4A(b) dm emim m m i
Hind 11 ..................................................................................................................
82

5.8. Hasf. uji elekimforesis panotongan DNA rekombinan (pCambia 1303
-cryfAb) &wiA . turnefaciens EHA 1Us'dga enzim Hind11 dm EcoRf ................... 84

5.10. Hasif uji dektroforesis potangan v&or pCambia 1303 dagan enzim
res&iksi Bum Hl+Hidf 11..............................................................................

......... 88

.,

5.1 3. Has11 uji dhforesis pemotongm plasmid rekombbaa pCambial303-cryIB
dari E-coii X L 1 dengan mzhn BarnMt-Hmi'lIl,dm pmob,an pCambia
1303 dmgm BamHI+HindXfI .................................................................................

91

5.14. Hasi1 uji eI&aforesis pernotangan plasmid r&ombinan.pCmbia 1303crylB dari E.coli XL-1 dmgm emkn restriksi o n 1 dm m z h BgflI .................... 91
S.15. IHwsil uji etektroforcsis pemotongm plasmid rekombinan pCambial303-clyEB
dari E .coij XL-1 dengan Bgl I1 (fajw 1-2). .............................................................. 91

5.16 . Wasil uji elhforesis pemotongrm plasmid r e k o m b h gHhmbi813Q3-cr)lIB

dari A . fumefaciens EEKAI 05 dengan BgEI I. .................. .,,.

.,.

6.1 . Has2 uji Gus padst dam tanman padi ...........*.....*....

.....................................

91

......................................

109

6.5. Hasil PCR g a m i TO untuk gen crylB .................................... ,.,............................1.13

6.6.Hasil PCR untuk. gen gos-5 ...............................................................................,. ...... 114

6.7.H a d PCRufltuIrgm hpt ....................................................
..,..... .............................. 114

J* PENDANULUAN
b t s r Bdsrhng

Padi ( O m ~ t r ' v aL) mmenrpk tanman pmgw mating pada
mpis mupun sub tsapis. Upqa pmingbtm produksi padi m ~ p a k m
s t r a t a mtuk maghadapi peningkatm k & i ~ t d mpmgm f i b a t m

b

w populasi

pendud&. hteapi berbagai War bio& dm abia* sa-ingld~menjadi pembatas
p & g k ~ prodddvitas padi dm diptlrkhkm lebih d a i 200 juta ton pduksi padi

h i b g setiap ta3runnya atcibat kkmm hghmgm, firnma dm p y a k i t ( W d t 1991).
Prduksi padi hrngga saat ini masih sangat

rnmaya hama p e n g g d batang padi W

&bat h d d a biologis di

g (Scirpophaga f~lcerftrl~s)
dan pggerek

batang @I put& ( S c i p p h g a innotuiu) yang sainglcali menjadi kendafa untuk

berbagai varietas p d i di fndonesia bahkem di A
s
h Untuk m-tasi
t&&

diupayakan M a g a i cant antara lain dengan m m *

kendda tersebut
varietas yang d w t

menjanain prduEaivim yang hnggi dm mbix. V a r i m yang d h k s u d adalah p g
memifiki s i b badaya haif thggi, tahan terhadap b,
pyakit sma kmdala-kmd&
non biologis hmya untuk menjamin pertmianyang kkelanjutaa
Tekxljk

den-

pemdiaan konvensioml terbW tdah mmgbsillran kbagai vari-

hasix tinggi, akan teeapi tehk ini masib m d i k i M e r a p keterbatasan (Ciiri

dm M 2000). Dalm upaya mentmjmg program pernuxiam wtuk mmgh~~dkm
v a r i w ymg dbmpkmtn maka k e t m d b plasma nu*

s&@

sundm k m g a m

gmetik sangat diperlukan. Permwdahan yang sahglrafi dihadapi addah apabila sifa

ketahmm yang d i p e r 1 . h seem &mi ti&

&at

diperoleh dari spacia padi liar

mupun budidaya, misalnya sifat k d m m t e r b h p hama penggerek b
gm ketahanan t d & p

a sehingga

bmu t d u t h a y &pat dipmoleh dari orgdsme Istin,

Sifat k e a h n m terhadap hama p g g &

dari golongan lepidopm

b-

s a m alami tidak terdapat pada t m m a ~padi xhmga p a n g m m y a s w i saat ini
masih mgat tergantuxfg p&

p a g g m m pestisida,

M a BPS (2001) menunjukh

bafiwa pggecek bamg mapakan hama yaug menyerang a d p

h di

w

Indunaia d e n w fuas d a d m m p m q a i 97.370 ha pada taXlu11.1999dm pada

td~un2000 luas d a d sangan m d g k a t hmgga 122.131 ha. Sedangkan di Pulau
Jam Iuas && m p pada tahun 1999

63.529 ha (BPS 2001), Hama

batmg mengaXElb&m p m pruduksi pa&

pea-&

510% bahkan @at

60-95% (Wunn ed al. 19%).

men@

Penaxpan t

perzhtm vari-

W safisformasi gmetik tabs sangat mmbantu ddam

tabu

kmtama jika

tidak ma-

dWukm den-

gen-gm yang m d l i b dal,

kanvensiand.

teknik

pa drllm @aikan

tanaman yang W a l dari species JHin serta penggabmgan b a h g a i

sifat
smm

basma ke dalam saru Wtivar, menpalm m d h ? pexlerapm k h i k transformasi
whkgga I&& m m b b plwmg untuk men-

gm&

Mtiw mmm sesuai

kebutuhm. A h tehpi pemanfatiXEfn teknik: eransfuwi gmetik
tabatas

umum masib

pada trmman dikotil yang dixbabkaa kumgnya prosedw yang musi u t u k

tanaman

Agrobacreriurn ufltuk proses msfomasi genet&

monakutil. P~~

pada tanaman monukotil masib ssmgat terbatas, &an mi M m p a Mil peaelitian
telah xnmunjukh keberhasilan

(Hie et ad. 1994 ;Dong ef a!, 1996 ; W

d et al,

1996).

Salsh satu pay&&

monokotil

hema ti&

inf&

Agrobacrerium pa& tmmm

adanya rapon pel-

ymg m~@itIrm inyawa

tidak ef-ya

fenolik yang alch b&exi d i p e r g u a h untuk menginduksi gen-ga vir (Shag dm
Citovsky 19%). ffici el al. ($994)menambalkan stmyam twtosyrixlgone ke ddam

pH 5 2 , namun kdtivar p d i yang be&asil d i m s f ~ m a s i

media kekultivasi d-an

a d a h kelompok japonica. T
&hkan

pada wximm p&

f mefalui
o Agrobacterr'um
~
j u g telah bedmit

~

Irelompak javmica (Dong et af.1996) dm kelompok

indica (Iiasfiid et al. 19961, m
u
n &siensinya masih =gat readah dm hanya tabatas
pada kdtivm tertentu. Kulejvaa padi yang banyak d i m di Asia adalah kelampok
indica, sedmgkan kultivar-kuxtivar yang ada di Indonesia termasuk irelompok indica

dm javEmia. Kumpetensi kelompok h d i dm
~ javanica untuk: cfitransfomasi serta
r q a n jaringamy8 mhadap perlakmn kultur jaringan &etahi f&ih Wsitrm

dibmdingkm dam kdompok japo&
T

(Coolty et a!. 1995).

W m f ~ r m a s igenet& y m g bmjuan utuk k&mm

tdah dircenbmgkan pa& hdtivar

mi Indonesia Sal&

thdap

hama

mtu gen ketdma ymg &lah

berhasil Bisisipkm ke mtivar Rzgal.de (kefompok javani~)adax.& gea, cryIA@)
p p d i k e t a h m t d d a p h a m dari gulong~m Iepiduptera meldui t

W

p e n c m b (Slam&-Win et al. 1998). Ebpresi gexl cyIA(b) y q diisolasi dari
bkteri Bacillus fhuringiensis ini pada padi kultivar IW8 dilaporkan m p u

meningkatkm ketdm~t~l
padi tdwdap penggerek bataog Bataing dm bergaris ( W m ef
al. 1996) ttan pa& maman padi kuItivar IR64 mta Vaidehi &b&

m p u

menk&hn kehhanm terhadap pggerek hang kming ( A het a/. 1W8 ;Nay&
er al. 1997). Wrmn et al, f 19%) Mail melakukata tmmfumasi gen crylA(b) pada

maman padi IW8 dan m

hama penggerek b-g

m

mn
t
i e k d m tanaman padi yang t m g

dapat dig-

b g g a 1100%. Breitler et a1 (2000) melaporkan

tanman p d i m g e n i k kdtivar Smia dm Aride yang meng&prmikan endotaksin

crylB mmwjukkan k o n s e n ~ m~~
i
d

h asai @an

sepuluh kdi I&& rendah darip& cryXA(c)

terfradap hama penggerek batmg pa& bergam (Chilo snrppressalrs).

Padi tmsgmik kultivar Senia ymg meagekg,resilran gen cryfB sscara nyata terlindung

dari hama m w e k Wmg bergark sejmjang perkembangan maman (Mafa et of.
2002).

h g m latar b e l a k q di atas malra dipfiukan suatu penelitim b@

pengembangan sistm mformasi gene&

ysng &sim melalui AgroBocterzum

rumefaciepfs pada tanaman pa& kefompok indica, tautam varietas komwsial ymg

d h u m di Indonesia &lam upaya rnatdapafkm p d indica transget& p b w a

ser&

gm k & m

t e h h p hama penggerek batmg (gen cry IA(b) dm cryIB).

Wm upya menghasilb taman t.cansgea& ic Eadampa f a h r y w
berpem, mtara lain : m d e yang efrsim &am

k&si

gm-ga h,
t&k

magMan g q k e k r s d i w

tmmfaamasi, sistem regmemi tammtn,sistem vektor

yang t m s dkwnbmgkm sma pmmotor yang spesi6k mtuk ekspresi gen pada organ

mentu (Aswidixmoor 1995).
Tujusrn Penelitian

I. Magkaji aptimasi, regmehasi pa& kultur in v i m @ indica sebagai target
iransformasi gen me£aluiAgrobacferium tumefuczefl~~
2. Mempelajati, metode tmmfo&

dm p M d v&im p g efWf untuk introduksi

gen-gm asing ke tanaman p d i in&wmelalui Agrobacrerium tumt$aciens,
3. Mengkmslmhi plasmid rekombinm pembwa gen cryM(b) dan a y l B yang sesuai

untuk. traasformasi melahi Agrabacterium tumefuciens,
4. M e n ~ f u padi
~ ihdia den=

t&&p

gen cyIA(b) dan/mu cvIB mtuk k e t d m m

hama p g g m k batang padi Iruning (3. incertulas) mdafui t n i l r

Agrobacterium turnefuciens,
5. Maganalisis kdektifan gm cryIA(b) Matau cryIB pa& padi indica &msgenik
tlfxtuk

ketahamn terhdap hama paggm& W g padi kuning (Scitpophaga

incerlulas).

Padi mmpakan makanaxx pokok bagi dua pertiga populasi penduduk dunia
Sebagai sumbex pangan u-

beras m a y d a k a n hmpir 60% Mori pada 2 a y a r

penduduk Asia dan lebih dari 30% m b e r Mori mtuk f milyard pduduk Affilcit dm

besar dam& tropis dan sub @upis, maka h a m d i t e m h teknologi wtuk m m a a
'p'oduk-si pa& agar dapat m a a h p i tambalm konsumi baas akibat -ahan

g ~ identi,

funmi gm, pagujian metabohme, mempelajari fisiologi serta

perkembangan tamman (Knight 1992 ; Walkmpach Bsn Veltea. 1994). Tmsformasi

k m q p y a p r d w -farmmi

yang s w a i ~11tuXrmonokotil.

T m f o m i g a & k dqat dhkukan metalui b&@

metode antam lain

elehoporasi (Axencibia et al. 19951, poIyefhyIene glycol ( D m et al, 19% ;Ratbore er
a/. 19931, pggunakan secat s i f h h i d e (Kaepplex ef al. 19401, penernbakm
pamkd DNA (CbristQu ef al. 1991 ;Nay& el al. 1997 ;Alam et al. 1998 ; M a q b f et

01. 1998) dm melalui pitfltam Agrobacterium (Rashid er al. 1%

;%ei el or. 1997 ;

Chenget al. 1998).

Tmsfomrasi protoplas pertam Mi d i t q k m pads tanaman padi teeapi msih
terbm pad8 kelompk japnica (Zhmg dan Wu 1988) h e n a regenerasi tamman. dari
protopla padi japuniw rdatif mudah, T&ik
traasfofmasi protoplas padi japonia ad&&

utam ymg dipergunskan pada

d&oparasi

dm plyefhyIene g&caII

S u s p s i sel embriogenik yang d i p e r w ddam isolasi protoplas dapat diperoleh

dari mbria

Eu;i

mmpun embrio muda Akm twi, be&@

t a p m menunj-

terdqat variasi p g sangat b a a eerbwdap W m s i regenemi dbtara varietasv a r i w pa& kdampok japanics, s e h g g a seleksi vari-

mmpakm WC
yaug

sangat p t i a g dab k&erWm transfomt~~i,

Regenemi tanmtman dari prutopfas pa& in&=

t
e
r
W X&ih sulit

dibdinw

Japonica. Untuk mmecahkaxl permdahan ini Ckistou ef al, (1991) melaMran
bombardment terh&p mbrio muda padi indica rnenggwkan pwtikef emas pembwa
DNA. T m m tmsgenik padi h d i a tm-bukti dwat dihasiUcan dari MIIShasil

~ s f o ~hdi ini, meanbuka p d m g pengembangan sistm transformasi padi indica.
m p a kultur protoplas. Dalam @mban@

mef*

selanjutnya, Dam ei al. (1 992) WhasiI

lmnsformasi pada protopla padi kelompok indica kultivar IR72,
Regenmsi tammm in pmtuptas b e k q a variw padi indica teM

dilaporkan. Drttta ef al. (19%) menge~bmgkmtek-nik regenerasi dsri prosoptas padi
indim Chnswah Boro dm rnen~furmasikmgm hygmmycm pkosphotmn~mse

pada protoplas yang diisolasi dari sel drmiirraspoxa dengan rnmgmdm polyethylene
glycol. Regmemi tansman dari pratoplrts IR.54 tel& ddaporkan (Peng et a/. 1992) dm

diperaleh tmaman dmgan gen neomycin phosphotmn$emse. Hal ini m e m b W m

msfumasi mengpakan pmtoplas dapat dilakuh pa& p d i indim., akm mtqi
kel&

teknik pratoph add& terbamya kebzhasifarr pa& Mtivar tertmm.
Pmggmam Agrobacferiurn mi& ~ f t m m spada
i tanamrm monokatil masih

tdtttas, akan tmpi teM tdulrti dip&

~~pada tamman padi kelompak

japanica Ecultivar Tsukinohikari, hohiEczri, Kodihikari (t-fieiet al. X994), kdompok

japonica kuxtivax Nippunbare (Cheng et a/. f 9981, kelompak javmica-Am&a kultiw
G a a n t (Dong et al. 1996) sah kefompok indica-India Icultivar Basmati (Rashid et
al. 1996).

trasfomasi pada sel tanaman tersebut ~

u

fb g a>n adanya
~ plasmid pengindubi

komponen, gaetik yang dipergumb mtuk mqinfeksi ta3laman. Kompanen paarna
adaxah T-DNA, yaihr frapm yan~;&transfer ke sel, tanaram dm terletak di plasmid Ti

dari AgroAacteritrm. Komponexl k d u a addah virulence (vir) region. Gen vir bendman

35kb terletak di plasmid Ti dm kfbagi mexljadi tujuh m2bcam yaitu vir A, vr'r B, vir C,
vir

D,vir E, vir G dm vir W. Gm-ge~vir mensintesis protein virulence yang k p w m

untuk mmginduksi terjadinya transfer T-DNA dm integrasi T-DNA ke tanaman. G m
vir berekspresi jika tmdapat inducer y m g antam lain b p a senyawa mono&&

fenolk seperti asetasyringant: dm monu&aridrt

s w i glukosa dm galaktosa.

dikutil mengalami luka dm pros= hi j m g terjadi pada monakotil. Oleh karma itu

traosfomi pada monokotif memerluhn m y e m kondisi infeksi bmpa

penambahafi senyawa fenolik, monos8c~dadm pagatwtm pH. Komponen k&ga
addah chromosumaI v i d e m e (ch), dimma gen chv terX&
Agrobacterium yang bdmgsi ddam @&taxi

di kromosom

M k d a h s d taaaman d a g m

b

mmbentulc q a w a protein 8- 1,2 @h
SaXah saeu

peating d a b Irehasitan twsformasi mefahi Agrobacerium
Sistem v e b r gmdti @hermenrpabn
)

addah s p i W i vek;tar yang rfipergun-

am yang umum d i l i b b u . Pad31 s & m vek-tar p d a &&&an

dm phimid ddm

Agrobacferium. f b d W u t a d a h p l d d vektor yang magandug fhgmen
DNA dan plasmid helper Ti ymg menydakm g a vir sebagai Mtator mfes' gm

ke d a b sd tamman (Slitmet-Lmdh 1994). Dkamping im efisimsi &msfo&
meldui Agrobc1cten'u7fp sangat dipaganh kesesuaian antam stn& Agrobacferieccm
dm-

j d mupun vari-

Wmnm ymg

ditransformsi. Varicdas ~ m m m

yang berbeda madiki respon b d d a pala terhadap strain Agobacterium yang diptlkar.

dalam proses transfomi gene&, K M a n Hi& d d (1994) mentmuforma~i
tanlwan pa& dmga A.rumefiens menunjddm kekbasilan penempan istm

txsmsfuwi A.turne$acie pada monokatif. S e a m
h y a mengmfksi tamman dikotif d-

h k b i patogen tanah ini

mmmgktroduksi T-DNA dari plasmid Ti

b&efi kc dalam inti sel t m m m (Smith dan Hood 1995).
K&dmilan Hiei er ai. (1994) d i d b g o1eh pggmm vektor super binolFi

pTOK233, tenrtam

ufltuir

Mtivar ymg lebih r&dsim. Veirtor super b

M pda

prinsipnya sama d e n w v&ur bkari., transfer T-DNA tczjmdi mexafui kerjamm 2

plasmid d i m plasmid pertama magandung gw-gen vinrlen Agrobacterium dm
plasmid kedua mengmdung T-DNA dm gen ymg diiagmkan. P ~ b d a m y aaddah.
pada vektor super b b r i gm vrr-b, vr'r-c dm vir-g juga disisiph gada v W r yang

mmgmdrmg T-DNA m a rekombimi homofo~Sistm ini Impem pen-

ddm

stwii tcansfocmasi taxulnnan padi dm b h p a tsnaman monokotil. K-ilan

tmebut didukung o l d p e n w Wus anbriogaik, pambahan inducer

a c & u ~ g o n edm kondisi pH d a h W u k mmgakt~fkan gen-gen vir dari
A.tumefuciens. V&r

t d u t disisipkan, ke daxm Agmhacrerium vkden biasa

LBA44U4. Sehh itu dipwgudzm pIGl2lHm yang disisipkm dwlam A. fumejifaciens

super vi.ruXen EHAf O 1 @heiet al. 1994,1997).
Dong el d.(1996) mmggimkm A.tarm.faeiens LBA4404 d m p pTOK233

m&kmsfonnasi padi jsvanica Inzftimr Guhont, # q i &siensinya transfumasinya

ma& sangat rendah. Remudim W

d et al. (19%) b d a d mentransfommi tan-

padi in&=-India W v a r Basmati meaggunaIt;an A.fum~ucciens EffAlOX deagm

pIGlZlMm, D
a
inm bwbagm j&s

tamman

pertam yang

pa&

tmmtm

padi mempakm species

tamm pang~g~

fd.
Metode tramfomzasi g a l a

padi semakin Imkmb8ng t

e p e n g ~ u a ntentang Wagai

pmotm ( T d a dan Shhmoto 1993).
K ~ ~ g ~ss f oo m a s genetik;
i
meldui Agrobacteriurn pa& tamman pa&

oadaIafi jumaah &an

gm ymg r&&f &&it didam laornosom

mmgmmgi

kemuflghan twganggmya fimgsi gen lam, mampu mentnmfer segmm DNA ymg

r

M b w serFa maghasillran tanaman t m ~ ~ g ndenik

1997). Dimping itu teW m f o m i m-ui

fdiitas hggi {%ei et al.
Agrobacterium retatif I&&

seddana, M a m b & q a kasus lebih efisia dan I&& &onamis &%andznglr;tnt&ik

protopla dan penabakm DNA (DeBlock 1993 ;Slam@-Ldh 2994).
Untuk m & & h

efisiml tmnsformasi mefalui Ag~bocferiurnpala

tanaman monokotil k m t m a urttuk s p i e s yang reidsitran seringkah diplukm

be&@

m~~

ddam metode msfomxasi meIalui AgruBaeterium (Smith dan

tdd& efisim bagi mfomasi mdalui AgroBae~eriumtwm@c1ciep1s pada trmamsn

Petunia hybrik dmgm g a penyefeksi 35s-Bar (Tjokrolmmo ef ~ 1 2 0 0 0 ) .

Tmmm m e r u p h organisme muIti

omis, k-msi,

AUltg

ymg kompleh dmga organ-

p e m b q p ) , b a b maman (gaotipe, bagiaxn macam,

ULXSUT

fisologi dm uhrm) swta lingkuugm tumw @H media, ironsatmi hrtra, &aya dan

f e d dai jaringan tansrman (Rueb et al. 1994). Pengembangan sistan in vfiro ymg
mantap dun.&

dmgm paelitian regmemi dan peagujh kemmpm regmemi

tanstman d a b sub kulm (IBkwkmm dm Smith 1990).

pmbmtukm organ

dari &plan, peaiben-

embrio langsung dari eHrsplan,

p n h m k a n organ mdalui MUSm-ta panbentdm embrio meldui Mus. Upaya

di m&a s&&i maupun media regmerasi untuk kdompok p d i indica Lltivar XR72,

R#, IR68899B, m 6 3 , Vaidehi, Wmti

370 dm M7. Nayak d al (1997)

m a g g m k m 50 m g l higromish pada media &&si

q dua kali

pwdi india IR64 d

sub k-ulrur masing-masing 2 m i n m twi =tibia& fiigmmisin tidak dibaikan lagi di
media regenemi.
P U a n zat pmgm m b u h yang tepa =gat
daim k & W a n

regemrasi Uam

kjultm: in vitro

h =@;at

kp@

pa& teruma bagi kelampuk

relcalsim. Datta et d (2003) mmggunalcan media regmemi N6d a m 2mgA kinetin

dan lm@ NAA pada padi indica Mtivar R72, R64,XXC68899B d m MH63. Nay&
al(1997) m m p q g m k m media MS

d-

3

m a BAP + 1

I@

el

NAA mtuk regenmi

padi indim XR64, m h g h Alam et al(1998) mmggmdm media regmemi MS + 2
mg/l kinetin

-t-

0,l mgA PJAA pada p d i n d b

(1998) menggmakan media r - 6

India kultivar Mrml-0,

- hdia Wtivar Vaidehi.

LS + 0,3 m g l BAP 4 0,smgl EAA pa& padi

akan ttapi sebagha b a r Mus resisten bigmmisln tidak

k h s i l mmhtuk: tunas bahkm kdw dido-

i-

old aka. Dalam panelibnya

Wwa media regen&

Chmhan dm Sin@ (1995)-nr

0,5 mg~lIAA

Hare&&

MS -1- 4 ml;C1 BAF +

30 gA sucrose seswi ba@ regenemi Iralus embriogd pt&

Mtivar HPU 799, MPU 242 1, W U 741, W U 22 16, b
regmerasi m e a m 922% dengm j

Indim

h @a WU741 fnkwai

d planlet per kdus aaacslpai 27,4,

Rekombinasi DNA
Rekombkasi DNA mewpalran teImik gembentukan k a m b b i banr dari materi
pembawa informasi genetik dengan carslm1-

pmyisipan moldad-rnolehl asam

nukleat yang dikerjakan d i l w wl ke ddam mah v&or dan diin~oduIcsikmke dalm

sel hang ymg baru sehingga M e m b g biak d a m sel inmg tersebut. Tek-noIagi

DNA &ombinan am rekaytts8 gm&ka p d a m y a ssd&
er al. $994 ;FreiMder f 995). G m m e m p b &en

dm m d k i kode

u11&

pros@ Honing gm (Davis

DNA yang tam dan:nuMeotida

pemhukan protein besemi sekma pgmdali berupa

promotor dm terminator. Honing gen ma-

sejdah gen darl: sumba

berbeda disatukaa dm mk&&
DNA fekombkan (Meinsmith dm f i s h 2995).
Tahapan dalam kegiatan Muning gen mdipiputi : pmyisiptm h g m a DNA yang
meffgmdmg gm target ksdaXam mo1W DNA vddm, v&or rekombinan b u k k m

keddrrm sd inang, v&ur daim sel inang dxpedmyak: siring dm@ panbel&iifl sd
hang dan s W g u s rnempdanyak gen yang &%awa, saat st4 hang mmM& dki

vektor r&ornbhm ymg ada diddamp him diturunir;zm @a g&

sd, set&&

sel

membeX& a b p banyak &an terbeamk ko1anI abu Uun dimma masing-masing sel
dalm klon, t&ut

magandung satu mu lebih ma1W DNA rekornbinan (Davis et

01, 1994; Kleinsmith d m Gsh 1995)

Kumponeax pmting daXan rekombiwi DNA adalah & a z i m

manipuki

DNA smta DNA v&or. Brawn (19%) membagi enzim manigulasi berdaswkm jenis

dm c&i

ymg dikatdisisnya mmjdi lim golongan yaitu : a) nulctase, & yang

mampu memotong m o l W

asam nuMmt, b) b g w , m z h ysng beduqsi menyatukan

moI&ul asam aukleaf, c) pofimeme, eaazim y a g menmpli&asi DNA m&m, d)
emim m d h i yang mampu men*&
e)

atau mcaamkhkrrn gugus &it,

topoisomeme, & yang mmgubah DNA tertutup m

sem

a k-ovdm menjadi DNA

supacoil. Pada kcghtan Man@ g a hmya dua jeais e u h ymg beperan yaitu m z h
xestriksi endonuklwe dm enzinl ligase.

§A& satu kompana yang diperlukm dalm dombinasi DNA addah adanya
v&or DNA, yajtu moleirul DNA yang dipdukan unh& meanbawa dm manpdmyak
f ~ a p e nDNA. DNA v&or ymg sexing dipergumkim addah piasmid b&ai yrmg

m e r t l p b m e r i gm&

ekstszl kramasam yang d i w a s i h seam t a p . Piamid y m g

&an dipeqpakan s & U vekor s e h h y a lxmkwm k d dm tdesax add& f 5 kb.
Ilkwan k d m&at
patting agar &pat memuat h j g m a DNA askg ymg bew, &an

k e c i l l W mudah Wadi c%engrmp t a ratrksi, dismping i h plasmid fmdam keci1
maghasilkan jrrmlah &inan wI&f lebih banyak daripda yang b m h m besar

(Sambrook 1989). Kmkmistik utmaa suatu plasmid v&or ddah mexniljlci origrta of
replication, adanya marker penye1eksi serta situs k£oning(Dale 1995-a).

Pada pmelitian ini dipergtmakan v&ur pCambk 1301 ( W W 2.1), X>Cambiia
I303 (-bar

2.21, pCambia 1304 (Gainbar 2.3)

dan pMog 22 (Gambar 2.4). V&or

t d u t m m i W M m p a kel&ihan antam fain memiliki multiple cioni~gside (MCS),

bersifat: stabil di Agrobacferium,dmamya mlatif k&

dm jumlah salinannya t i n e

d d m E.coli. Sifat &usus dari pCmbia adalah mgkaxmya lengkap, memiliki

pBR322 origin ofreplica#ionuxltuir replikasi dalam E.coIi daxlAgrobaeferium, rnediki

pBR322 horn sire untuk mabilisasi dari E.c& ke Agmbacteriurm, membawa gen hpr
untuk k d m t m terhdap mtibiotik higromisin, gm npfIl uakrk: k e t d m m tdadap

krmamisin, gen gersA, m t a &pat diuji dengin seleksi binr - putih karena mmbawa gm
lac2 (Brown 1996).
T-DNA vetor pCmbia mengmdung gen. nptXI, gm hpr, dan gen p A . C h

npfXI penyandi e n z h neomycipt phasphotransferase ytmg & g u n a h sebagai penydebi
pada Wwi. Enzim tersebut mendetobiWi senyawit wminoglukosida meMui

fosforilasi. Gm hpf menymdilcan azb hygramycin plaosphotran$emse yang
dipakan

pmmda mruk mmgd~ul:terintegminya T-DNA Agwbacrerium

kedaIm genom tanaman, d m g g a hanya tanaman trrtnsgak yang dapat M u p di

media tumbuh y m g mmgandung antibiutilc kigmmisin. Em hpd mum digmakm
unhlk tmmformasi gad& padr karena antibiutik higmmisin pada konsentrasi tmmtu

mampu m a e b pertumbuhan Mus padi (Chiistau et a!. 1991). Gexl

MA penyandi

V&ar pCambia 1303 dm pCmbia 1304 juga mengmdung gm gfXl (green
flourescent protein) ymg clapat d i m t i smm mudah dengixn menghasdkan p~~cxuari

flamscmt hijau pada jarinw transgaik. Gen gfp bmyak dimanfaatkm xbagai

"S pPMnMa!
LAC ZALPWA
8

I
,

Earnbar 2.4 Piasmid VekEor pMog 22
Een d p ddari jell@h

Aequora vicfnriu tehh dipergunakm OX&

Vain et d

(1998) dafam sistem transfomasi maman padi meng&un&m particle barnbarmen#

t h i embrio irnmfure.G a m
seem mudah den=

padi 12 hari

m dibawah kontxol pramator 3 5 S I C U dapat dimti

m m g h a s i h pancaran flowacent hijau p& jaingan. tanaman

- 22 hari setelah bombardw~f,&pmi

dam dim& pads g a d tanaman

gen glrp pa&

padi tmxgmk

ToBan TI (Vain et a/.1998).

Vetor p M b i a 1302 d a t e ukmw I l.837bp tab&

sesuai bagi twsfomasi

pa& baik: mdalui particle bombardment mupun Agrubacterium (Hajdukkwicz et ai,

I994 ;Hiei et al. 1994). Veldor pMug22 (10.000 bp) rnmgandung gm hpt, npf 11, @,
serta

gen ketahman tehdap hdisida bialapfios (gen Bar). Gen Bar penyaudi azim

phosphilrotkrici~~aceyItranSfeuse y m g mmonaktiflran frrbisida phosphinathricin

den-

am d l a s i . Phosphinothricin ad&

d o g glutmat yang mmghambat

glutamre sy~athetase,pe?nwbatan ini mengbdkau akumulasi

yang basifat

toksid bgi seX-seI tanaman. Pmalmian gen bar sebagai pamda didasari oI&
kenyatmn bahwa tmimrm yang mengekspwsikm g m bar addah misten terfiadap dosis
pfiospfikothricin yang tin@ (La!dm

1993).

Gat cry LA@) dan cry IB Pwysndi K&hnrin
Twhitdap Hama Paggerek Hatang

batmg mefllpdm sahh srrtu hama utErma &maman padr ymg

Pen-

b t j t a s samgmnya dai tabxxn kc tahw sand& mmngkat. Penggerek batang
merutpakan salah satu hama utma padx, di Asia ymg meog&ib&m kehilaqm

p r o d h i s e k m 5-10% (PatRwk: dm Khan 19941, -b

(Wunn er al. 19%). Tmdapt mpai species p-ek
M

tmhdszlg sampai 60-95s

b a m g pradx yetitu p g g m k

g kurring (Scipophaga incemlm), pmggmek batan8 put& (Scipuphaga

~nnofata),
pnggtrek b

g bexpis (ChiIo mpesulis) dm

kingm d ~

jambu (Sesamia infeens). Tiga jmis pertma tmgalang f k d i Pyralrdae dm ymg
k&hh tergulong fmdi N d d a e dan wmm terrnasulr ordo Lepidopta fi Indonesia

dari

s p i e s ysng ads furnyil dua yang dominm diw&yaXn produksi @I, yaim

Seiqmphaga i~lcemIw@gg&
w
g
g
e
r
e
k

b a r n padi b u n g ) dan 3. i~notafoWalker

padi putih) (Wet al. 1995 ;S W t o et al. 1995-a).

Penggwek &tang lpsldi m & m

Hala kerusakan mMui bang g&

yang

dibuat: ol& larva dmgga &pat memutudm lramport air dan unsur ham dari dm,
Kenrsrtkan yang h b u X ta&"rtung pada fase pcmmbuhm tmmm. J&a smugan
terjadi

mar fase -v

m d a daun em@ am pucuk tmmm mati karma ti&

tllmbutraya &mb,wjda ini d i d u t sundep. Jika m g a n # q a d ipada h e g~~

m k a maiai &m mati k - a r e ~pwngbhya
~~
&em oleh h a sehmgga bulk padi majadi

hampa, gejala samgan p d a tahq h i diwbut bduk (Somito er al. 1995-a).
Sampai saat hi belum dihasilh &etas

mggd y a g tatran eerhadap pmgg&

putih (Kilh ef ai. 1995) sehmh;ga p m g e y a masib meay:gmab imehisida dart

pengatwin wakhr &nam (bewit0 et al. 1995-a). Varietas domintm di Indonesia s e p 4
PB36, PM2 dm IR46 befeaksi peka tehadap pqgmek put&. Sampai saat ini sef&i

plasma nu&& pa& klm mmghasikm vaietas ymg tahan. texhadap h m a

t&adap

pmggmk batang @&tba@m 1993 ; S h t o et d. 19954). Sdah satu upaya

m e n m i sertmgan p g g &
&m t-pi

sifat k a d m m

tamman pacli mupun k&at

b
td&q

perbaikan gene& tanman W,

~ adalah
g d-

him p a g e r & b

limp s&gga

g tidak ditemukm p d a

upaya pdngbtan k e t a h m me2aJui

pemuli8atl konvmionzl2 srrlit dilaksanakan.

Pentmgam Xlama palggmek bamg sampai saat I'ni wih tergantung pa&
p a g g m m pmtisi& T&ik penyisipm gen ashg untuk tujuan pembmh krettxhanan

twhadap hama &I& dikembmgkm pada beberap lruxtivtif pad^ Indonesia, d a b wu

gm ketahmm yzmg Masif disisipkan ke kultivar RajdeIe addah cryIACt,) p q m d i
kmhmm t d a d q ham dari golongan lepidoptera meIalui bombarlmenf (Slam&-

Lmdh et al. 1998). Ekspmi gen ymg diiwlasi dari B. tkuriptgiemis ini prada Mtim
M 8 dm Basmati d a p m
&-

ketahanan tahdap pmggerek batang kming

dm b w m (Wunn et al. 1996 ;Nayak et aI, 1997). Wunn et al. (1996) meXaporlrPm
hasil bmsfarmasi gca cyIA@) ke tElxlztman par3x dm bngk& kmatim tawam padt
ymg d i m hama pmggerek ba~ang&pat d i t h smpai 100%

Gen cr), addah penyandi protein &if anti m g g a yang diisolasi dari BaciIIm
fhringienis, y&tu b&&

ymg rnmghadm smtu kristal pratein yang b f a t mun

jika tahidrolisis ddam jafin&an usus s
m
n
m (Meyser d al. 2 99U). Gm cry dam

dikfasifikasikan b e d a s a h protein y q disandikan dan spesifitasnya t d a d a p
sawflgga yaitu cry 1, cr)i 11, cry $11, cry N,cry V dm cr)l VI. Protein yang disluxdikan

ofeh gen crf mifat m m tPhadap m g g a orda Lepidoptm, Diptm dm Coleoptaa

(Tommiessen 1991) akan tetapi &vita

bioinsektkida Bf ti&

hamoptma ( h a et al. 1928). G a cry I men-

lepidoptm &

~

a

uunrm basmy8 gm cry I

toksid terfidap ordo

protein yrmg speciiik mtuk

terbagi am enm Mas yairu cry

cry IA(c), c v B,c y ZC,dm cry D.P

XA(a), cry I*),
memberi,

B gmD cry cuZcup

~

harapan karena eadotaksin yang d i s a n d b cry tidak: Mfat racun bagi

hewan dm manusia swta ti& m e n d linglcuqm (Brotanetjoxo 1995).

Piramida gen resisten merupkm mtu metode mtuk mmgkornbkdm 2 g a
k e t a h m atau 18bih kcd&am satu maman, Pimmkh gm ymg d @ e q y d m
p d d k a n ketahman varktas dit:dW&m seem kanvemiomI (Soewita et a1.1995-b)

karma pm€mWvarietas mddui piramids gen W g magalami hurim d d m

penwjim, disamging itu gm-gm minor y m g tPkandung pada VW
W
it donor ti&
&-

diwaiskm. Untuk: mm@&ui seam cqat dm mudah

gm-ga

minor maka pmggwim gen pamda dagat m a W (Soewito et a&.1995-a).
Berger (2003) mend&sikm

"'piramida

m s g d ' sebagsi. inbroduksi stabil

l&& dmi mu gen yang bergtau k d h gmom suatu tamman meZslui trmfurmsi.
s&atcgi ma& piramida ttansgen telah dilakmdm sqxrti p d & m

dua atau iebih marker sdeksi, yang m&puti : 1) k

m~~

o

l

~

S deargan
f ~ ~

lebih dari satu marker, yang dilakuhn meldui introduksi setma simulm dw
konstdisi T-DNA yang b&da dm &ap konstnksi membawa satu marker seleksi
babe&. ~

kb&

~

t

~dilakdm
f odengm
~ : a)
i mencampw dua Agr~kten'urnyang

dan sdap Agrobacterium m m b m suatu v&or b i n q ymg W a , b)

karnbinasi dari dm T-DNA datam satu plasmid tun@

ddam satu Agrobacterium, c)

d a q p satu Apbacterium y a q memb#wa dm plasmid kaqetcxt d m &ap

phmid

den@ T-DNA bwbada ( K a m ef al. 1996 ; Wey et al. 1998). Ko-trmsformasi
dagan dm Agrobacterium p g babe& treFhaS ditakukan pakt kentag Sel&si
dilddan

b d a p dengan pmakaian mtibiotik pada media regmemi,

~

kemuditm d&si kdua pafa media p a k a m mtuk mmdapatb b.aasforman yang

rnmgmdung kedua maker. 2 ) "Sup& msformztsi, y&tu trmfomasi menggwalran
satu gen marker ymg t d a i t pada dua
wtuk &pmi tram=

( m i d A dm B), m f o m disel&i

p g d i i n g h h . Jika p i u g a tambahan ( m i d C dm D)

diIak&m introduXssi kmbali mengpmksm marker pmyeleksi yang berbeda sehmgga
prduk akhir magandung empat m g m dm dm jenis markererMaode ini td&
ditemph bagi pmhgkrtran M h s kentang tmsg&.
drui

saru makes penyeleksi

Keunlmgm pgguutian M
i
f
i

addah mgat fleksibef karena bebaapa kombinasi g a

yang b W a dap& &campur dan dhmaikm Bsampirag itu beberap has2 penehtian

menmjukkm sediIdtnya tiga marker deirsi ( ~ l p f I I bar,
,
hyg) Wmja M k @a tamman
kentang K e r u g b pendekatm ini adalah behim dmgan Irebadam d t n y a dust
gen h e r pads praduk akhk y a g m & b

msdah d a b biosafety (Ddey et

al. 1998).

Metode ko-tmsfommi memwluh dua T-DNA M k d a ymg dimmfer

setma simultan padzt & yang m m , &mgp A hmrnrs ~ o m p e t i s si e h r e g a m i

dan seleksi, Dalam hai ini dapzd d q m h k m bahwa j b frehensi transform& untuIr
T-DNA tunggal addah 10% (I ddam lo), maka kkwensi ko-transformasi menjadi

lO%xlUYel%

(1 d a m IUU). Dapat diar&n

bahwa k

o - ~ f pada
~ kuftivar
i

tsnaman ymg retcdsitrm menjadi sangat d t . Paggmam lebih dari, ~0thmarker gm

sering m~~

htegrasi T-DNA d i k i t n y a pada dua sisi b a k d a dakn

homosom, h d ini menjadi masdab bagi pemulia ymg ingin rnmggumkamya % b a a
t-a

pada pmufim bahexlya. Kan-

majadi b e r h m g , s&gga

insersi kapi tmg@ map T-DNA

diperlukan delrsi mtuk mmdapatlm s&w sifat yang

d i i n g m h ymg tidak mm@batkm

gm silensing. Hal ini didabkm &pmi

tcansgen dari satu T-DNA dapt men@ibatkan sifasing terfiadap gen yang m

a dari T-

Analisis Tammorn Tramgmik
Tujuan utama &am proses tmwformasi gene& adalah me~ldqatkan & p s i

dari gen-gen ~ i n gymg diintroduksikan ke dalam sel atau jarinm tmmaa

Proses m f e p gen dalm mmm ti&

majamin bahwa gen askg yang

diintroduksikm nantinyzi akm selafu diekpresib. Oleh karena itu rfipwX.ub
a d i s i s untuk m e n w t h n keberadann gen yang t&h ~ o d u k kes ~

serantanman.

Anatisis tanaman trmsgenik dab proses &ansfdilaErukan pada k b g i

gm& Eanamrrn dapat

~~ yaitu : 1) introduksi gm, 2 ) tmdxipsi, 3) translasi,

serta 4) pmgujiau efefitas protein yaug d h d k a n . Dewasit ini Mah d i k d babagai
&&t

analisis tamman. t r m s g d seperti : uji histakimia P-gIumronicEase (uji Gus),

analisis po&merasc chain reucfim (PCR), andisis Southem Blot, Natfim, W w n ,
Elysa dlf. Untuk gen ketahanan terhsdap m g g a , pgujian e f M t a s protein ymg

&hasilkan tdadap m g g a target dapi dilakdm mefafui uji hayati, uji pairan, dsb.
G Uji GUS

Uji histokimitt P-gl'ucurotlzdase (uji Gus) drtpat d i l h k m pada t&ap awal
segm setel& ko-Xcurtivasi mupun. Weiah gen terintegrasi cfengan stabiI di hrnasam.

Wanna bint ymg muncul @a