IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG(Vigna sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA.

TESIS
IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG
BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA
TANAMAN KACANG PANJANG (Vignasinensis L.)
BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA

I WAYAN SUKADA

PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2016






TESIS
IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG
BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA

TANAMAN KACANG PANJANG (Vignasinensis L.)
BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA

I WAYAN SUKADA

PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2016






TESIS
IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG
BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA
TANAMAN KACANG PANJANG (Vigna sinensis L.)
BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA

I WAYAN SUKADA
NIM 1490861007

PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2016
i





IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG
BERASOSIASI DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA
TANAMAN KACANG PANJANG(Vigna sinensis L.)
BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA

Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister
pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian,
Program Pascasarjana Universitas Udayana

I WAYAN SUKADA
NIM 1490861007

PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2016

ii




Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI
PADA TANGGAL, 12 Juli 2016

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si
NIP : 19540220198503 1 001

Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc
NIP : 19620607 198703 1 001

Mengetahui

Ketua
Program Studi Bioteknologi
PertanianProgram Pascasarjana

Universitas Udayana,

Direktur
Program Pascasarjana
Universitas Udayana,

Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K).
NIP : 19621009 198803 1 002
NIP : 19590215 198510 2 001



iii





PENETAPAN PANITIA PENGUJI

Tesis ini Telah Diuji pada
Tanggal 12 Juli 2016

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Direktur Program Pascasarjana Universitas
Udayana , No.3528/UN14.4/HK/2016, Tanggal 12 Juli 2016

Ketua

: Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si.

Anggota :
1. Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc
2. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P.
3. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S.
4. I Putu Sudiarta, SP., M.Si., Ph.D

iv




SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama

: I Wayan Sukada

NIM

: 1490861007

Program studi : Bioteknologi Pertanian
Judul Tesis

: IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI
DENGAN PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN
KACANG PANJANG(Vigna sinensisL.) BERDASARKAN
SEKUEN NUKLEOTIDA

Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat.
Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya
bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan
Peraturan Perundang -undangan yang berlaku.

Denpasar, 12 Juli 2016
Yang membuat pernyataan

(I Wayan Sukada)

v





UCAPAN TERIMA KASIH
Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke
hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena hanya atas asung wara nugrahaNya, tesis ini dapat diselesaikan.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih
yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir.I Dewa Nyoman Nyana, M.Si.selaku
Pembimbing I yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah memberikan
bimbingan dan saran kepada penulis; Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc selaku
Pembimbing II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran memberikan
dorongan, semangat, bimbingan, saran dan pengarahan kepada penulis selama
penyusunan tesis ini.
Ucapan yang sama juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana
Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, SpPD., KEMD dan Ibu Direktur Pascasarjana
Universitas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) serta Prof. Dr. Ir. I
Gede Rai Maya Temaja, M.P. selaku Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian
Program Pascasarjana Universitas Udayana atas kesempatan yang diberikan
kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program
Pascasarjana Universitas Udayana serta seluruh staf dosen dan staf administrasi
yang telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Pada
kesempatan ini penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar- besarnya
kepada Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S selaku ketua Laboratorium Penyakit
Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Udayana atas kesempatan untuk belajar
dan kemudahan dalam penggunaan fasilitas Laboratorium Penyakit Tumbuhan
Fakultas Pertanian Universitas Udayana, selama penulis melakukan penelitian,

serta penulis juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarmya kepada Dr.
Ir. Gede Suastika, M.Sc selaku Dosen serta staf di Institut Pertanian Bogor atas
kerjasama dan kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam penggunaan
fasilitas laboratorium di Laboratorium Virologi Tumbuhan, Institut Pertanian
Bogor, selama penulis melakukan penelitian. Ucapan terima kasih penulis
sampaikan pula kepada para penguji tesis Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S,Prof.
Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P, I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D yang
telah dengan sabar memberikan masukan, saran dan koreksi sehingga tesis ini
dapat terwujud menjadi lebih baik. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan
pada Dr. G.N Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr, Ir. I Ketut Siadi,M.Si. dan Ir. I
Gusti Ngurah Raka, M.S telah banyak membantu penulis selama menempuh
pendidikan.
Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada kedua orang tua
tercinta Made Runarta dan I Ketut Sunarti, adikku Made Edi Suryawan, dan
Kepala Desa Kerta Payangan Gianyar selaku sepupu saya I Made Gunawan.
SP.SH.,M.Par.serta sahabat-sahabat di Kerta, bersama seluruh keluarga yang tidak
dapat penulis sebutkan satu per satu atas dukungan, semangat dan do’a selama
penulis menyelesaikan pendidikan terutama penyusunan tesis ini. Teman-teman
Virologi di Fakultas Pertanian Universitas Udayana: Raga, Tude, Gusde, Veni,
Awa, Gun, Mbok Putri, Bli Dewa Oging, serta semua teman-teman yang tidak

dapat penulis sebutkan satu persatu atas do’a, kerjasama dan loyalitasnya selama

vi





ini.Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada
semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini.Semoga
tesis ini dapat memberikan sumbangan bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan
bermanfaat bagi semua.

Denpasar, 12 Juli 2016

Penulis

vii





ABSTRAK
IDENTIFIKASI SPESIES POTYVIRUS YANG BERASOSIASI DENGAN
PENYAKIT MOSAIK PADA TANAMAN KACANG PANJANG(Vigna
sinensis L.) BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA

Survei yang dilakukan pada beberapa area penanaman kacang panjang di Bali
menemukan kejadian penyakit mosaik yang cukup tinggi. Gejala penyakit
dicirikan dengan mosaik vein banding, terjadi perubahan warna pada daun,
mosaik hijau dan hijau muda kekuningan menyebar pada helaian daun, namun
jaringan sepanjang tulang daun masih tetap berwarna hijau normal (vein banding).
Untuk mengetahui virus penyebab penyakit mosaik ini, telah dilakukan sampling
terhadap tanaman sakit kemudian dilakukan identifikasi secara molekuler. RNA
total diekstraksi dari daun bergejala menggunakan RNA Extraction Kit.
Complementary (c) DNA disintesis melalui reaksi reverse transcription (RT)
menggunakan total RNA sebagai cetakan dan primer Oligo-dT.Polymerase chain
reaction (PCR) dilakukan menggunakan cDNA dan pasangan primer MJ1 dan
MJ2 yang dapat mengamplifikasi sebagian gen coat protein (CP) semua anggota
Potyvirus. Terlihat pada gel agarose, setelah dielektroporesis, satu pita DNA
berukuran sekitar 327 bp, yang sesuai dengan yang diharapkan. Hasil ini
mengindikasikan bahwa salah satu Potyvirus berasosiasi dengan penyakit mosaik
pada tanaman kacang panjang di Bali.Produk RT-PCR berhasil disekuen dengan
pembacaan dari kedua arah primer forward dan reverse. Analisis menggunakan
BLAST yang dilakukan terhadap sekuen nukleotida mendapatkan bahwa isolat
virus ini merupakan Bean common mosaic virus (BCMV) karena mempunyai
homologi yang sangat tinggi (90 – 92%) dengan isolat BCMV asal negara lain
yang telah dilaporkan di GenBank. Analisis pohon filogeni memperlihatkan
bahwa BMCV asal Bali mempunyai hubungan kekerabatan yang sangat dekat
dengan BCMV asal China.
Kata kunci :Bean common mosaic virus (BCMV), potyvirus,kacang panjang.

viii





ABSTRACT
IDENTIFICATION OF APOTYVIRUS SPECIES ASSOCIATED WITH
MOSAIC DISEASE ON YARD LONG BEAN (Vigna sinensis L.)BASED ON
NUCLEOTIDE SEQUENCE

Surveys conducted on several areas cultivating yard long bean (Vigna sinensisL.)
in Bali found high incidence of mosaic disease. The disease symptoms were
characterized by mosaic vein banding:green and yellowish green mosaic on the
leaves but the tissues along the veins were still normal green. To know the causal
virus, some diseased plants were collected and then were molecularly identified.
Total RNAs were extracted from the symptom showing leaves using RNA
Extraction Kit. Complementary (c) DNAs were syntized using total RNA as
template and Oligo dT primer in reverse transcription (RT) reaction. Polymerase
chain reaction (PCR) were conducted using cDNA as template and primer pairs of
MJ1 and MJ2 that would be used to amplified a part of coat protein (CP) gene of
all members of Potyvirus. It is found on agarose gel, after electrophoresed,one
band of approximatly 327 bp DNA that accordant with the expected one. This
result indicated that a Potyvirus was associated with mosaic disease on yard long
bean in Bali. The RT-PCR products were successfully sequenced by reading from
both direction of forward and riverse primers. BLASTanalyses of the nucleotide
sequences reveal that the virus isolate was Bean common mosaic virus (BCMV)
according to high homology of the sequence with BMCV isolates from other
country that were reported in GenBank. Phologenetic tree analyses reveal that
BCMV from Bali having close relationship with that of from China.
Keywords: Bean common mosaic virus (BCMV), potyvirus, yard long bean.

ix





RINGKASAN
Kacang panjang (Vigna sinensis L.) merupakan tanaman hortikultura jenis
kacang-kacangan yang dibudidayakan secara luas di Indonesia.Namun akhir-akhir
ini terjadi gangguan penyakit yang mempengaruhi hasil panen kacang
panjang.Penyakit penting pada kacang panjang sebagain besar disebabkan oleh
infeksi virus golongan Potyvirus.Gejala yang disebabkan oleh Potyviruspada
kacang panjang di lapangan sangatlah bervariasi karena gejala yang muncul pada
tanaman dipengaruhi oleh inang, strain virus, waktu infeksi dan kondisi
lingkungan.
Survei pada bulan Desember tahun 2015 yang dilakukan di beberapa
sentra pertanaman kacang panjang di daerah Bali, menunjukkan adanya insiden
penyakit mosaik pada tanaman kacang panjang dengan gejala mosaik vein
banding. Insiden penyakit mosaik vein banding pada tanaman kacang panjang
merupakan kejadian penyakit baru di daerah Bali.Maka dari itu asal dari virus
yang berasosiasi dengan penyakit tersebut perlu dikaji lebih lanjut sehingga dapat
dilakukan pencegahan.Selain itu, masuknya virus ke daerah Bali hanya dapat
terjadi melalui bibit kacang panjang terinfeksi virus.Untuk mengkaji masalah
tersebut penelitian yang dilakukan adalah untuk mencari keragaman genetik
Potyvirus berdasarkan perunutan basa.Berkaitan dengan hal tersebut, perlu
dilakukan penelitian untuk dapat mengidentifikasi spesies Potyvirus pada tanaman
kacang panjang di Bali. Keragaman genetik Potyvirusdi Indonesia berdasarkan
perunutan basa nukleotida belum banyak dilaporkan. Informasi yang lebih
mendalam mengenai urutan DNA dari Potyvirus yang ada di Indonesia untuk
menunjukkan adanya keragaman genetik diantara Potyvirus belum pernah
dilakukan.
Penelitian ini dilakukan di sentra penanaman kacang panjang di Bali.
Proses identifikasi virus dilakukan menggunakan metode molekuler yaitu RTPCR. Hasil PCR tersebut kemudian divisualisasikan melaui metode
electrophoresis.Jika hasil PCR tersebut posistif kemudian dilanjutkan dengan
Analisa sekuen nukleotida. Data sekuen nukeotida yang terpilih kemudian
dimodifikasi dan dianalisis spesifisitas nukleotidanya dengan program multiple
alignment, ClustalW dengan MEGA 6.0. Pohon filogenetika dikonstruksi
menggunakan program PAUP 4.9, j Model Test berdasarkan pendekatan
Maximum Parsimony. Berdasarkan hasil analisis sekuen tersebut, maka
didapatkan spesies virus yang menginfeksi tanaman kacang panjang sehingga
dapat digunakan sebagai acuan untuk tindakan pencegahan maupun pengendalian
penyebaran virus selanjutnya.
Hasil pengamatan pada beberapa sentra pertanaman kacang panjang di
Bali, tanaman kacang panjang yang diduga terinfeksi Potyvirus menunjukkan
gejala belang hijau dan kuning pada helaian daun dan mengalami penebalan
tulang daun (vein banding). Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa tanaman
kacang panjang yang diuji positif terinfeksi oleh Potyvirus.Hal ini berdasarkan
hasil dari elektroforesis dari hasil RT-PCR, dimana pita DNA dengan ukuran
sekitar 327 bp sesuai dengan primer yang digunakan.Hasil ini memberikan
informasi awal, bahwa gejala mosaik yang muncul dilapangan memang benar

x





diinfeksi oleh virus dari golongan Potyvirus. Untuk memastikan spesies Potyvirus
yang menginfeksi tanaman kacang panjang maka dilakukanlah sekuen nukleotida
pita DNA hasil PCR tersebut.
Pengujian tingkat homologi antar isolat menunjukan bahwa isolat
PotyvirusBali mempunyai kesamaan sebesar 92 % dengan isolat Potyvirusyang
berasal dari Negara-negara lain yaitu Cina, Meksiko, Amerika, Jerman, Korea
Australia, Vietnam dan Turky. Hasil penyejajaran sekuen dengan ClustalW
mendapatkan hasil, isolat Potyvirus Bali memiliki homologi yang tinggi dengan
isolate Potyvirusyang berasal dari Asia timur, Asia Tenggara, Benua Amerika,
dan Benua Eropa, dengan tingkat nilai homologi berkisar antara 90-92%.
Sedangkan isolate Bali memiliki tingkat homologi yang paling tinggi dengan
isolate Potyvirus yang berasal dari Cina. Jarak genetik menunjukan dekat atau
tidaknya hubungan kekerabatan antara sekuen nukleotida yang diamati. Isolat
Potyvirus Bali dengan memiliki nilai jarak genetik yang paling rendah rendah
dengan isolat BCMV Cina yaitu sebesar 0,030. Rendahnya nilai jarak genetik
antara Potyvirus isolat Bali dengan isolate BCMV Cina ini menunjukan bahwa
tingkat kesamaan gen antara kedua isolat tersebut sangat tinggi.
Hasil analisis filogenetika menggunakan pendekatan Maximum parsimony
membagi isolat-isolat dalam beberapa kelompok percabangan.Isolat Potyvirus
Bali terletak dalam satu clade dengan isolat BCMV yang berasal dari Cina dengan
dukngan nilai bootstrap sebesar 79,5%. Berdasarkan hasil tersebut dapat
disimpulkan bahwa isolatPotyvirus Bali, merupakan spesies Bean common mosaic
virus.
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa Gejala penyakit
mosaik pada tanaman kacang panjang di beberapa sentra pertanaman kacang
panjang di Bali berasosiasi dengan infeksi virus dari genus Potyvirus.Spesies
Potyvirusyang menginfeksi kacang panjang di Bali adalah Bean Common Mosaic
Virus. Isolat Bean common mosaic virus Bali memiliki tingkat similiritas 92%,
dengan jarak genetik yang rendah (0,030), dan dalam pohon filogeni berada dalam
satu clade dengan isolat Bean common mosaic virus yang berasal dari Cina.

xi





DAFTAR ISI

Halaman
SAMPUL DALAM ..........................................................................................

i

PRASYARAT GELAR ....................................................................................

ii

LEMBAR PENGESAHAN ..............................................................................

iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ................................................................

iv

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT .................................................

v

UCAPAN TERIMAKASIH .............................................................................

vi

ABSTRAK ........................................................................................................ viii
ABSTRACT .....................................................................................................

ix

RINGKASAN ...................................................................................................

x

DAFTAR ISI ....................................................................................................

xii

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xvii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii

BAB

I

PENDAHULUAN ....................................................................

1

1.1

Latar Belakang ..........................................................................

1

1.2

Rumusan Masalah ....................................................................

3

1.3

Tujuan Penelitian .....................................................................

3

1.4

Manfaat Penelitian ...................................................................

4

KAJIAN PUSTAKA ...............................................................

5

2.1

Klasifikasi dan Budidaya Tanaman Kacang Panjang ...............

5

2.2

Penyakit Virus pada Kacang Panjang .......................................

8

2.3

Potyvirus ...................................................................................

8

BAB II

xii





2.4

Karakter Molekuler Potyvirus ..................................................

9

2.5

Identifikasi Potyvirus ................................................................

12

2.6

Analisis Filogenetika ................................................................

14

2.6.1 Sequence Alignment .........................................................

15

2.6.2 Rekontruksi Pohon Filogenetika......................................

16

2.6.2.1 Distance method ...................................................

16

2.6.2.2 Maximum likelihood dan bayessian inference ......

17

2.6.2.3 Maximum parsimony ............................................

17

2.6.3.4 Evaluasi pohon filogenetika..................................

18

III

KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ......

20

3.1

Kerangka Berpikir.....................................................................

20

3.2

Konsep Penelitian .....................................................................

21

3.3

Hipotesis ...................................................................................

22

BAB IV

METODE PENELITIAN .........................................................

23

4.1

Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................

23

4.2

Bahan dan Alat .........................................................................

23

4.3

Pelaksanaan Penelitian..............................................................

23

4.3.1Pengumpulan Sampel Tanaman Kacang Panjang ............

23

4.3.2Deteksi Virus melalui RT-PCR ........................................

24

4.3.2.1 Ekstrasi Total RNA.......................................................

24

4.3.2.2 Sintesis Complementary (c) DNA ................................

25

4.3.2.3 Amplifikasi Complementary (c) DNA………….

26

4.3.2.4 Visualisasi Hasil RT-PCR ....................................

27

4.3.3 Sekuen Nukleotida dan Analisis Filogenetika .................

28

V

HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................

29

5.1

Gejala Infeksi Potyviruspada Tanaman

BAB

BAB

5.2

Kacang Panjang ........................................................................

29

Deteksi Potyvirus melalui RT-PCR ..........................................

31

i





5.3

Analisis Hubungan Kekerabatan Antara Isolat-Isolat ..............

33

VI

SIMPULAN DAN SARAN .....................................................

38

6.1

Simpulan ...................................................................................

38

6.2

Saran .........................................................................................

38

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................

39

LAMPIRAN …………………………………………………………………

43

BAB

xiv





DAFTAR TABEL

Halaman
2.1

5.1

5.2

Fungsi beberapa protein yang terdapat dala struktur
Genom Potyvirus.......................................................

10

HomologiPotyvirus yang menginfeksi tanaman
kacang panjang di Bali dengan sekuen homolognya
yang ada diGenBank.................................................

34

Jarak genetik Potyvirus yang menginfeksi tanaman
Kacang panjang di Bali dengan sekuen homolognya
yang ada di GenBank ................................................

35

i xv





DAFTAR GAMBAR

Halaman
2.1

Organisasi genom potyvirus..................................

11

3.1

Kerangka konsep penelitian.................................

21

5.1

Variasi gejala infeksi Potyvirus pada kacang
panjang (A) Mosaik; (B) Mosaik melepuh
(permukaan daun kasar);(C) Mosaik Vin
Banding; (D) Klorosis; (E) Malformasi
perubahan bentuk daun.........................................

29

Hasil amplifikasi DNA gen CP dengan metode
RT-PCR, menggunakan primer MJ1 dan MJ2,
dengan produk PCR ~327 bp................................

32

Hubungan kekerabatan 16 isolat virus hasil
analisis kelompok berdasarkan pola pita DNA
dengan metode Maximum Parsimony. Angka
pada cabang merupakan persentase tingkat
kepercayaaan.........................................................

36

5.2

5.3

xvi
i





DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Penyejajaran urutan nukleotida fragmen DNA
isolat Bean Common Mosaic Virus Bali dengan
isolat Bean Common Mosaic Virus lainnya yang
terdapat Di GenBank. Tanda * (bintang)
menunjukkan basa Nukleotida yang identik.........

xvii


43