Penapisan Bakteri Kitinolitik dari Sumber Air Panas Penen, Kecamatan Sibiru-biru, Kabupaten Deli Serdang dan Karakterisasi Kitinasenya

Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian
Isolasi bakteri kitinolitik
dari Sumber Air Panas
Penen
Pengukuran Indeks kitinolitik
Penentuan Isolat Terpilih

Penentuan Waktu Produksi
Enzim Kitinase Sampai hari
ke-8

Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase
dan Perhitungan Kadar Protein pada
Produksi Enzim Kitinase Hari ke-4

Presipitasi Enzim Kitinase
pada Beberapa Konsentrasi
Amonium Sulfat

Presipitasi Enzim Kitinase pada
Konsentrasi 50% Amonium Sulfat

(Pengukuran Aktivitas Enzim Kitinase
dan Perhitungan Kadar Protein)

Dialisis

Penentuan suhu dan
pH optimum

Penentuan nilai Km
dan Vmaks

Identifikasi Isolat Terpilih
berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA

Lampiran 2. Kurva Standard N-Acetyl-D-Glukosamin (GlcNAc)
GLcNAc
(µgram)
0
10
20

30
40

Absorbansi
0,6615
0,5685
0,5130
0,4590
0,3650
0,7
0,6

Absorbansi

0,5
y = -0,007x + 0,6539
R² = 0,988

0,4
0,3

0,2
0,1
0
0

10

20

30

konsentrasi GlCNAc

40

50

Lampiran 3. Kurva Standar Bovine Serum Albumin (BSA)

Abs terkoreksi

0
20
40
60
0
100

0
0.1355
0.2065
0.302
0.376
0.4465

Absorbansi

BSA
(µgram)

0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0

y = 0,0044x + 0,0266
R² = 0,9877

0

20

40

60

Konsentrasi BSA

80

100

Lampiran 4. Pembuatan Larutan Schales

Potasium Ferisianida

0,25

g

Na2CO3

26,4975 g

Dilarutkan dalam 500 ml akuades

Distirer

Dituang ke dalam botol kaca

Disimpan dalam kulkas

Lampiran 5. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997)
Substrat

Sampel Kontrol

Koloidal Kitin 0,3 %

300 l

300 l

Penyangga fosfat 50

200 l

200 l

100 l

0 l

mM
Enzim

Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit
Keterangan

Kontrol

Enzim yang setelah dipanaskan selama 10

100 l

menit

Dididihkan 10 menit
Disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit
Substrat

Sampel Kontrol

Blanko

Campuran enzim diambil

300 l

300 l

-

Akuades

700 l

700 l

1000 l

Schales

1000 l

1000 l

1000 l

Vortex
Dididihkan pada suhu 100 ᴼC selama 10 menit
Didinginkan
Diukur

= 420 nm

Hasil

Rumus :


Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel – konsentrasi blanko) – (Konsentrasi kontrol
– konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1 : menit X 1 :
BM kitinase.





Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (mL)
Total protein : protein (mg/mL) x volume enzim (mL)
Aktivitas spesifik
Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL)
Total protein (mg/mL)
Hasil % = Total aktivitas n
Total aktivitas 0

X 100

Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n
Aktivitas spesifik 0

Lampiran 6. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976).

Pereaksi
Akuades
Enzim
Reagen Bradford

Blanko (ml)
0,5
0
0,75

Divorteks

Campuran diukur pada

5λ5 nm

Sampel (ml)
0
0,5
0,75

Lampiran 7. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford

A. Larutan Stock Bradford
Comassie Blue G-250
Etanol 95%
H3Po4 88%
Distirer
Disaring dengan kertas saring

B. Pembuatan Reagen Bradford
425 ml akuades
15 ml 95% Etanol
35 ml 88% fosfat
30 ml larutan Stock
Distirer
Disaring dengan kertas saring
Dimasukkan dalam Botol Kaca
Disimpan dalam kulkas

70 mg
20 ml
40 ml

Lampiran 8. Perhitungan Parameter Km dan Vmaks
0,07
y = 0,0045x + 0,014
R² = 0,9769

0,06
0,05

1/ V

0,04
0,03
0,02
0,01
0
0

5

10

1/s

PERSAMAAN LINEAWER-BURK=
1/Vmaks=
Vmaks =
Km/Vmaks =
Km=
kemiringan=
1/= 0, 1/v
1/Km=
(-)1/Km, 1/v=0

0.0045X + 0.014
0.014
71.4286
0.0045
0.3214
0.0045
0, 0.0045
3.1
(-)0.321,0

15

Lampiran 9. Data Hasil Sequencing Identifikasi Isolat JP2 dengan Menggunakan Gen
Penyandi 16S rRNA

GGGGGCAAGGGGCTGCTCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGG
TAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATG
CTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTTCA
AGATGGACCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCG
ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG
CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTC
TGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTT
GTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAAC
CAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAA
GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGA
TGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAG
TGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTG
GAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGC
GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACG
ATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTA
AGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG
GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACC
TTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGG
GCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCA
CTCTAAGGTGACTGCCCGGTGACAAACCCGAAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAA
ATCATCATGGCCCCTTATGACCTGGGGCTACCCACCGGGTACAATGGGCAGAAC
AAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGCTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTC
GGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAT
CAGCATGCGGGGGGGGGT