Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah [Piper crotatum Ruiz dan Pav] terhadap kultur sel raji - USD Repository
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:
Clara Sinta NIM : 058114024
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2009
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSIDiajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi Oleh:
Clara Sinta NIM : 058114024
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2009
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Pengesahan Skripsi Berjudul
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI
Oleh : Clara Sinta
NIM : 058114024 Dipertahankan di Hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tanggal 23 April 2009
Mengetahui Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Dekan Rita Suhadi, M.Si., Apt.
Pembimbing : drh. Renny Kusumastuti, M. P.
Panitia Penguji : Tanda tangan 1. drh. Renny Kusumastuti, M. P. …………….
2. Yohanes Dwiatmaka, M. Si. …………….
3. C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. ……………. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kita hidup dengan apa yang kita dapat,
kita membangun kehidupan dengan yang kita beri
(Sir Winston Churchill)
Skripsi ini kupersembahkan untuk : Bapak & Ibuku tercinta Kakak, Adik-adikku Cinta, teman-teman & alamamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji syukur penulis haturkan pada Tuhan Yang Maha Pengasih dan Penyayang atas segala rahmat dan penyertaan-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan akhir yang berjudul Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan
Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji
dengan baik. Laporan ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi.
Laporan akhir ini tidak akan dapat terselesaikan tanpa dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dala kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. drh. Renny Kusumastuti, M. P. selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan ilmu, bimbingan dan pengetahuan baru kepada penulis dengan penuh kesabaran dan ketulusan.
3. Yohanes Dwiatmaka, M. Si. dan C. M. Ratna Rini Nastiti, M. Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan saran dan kritik yang membangun bagi penulis.
4. Bu Haryati, Mas Anief dan Mba Yuli LPPT UGM atas pendampingan dan pengarahannya selama penelitian.
5. Bapak, Ibu, Mas Pandu, Imel, Dewa dan Yoyo untuk segala dukungan baik material maupun cinta yang diberikan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 6.
Erlin, Presti dan Rini buat kerjasama, suka duka, dan kebersamaannya selama di laboratorium.
7. Teman-teman UKKA dan teman-teman Farmasi Sains dan Teknologi buat persahabatan kita di farmasi.
8. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu dalam penyusunan laporan akhir ini.
Penulis menyadari sepenuhnya bahwa penulisan laporan akhir ini masih banyak kekurangan dan kesalahan yang tidak terlepas dari keterbatasan dan kekurangan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Semoga laporan ini dapat memberikan manfaat dalam perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 18 April 2009 Penulis,
Clara Sinta PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Kanker limfoma merupakan salah satu penyakit penyebab kematian utama di dunia. Pengobatan kanker dengan obat tradisional telah banyak dikembangkan, salah satunya adalah daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai LC ekstrak heksan
50 daun sirih merah terhadap kultur sel Raji (sel kanker limfoma).
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Metode ekstraksi yang dilakukan adalah perkolasi dan uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah yang diperoleh dilakukan dengan metode direct counting. Dari hasil penelitian ini dapat dihitung persen kematian sel yang kemudian dilakukan analisis probit untuk menentukan nilai LC
50 .
Berdasarkan hasil penelitian diperoleh nilai LC ekstrak heksan daun
50 sirih merah terhadap sel Raji sebesar 150,583µg/ml.
Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak heksan, daun sirih merah, sel Raji, LC
50 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Lymphoma Cancer is one of the diseases which causes death. Piper
crocatum leaves have been used for traditional cancer treatment. The aim of this
research was to determine LC
50 value of hexane extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves on Raji cell culture.
This research was pure experimental with one way completely randomized design. Extraction method was conducted with percolation and cytotoxicity assay was carried out by using direct counting method. Percentage of death cells was calculated and the LC
50 value was analyzed with probit statistic.
From the result we revealed that the hexane extract of Piper crocatum Ruiz & Pav leaves showed cytotoxicity effect on Raji cell culture with the LC
50
value of 150,583 μg/ml. Key words : cytotoxicity, hexane fraction, Piper crocatum Ruiz & Pav, Raji cell culture, LC
50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL...........................................................................…. i HALAMAN JUDUL.................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................... .. iii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................ ... iv HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................. v PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI………………………… vi PRAKATA.................................................................................................. vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA..................................................... ix
INTISARI...............................................................................................…. x
ABSTRACT ............................................................................................ ….. xi
DAFTAR ISI......................................................................................... ….. xii DAFTAR TABEL................................................................................. ….. xv DAFTAR GAMBAR................................................................................... xvi DAFTAR LAMPIRAN............................................................................. .. xviii BAB I PENGANTAR............................................................................... ..
1 A. Latar Belakang...............................................................................
1 1. Permasalahan............................................................................
3 2. Keaslian penelitian....................................................................
3 3. Manfaat penelitian.....................................................................
3 B. Tujuan Penelitian…………………………………………………
3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………..
4
A. Tanaman Sirih Merah................................................................... .
10 2. Metode direct counting.......................................................... ..
14 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14 1. Alat.......................................................................................... .
13 C. Alat dan Bahan...............................................................................
13 2. Definisi operasional..................................................................
13 1. Variabel.................................................................................. ..
13 B. Variabel dan Definisi Operasional................................................
13 A. Jenis dan Rancangan Penelitian...............................................…..
12 BAB III METODOLOGI PENELITIAN................................................…
11 J. Hipotesis…………………………………………………………
10 I. Landasan Teori……………………………………………………
1. Metode MTT……………………………………………….…
4 1. Keterangan Botani....................................................................
10
9 H. Uji Sitotoksisitas....................……………………………………
9 G. Senyawa Antikanker ……………………………………………
8 F. Sel Raji...........................................................................................
7 E. Kanker............................................................................................
6 D. Minyak Atsiri.................................................................................
5 C. Perkolasi.........................................................................................
5 B. Ekstraksi..…………..………….....................................................
5 4. Khasiat dan Penggunaan...........................................................
4 3. Kandungan Kimia.....................................................................
4 2. Deskripsi Tanaman...................................................................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2. Bahan........................................................................................
14 D. Tata Cara Penelitian.......................................................................
15 1. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah...................
15 2. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah.......................
15 3. Ekstraksi Simplisia Daun Sirih Merah…..................................
16 4. Propagasi dan Panen Sel Raji...................................................
16 a. Propagasi Sel Raji.............................................................
16 b. Panen Sel Raji .................................................................
17
5. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah Pada Sel Raji.. 17 a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT..................……..
17 b. Uji sitotoksisitas dengan metode Direct Counting...........
18 6. Analisis Hasil............................................................................
18 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN.....................................................
20 A. Pengumpulan dan Determinasi Daun Sirih Merah........................
20 B. Pembuatan Serbuk Simplisia Daun Sirih Merah...........................
20 C. Ekstraksi Simplisia Daun Sirih Merah...........................................
21 D. Propagasi dan Panen Sel Raji……………………………………
24 D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah Pada Sel Raji...
26 1. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT.................................. ..
26 2. Uji sitotoksisitas dengan metode Direct Counting.................. .
29 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan………………………………………….. ...………..
39 B. Saran………………………………. …………………………….
39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………….……….
40 BIOGRAFI PENULIS………………………………………………….…
56 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL
Tabel I Hasil pengamatan profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah …... 23 Tabel II Tabel nilai absorbansi ekstrak heksan daun sirih merah pada ber- bagai konsentrasi dengan metode MTT..........................................
27 Tabel III Hasil perhitungan sel Raji pada masing-masing konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting .............
32 Tabel IV Hasil perhitungan sel Vero pada masing-masing konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah dengan metode Direct Counting.............. 32 Tabel V Data % kematian sel Raji dan harga probitnya setelah inkubasi
24jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah.............. 34 Tabel VI Data % kematian sel Vero dan harga probitnya setelah inkubasi 24 jam dengan perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah ...........................................................................................
34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Reaksi reduksi MTT oleh enzim dehidrogenase mitokondria ……
26 Gambar 2. Kurva konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap hasil perhitungan % kematian sel....................................................
28 Gambar 3. Sel yang hidup dan sel yang mati setelah pemberian trypan
blue pada haemocytomoter di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x .................................................................
30 Gambar 4. Kontrol sel Raji dan kontrol sel Vero di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x ...........................
31 Gambar 5. Kurva Konsentrasi Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap % Kematian Sel Raji dan Sel Vero ..................................
33 Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap harga probit pada sel Raji................................................................
34 Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap harga probit pada sel Vero ..............................................................
35 Gambar 8. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) ……………
42 Gambar 9. Laminar Air Flow…………………………………………………. 42 Gambar 10. Inverted Microscope…………………………………………….. 42 Gambar 11. 96well plate, tabung conical steril dan flask …………………….
43 Gambar 12. Cell counter dan haemocytometer ……………………………….
43 Gambar 13. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 300 µg/ml ………………... 44 Gambar 14. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 275 µg/ml ………………... 44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 15. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 250 µg/ml ………………... 44 Gambar 16. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 225 µg/ml ………………... 44 Gambar 17. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 200 µg/ml ………………... 44 Gambar 18. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 175 µg/ml ………………... 44 Gambar 19. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 150 µg/ml ………………... 45 Gambar 20. Pengamatan sel Raji pada perlakuan 125 µg/ml ………………... 45 Gambar 21. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 800 µg/ml ………………... 45 Gambar 22. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 700 µg/ml ………………... 45 Gambar 23. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 600 µg/ml ………………... 45 Gambar 24. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 500 µg/ml ………………... 45 Gambar 25. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 400 µg/ml ………………... 45 Gambar 26. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 300 µg/ml ………………... 45 Gambar 27. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 200 µg/ml ………………... 46 Gambar 28. Pengamatan sel Vero pada perlakuan 100 µg/ml ………………... 46
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Bahan dan Peralatan yang Digunakan dalam Penelitian ………..42 Lampiran 2. Hasil Pengamatan Sel Raji dan Sel Vero dengan Mikroskop dengan Perbesaran 100x Setelah Pemberian Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah pada Inkubasi 24 jam ……………………….
44 Lampiran 3. Tabel Probit ……………………………………………………
47 Lampiran 4. Perhitungan LC
48 Lampiran 5. Hasil Uji Signifikansi Antara Perlakuan dengan Kontrol dengan Z-test …………………………………………………….. ……..
52 Lampiran 6. Hasil Uji KLT Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah……………… 54
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50 Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah terhadap Sel Raji Dan Sel Vero ………………………………………….
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I PENGANTAR A. Latar belakang Kanker merupakan penyakit nomor satu yang mematikan di dunia dan
angka kematian yang disebabkan penyakit kanker juga terus bertambah. Kanker adalah suatu penyakit yang berhubungan dengan pertumbuhan sel tubuh yang tak terkendali, dimana sel yang tak terkendali ini juga menyebabkan kerusakan jaringan tubuh yang sehat lainnya. Kanker dapat muncul di setiap jenis organ tubuh, ada yang ganas dan ada yang jinak (Anita, 2008).
Efek merugikan dari pertumbuhan kanker adalah gangguan aktivitas sel normal, jaringan, dan organ atau sampai pada kematian sel karena terjadinya perubahan sel yang fungsional menjadi sel yang tidak fungsional. Tumor menghancurkan jaringan normal dengan tekanan dan gangguan pada darah dan saraf serta menembus barrier kulit, internal membran atau epitelia (Wolfe,1993).
Salah satu jenis kanker yang banyak menyerang adalah kanker limfoma Limfoma adalah kanker sel darah putih yang disebut juga limfosit-B atau Non-
Hodgkin Limfoma (NHL). Tumor NHL dapat terjadi di tulang, perut, hati, otak,
atau bagian tubuh yang lain. Tanda pertama NHL adalah bengkak pada kelenjar getah bening, demam, keringat malam dan hilang berat badan lebih dari sepuluh persen. Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor genetik (Anonim, 2009a). Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt (Anonim, 2009b).
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Banyak bukti empiris orang sembuh dengan beragam penyakit setelah mengkonsumsi daun sirih merah. Sirih merah dipakai untuk mengobati diabetes, kanker, peradangan, hipertensi, hepatitis, leukimia dan ambeien. Senyawa fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah telah diketahui meliputi flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
Suatu penelitian menggunakan ekstrak etanolik daun sirih merah terbukti bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji dengan nilai LC sebesar 395,5µg/ml
50
(Kusumaningtyas, 2008). Mengacu pada penelitian tersebut, maka perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui nilai LC ekstrak heksan daun sirih merah. Heksan
50
merupakan pelarut dengan kepolaran yang rendah (non polar). Dalam ekstrak heksan tersebut diharapkan agar kandungan senyawa-senyawa non polar yang tersari mempunyai konsentrasi lebih besar daripada dalam ekstrak etanol. Hal ini dikarenakan dalam ekstrak etanol senyawa yang tersari lebih banyak, dengan
range kepolaran yang cukup jauh, sehingga tidak hanya senyawa non polar saja
yang akan tersari, namun senyawa polar dan semipolar pun akan ikut tersari, sehingga konsentrasi senyawa non polar dalam ekstrak etanol ini akan lebih kecil.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah senyawa-senyawa nonpolar yang berada dalam ekstrak heksan tersebut lebih berpotensi sebagai senyawa sitotoksik terhadap kultur sel Raji yang ditunjukkan dengan nilai LC . Dengan
50
adanya hasil tersebut diharapkan ekstrak heksan dari daun sirih merah ini akan memberikan daya sitotoksik yang lebih besar dan lebih berpotensi sebagai antikanker.
3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 1.
Permasalahan
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan di atas, maka dirumuskan permasalahan yaitu berapakah nilai LC ekstrak heksan daun sirih
50
merah terhadap kultur sel Raji? 2.
Keaslian penelitian Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel
Raji. Adapun penelitian yang sudah pernah dilakukan adalah Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah terhadap Kultur Sel Raji (Kusumaningtyas, 2008).
3. Manfaat penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai khasiat dan efek sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.
Diharapkan dengan adanya informasi ini, penggunaan bahan alam sebagai obat kanker semakin dikembangkan.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik ekstrak heksan daun sirih merah dengan mencari nilai LC ekstrak heksan daun sirih
50 merah terhadap sel Raji. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Sirih Merah
1. Keterangan botani
Famili : Piperaceae Genus : Piper Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav Sinonim : Piper ornatum N. E. Br.
Nama daerah : Sirih merah Nama Inggris : Red betle vine (Anonim, 2007)
2. Deskripsi Tanaman Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.
Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15- 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).
Sirih merah bisa tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar matahari. Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari secara terus-menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik (Sudewo, 2005).
5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3.
Kandungan Kimia
Berdasarkan penelitian yang pernah dilakukan menunjukkan bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).
4. Khasiat dan penggunaan
Tumbuhan sirih merah digunakan sebagai obat di masyarakat, antara lain sebagai anti diabetes, jantung koroner, radang prostat, TBC, asam urat dan antikanker (Sudewo, 2005).
Secara empiris ekstrak daun sirih merah dalam pemakaian secara tunggal atau diformulasikan dengan tanaman obat lainnya mampu membasmi aneka penyakit. Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat merangsang saraf pusat dan daya pikir. Di samping itu, juga memiliki efek pencegah ejakulasi dini, antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, pelindung organ hati, antidiare, antikoagulan, mempertahankan kekebalan tubuh, dan penghilang bengkak. Daun sirih merah juga mampu mengatasi penyakit seperti peradangan akut pada organ tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus, leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung koroner, dan darah tinggi (Sudewo, 2005).
B. Ekstraksi
Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Anonim, 2000). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan (Anonim, 1995).
Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut. Proses penyarian dapat dipisahkan menjadi pembuatan serbuk, pembasahan, penyarian dan pemekatan. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan (Anonim, 1986).
C. Perkolasi
Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Kekuatan yang berperan dalam perkolasi antara lain kekentalan, daya larut, tegangan permukaan, difusi, osmosa, daya kapiler dan daya geseran (friksi). Cara perkolasi lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi karena aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).
Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut perkolat, sedangkan sisa setelah dilakukannya penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).
7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
D. Minyak Atsiri
Minyak atsiri terdiri dari molekul-molekul hidrokarbon yang terdiri dari 10-15 atom karbon. Kelarutan minyak atsiri ini adalah pada pelarut nonpolar sehingga ekstraksinya pun juga dilakukan dengan pelarut nonpolar (Houghton & Raman, 1998).
Berbagai alkohol, aldehida, keton dan ester yang mudah menguap atau atsiri terdapat dalam tumbuhan walaupun biasanya terdapat hanya sedikit sekali.
Walaupun konsentrasinya rendah, senyawa ini penting dari segi estetika oleh karena perannya pada citarasa, dan bau makanan, bunga, parfum dan sebagainya.
Minyak atsiri berperan pada daya tariknya untuk serangga penyerbuk serta hewan penyebar biji. Selain itu, senyawa ini juga bertindak sebagai antibiotika, hormon luka, dan perangsang perkecambahan biji (Robinson, 1995).
Minyak atsiri dalam tumbuhan terdapat dalam jumlah yang sangat kecil sehingga diperlukan bahan awal yang sangat besar jumlahnya untuk mengisolasi senyawa yang memadai untuk diteliti. Ada tiga cara umum untuk mengambil komponen atsiri dalam tumbuhan yaitu destilasi, ekstraksi memakai pelarut, dan pengaliran udara atau aerasi. Destilasi pada tekanan dan suhu rendah memungkinkan terjadinya penguraian oleh enzim, sehingga menimbulkan perubahan kandungan jaringan. Cara ekstraksi dengan pelarut dapat dilakukan pada keadaan khusus terutama untuk senyawa yang tidak begitu polar. Pada proses aerasi hanya senyawa senyawa yang dikeluarkan ke udara saja yang terisolasi dengan mengalirkan udara melalui bahan tumbuhan untuk jangka waktu
8
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
yang lama dan mengembunkan senyawa yang terbawa udara dalam penampung yang didinginkan (Robinson, 1995).
E. Kanker
Kanker adalah kelainan genetik yang merupakan akibat dari peristiwa- peristiwa mutasional berganda. Mutasi-mutasi tersebut mengubah fungsi normal suatu sel sehingga sel itu menjadi memiliki ciri-ciri sebagai berikut : (1) sel menjadi immortal, yaitu mampu melakukan pembelahan sel secara tak terbatas, (2) sel menjadi independen dari kontrol-kontrol selular normal yang membatasi pertumbuhan dan pembelahan, dan (3) sel itu menjadi invasif dengan menyebar ke jaringan-jaringan lain, dalam sebuah proses yang disebut metastatis. Satu sel kanker mampu membelah menjadi massa klonal sel yang disebut tumor.
Onkogenesis adalah proses perubahan sel normal menjadi sel kanker. Sedangkan neoplasma adalah populasi sel-sel berpotensi kanker yang yang tumbuh secara lepas kendali. Jika neoplasma terbatas di tempat asalnya dan tak memiliki kecenderungan untuk tumbuh lagi setelah disingkirkan, maka neoplasma itu disebut jinak (benign). Jika neoplasma bermetastatis dari tempat asalnya, maka neoplasma itu menjadi ganas (malignant) dan membahayakan jiwa (Elfrod and William, 2007).
Untuk mempelajari kanker secara in vitro, sel-sel dapat ditumbuhkan menggunakan teknik-teknik kultur yang disebut kultur sel atau kultur jaringan.
Sejumlah sel ditempatkan dalam vial berdasar datar yang terbuat dari gelas atau plastik. Vial tersebut sudah diberi perlakuan dan berisikan medium kaya nutrien.
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Sel-sel kemudian turun dan melekat ke dasar wadah, sel-sel itupun mulai tumbuh dan disebut sebagai kultur primer (Elfrod and William, 2007).
F. Sel Raji
Sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt ( Anonim, 2009b). Limfoma adalah kanker sel darah putih yang disebut limfosit-B atau disebut juga dengan NHL. Sel tersebut cepat menggandakan diri dan membentuk tumor. NHL disebabkan oleh rangsangan jangka panjang sistem kekebalan tubuh. Jika sel-B menggandakan diri dengan cepat selama bertahun-tahun, makin banyak mutasi atau perubahan terjadi pada sel ini. Beberapa mutasi ini dapat menyebabkan kanker (Anonim, 2009a).
Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor genetis. Tumor NHL dapat terjadi pada tulang, perut, hati, otak, atau bagian tubuh lain. Tanda pertama NHL adalah bengkak pada kelenjar getah bening, demam, keringat malam, dan hilang berat badan lebih dari sepuluh persen. Gejala ini terjadi dengan beberapa penyakit lain yang berhubungan dengan AIDS (Anonim, 2009a).
G. Senyawa Antikanker
Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC . Klasifikasi tersebut
50
meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC = 0,19-0,528
50
mg/ml; Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC = 0,528-
50
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1,197 mg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC = 1,259-
50
2,515 mg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate LC =
50
2,528-4,939 mg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak LC > 5,0
50 mg/ml (Mazzio,2009).
H. Uji Sitotoksisitas 1.
Metode MTT
Metode MTT merupakan uji sitotoksik yang cepat, sensitif, akurat dan sejumlah besar sampel dapat diukur secara otomatis dengan spektrofotometer.
Metode ini didasarkan pada aktivitas enzim dehidrogenase mitokondria untuk mengubah substrat MTT yang larut air (berwarna kuning), menjadi formazan berwarna biru tua yang tidak larut air (Doyle and Griffiths, 2000).
Pada metode MTT dilakukan pengukuran absorbansi sampel dengan menggunakan ELISA plate reader pada panjang gelombang 570 nm. Hasil pengukuran bersifat kuantitatif, dimana terdapat hubungan yang linier antara aktivitas sel dengan absorbansi, dan pertumbuhan atau kematian sel dapat diukur (Anonim, 2009c).
2. Metode Direct counting
Metode yang paling umum digunakan dalam perhitungan sel yang efisien dan akurat adalah menggunakan haemocytometer. Dalam metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan berbentuk persegi untuk mempermudah penghitungan. Suspensi sel yang diisikan ke dalam chamber dapat diamati di bawah mikroskop dan sel yang terhitung terdapat pada angka
11
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI skala. Dari hasil perhitungan ini, jumlah sel per ml suspensi dapat dihitung.
Menggunakan zat warna seperti trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat dilakukan. Trypan blue ini hanya bisa menembus membran pada sel yang mati. Ketika suspensi sel dilemahkan dengan trypan blue, sel yang sehat akan tetap kecil dan bergerak, sedangkan sel yang rusak atau mati akan membengkak, lebih luas dan berwarna biru tua (Doyle and Griffiths, 2000).
Perhitungan sel menggunakan haemocytometer cukup murah dan dapat melihat langsung sel yang kita hitung. Namun prosedur ini cukup lama dan mudah terjadi kesalahan pada sampling dan jumlah sel yang dihitung pada saat transfer sel ke dalam chamber, sehingga harus dipastikan sel tercampur dengan baik dalam suspensi dan sel dalam suspensi tidak membentuk agregat yang dapat membuat perhitungan tidak akurat (Freshney, 1986).
I. Landasan Teori
Kanker terjadi karena perubahan sel yang mengalami pertumbuhan tidak normal dan tidak terkontrol. Kanker limfoma termasuk penyakit kanker yang paling banyak diperbincangkan karena keganasannya. Limfoma berhubungan dengan AIDS dan sering juga disebut Limfoma Non-Hodgkin (NHL). NHL disebabkan oleh rangsangan jangka panjang sistem kekebalan tubuh. Jika sel-B menggandakan diri dengan cepat selama bertahun-tahun, makin banyak mutasi atau perubahan terjadi pada sel ini. Beberapa mutasi ini dapat menyebabkan kanker. Resiko NHL ditingkatkan oleh infeksi virus Epstein-Barr dan oleh faktor
12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
genetis. Tumor NHL dapat terjadi pada tulang, perut, hati, otak, atau bagian tubuh lain.
Pengobatan kanker dengan obat tradisional telah banyak dikembangkan, salah satunya adalah daun sirih merah (Piper crocatum). Sekilas bila dilihat dari bentuk dan namanya, sirih merah dan sirih terlihat sama. Banyak fungsi daun sirih merah ini yang tidak dimiliki daun sirih biasa. Banyak bukti empiris orang sembuh dengan beragam penyakit setelah mengkonsumsi sirih merah. Senyawa fitokimia yang terkandung dalam daun sirih merah meliputi alkaloid, saponin, tannin, flavonoid dan minyak atsiri. Selain bersifat antiseptik seperti sirih hijau, sirih merah juga bisa dipakai mengobati diabetes, kanker, peradangan, hipertensi, hepatitis, leukimia dan ambeien.
Mengacu pada hasil penelitian sebelumnya bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel Raji , maka perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui potensi ekstrak heksan daun sirih merah sebagai senyawa yang sitotoksik terhadap kultur sel Raji. Ekstrak heksan daun sirih merah diharapkan mengandung senyawa-senyawa nonpolar yang lebih berpotensi sitotoksik terhadap kultur sel Raji. Dengan adanya hasil tersebut diharapkan ekstrak heksan dari daun sirih merah ini akan memberikan daya sitotoksik yang lebih besar dan lebih berpotensi sebagai antikanker.
J. Hipotesis
Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum) bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji. kultur sel Raji ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola searah.
Variabel
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah yang disajikan dalam bentuk log konsentrasi.
b. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah % kematian sel Raji yang disajikan dalam bentuk probit.
c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah suhu, pH, media, kualitas pereaksi, umur sel Raji dan pelaku penelitian.
d. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah kematian alami sel Raji.
a. Ekstrak heksan daun sirih merah ialah hasil ekstraksi daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dengan pelarut heksan yang dibuat sesuai prosedur dalam penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian daya sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap
B. Variabel dan Definisi Operasional 1.
2. Definisi operasional
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI b.
Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel Raji.
c.
Sel Raji adalah kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt.
d.
Kematian sel Raji ditunjukkan dengan terjadinya pembengkakan sel yang
dilanjutkan perubahan warna sel yang transparan menjadi biru tua oleh penambahan trypan blue.
C. Alat dan Bahan
1. Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas (Pyrex), timbangan analitik (Denver Instrument XL-610), mesin penyerbuk (Modifikasi LPPT UGM), perkolator, seperangkat alat KLT, vacuum rotary
evaporator , Mikropipet 0,5 – 10 µl dan 100 – 1000 µl, vortex (Max Mix II
Therolyne), inkubator (Memmer), tabung conical (Nunc), tissue culture flask (Nunc), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate (Nunc), spektrofotometer UV, laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),
haemocytometer (Neubauer).
2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah daun sirih merah segar ( diambil di pekarangan warga Dusun Ngangkrik, Sleman), kultur sel Raji (diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta),
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
kultur sel Vero (diambil dari stok di Laboratorium Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta).
Pereaksi-peraksi yang digunakan untuk preparasi ekstraksi dan uji KLT kandungan senyawa daun sirih merah antara lain heksan, toluen, etil asetat, metanol, air, amonia, asam asetat, asam formiat, dan semprot vanilin. Sedangkan untuk uji sitotoksisitas antara lain RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, Penisilin-Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco); Reagen Stopper : SDS (sodium dodeksil sulfat) dalam HCl 0,01 N (Merck); MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma).
D. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan dan determinasi daun sirih merah
Daun sirih merah yang digunakan diambil dari pekarangan warga Dusun Ngangkrik, Sleman. Determinasi daun sirih merah dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
2. Pembuatan serbuk simplisia daun sirih merah
Simplisia dibuat dengan memilih daun sirih merah yang masih segar, dibersihkan dari pengotor dan bagian lain yang tidak diinginkan seperti tanah, akar, atau batang. Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa-sisa air menghilang. Daun kemudian dikeringkan
16
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dalam lemari pengering dengan suhu 65-70 ˚C. Setelah kering, dibersihkan lagi dari partikel asing lalu diserbuk dengan mesin penyerbuk sampai halus.
3. Ekstraksi simplisia daun sirih merah (Piper crocatum)
Serbuk simplisia sebanyak 100 gram diekstraksi secara perkolasi dengan pelarut heksan. Perkolasi dilakukan dengan mengalirkan pelarut heksan melalui serbuk simplisia dalam perkolator. Proses ini dilakukan berulang dengan pelarut yang baru sampai tetesan terakhir pada perkolasi tidak berwarna lagi. Ekstrak heksan yang didapat kemudian dipekatkan menggunakan vacum rotary evaporator kemudian kandungan senyawa diidentifikasi secara KLT.
4. Propagasi dan panen sel Raji
a. Propagasi sel Raji Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam
o
penangas air 37
C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.