Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air [Impatiens balsamina L.] terhadap kultur sel SiHa - USD Repository

  

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR

(Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Widya Adhitama

  

NIM : 058114069

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

  

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR

(Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

  

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Widya Adhitama

  

NIM : 058114069

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

  

Bersukacitalah dalam pengharapan, sabarlah dalam

kesesakan, dan bertekunlah dalam doa

(Roma 12 : 12)

Karena

  

Ia membuat segala sesuatu indah pada waktunya,

bahkan Ia memberikan kekekalan dalam hati

mereka

(Pengkhotbah 3 : 11a)

  Kupersembahkan karya kecilku ini untuk: Tuhan Yesus Kristus pemilik hidupku Papa dan mama Kakak-kakak ku dan keponakanku

  Sahabat-sahabatku Almamaterku…

  

PRAKATA

  Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul: “Uji Sitotoksisitas Ektrak Kloroform Daun Pacar Air Terhadap Kultur Sel SiHa”, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar kesarjanaan Strata satu (S-1).

  Dalam proses penyusunan skripsi ini, penulis banyak mendapat bantuan berupa bimbingan, dorongan, sarana, dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Ibu Rita Suhadi, M. Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

  2. Bapak Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., selaku Dosen Pembimbing, atas bimbingan, pengarahan, dan dukungan selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini.

  3. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro M.Si., Romo Sunu, serta Bapak Aris Dwiatmaka yang telah banyak membantu dalam penyelesaian skripsi ini.

  4. Ibu Tri Yuliani dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

  5. Papa dan Mamaku tercinta, Mbak Vivi, Mas Silo, Mas Ary, keponakan ku Vio dan Eren atas segala dukungan, kasih sayang dan keceriaan yang diberikan.

  6. Sahabat - sahabat setiaku Ika, Nia, Sukma, Dewi,Yesi, dek Lulu, dek Jati, dek Oline, Adith, Rafi, Mbak Eva, Wahyu, Eka, atas dukungan, semangatnya

  7. PMK Apostolos keluarga kedua ku, terima kasih karena aku boleh bertumbuh bersama kalian. Aku percaya bahwa bukan suatu kebetulan aku berada di tengah – tengah kalian dan menjadi bagian dari keluarga Apostolos.

  8. Anni dan Lise buat suka duka selama dalam penelitian ini makasih buat semangat dan pengertian kalian.

  9. Temen – temen farmasi angkatan 2005 kelas B dan FKK 2005 makasih buat semangatnya dan kebersamaan selama ini.

  10. Mas Wagiran, dan Mas Sigit yang telah membantu dalam penelitian.

  11. Semua pihak yang telah membantu penulis.

  Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Namun, penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu pengetahuan.

  Yogyakarta, Mei 2009 Penulis

  

INTISARI

  Kanker merupakan penyakit yang dapat menyebabkan kematian. Banyak penelitian yang telah dilakukan untuk mendapatkan senyawa baru yang dapat mengobati kanker. Secara empiris tanaman pacar air (Impatiens balsamina) telah digunakan untuk melancarkan persalinan, peluruh haid, dan untuk kanker saluran pencernaan bagian atas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa dan sel Vero.

  Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang digunakan adalah 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; dan 100 µg/ml. Uji sitotoksik dilakukan menggunakan metode direct counting. Hasil perhitungan merupakan prosentase kematian sel yang kemudian dianalisis z-test dan analisis probit untuk menentukan nilai LC

  50 .

  Melalui uji sitotoksisitas ini dapat diketahui bahwa ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa maupun sel Vero dengan LC 50 sebesar 52,5 µg/ml dan 275,4 µg/ml.

  Kata kunci: sitotoksisitas, kanker, daun pacar air, sel SiHa, sel Vero, LC

  50

  

ABSTRACT

  Cancer is a kind of disease that might cause death. Many researches have been done to obtain new compounds for cancer treatment. Empiricaly, Impatiens

  

balsamina has been used for partufasien, emenagog, and antitumor. This study

  aimed to determine whether the chloroform extract of Impatiens balsamina leaves has a cytotoxic effect against SiHa and Vero cell cultures.

  This research was a pure experimental with one way completely randomized design. Chloroform extract of Impatiens balsamina was made in concentrations that were 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; dan 100 µg/ml. Cytotoxicity test was conducted against SiHa cell using direct counting method. Percentage of death cell data were analyzed by z-test and probit analysis to determine the LC

  50 values.

  Through this cytotoxicity test, it can be noted that the chloroform extract of Impatiens balsamina leaves have cytotoxicity effect against both SiHa cell and Vero cells with LC of 52,5 µg/ml and 275,4 µg/ml, respectively.

50 Keyword: cytotoxicity, cancer, Impatiens balsamina leaves, SiHa cell, Vero cell,

  LC

  50

  DAFTAR ISI

  Halaman HALAMAN JUDUL............................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN .............................................................................v PRAKATA............................................................................................................. vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. viii

  INTISARI............................................................................................................... ix

  

ABSTRACT ...............................................................................................................x

  DAFTAR ISI.......................................................................................................... xi DAFTAR TABEL................................................................................................ xiv DAFTAR GAMBAR .............................................................................................xv DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... xvii

  BAB I. PENGANTAR .............................................................................................1 A. Latar Belakang ..............................................................................................1

  1. Permasalahan ..............................................................................................3

  2. Keaslian penelitian .....................................................................................3

  3. Manfaat penelitian ......................................................................................3

  B. Tujuan Penelitian ............................................................................................4

  1. Tujuan umum..............................................................................................4

  2. Tujuan khusus.............................................................................................4

  BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................................5

  1. Keterangan botani.......................................................................................5

  2. Kandungan kimia .......................................................................................5

  3. Khasiat dan penggunaan.............................................................................5

  4. Penelitian tanaman pacar air.......................................................................6

  B. Naftokuinon ....................................................................................................6

  C. Teknik Penyarian ............................................................................................7

  D. Kanker ............................................................................................................8

  E. Kultur Sel ........................................................................................................9

  1. Sel Vero......................................................................................................9

  2. Sel SiHa......................................................................................................9

  F. Uji Sitotoksisitas .............................................................................................9

  G. Landasan Teori .............................................................................................10

  H. Hipotesis .......................................................................................................11

  BAB III. METODE PENELITIAN .......................................................................12 A. Jenis dan Rancangan Penelitian....................................................................12 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...............................................12

  1. Variabel penelitian....................................................................................12

  2. Definisi operasional ..................................................................................13

  C. Alat dan Bahan .............................................................................................13

  1. Alat ...........................................................................................................13

  2. Bahan ................................................................................................. ….14

  D. Tata Cara Penelitian .....................................................................................14

  1. Determinasi tanaman ...............................................................................14

  3. Ekstraksi ..................................................................................................15

  4. Sterilisasi alat...........................................................................................15

  5. Pembuatan medium pencuci dan penumbuh ...........................................16

  6. Propagasi dan panen sel SiHa dan sel Vero ............................................16

  7. Pembuatan larutan uji ..............................................................................17

  8. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air dengan menggunakan metode direct counting............................................................................18

  9. Analisis hasil............................................................................................18

  BAB IV. PEMBAHASAN.....................................................................................20 A. Determinasi Tanaman.................................................................................. 20 B. Pengumpulan Daun Pacar Air ..................................................................... 20 C. Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air .......................................... 21 D. Sterilisasi Alat ............................................................................................. 22 E. Pembuatan Medium Penumbuh dan Pencuci............................................... 22 F. Preparasi Kultur Sel SiHa ............................................................................ 23 G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air ................................ 24 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...............................................................35 A. Kesimpulan...................................................................................................35 B. Saran .............................................................................................................35 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................36 LAMPIRAN...........................................................................................................39 BIOGRAFI PENULIS ...........................................................................................63

  

DAFTAR TABEL

  Tabel I. Hasil Perhitungan Prosentase Kematian Sel SiHa Setelah Inkubasi 24 Jam ....................................................................................................26

  Tabel II. Hasil Perhitungan Prosentase Kematian Sel Vero Setelah Inkubasi 24 Jam ....................................................................................................27

  Tabel III. Data Perhitungan Jumlah Kultur Sel SiHa Dengan Metode Direct

  Counting ............................................................................................41

  Tabel IV. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel SiHa Pada Replikasi 1.........................................................................................43

  Tabel V. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel SiHa Pada Replikasi 2.........................................................................................46

  Tabel VI. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel SiHa Pada Replikasi 3.........................................................................................48

  Tabel VII. Data Perhitungan Jumlah Kultur Sel Vero Dengan Metode Direct ............................................................................................49

  Counting

  Tabel VIII. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel Vero Pada Replikasi 1.........................................................................................51

  Tabel IX. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel Vero Pada Replikasi 2.........................................................................................54

  Tabel X. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel Vero Pada Replikasi 3.........................................................................................56

  Tabel XI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% ........57

  

DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Struktur 2-metoksi-1,4-naftokuinon..................................................6 Gambar 2. Morfologi sel setelah pemberian trypan blue, pada bilik haemocytometer dengan perbesaran 100x ......................................25 Gambar 3. Morfologi sel yang hidup pada kontrol sel SiHa dilihat dengan perbesaran 100x ..............................................................................28 Gambar 4. Morfologi sel yang hidup pada kontrol sel Vero dilihat dengan perbesaran 100x ..............................................................................28 Gambar 5. Sel SiHa pada konsentrasi ekstrak 60 µg/ml dilihat dengan perbesaran 100x ..............................................................................28 Gambar 6. Sel Vero pada konsentrasi ekstrak 100 µg/ml dilihat dengan perbesaran 100x ..............................................................................29 Gambar 7. Grafik pengaruh kadar ekstrak kloroform daun pacar air terhadap prosentase kematian sel SiHa..........................................................29 Gambar 8. Grafik pengaruh kadar ekstrak kloroform daun pacar air terhadap prosentase kematian sel Vero..........................................................29 Gambar 9. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada sel SiHa replikasi 1 .........................................................................30 Gambar 10. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada sel SiHa replikasi 2 .........................................................................31 Gambar 11. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada sel SiHa replikasi 3 .........................................................................31

  Gambar 12. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada sel Vero replikasi 1..........................................................................32 Gambar 13. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada sel Vero replikasi 2..........................................................................32 Gambar 14. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada sel Vero replikasi 3..........................................................................33 Gambar 15. Tanaman pacar air ...........................................................................41 Gambar 16. Daun pacar air .................................................................................41

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Hasil Determinasi..................................................................... .....40 Lampiran 2. Tanaman Pacar Air yang digunakan dalam penelitian............. .....41 Lampiran 3. Perhitungan LC

  50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel

  Siha menggunakan analisis probit............................................ .....42 Lampiran 4. Perhitungan LC

  50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel

  Vero menggunakan analisis probit........................................... .....50 Lampiran 5. Perhitungan uji linearitas untuk analisis regresi....................... ….58 Lampiran 6. Analisis statistik uji z antara kelompok kontrol dan perlakuan ….59 Lampiran 7. Uji t terhadap log LC

  50 sel SiHa dan Sel Vero......................... .....63

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Timbulnya penyakit kanker di Indonesia erat kaitannya dengan peralihan Indonesia dari negara pertanian menjadi negara industri yang mengubah perilaku

  atau gaya hidup dan kebiasaan masyarakat (Anonim, 2008a). Kanker leher rahim merupakan tumor ganas yang paling sering menyerang wanita, terutama yang disertai dengan predisposisi tertentu seperti wanita yang sering berganti-ganti pasangan, kawin muda, berhubungan seksual pertama kali pada umur < 20 tahun.

  Di negara yang telah maju dan berhasil membasmi penyakit infeksi, kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler.

  Pada saat ini dari metode pengobatan yang telah dilakukan, 1/3 jumlah pasien tertolong melalui pembedahan dan terapi radiasi. Kesembuhan hampir seluruhnya terjadi pada pasien yang penyakitnya belum menyebar pada saat pembedahan (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Menurut WHO, setiap tahun jumlah penderita kanker di dunia bertambah 6,25 juta orang. Di Indonesia diperkirakan setiap tahunnya terdapat 100 penderita kanker yang baru dari setiap 100.000 penduduk (Anonim, 2008a). Mahalnya biaya pengobatan membuat banyak kalangan masyarakat mulai beralih pada pengobatan tradisional menggunakan berbagai macam tanaman obat alami (Soedibyo, 1998).

  Antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal (Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).

  Khasiat dari tanaman pacar air (Impatiens balsamina) secara empiris untuk melancarkan peredaran darah, peluruh haid, melancarkan persalinan.

  Tanaman ini juga diindikasikan untuk mengobati kanker saluran cerna bagian atas (Dalimartha, 2007).

  Penelitian tentang ekstrak kloroform daun pacar air yang dilakukan di China menunjukkan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas anti tumor terhadap hepatocelular carcinoma cell line Hep-G

  2 . Senyawa aktif yang

  diidentifikasi sebagai anti tumor tersebut adalah 2-metoksi 1,4-naftokuinon (Zhi- Shan et al., 2008).

  Perlu dilakukannya penelitian ekstrak tersebut terhadap sel kanker. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan sel SiHa untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air ini mempunyai efek sitotoksik terhadap sel kanker. Digunakan sel SiHa karena mempunyai persamaan dengan hepatocelular

  

carcinoma cell line Hep-G yaitu keduanya diambil dari jaringan epitel dan

  2

  merupakan kanker yang disebabkan karena virus (Anonim, 2008c). Berdasarkan hasil, sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air ini selanjutnya dapat digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan suatu senyawa antikanker terutama pada sel SiHa.

  1. Permasalahan

  Berdasarkan latar belakang tersebut maka dapat ditarik suatu permasalahan sebagai berikut: a. Apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap sel SiHa ? b. Seberapa besar nilai LC

  50 dari ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

  sel SiHa ?

  2. Keaslian penelitian

  Penelitian mengenai Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air Terhadap Sel Kultur SiHa sejauh penelusuran penulis belum pernah dilakukan.

   Manfaat penelitian 3.

  a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai khasiat, penggunaan dan efek sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel SiHa yang dapat menambah kemajuan ilmu pengetahuan khususnya dibidang kefarmasian.

  b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan khasiat daun pacar air sebagai antikanker.

B. Tujuan Penelitian

  1. Tujuan umum

  Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air ini memiliki potensi yang dapat dikembangkan sebagai senyawa anti kanker.

  2. Tujuan khusus

  a. Untuk mengetahui potensi sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel SiHa.

  b. Untuk mengetahui seberapa besar nilai LC

  50 dari ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel SiHa.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Tanaman Pacar Air Keterangan botani 1. Tanaman Pacar Air (Impatiens balsamina) merupakan anggota familia Balsaminaceae (Backer dan Brink, 1986). Tanaman ini berupa terna semusim

  yang biasa ditanam di halaman sebagai tanaman hias atau tumbuhan liar di tempat yang cukup mendapat air dan sinar matahari. Mempunyai daun tunggal, bertangkai dan berbentuk lanset memanjang, tepi bergerigi tajam, ujung dan pangkal menyirip, warna hijau (Dalimatha, 2007). Nama lain dari tanaman ini adalah Lahine (Nias), Paru inai (Minangkabau) (Dalimartha, 2003).

  2. Kandungan kimia Daun: 2-metoksi 1,4-naftokuinon (Thongnopnua et al., 1991).

  Biji: saponin, balsaminasterol, kuersetin, naftokuinon (Dalimartha, 2003). Bunga: sianidin, delphinidin, malvidin, kaempherol, kuersetin (Dalimartha, 2003).

  3. Khasiat dan penggunaan

  Melancarkan peredaran darah, peluruh haid, melancarkan persalinan, dan diindikasikan untuk mengobati kanker saluran cerna bagian atas (Dalimartha, 2007).

4. Penelitian tanaman pacar air

  Penelitian - penelitian yang telah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa tanaman pacar air dapat digunakan untuk obat topikal yang mempunyai efek antipruritik yang dapat mengobati beberapa tipe dari dermatitis. Telah dilaporkan juga tanaman tersebut digunakan sebagai antianafilaksis, antihistamin, antiplatelet. Senyawa aktif utama dari tanaman pacar air adalah 1,4-naftokuinon (balsakuinon) (Oku dan Kyoko, 2002). Pada penelitian yang lain, balsakuinon yang merupakan senyawa aktif dari daun pacar air memiliki aktivitas antifungal (Thongnopnua et al., 1991).

B. Naftokuinon

  

O

O

OCH ₃ Gambar 1. Struktur 2-metoksi-1,4-naftokuinon Senyawa naftokuinon merupakan senyawa aromatik alami yang

mempunyai ciri mengandung satu rantai samping alifatik yang terikat pada cincin

aromatik. Semua senyawa kuinon berupa minyak atau hablur yang mempunyai

rentang warna mulai dari kuning sampai merah dan sangat mudah larut dalam

pelarut organik seperti benzena, eter dan kloroform (Robinson, 1995).

  Senyawa derivat naftokuinon dalam beberapa penelitian telah

dikembangkan sebagai obat anti kanker. Seperti misalnya 5-hidroksi-1,4

naftokuinon dan 5-hidroksi-2-metil-1,4-naftokuinon mempunyai aktivitas sebagai anti tumor yang kuat (Anonim, 2008b). Senyawa 5-hidroksi-2-metil-1,4- naftokuinon mampu secara efektif melawan kanker payudara dengan menghambat pertumbuhan sel kanker payudara dengan tidak memberikan efek terhadap sel epitelial payudara normal (Ahmad et al., 2008). Suatu penelitian tentang senyawa 2-metoksi-1,4 naftokuinon dalam ekstrak daun pacar air identifikasi sebagai senyawa yang mempunyai aktivitas terhadap human hepatocellular carcinoma

  cell line HepG2 (Zhi-Shan et al., 2008).

C. Teknik Penyarian

  Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang disari, mengandung zat aktif yang dapat larut dan zat yang tidak larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain – lain. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986). Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).

  Pelarut merupakan cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif yang berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa lainnya dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa berkhasiat yang diinginkan (Anonim, 2000).

  Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dan digunakan simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari.

  Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan yang pekat akan keluar (Anonim, 1986).

D. Kanker

  Kanker adalah kelainan genetik yang merupakan akibat dari peristiwa - peristiwa mutasi. Mutasi tersebut mengubah fungsi normal suatu sel itu menjadi memiliki ciri – ciri berikut: (1) sel menjadi immortal, yaitu mampu melakukan pembelahan sel secara tak terbatas, (2) sel menjadi independen dari kontrol – kontrol selular normal yang membatasi pertumbuhan dan pembelahan, dan (3) sel itu menjadi invasif dengan menyebar ke jaringan – jaringan lain, dalam sebuah proses yang disebut metatasis (Elrod dan William, 2002).

  Tumor dapat dibedakan menjadi 2 yaitu tumor jinak (benigna) dan tumor ganas (malignan). Tumor benigna bukanlah kanker. Tumor benigna tumbuh di dalam suatu kapsul yang dikemas dengan baik dimana membatasi ukuran dan memelihara karakteristik sel asal, serta jarang menyebabkan kematian. Sel dari tumor benigna tidak menyebar ke bagian lain pada tubuh. Kebalikkannya tumor malignan merupakan kanker, biasanya lebih serius dan dapat mengancam hidup.

  Sel kanker dapat menyerang dan merusak organ dan jaringan didekatnya (Dipiro, 2005).

E. Kultur Sel

  1. Sel Vero

  Kultur sel Vero dimulai pertama kalinya pada tahun 1962 yang diambil dari ginjal kera (jenis African Green Monkey) yang sehat sehingga sering digunakan sebagai contoh dari sel normal (Doyle dan Griffiths, 2000).

  2. Sel SiHa

  Infeksi HPV (Human Papilomavirus) merupakan faktor tertinggi penyebab kanker leher rahim. Sel SiHa diambil dari suatu karsinoma serviks yang banyak digunakan sebagai model dari sel karsinoma serviks (Ishibashi et al., 2008).

  Serviks atau leher rahim merupakan bagian ujung bawah rahim yang menonjol ke vagina. Kanker leher rahim berkembang secara bertahap, tetapi progresif. Proses terjadinya kanker ini dimulai dengan sel yang mengalami mutasi lalu berkembang sehingga terjadi kelainan epitel yang disebut displasia (Dalimartha, 2007). Human Papilomavirus (HPV) 16 mempunyai peran dalam terjadinya karsinoma serviks (Arjono, 1999).

F. Uji Sitotoksisitas

  Sitotoksisitas ialah sifat toksis atau beracun suatu senyawa terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas ialah suatu uji yang secara in vitro menggunakan kultur sel dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik, maupun bahan- bahan kimia lainnya (Freshney, 2000).

  Metode direct counting merupakan uji yang umum dan sering digunakan untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien yaitu dengan haemocytometer. untuk mempermudah penghitungan. Pada saat suspensi sel dimasukkan ke dalam bilik, dapat langsung dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik pada haemocytometer. Trypan blue berguna untuk memastikan analisis kuantitatif dari kondisi kultur sel. Trypan blue merupakan zat warna yang hanya akan dapat menembus membran sel yang mati. Ketika suspensi sel diberi trypan blue, sel yang hidup akan tetap berbentuk bulat dan bersinar sedangkan sel yang mati mengalami perubahan menjadi berwarna biru tua. Hal yang perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam bilik pada

  

haemocytometer yaitu agar tidak ada gelembung yang dapat menyebabkan

  terjadinya kesalahan dalam penghitungan sel. Kondisi lain yang menentukan keakuratan dalam penghitungan sel adalah kebersihan bilik hitung dan ketepatan dalam pengisian suspensi sel ke dalam bilik (Doyle dan Griffiths, 2000).

  Pada penelitian dengan Brine Shrimp Test menyatakan bahwa suatu ekstrak atau bahan dikatakan mempunyai efek sitotoksik jika memiliki LC

  50 <

  1000 µg/ml dan mempunyai efek toksik yang berpotensi sebagai anti kanker jika memiliki LC

  50 < 30 µg/ml (Meyer et al., 1982).

G. Landasan Teori

  Sel SiHa merupakan model dari sel karsinoma serviks. Terjadinya karsinoma serviks diperantarai oleh Human Papilomavirus (HPV) 16. Dewasa ini produk herbal sangat berkembang. Banyak tanaman diteliti untuk digunakan sebagai obat kanker, salah satunya adalah pacar air. Dalam suatu penelitian daun pacar air mengandung senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai anti tumor terhadap human hepatoscellular carcinoma cell line HepG2. Senyawa tersebut adalah 2-metoksi-1,4 naftokuinon (Zhi-Shan et al., 2008).

  Berdasarkan penelitian tersebut, maka perlu dilakukan penelitian apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

H. Hipotesis

  Ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan penelitian Penelitian tentang uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air

  (Impatiens balsamina) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian eksperimental murni yang mengikuti rancangan acak lengkap pola satu arah.

  Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

  a. Variabel bebas Kadar ekstrak kloroform daun pacar air untuk perlakuan terhadap sel

  SiHa yaitu 30 µg/ml; 40 µg/ml; 50 µg/ml; 60 µg/ml; 70 µg/ml; 80 µg/ml; 90 µg/ml; 100 µg/ml. Untuk perlakuan terhadap sel Vero yaitu 100 µg/ml; 200 µg/ml; 300 µg/ml; 400 µg/ml; 500 µg/ml; 600 µg/ml; 700 µg/ml; 800 µg/ml

  b. Variabel tergantung Persentase kematian sel SiHa dan sel Vero

  c. Variabel pengacau terkendali i. Medium tumbuh sel SiHa dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum dan untuk sel Vero dengan medium M199. ii. Umur dan tempat tumbuh tanaman pacar air.

  Daun pacar air yang digunakan untuk penelitian ini diperoleh dari tempat

2. Definisi operasional

  1. Sitotoksisitas adalah sifat toksik atau beracun dari ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel SiHa.

  2. Sel SiHa adalah sel yang di ambil dari kanker serviks yang disebabkan oleh HPV 16.

  3. Sel Vero adalah sel yang diambil dari ginjal kera jenis African Green Monkey, digunakan sebagai contoh sel normal.

  4. Ekstrak kloroform daun pacar air adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun pacar air secara maserasi menggunakan larutan penyari kloroform.

  5. LC

  50 adalah konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang mampu

  membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50 % sel uji dan dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan 1.

   Alat

  Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas, timbangan analitik (Mettler toledo), alumunium foil, tabung conical (Nunc), autoklaf, tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge (PLC), inkubator (Memerd), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well

  plate

  (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),

  

haemocytometer (Nebauer), tissue, glove, waterbath, yellow tip, blue tip,

effendorf, masker.

2. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Daun pacar air segar.

  b. Kultur sel SiHa dan kultur sel Vero yang diambil dari stok dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

  c. Kloroform untuk preparasi ekstrak daun pacar air.

  d. Pereaksi - pereaksi untuk uji sitotoksisitas i. Media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, HEPES ii. Media penumbuh: RPMI 1640, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%,

  Penisilin - Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco), M199, natrium bikarbonat, HEPES {4-(2-hidroxyethyl)-1-piperazine etane sulphonic acid}. iii. Pelarut : DMSO (dimethylsulfoxide) 0,25 %

  e. Bahan untuk melepas sel SiHa: tripsin 0,25 %

  f. Trypan blue

D. Tata Cara Penelitian 1.

   Determinasi tanaman

  Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun pacar air segar, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi- Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku ( Backer dan Van den Brink, 1965).

  2. Pengumpulan daun pacar air

  Bahan yang digunakan berupa daun pacar air, diambil dari tanaman pacar air di daerah Tajem, Sleman. Daun tersebut dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran - kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa - sisa air menghilang. Daun dijemur di bawah sinar matahari, dengan ditutup kain hitam supaya tidak merusak kandungan dalam daun, kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 45˚ C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan menggunakan mesin sampai halus. Ukuran patikel serbuk sebesar 65 mesh yang telah di set pada mesin.

   Ekstraksi 3.

  Serbuk kering daun pacar air ditimbang kemudian dimaserasi menggunakan larutan penyari kloroform selama 24 jam dan dilakukan penyaringan menggunakan pompa vakum. Setelah itu dilakukan pengupan dengan menggunakan vacum rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat dilanjutkan dengan penguapan di atas penangas air hingga kloroform menguap semua. Ekstrak kental kemudian dimasukkan dalam oven dan setiap 2 jam ditimbang sampai didapatkan bobot konstan.

  4. Sterilisasi alat

  Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121 C dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).

  5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh

  a. Pembuatan medium pencuci RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2 lalu disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 µm. Medium

  o

  disimpan dalam almari es pada suhu 4 C (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

  b. Pembuatan medium kultur (RPMI 1640-serum) Untuk medium RPMI 1640-serum dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2 kemudian ditambahkan FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5% dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter berdiameter 0,22

  o

  µm. Media disimpan dalam almari es pada suhu 4 C (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

  6. Propagasi dan panen sel SiHa dan sel Vero

  a. Propagasi sel SiHa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan

  o

  dalam penangas air 37

  C, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan

  1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue

  o culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37 C

  dengan aliran 5% CO 2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

  b. Panen sel SiHa Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan diberi tripsin 0,25%. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar

  4

  2,5x10 /100 µl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

  c. Propagasi dan panen sel Vero Propagasi dan panen sel Vero menggunakan langkah yang sama dengan propagasi dan panen sel SiHa. Perbedaannya hanya terletak pada medium yang digunakan. Sel Vero menggunakan medium M199.

   Pembuatan larutan uji 7.

  Ekstrak kental ditimbang sebanyak 0,01 g, dilarutkan dengan pelarut DMSO 0,25 % dan diaduk untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan dengan konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air 30 - 100 µg/ml untuk perlakuan terhadap sel SiHa dan 100 – 800 µg/ml untuk perlakuan terhadap sel Vero.

  

8. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air dengan menggunakan

metode direct counting

  Pada uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan

  4 dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang

  kepadatan 2x10 /100 µl

  

telah berisi 100 µl ekstrak kloroform daun pacar air dengan kadar 30 µg/ml; 40 µg/ml;

  50 µg/ml; 60 µg/ml; 70 µg/ml; 80 µg/ml; 90 µg/ml; 100 µg/ml. Sebagai kontrol, 100 µl suspensi sel SiHa ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 – serum. Selanjutnya 96-well plate diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C, dalam inkubator dengan aliran CO

  2 5%. Pada akhir masa inkubasi,

  tiap sumuran sel diresuspensi bersama trypan blue, dimasukkan dalam haemocytometer kemudian dihitung jumlah sel dengan mikroskop.

  Uji sitotoksisitas terhadap sel Vero dilakukan dengan cara yang sama, yang membedakan adalah konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yaitu 100 µg/ml; 200 µg/ml; 300 µg/ml; 400 µg/ml; 500 µg/ml; 600 µg/ml; 700 µg/ml; 800 µg/ml dan medium yang digunakan adalah M-199.

9. Analisis Hasil

  Persentase kematian sel dihitung dengan persamaan berikut:

  sel hidup kelompok kontrol sel hidup kelompok perlakuan −

  ∑ ∑ × 100 % sel hidup kelompok kontrol

  ∑

  Untuk menghitung harga LC

  50 dilakukan perhitungan data menggunakan analisis dilakukan pengolahan data dengan statistik uji z dan untuk mengetahui adanya perbedaan antara perlakuan terhadap sel SiHa maupun sel Vero digunakan

  independent t-test dengan taraf kepercayaan 95 %.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Dalam penelitian ini, digunakan daun pacar air untuk uji sitotoksisitas

  terhadap kultur sel SiHa. Tanaman pacar air yang akan digunakan perlu diidentifikasi terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran bahwa bahan yang digunakan adalah benar tanaman pacar air.

  Determinasi tanaman ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi- Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, dengan menggunakan buku acuan (Backer dan Brink, 1986). Dari hasil determinasi, diperoleh bahwa tanaman tersebut merupakan tanaman pacar air (Impatiens balsamina ) (lampiran 1).

B. Pengumpulan Daun Pacar Air

  Daun pacar air yang digunakan untuk penelitian ini diambil dari daerah Tajem, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Agustus 2008. Daun dipanen dari tanaman yang sama dan pada waktu yang sama, hal ini bertujuan untuk menyeragamkan kualitas daun dan kandungan kimianya.

  Daun pacar air yang telah dipanen kemudian dicuci dengan air yang mengalir. Tujuannya agar dapat membersihkan daun dari pengotor - pengotor, misalnya mikroba, debu, bagian lain dari tanaman tersebut, atau bagian tanaman lain yang ikut terambil sewaktu pengumpulan bahan. Setelah dicuci daun o

  menggunakan oven pada suhu 45 C sehingga kandungan airnya berkurang dan kualitas daun masih tetap baik. Simplisia kering kemudian diserbuk untuk memperkecil ukuran partikel karena akan mempunyai luas permukaan yang besar sehingga kandungan senyawa dapat tersari dengan maksimal. Jika ukuran serbuk terlalu besar maka akan memperkecil luas permukaan dari partikel serbuk yang kontak dengan penyari. Sedangkan jika ukuran partikel terlalu kecil maka dapat mengakibatkan partikel serbuk akan menggumpal sehingga sulit untuk kontak dengan penyari.

C. Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air Pembuatan ekstrak daun pacar air dilakukan dengan metode maserasi.

  Metode ini dipilih karena prosesnya yang sederhana sehingga mudah untuk dilakukan. Sebagai cairan penyari digunakan kloroform, pemilihan cairan penyari ini didasarkan dari kandungan senyawa di dalam daun pacar air yaitu naftokuinon yang dapat larut dalam kloroform.