Sedang tanaman yang tidak menunjukkan gejala, diambil pada umur 4 minggu setelah tanam pada akhir pengamatan. Daun padi diambil dan ditimbang
sebanyak 0,3 g, diberi nitrogen cair untuk mengawetkan daun tersebut, kemudian disimpan pada -80
o
C sampai daun tersebut diekstraksi.
a. Ekstraksi DNA Total
Ekstrak DNA RTBV disiapkan dari daun masing-masing varietas uji yang berdasarkan pengamatan secara visual tidak bergejala, selain itu daun yang
bergejala juga diambil sebagai pembanding. Ekstraksi DNA RTBV ini menggunakan metode yang dimodifikasi dari Smith et al. 1992. Sebanyak 0,3 g
daun padi varietas uji yang ditambahkan nitrogen cair digerus dengan mortar dan pistil sampai terbentuk bubuk. Bubuk daun tersebut kemudian dimasukkan ke
dalam tabung mikro 2 ml dan ditambah 1 ml bufer ekstrak yang mengandung 50 mgml polyvinilpyrrolidone PVP dan 60 µl 10 sodium dedocyl sulfate SDS
ditambah 10 µl mercapto ethanol. Kemudian tabung tersebut divorteks sampai campuran homogen lalu dimasukkan ke dalam penangas air dengan suhu 65
o
C selama 30 menit setelah itu didinginkan sampai dengan suhu ruang lalu
ditambahkan 5 µl enzim RNase 1 mgml untuk mendegradasi RNA kemudian diinkubasikan pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Selanjutnya campuran tersebut ditambahkan 750 µl chloroform : isoamyl alcohol 24 : 1 lalu tabung yang berisi
ekstraktan divorteks dan disentrifugasi pada 11.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Supernatan ditambah 1 ml chloroform kemudian divorteks dan
disentrifugasi pada 11.000 rpm pada suhu 4
o
C. Supernatan ditambah 1 ml isopropanol
dingin kemudian dihomogenkan dengan cara membolakbalikkan tabung beberapa kali lalu diinkubasi pada suhu -20
o
C selama 30 menit dan disentrifugasi pada 11.000 rpm pada suhu 4
o
C selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan 200 µl TE pH 8,0 10 mM Tris Cl. pH 8,0 dan 1 mM EDTA
pH 8,0, dihomogenkan dengan cara membalikkan tabung beberapa kali kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama satu jam. Pelet ditambah 110 volume natrium asetat 3 M, pH 5,2 dan 2,5 x volume ethanol absolute dingin
dihomogenkan dengan cara membalikkan tabung beberapa kali lalu diinkubasi pada suhu -20
o
C selama 30 menit dan disentrifugasi pada 14.000 rpm pada suhu
4
o
C selama 10 menit. Cairan dibuang kemudian pelet dicuci dengan 500 µl ethanol
75 dingin, dikeringkan dan diresuspensi dengan 100 µl bufer TE kemudian disimpan pada suhu -20
o
C sampai digunakan pada metode selanjutnya.
b. Amplifikasi Gen Protein Selubung RTBV
