Uji Sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah (piper crocatum ruiz dan pav) terhadap kultur sel raji - USD Repository

  UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Erlin Frandita NIM : 058114026 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2009

  UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi Oleh : Erlin Frandita NIM : 058114026 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2009

HALAMAN PERSEMBAHAN

  Aku ingin mendaki puncak tantangan, menerjang batu granit kesulitan, menggoda mara bahaya, dan memecahkan misteri dengan sains.

  Aku ingin menghirup berupa - rupa pengalaman lalu terjun bebas menyelami labirin liku-liku hidup yang ujungnya tak dapat disangka.

  Aku mendamba kehidupan dengan kemungkinan-kemungkinan yang bereaksi satu sama lain seperti benturan molekul uranium: meletup tak terduga-duga, menyerap, mengikat, mengganda, berkembang, terurai dan berpencar ke arah yang mengejutkan.

  (Andrea Hirata) Skripsi ini kupersembahkan untuk : Bapak, Ibu & Eyang tercinta Adik-adikku tersayang Saudara, teman-teman & almamaterku.

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

  Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma: Nama : Erlin Frandita Nomor Mahasiswa : 058114026

  Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

  

UJI SITOTOKSISITAS FRAKSI ETANOL

DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL RAJI

  Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

  Dibuat di Yogyakarta. Pada Tanggal: 23 Agustus 2009 Yang menyatakan, (Erlin Frandita)

  

PRAKATA

  Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala berkat dan kasihNya yang tiada henti mengalir sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang berjudul “Uji Sitotoksisitas

  

Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap

Kultur Sel Raji.” Skripsi ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat

  untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm).

  Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis telah mendapatkan bantuan, bimbingan serta dorongan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, melalui kesempatan kali ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. drh. Renny Kusumastuti, M. P. selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan banyak pengarahan dan bimbingan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

  2. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan saran dan kritik yang membangun bagi penulis.

  3. Rita Suhadi, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  4. Ibu Tri Yuliani, Ibu Haryati, Mas Anief dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

  5. Sinta, Rini, dan Presti terimakasih untuk kerjasama, kesabaran serta bantuannya selama penelitian.

  6. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini.

  Penulis menyadari bahwa dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak demi kesempurnaan karya ini di masa yang akan datang. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, 12 Agustus 2009 Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 12 Agustus 2009 Penulis

  Erlin Frandita

  

INTISARI

Kanker merupakan salah satu penyakit yang dapat menyebabkan kematian.

  Saat ini penggunaan tanaman sebagai bahan alternatif pengobatan kanker sedang digalakkan. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) adalah salah satu tanaman obat potensial yang secara empiris digunakan sebagai antikanker. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi efek sitotoksik dan nilai LC

  50 fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan mengikuti rancangan acak lengkap pola searah. Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel Raji dengan fraksi etanol daun sirih merah dengan kadar 150; 175; 200; 225; 250; 275; dan 300 µg/ml. Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah dilakukan dengan metode Direct

  

Counting. Persentase kematian sel dinyatakan sebagai hasil perhitungan. Analisis

  akhir dilakukan dengan perhitungan nilai LC (

  50

  μg/mL) menggunakan analisis probit. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai LC fraksi etanol daun sirih

  50 merah terhadap sel Raji sebesar 174,16 µg/ml.

  Kata kunci : sitotoksisitas, fraksi etanol, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC , sel

  50 Raji

  

ABSTRACT

  Cancer is one of diseases that can cause death. Currently, the use of plant as alternative medication of cancer medication is being emboldened. Celebes pepper (Piper crocatum Ruiz & Pav) is one of potential medicinal plants that is used as an empirical anticancer. The objective of this research was to identify the cytotoxicity potential and the LC of ethanol fraction of celebes pepper leaves

  50 against Raji cell Culture.

  This research was experimental research with following complete random of unidirectional pattern. Cytotoxicity test had been done by giving treatment to Raji cell with the ethanol fraction of celebes pepper leaves with level 150, 175, 200, 225, 250, 275, and 300 µg/ml. Ethanol fraction cytotoxicity test of celebes pepper leaves had been done by direct counting method. A percentage of cell death was stated as a result of the calculation. The end of analysis had been done by accounting the value of LC (

  50 μg/mL) using probit analysis. Based on the

  result, there was obtained that the value of LC ethanol faction of celebes pepper

  50 leaves toward Raji cell was 174.16 µg/ml.

  Keywords: Cytotocity, ethanol fraction, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC50, Raji cell

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN SAMPUL...........................................................................…. i HALAMAN JUDUL.................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................... .. iii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................ ... iv HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. v PRAKATA.................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..................................................... viii

  INTISARI...............................................................................................…. ix

  

ABSTRACT ............................................................................................….. x

  DAFTAR ISI.........................................................................................….. xi DAFTAR TABEL.................................................................................….. xv DAFTAR GAMBAR................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN............................................................................... xviii BAB I PENGANTAR.................................................................................

  1 A. Latar Belakang...............................................................................

  1 1. Permasalahan............................................................................

  2 2. Keaslian penelitian....................................................................

  2 3. Manfaat penelitian.....................................................................

  3 B. Tujuan Penelitian…………………………………………………

  3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………..

  4

  1. Keterangan botani.....................................................................

  11 BAB III METODOLOGI PENELITIAN................................................…

  15 1. Determinasi tanaman................................................................

  14 D. Tata Cara Penelitian.......................................................................

  13 2. Bahan........................................................................................

  13 1. Alat...........................................................................................

  13 C. Alat dan Bahan...............................................................................

  12 2. Definisi operasional..................................................................

  12 1. Variabel....................................................................................

  12 B. Variabel dan Definisi Operasional.................................................

  12 A. Jenis dan Rancangan Penelitian...............................................…..

  10 I. Hipotesis…………………………………………………………

  4 2. Deskripsi tanaman.....................................................................

  9 H. Landasan Teori……………………………………………………

  9 G. Metode Direct Counting.....………………………………………

  8 F. Metode MTT...................................................................................

  7 E. Uji Sitotoksisitas.............................................................................

  7 D. Sel Raji...........................................................................................

  6 C. Kanker............................................................................................

  6 B. Metode Fraksinasi.....…..…………...............................................

  4 4. Khasiat dan penggunaan...........................................................

  4 3. Kandungan kimia......................................................................

  15

  3. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah................................

  15 a. Pembuatan serbuk simplisia.............................................

  15 b. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah.......................

  16 4. Preparasi sel raji........................................................................

  16 a. Propagasi sel raji ............................................................

  16 b. Pemanenan sel raji...........................................................

  17 5. Pembuatan larutan uji ..............................................................

  17 6. Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah.......................

  17 a. Metode MTT....................................................................

  18 b. Metode direct counting....................................................

  18 7. Analisis hasil............................................................................

  18 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................

  20 A. Determinasi Tanaman...................................................................

  20 B. Pengumpulan Daun Sirih Merah ..................................................

  20 C. Pembuatan Fraksi Etanol Daun Sirih Merah................................

  20 D. Preparasi Kultur Sel Raji..............................................................

  25 E. Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah......................

  27 a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT.....................................

  27

  b. Uji sitotoksisitas dengan metode perhitungan langsung (direct counting) ........................................................................

  31 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................

  42 A. Kesimpulan………………………………………….. ...………..

  42

  DAFTAR PUSTAKA…………………………………………….……….

  43 BIOGRAFI PENULIS………………………………………………….…

  67

  

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil pengamatan profil KLT fraksi etanol daun sirih merah …...

  24 Tabel II. Tabel nilai absorbansi fraksi etanol daun sirih merah.....................

  29 Tabel III. Hasil perhitungan masing-masing konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji dengan metode perhitungan langsung (Direct Counting).............................................................

  34 Tabel IV. Hasil perhitungan masing-masing konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Vero dengan metode perhitungan langsung (Direct Counting)............................................................

  34 Tabel V. Data % kematian sel Raji dan harga probit setelah pemberian fraksi etanol daun sirih merah..........................................................

  36 Tabel VI. Data % kematian sel Vero dan harga probit setelah pemberian fraksi etanol daun sirih merah..........................................................

  36

  

DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Reaksi Pembentukan Formazan...................................................…

  28 Gambar 2. Kurva Antara Konsentrsi Fraksi Etanol Daun Sirih Merah terhadap Hasil Perhitungan % Kematian Sel ..................................

  29 Gambar 3. Hasil pengamatan perbedaan warna sel yang hidup (a) dan sel yang mati (b) setelah pemberian trypan blue pada haemocytomoter di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x ....

  33 Gambar 4. Kurva Konsentrasi Fraksi Etanol Daun Sirih Merah terhadap % Kematian Sel Vero.......................................................

  36 Gambar 5. Kurva Konsentrasi Fraksi Etanol Daun Sirih Merah terhadap % Kematian Sel Vero.......................................................

  37 Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap harga probit pada sel Raji................................................

  37 Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah terhadap harga probit pada sel Vero................................................

  38 Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) ……………

  47 Gambar 9. Perkolator................……………………………………………….

  47 Gambar 10. Vacumm Rotary Evaporator....…………………………………..

  47 Gambar 11. Laminar Air Flow .........................................…………………....

  48 Gambar 12. Inverted Microscope.....................……………………………….

  48 Gambar 13. 96 well Plate, tabung conical steril dan flask ....………………...

  48

  Gambar 15. Incubator CO

  57 Gambar 24. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 700 µg/ml ..………….....

  58 Gambar 31. Pengamatan sel Vero pada kontrol ..........................…………......

  58 Gambar 30. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 100 µg/ml ..………….....

  58 Gambar 29. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 200 µg/ml ..………….....

  58 Gambar 28. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 300 µg/ml ..………….....

  58 Gambar 27. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 400 µg/ml ..………….....

  58 Gambar 26. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 500 µg/ml ..………….....

  58 Gambar 25. Pengamatan sel Vero pada konsentrasi 600 µg/ml ..………….....

  57 Gambar 23. Pengamatan sel Raji pada kontrol ..........................…………......

  2 ...............................................................................

  57 Gambar 22. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 150 µg/ml ..…………......

  57 Gambar 21. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 175 µg/ml ..…………......

  57 Gambar 20. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 200 µg/ml ..…………......

  57 Gambar 19. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 225 µg/ml ..…………......

  57 Gambar 18. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 250 µg/ml ..…………......

  57 Gambar 17. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 275 µg/ml ..…………......

  49 Gambar 16. Pengamatan sel Raji pada konsentrasi 300 µg/ml ..…………......

  58

  

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman.........................................................

  46 Lampiran 2. Bahan dan Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian..............

  47 Lampiran 3. Hasil Uji KLT Fraksi Etanol Daun Sirih Merah ……………..

  50 Lampiran 4. Hasil Pengamatan Sel Raji dengan Mikroskop dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Fraksi Etanol Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam ……………………….

  57 Lampiran 5. Hasil Pengamatan Sel Vero dengan Mikroskop dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Fraksi Etanol Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam ………………………

  58 Lampiran 6. Perhitungan LC

  50 Fraksi Etanol Daun Sirih Merah terhadap Sel Raji Dan Sel Vero Menggunakan Analisis Probit ………….

  59 Lampiran 7. Tabel Probit ……………………………………………………

  63 Lampiran 8. Hasil Uji Signifikansi Antara Perlakuan dengan Kontrol Menggunakan Z-test……....……………………………..……..

  64 Lampiran 9. Perhitungan % Kematian dan Harga Probit Sel Raji Menggunakan Metode MTT……....………………….......... …..

  66

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Kanker merupakan salah satu penyakit yang berpotensi menyebabkan kematian. Di Amerika Serikat kanker merupakan penyebab kematian nomor dua. Pada tahun 2003 diperkirakan ada 1.334.100 kasus dengan angka kematian

  sebanyak 556.500 orang. Menurut Dr. dr. Soehartati Gondhowiardjo, di Indonesia setiap tahun diperkirakan terdapat 190 ribu penderita baru dan seperlimanya akan meninggal akibat penyakit tersebut (Anonim, 2009c).

  Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya. Sel kanker mempunyai ciri khusus pada fenotipnya, yang disebabkan adanya mutasi pada genotipnya, yaitu mampu mencukupi kebutuhan sinyal pertumbuhannya sendiri, tidak sensitif terhadap sinyal antiproliferatif, memiliki potensi tak terbatas untuk replikasi, mampu menginduksi angiogenesis serta mampu menginvasi jaringan di sekitarnya (Hanahan & Weinberg, 2000).

  Saat ini penggunaan tanaman sebagai bahan alternatif pengobatan sedang digalakkan. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) adalah salah satu tanaman obat potensial yang sejak lama telah diketahui memiliki berbagai khasiat obat seperti antioksidan, antidiabetik, antikanker, antiseptik, dan antiinflamasi. Senyawa fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah telah diketahui meliputi flavonoid, alkaloid, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

  Berdasarkan penelitian Kusumaningtyas (2008), ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terbukti memiliki efek sitotoksik yang besar terhadap sel Raji. Yang dimaksud ekstrak etanol dun sirih merah dalam penelitian tersebut ialah hasil maserasi daun sirih merah dengan penyari etanol 70%. Untuk itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kemampuan senyawa-senyawa sitotoksik tersebut dalam membunuh sel kanker yakni, dengan menguji efek sitotoksik fraksi etanol daun sirih merah terhadap sel Raji. Fraksi etanol daun sirih merah dalam penelitian ini adalah hasil perkolasi daun sirih merah dengan pelarut etanol yang telah dipisahkan terlebih dahulu senyawa non- polarnya menggunakan pelarut heksana. Dengan dilakukannya pemisahan terhadap senyawa non-polar diharapkan fraksi etanol daun sirih merah dapat memberikan efek sitotoksik yang lebih besar dibandingkan ekstrak etanol daun sirih merah dilihat dari besarnya nilai LC yang diperoleh.

  50

  1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang di atas maka muncul permasalahan:

  a. Apakah fraksi etanol daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji? b. Berapa harga LC dari fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji?

  50

  2. Keaslian penelitian

  Sejauh pengetahuan penulis sampai saat ini belum pernah dilakukan uji

3. Manfaat penelitian

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai efek sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat digunakan untuk menambah bukti- bukti ilmiah penggunaan fraksi etanol daun sirih merah sebagai obat alternatif antikanker baik bagi praktisi maupun bagi masyarakat luas.

B. Tujuan Penelitian

  1. Tujuan umum

  Tujuan umum dari penelitian uji sitotoksik fraksi etanol daun sirih merah terhadap sel Raji ini adalah untuk membuktikan efek sitotoksik fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  2. Tujuan khusus

  Tujuan khusus dari penelitian uji sitotoksik fraksi etanol daun sirih merah terhadap sel Raji ini adalah untuk mengetahui kebenaran khasiat daun sirih merah sebagai antikanker terhadap sel Raji.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah

  1. Keterangan botani

  Berdasarkan hasil klasifikasi ilmiah, tanaman sirih merah termasuk dalam kingdom Plantae, subkingdom Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh), super divisi Spermatophyta (menghasilkan biji), divisi Magnoliophyta (tumbuhan berbunga), kelas Magnoliopsida (berkeping dua/dikotil), subkelas Magnoliidae, dan ordo Piperales (Anonim, 2009b). Tanaman sirih merah juga masuk ke dalam famili Piperaceae dan genus Piper, memiliki nama spesies Piper crocatum Ruiz & Pav, serta sinonim dengan Piper ornatum N.E.Br (Anonim, 2008a).

  2. Deskripsi tanaman

  Tanaman sirih merah tumbuh menjalar dengan batang bulat berwarna hijau keunguan. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15 sampai dengan 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu – abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit dan beraroma wangi khas sirih (Sudewo, 2005).

  3. Kandungan kimia

  Dari hasil penelitian berupa uji tabung dan uji kromatografi lapis tipis diketahui daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, tanin, dan a. Flavonoid Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol umumnya terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon (Harborne, 1987). Aktivitas flavonoid dalam sistem biologis antara lain sebagai antioksidan, antivirus, antihistamin, antihipertensi, dan bakterisida. Beberapa senyawa flavonoid dapat menghambat monoamin oksidase (MAO), protein kinase, DNA polimerase, hipoksigenase serta terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker (Robinson, 1995; Grotewold, 2006).

  b. Alkaloid Istilah alkaloid mencakup senyawa bersifat basa mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya dalam gabungan, sebagai bagian dari sistem heterosiklik (Harborne, 1987). Alkaloid sebagai golongan dibedakan dari komponen tumbuhan lain berdasarkan sifat basanya (kation). Senyawa ini terdapat dalam tumbuhan sebagai garam berbagai asam organik dan asam organik (Robinson, 1995).

  Beberapa alkaloid diketahui memiliki aktivitas antikanker melalui interaksi dengan RNA polimerase dan DNA topoisomerase (Sukardiman, 2003).

  Senyawa alkaloid seperti vinkristina dan vinblastina dapat menghambat RNA polimerase, vinblastina berperan dalam penghambatan pembelahan sel, yaitu pada tahap metafase (Roberts, 1998).

  c. Minyak atsiri Minyak atsiri terdiri dari molekul-molekul hidrokarbon yang terdiri dari sehingga ekstraksinya pun juga dilakukan dengan pelarut nonpolar (Houghton & Raman, 1998). Minyak atsiri berperan pada daya tariknya untuk serangga penyerbuk serta hewan penyebar biji. Selain itu, senyawa ini juga bertindak sebagai antibiotika, hormon luka, dan perangsang perkecambahan biji (Robinson, 1995).

4. Khasiat dan kegunaan

  Secara empiris ekstrak daun sirih merah pada pemakaian tunggal atau dikombinasikan dengan tanaman obat lainnya mampu mengobati penyakit seperti diabetes melitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia, TBC, radang pada lever, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).

B. Metode Fraksinasi

  Suatu komponen dalam campuran seperti ekstrak dari organisme hidup dapat dipisahkan dalam suatu kelompok senyawa berdasarkan persamaan karakteristik fisikokimia. Proses ini disebut fraksinasi yang dapat dilakukan dengan berbagai cara. Pengelompokan senyawa dilakukan berdasarkan kelarutan, ukuran, bentuk, perbedaan elektrikal dan beberapa hal lain asalkan fraksi hasil kriteria berbeda tidak digabungkan menjadi satu (Houghton & Raman, 1998).

  Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip perkolasi adalah serbuk simplisia ditempatkan dalam bejana silinder yang bagian bawahnya tersebut. Cairan penyari akan melarutkan zat aktif ke bawah yang disebabkan oleh beberapa faktor seperti gaya berat, kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, adesi, daya kapiler, dan daya geseran (Anonim, 1986).

C. Kanker

  Kanker adalah suatu penyakit di mana terjadi pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat, dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah diri bila tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel-sel yang rusak atau mati. Sebaliknya, sel kanker akan membelah diri meskipun tidak dibutuhkan sehingga terjadi kelebihan sel-sel baru (Dalimartha, 2006).

  Kanker timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi. Mutasi gen dapat menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dan membiarkan sel-sel tersebut tidak terkendali perkembangannnya (Macdonald & Ford, 1997). Sejalan dengan pertumbuhannya, sel kanker membentuk suatu massa dari jaringan ganas menyusup ke jaringan di dekatnya, menyebar ke seluruh tubuh dan mengakibatkan terjadinya perubahan genetik (Sherr, 1996).

D. Sel Raji

  Sel Raji merupakan continous cell line dari sel limfoblastoid yang diperoleh dari penyakit Limfoma Burkitt’s (Anonim, 2008d). Penyakit ini disebabkan virus Epstein Barr, yaitu virus DNA yang menimbulkan ploriferasi meningkatkan proliferasi karena DNA yang rusak tetap mengalami pembelahan secara berkelanjutan (King, 2000). Protein 53 (p53) merupakan tumor suppresor protein yang berperan sebagai faktor pengendali pertumbuhan sel terutama pada siklus pembelahan sel dan apoptosis, yaitu pemeliharaan replikasi DNA dan merusak sel yang memiliki urutan nukleotida yang abnormal (Anonim, 2009d). Bentuk morfologi dari sel Raji berupa sel tunggal berbentuk lingkaran yang terkadang dalam bentuk berkelompok. Sel Raji memiliki sifat tidak melekat pada dinding atau dasar sumuran namun melayang di dalam cairan media (Anonim, 2008c).

E. Uji Sitotoksisitas

  Uji sitotoksisitas merupakan uji toksisitas secara in vitro pada suatu kultur sel. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan untuk mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia (Doyle and Griffiths, 2000). Metode in vitro mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan metode in vivo, yakni lebih ekonomis dan lebih mudah dilakukan. Namun kerugian in vitro adalah kadang-kadang tidak memberikan efek senyawa uji yang sama dengan bila diberikan secara in vivo. Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara in vitro menggunakan kultur sel di dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun bahan – bahan kimia yang lain (Freshney, 1986).

F. Metode MTT

  Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi dan direduksi melalui reaksi yang ada di mitokondria membentuk formazan dan terakumulasi di dalam sel (Barille, 1997). Kemampuan sel mereduksi MTT merupakan indikasi adanya aktivitas mitokondria, yang menggambarkan jumlah sel. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 550 nm menggunakan microplate reader (Castell & Gomez-Lechon, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat, dan dapat mengukur sampel dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000).

G. Metode Direct Counting

  Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien adalah dengan menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan persegi untuk mempermudah penghitungan. Zat warna seperti trypan blue akan membantu penghitungan sel hidup maupun sel mati. Penghitungan dengan haemocytometer memiliki keuntungan yaitu memberikan pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle & Griffiths, 2000).

H. Landasan Teori

  Kanker merupakan salah satu penyakit berbahaya yang dapat menyebabkan kematian. Penyakit ini timbul dari sel tunggal yang mengalami mutasi sehingga menyebabkan pertumbuhan sel meningkat dan membiarkan sel- sel tersebut tidak terkendali perkembangannnya (Macdonald and Ford, 1997).

  Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah diri apabila tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel-sel yang rusak atau mati. Sebaliknya, sel kanker akan membelah diri meskipun tidak dibutuhkan sehingga terjadi kelebihan sel-sel baru (Dalimartha, 2006).

  Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) merupakan salah satu tanaman yang diketahui memiliki berbagai khasiat obat yang disebabkan sejumlah senyawa aktif antara lain flavanoid, alkaloid, tanin, dan minyak atsiri.

  Beberapa dari flavonoid terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker, sedangkan beberapa senyawa alkaloid diketahui memiliki aktivitas antikanker melalui interaksi dengan RNA polimerase dan DNA topoisomerase (Sukardiman, 2003).

  Berdasarkan penelitian Kusumaningtyas (2008), diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel Raji, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui potensi sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji. Fraksi etanol daun sirih merah diharapkan dapat memberikan efek sitotoksisitas yang lebih besar daripada ekstrak etanolik daun sirih merah dengan demikian akan lebih berpotensi sebagai

I. Hipotesis

  Berdasarkan landasan teori, penulis merumuskan hipotesis bahwa fraksi etanol daun sirih merah memiliki efek sitotoksik yang kuat terhadap kultur sel Raji.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian tentang sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah (Piper

  

crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji ini termasuk penelitian

eksperimental murni yang mengikuti rancangan lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

  a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

  b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah persentase kematian sel Raji.

  c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini meliputi :

  1. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.

  2. Ruang kerja, peralatan yang digunakan dan pengerjaan uji sitotoksisitas dikendalikan dengan teknik aseptis.

  3. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

  4. Suhu dan kandungan CO saat proses inkubasi dikendalikan pada suhu

2 O

  5. Kepadatan sel yang digunakan dalam pengujian dikendalikan dengan

  4

  konsentrasi kepadatan sel sebesar 2,0x10 sel/100 μl.

  d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kematian alami sel Raji dan konsentrasi pelarut etanol yang terdapat dalam fraksi etanol daun sirih merah.

2. Definisi Operasional

  a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

  b. Fraksi etanol daun sirih merah adalah hasil perkolasi serbuk daun sirih merah dengan pelarut etanol yang telah dipisahkan terlebih dahulu senyawa non-polarnya menggunakan pelarut heksan.

  c. Sel Raji adalah kultur sel kanker dari sel limfoblastoid yang diperoleh dari penyakit Limfoma Burkitt’s.

  d. LC ialah konsentrasi fraksi etanol daun sirih merah yang mampu

  50 membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel Raji.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas (Pyrex), oven, mesin penyerbuk (modifikasi LPPT-UGM), ayakan, timbangan analitik (Denver Instrument XL-610), perkolator, Vacuum Rotary Evaporator,

  

blue tips , yellow tips, tabung conical (Nunc), tissue culture flask (Nunc), swing

rotor sentrifuge , mikropipet 0,5 – 10

  μl dan 100 – 1000 μl, effendorf, membran dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), homogenizer (Max Mix II Therolyne), mikroskop (Olympus IMT-2), ELISA reader, haemocytometer (Neubauer).

2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :

  a. Bahan utama: daun sirih merah segar yang diambil di Desa Ngangkrik, Kecamatan Triharjo, Kabupaten Sleman, Yogyakarta

  b. Bahan untuk fraksinasi: pelarut heksana dan etanol 96 %

  c. Bahan untuk uji KLT: etanol, amonia 10%, kloroform, etil asetat, metanol, butanol, asam asetat, aquadest, toluen, asam formiat, pereaksi Dragendorff, besi (III) klorida, vanilin, larutan pembanding kinina, larutan pembanding tanin, larutan pembanding cineol, larutan pembanding

  carvacrol , larutan pembanding cavicol, larutan pembanding caryophyllen,

  larutan pembanding rutin, silika GF 254, selulosa

  d. Bahan untuk uji sitotoksisitas: kultur sel Raji (diperoleh dari stok Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta); medium pencuci sel meliputi RPMI 1640 (Gibco), natrium bikarbonat, dan HEPES; medium penumbuh sel meliputi RPMI 1640 (Sigma), FBS (Fetal Bovine

  Serum ) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 % dodesil sulfat) dalam asam klorida 0,01 N (Merck); pereaksi MTT (3-(4,5-

  dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma), aquabidest.

D. Tata Cara Penelitian

  1. Determinasi tanaman

  Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih merah yang kemudian dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta (Lampiran 1).

  2. Pengumpulan daun sirih merah

  Bahan yang digunakan dalam penelitian berupa daun sirih merah yang diambil dari tanaman sirih merah di Desa Ngangkrik, Kecamatan Triharjo, Kabupaten Sleman, Yogyakarta.

  3. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah

  a. Pembuatan serbuk simplisia Daun sirih merah yang telah dikumpulkan kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat pada daun. Daun yang telah dicuci kemudian ditiriskan untuk menghilangkan sisa-sisa air. Daun sirih merah kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 40-60

  ˚C selama 4 x 24 jam. Daun sirih merah kering selanjutnya diserbuk dengan blender sampai halus dan diayak menggunakan ayakan 0,75 mm. b. Pembuatan fraksi etanol daun sirih merah Pembuatan fraksi etanol dilakukan secara perkolasi. Fraksinasi dilakukan dengan menambahkan 100 g serbuk simplisia dengan 400 ml pelarut heksana dalam bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, kemudian dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari untuk mencegah reaksi yang dikatalisis oleh cahaya atau perubahan warna. Setelah 24 jam pelarut dialirkan dan ditambahkan cairan penyari yang baru sedikit demi sedikit sebanyak 350 ml hingga diperoleh perkolat yang jernih. Residu yang diperoleh kemudian dikeringkan dan ditambah etanol 96% sebanyak 400 ml, diaduk dan diserkai.

  Bejana ditutup, dibiarkan terlindung dari cahaya, selama 24 jam kemudian pelarut dialirkan dan ditambahkan cairan penyari yang baru sedikit demi sedikit sebanyak 350 ml hingga diperoleh perkolat yang jernih. Fraksi etanol yang terkumpul

  o

  kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator dengan suhu 70

  C,

  o dikeringkan dalam oven pada suhu 45 C dan buat profil KLT-nya.

4. Preparasi sel Raji

  a. Propagasi sel Raji Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian dicairkan dalam

  o

  penangas air 37 C. Ampul disemprotkan dengan etanol 96% dan dibuka. Selanjutnya sel Raji dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640, sentrifugasi selama 5 menit, supernatan diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian diresuspensikan kembali. Suspensi sel disentrifugasi kembali selama 5 menit, supernatan dibuang dan ditambahkan 1 ml sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan

  o

  diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37 C dengan aliran 5% CO selama

  2

  24 jam. Medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan kembali hingga jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

  b. Pemanenan sel Raji Setelah kurang lebih satu minggu dan jumlah sel dirasa cukup, sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama ± 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel yang diperoleh selanjutnya diresuspensikan dengan 1 ml medium RPMI. Jumlah sel dihitung menggunakan

  4

haemocytometer . Selanjutnya dibuat konsentrasi sel sebesar 2,0x10 sel/100

  μl untuk penelitian lebih lanjut (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook

  et al , 1989).

  5. Pembuatan larutan uji

  Timbang fraksi etanol kering sebanyak 50 mg kemudian dilarutkan dengan 200 μl pelarut DMSO dan 800 μl medium RPMI, homogenkan.

  Konsentrasi larutan induk fraksi etanol yang diperoleh sebesar 50 mg/ml. Larutan uji selanjutnya disterilkan dengan filter membran.

  6. Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah

  4 Masukkan 100 /100

  μl suspensi sel dengan kepadatan 2x10 μl ke dalam sumuran 96 well plate yang telah berisi 100 μl fraksi daun sirih merah dengan media penumbuh. Masing-masing dibuat tiga replikasi. Selanjutnya, 96-well plate

  o

  diinkubasikan pada suhu 37

  C, dalam inkubator dengan aliran 5% CO selama 24

  2 jam (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

  a. Metode MTT

  Setelah proses inkubasi selesai, ditambahkan 10 μl MTT 5 μg/ml dalam media RPMI 1640 ke dalam masing-masing sumuran, kemudian diinkubasi pada

  o

  suhu 37

  C, dalam inkubator dengan aliran CO 5% selama 24 jam. Sel hidup akan

  2

  bereaksi dengan reagen MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 100 μl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi selama 24 jam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca menggunakan

  ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup.

  b. Metode Direct Counting

  Setelah proses inkubasi selesai, tambahkan 50 μl trypan blue ke dalam masing-masing sumuran dan homogenkan. Ambil suspensi yang telah di beri

  trypan blue sebanyak 10

  μl dan dimasukkan dalam haemocytometer, diletakkan di bawah mikroskop kemudian dihitung jumlah sel hidup dan mati menggunakan

  cell counter .

7. Analisis hasil

  Pada pengujian sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji dengan menggunakan metode MTT, besarnya serapan berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup sehingga perhitungan persentase kematian sel

  A - B

  % kematian sel = ,

   100 % A

  Keterangan : A = rata-rata absorbansi kontrol B = rata-rata absorbansi perlakuan

  Pada pengujian sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah terhadap kultur sel Raji dengan menggunakan metode perhitungan langsung (direct

  

counting ), perhitungan persentase kematian sel dilakukan dengan menggunakan

rumus berikut.

    ( sel hidup sel mati ) sel hidup  

  % kematian sel = 

  100 % ( sel hidup  sel mati ) 

  Untuk menghitung harga LC dilakukan perhitungan menggunakan

  

50

  analisis probit (Mursyidi, 1985). Analisis probit merupakan analisis regresi yang digunakan untuk mengetahui hubungan konsentrasi dengan respon dalam hal ini persen kematian sel. Persamaan garis lurus yang diperoleh dapat digunakan untuk menentukan LC , sedangkan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan