Ekspresi Imunohistokimia Human Epididymis Protein 4 Pada Jaringan Kista Ovarium Benigna Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan penelitian
Penelitian ini merupakan suatu penelitian observasional analitik dengan
rancangan case control. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan ekspresi
imunohistokimia Human Epididymis Protein 4 terhadap blok paraffin jaringan
kista ovarium jinak dan ovarium normal.
Dalam penelitian ini, tidak diberikan perlakuan terhadap variabel, namun
hanya dilihat hasil pulasan immunohistokimia HE4. Pengukuran variabelnya
hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat.
3.2. Tempat dan waktu penelitian
`Penelitian ini dilakukan di Departemen Obstetri dan Ginekologi Fakultas
Kedokteran USU, dan pemeriksaan imunohistokimia dilakukan di Laboratorium
Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
Medan. Penelitian ini dilakukan bulan Mei hingga Juni 2017.
3.3.
Subjek Penelitian
Objek penelitian kelompok kasus adalah blok paraffin jaringan kista
ovarium benigna yang diperoleh dari operasi ginekologi kista ovarium benigna.
Objek penelitian kelompok kontrol adalah blok paraffin jaringan ovarium
normal yang diperoleh dari operasi ginekologi non kista ovarium, seperti pada
pasien menopause yang menjalani operasi total abdominal histerektomi dan
bisalfingoooforektomi atas indikasi hiperplasia endometrium, mioma uteri,
Universitas Sumatera Utara
karsinoma endometrium stadium dini, yang memiliki hasil histopatologi ovarium
dalam batas normal.
3.4.
Besar Sampel Penelitian
Besar sampel penelitian dihitung secara statistik dengan rumus87 :
dimana :
Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai α
yang ditentukan. Nilai α=0,10 Zα= 1,64
Zβ=
nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai β
yang ditentukan. Nilai β=0,20 Zβ= 0,84
P2=
Proporsi pada kista ovarium benigna = 0,2 25
Q2=
1-P2 = 0,8
P1=
Proporsi pada kelompok yang nilainya merupakan ketetapan peneliti =
0,8
Q1=
1-P1 = 0,2
P1-P2= Selisih proporsi minimal yang dianggap bermakna= 0,6
P=
Proporsi total =
= 0,5
Q=
1-P = 0,5
n1=
Besar sampel kelompok 1 (kasus)
n2=
Besar sampel kelompok 2 (kontrol)
Universitas Sumatera Utara
Maka perhitungan besar sampel penelitian berdasarkan rumus tersebut
didapatkan besar sampel minimal untuk masing-masing kelompok adalah n1=
n2= 18,63 dibulatkan 19 sampel (jumlah sampel masing-masing kasus dan
kontrol), sehingga total besar sampel minimal pada penelitian ini adalah 38
sampel.
Namun
pada
penelitian
ini
akan
dilakukan
pemeriksaan
imunohistokimia HE4 pada blok paraffin kista ovarium benigna sebanyak 20
sampel, dan blok paraffin jaringan ovarium normal sebanyak 20 sampel,
sehingga total akan diperiksa sebanyak 40 sampel.
3.5.
Kriteria Penelitian
3.5.1. Kriteria Inklusi
3.5.1.1.
Kelompok Kasus
Blok parafin jaringan kista ovarium benigna yang memenuhi kriteria inklusi
sebagai berikut :
1. Wanita dengan kista ovarium benigna
2. Leukosit < 11.000/mm3 , tidak dijumpai fokal infeksi
3. Tidak mempunyai riwayat tumor non ginekologis
4. Tidak mempunyai penyakit ginjal
3.5.1.2.
Kelompok Kontrol
Blok parafin jaringan ovarium normal yang diperoleh pasien menopause yang
menjalani operasi total abdominal histerektomi dan bisalfingoooforektomi atas
indikasi hiperplasia endometrium, mioma uteri, karsinoma endometrium stadium
Universitas Sumatera Utara
dini, yang memiliki hasil histopatologi ovarium dalam batas normal serta
memenuhi kriteria inklusi sebagai berikut :
1. Wanita yang menjalani pembedahan Total Abdominal Histerektomi –
Bisalfingoooforektomi dengan diagnosa non kista ovarium.
2. Tidak mempunyai penyakit ginjal.
3. Tidak mempunyai penyakit tumor non ginekologis lainnya.
3.5.2. Kriteria Eksklusi
Kriteria Eksklusi untuk kelompok kasus dan kontrol adalah :
1. Sediaan tidak dapat dianalisa oleh sebab pembuatan blok paraffin yang
tidak baik atau blok paraffin telah rusak.
2. Tidak memenuhi kriteria inklusi
3.6.
Etika Penelitian
Penelitian ini diajukan ke Komisi Etika Penelitian Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara untuk mendapatkan Ethical Clearence, setelah
mendapatkan persetujuan dari Departemen Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan untuk pemeriksaan sampel blok
paraffin di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara Medan.
3.7.
Cara Kerja Penelitian
1. Setelah mendapatkan persetujuan dari komisi etik dalam melakukan
penelitian,
penelitian
dimulai
dengan
mengumpulkan
data
dari
Departemen Patologi Anatomi RSUP Haji Adam Malik, RSU dr. Pirngadi
Medan, dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara
Universitas Sumatera Utara, berupa blok paraffin kista ovarium benigna
dan ovarium normal.
2. Dari data histopatologi tersebut, diambil data rekam medik tentang
identitas lengkap dan karakteristik pasien.
3. Dilakukan
pewarnaan
imunohistokimia.
Prosedur
imunohistokimia
dilakukan di Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran
Universitas
Sumatera
Utara
imunohistokimia Human HE4
dengan
melakukan
pewarnaan
Antibody (R & D system). Dengan
prosedur pelaksanaan sebagai berikut :
a. Deparafinisasi slide (dengan Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3) masingmasing dikerjakan selama 5 menit
b. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolute, alkohol
95%, alkohol 80%, alkohol 70%) selama 4 menit
c. Lalu dicuci dengan air mengalir selama 5 menit
d. Masukkan slide ke dalam PT Link Deko Epitope Retrieval : set up
pretreat 65°C, running time 98°C selama 15 menit
e. Pap pen, segera masukkan dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH
7,4 selama 9 menit
f. Prosedur pewarnaan menurut tabel dibawah ini:
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.7. Prosedur Pewarnaan
LANGKAH
Pretreatment
PENCUCIAN/
INSTRUKSI
WAKTU
Sesuai dengan petunjuk dari data
3x2 menit
sheet antibody primer
Jaringan Primer
Aplikasi
reagensia
dan
inkubasi
3x2 menit
selama 5 menit pada suhu ruangan
Parafin Blok
Aplikasi
reagensia
dan
inkubasi
selama 5 menit pada suhu ruangan
Antibodi Primer
Sesuai dengan petunjuk dari data
3x2 menit
sheet antibody primer
PolyVue PlusTM
Aplikasi
Enhancer
selama 10 menit pada suhu ruangan
PolyVue PlusTM
Aplikasi
HRP
selama 10 menit pada suhu ruangan
DAB/ Plus
Aplikasi
reagensia
reagensia
reagensia
dan
dan
dan
inkubasi
inkubasi
inkubasi
3x2 menit
3x2 menit
3x2 menit
selama 5 menit pada suhu ruangan
Mayer’s
Aplikasi
Hematoxylin
selama 2 menit pada suhu ruangan
reagensia
dan
inkubasi
3x2 menit
lalu dicuci dengan air
Dehidration/
Sesuai metode rutin laboratorium
N/A
Clearing/ Mounting
Universitas Sumatera Utara
3.8.
Alat, Bahan Penelitian dan Instrumen Penelitian
3.8.1. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah : Mikrotom,
waterbath. Hot plate, Freezer, inkubator, staining jar, rak kaca objek,
kaca objek, rak inkubasi, Pensil Diamond, Pipet Mikro, timbangan bahan
kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker,
tabung sentrifuge, microwave, thermolyte stirrer, kaca penutup, entelan
dan mikroskop cahaya.
3.8.2. Bahan Penelitian
o
Blok paraffin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin
sebagai jaringan kista ovarium.
o
Pulasan immunohistokimia menggunakan metode The EnVision + Dual
Link System kit, teknik pulasan IHK 2 langkah. Antibodi primer yang
digunakan
adalah
Mouse
monoclonal
Hu-antibody
HE4
dengan
pengenceran 1 : 20.
The Envision + Dual Link System kit terdiri dari :
o 1 Botol Dual endogenous enzyme block
( 15 ml)
o 1 Botol Labelled polymer –HRP
( 15 ml)
o 1 Botol DAB + Substrat Buffer
( 18 ml)
o 1 Botol DAB + Chromogen
( 1 ml)
o
Larutan PBS :
o NaCl 87,5 gr + KH2PO4 1,92 gr dalam aquadest 800 ml
o Tambahkan dengan Na2HPO42H2O 15,33 gr, aduk sampai larut
o Tambahkan aquadest sampai 1 liter
Universitas Sumatera Utara
o Bilas akan digunakan, harus diencerkan 10x.
o Larutan Buffer Sitrat :
o Citric acid 2,1 gr dilarutkan dalam 1 liter aquadest.
o Ditetesi dengan NaOH 2M sampai tercapai pH 6.
o Larutan DAB + Substrat-kromogen (1 ml larutan cukup untuk 10 jaringan)
:
o Langkah 1 : Masukkan ke aliquot 1 ml Substrat Buffer secukupnya ke
dalam kontainer ( tergantung dari jumlah spesimen yang akan
dikerjakan)
o Langkah 2 : Untuk setiap 1 mL buffer, tambahkan setetes (20 μL) cairan
DAB + Kromogen, campurkan segera.
o Larutan DAB + Substrat kromogen ini hanya stabil dalam ± 5 hari bila
disimpan dalam suhu 2-8⁰C
3.8.3. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang akan digunakan adalah hasil pulasan
immunohistokimia HE4 terhadap sampel sediaan jaringan kista ovarium
benigna. Untuk penelitian terhadap pulasan immunohistokimia HE4 adalah
sebagai berikut:
o Kontrol Positif: Jaringan yang telah diketahui positif terhadap HE4
pada penelitian terdahulu (dalam hal ini jaringan fibro adenoma
mammae)
o Kontrol negatif : Kista Ovarium dengan antibodi primer
o Positif : Warna coklat yang tampil pada sitoplasma sel epitel maupun
stroma
Universitas Sumatera Utara
o Dilakukan interpretasi sediaan tersebut oleh dua orang ahli Patologi
Anatomi. Pemeriksaan Histopatologi dilakukan dengan menggunakan
mikroskop cahaya 400x
o Kemudian dilakukan analisis data ekspresi imunohistokimia HE4
masing-masing kelompok penelitian.
o Penilaian imunohistokimia untuk ekspresi HE4 menggunakan skor
Allred karena sistem ini mempunyai sensitifitas dan spesifisitas lebih
baik dibandingkan dengan penilaian secara konvensional. Skor ini
adalah hasil penjumlahan skor persentase dari sel yang terwarnai
atau Proportion Score (PS) dan skor intensitas pewarnaannya atau
Intensity Score (IS).
Tabel 3.8.3.1. Penilaian Proportion Score (PS) dan Intensity Score (IS).88
Observasi PS
Tidak ada yang terwarnai
Kurang dari 1% sel terwarnai
1 - 10% sel terwarnai
11 - 33% sel terwarnai
33 - 66% sel terwarnai
66 - 100% sel terwarnai
PS
atau
IS
0
1
2
3
4
5
Observasi IS
Tidak terwarnai
Intensitas pewarnaan lemah
Intensitas pewarnaan sedang
Intensitas pewarnaan kuat
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.8.3.2. Interpretasi Score Allred88
Score total
0–2
≥3
Interpretasi
Negatif
Positif
IHK HE 4, 40x (+ atau ++)
No. slide: O/3926/16
IHK HE 4, 100x (+++)
No. slide: O/4374/16
Universitas Sumatera Utara
3.9.
Analisis Data
Analisa data dan uji statistik dilakukan secara terkomputerisasi. Hasil
penelitian akan disajikan ke dalam tabel distribusi frekuensi. Untuk menganalisa
perbedaan akurasi dua observer akan dihitung nilai kappa, dimana jika validitas
>75% maka tidak ditemukan perbedaan bermakna antara kedua pengamatan
observer. Hubungan antar variabel dilakukan uji statistik Chi square dengan
derajat kepercayaan 95% dan p 50 tahun
Paritas
jumlah kelahiran yang
dilihat dari rekam
Virgo
pernah dialami
medis
Nullipara
Nominal
Paritas ≥1
Usia
umur pasien saat
kalender dalam tahun
Menarche
mendapatkan haid
melalui anamnesis
≤12 tahun >12 tahun.
Nominal
Ordinal
pertama kali
Indeks Massa
Suatu pengukuran
Alat pengukur berat
WHO :
tubuh (IMT)
yang menghubungkan
badan/ timbangan
Underweight :
(membandingkan)
dalam satuan
< 18,5
berat badan dengan
Kilogram serta alat
Normal :
tinggi badan
pengukur tinggi
18,5-24,9
badan dalam satuan
Overweight:
meter dan kalkulator
25-29,9
untuk menghitung
Obese :
indeks massa tubuh
> 30
Universitas Sumatera Utara
3.11. Alur Penelitian
Data Laporan Rekam Medik
Diagnosa dan Data Umum
Pasien
Kriteria Inklusi dan Eksklusi
Sampel Blok Parafin
3. Jaringan Ovarium
Jaringan Kista Ovarium
Benigna
Jaringan Ovarium
Normal
Pewarnaan Imunohistokimia Human Epididymis Protein 4
Pembacaan Ekspresi Imunohistokimia Human Epididymis Protein 4
Analisa Data
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1.
Hasil Penelitian
Penelitian ini menggunakan subjek penelitian kelompok kasus sebanyak
20 blok paraffin jaringan kista ovarium benigna yang diperoleh dari tindakan
operasi ginekologi kasus kista ovarium jinak. Sedangkan subjek penelitian
kelompok kontrol sebanyak 20 blok paraffin jaringan ovarium normal yang
diperoleh dari tindakan operasi ginekologi kasus non kista ovarium benigna.
Pengamatan hasil pulasan immunohistokimia HE4 dilakukan oleh dua
orang observer. Untuk menganalisa perbedaan akurasi dua observer digunakan
nilai kappa, dimana didapatkan nilai uji Kappa sebesar 85,5%. Karena tidak ada
perbedaan antara kedua observer, maka pada penelitian ini digunakan hasil
pemeriksaan dari observer 1.
4.1.1. Karakteristik Subjek Penelitian
Gambaran karakteristik subjek penelitian berdasarkan usia, usia
menarche, paritas, Indeks massa tubuh, dijelaskan pada tabel di bawah ini.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.1.1. Karakteristik Subjek Penelitian Berdasarkan Usia, Usia
Menarche, Paritas, dan Indeks Massa Tubuh.
Karakteristik
Usia (tahun)
50
Usia Menarche (tahun)
≤12
>12
Paritas
Virgo
Nullipara
≥1
Indeks Massa Tubuh
Normoweight
Overweight
Obese
Kista Ovarium Jinak
Ovarium normal
(n%)
(n%)
3 (15)
14 (70)
3 (15)
0 (0)
8 (40)
12 (60)
17 (85)
3 (15)
15 (75)
5 (25)
4 (20)
2 (10)
14 (70)
0 (0)
0 (0)
20 (100)
14 (70)
4 (20)
2 (10)
15 (75)
5 (25)
0 (0)
Tabel di atas menunjukkan bahwa pada kelompok kista ovarium jinak
lebih banyak dengan usia 20-50 tahun sebanyak 14 orang (70%) kemudian
dengan usia 50 tahun masing-masing 3 orang (15%). Pada
kelompok ovarium normal lebih banyak dengan usia >50 tahun sebanyak 12
orang (60%) dan lainnya dengan usia 20-50 tahun sebanyak 8 orang (40%).
Dari usia menarche baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dijumpai usia menarche ≤12 tahun masing-masing 17 orang
(85%) dan 15 orang (75%).
Dari jumlah paritas, pada kelompok kista ovarium jinak terbanyak
dengan paritas ≥1 sebanyak 14 orang (70%) sedangkan kelompok ovarium
normal seluruhnya dengan paritas ≥1 (100%).
Universitas Sumatera Utara
Dari indeks massa tubuh baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dengan indeks massa tubuh normoweight masing-masing 14
orang (70%) dan 15 orang (75%).
4.1.2. Distribusi Histopatologi Kista Ovarium Benigna
Gambaran subjek penelitian berdasarkan klasifikasi kista ovarium
benigna dapat dilihat pada tabel di bawah ini :
Tabel 4.1.2. Distribusi Histopatologi Kista Ovarium Benigna
Jumlah
Histopatologi Kista Ovarium Benigna
N
(%)
Epitel
8
40
Cystadenoma musinosum
7
35
Cystadenoma serosum
2
10
Kista Endometriosis
Non Epitel
3
15
Kista Dermoid
Tabel di atas menunjukkan distribusi histopatologi kista ovarium jinak,
dimana terbanyak jenis epitel (85%) yaitu Cystadenoma musinosum (40%),
Cystadenoma serosum (35%), Kista Endometriosis (10%). Sedangkan jenis
non epitel hanya sebanyak 15% yaitu kista dermoid.
Universitas Sumatera Utara
4.1.3. Ekspresi Immunohistokimia HE4 Pada Jaringan Kista Ovarium
Benigna dan Ovarium Normal.
Hasil pengamatan terhadap ekspresi imunohistokimia HE4 pada jaringan
kista ovarium benigna dan ovarium normal tampak pada tabel dibawah ini.
4.1.3. Ekspresi Immunohistokimia HE4 Pada Jaringan Kista Ovarium
Jinak dan Ovarium Normal.
Hasil pengamatan terhadap ekspresi imunohistokimia HE4 pada jaringan
kista ovarium jinak dan ovarium normal tampak pada tabel dibawah ini.
Tabel 4.1.3. Ekspresi
Immunohistokimia
HE4
Pada
Jaringan
Kista
Ovarium Jinak dan Ovarium Normal.
Ekspresi HE4
(Skor Allred)
Subjek
Penelitian
Kista Ovarium
Jinak
Ovarium normal
Positif
Negatif
Total
n (%)
n (%)
N (%)
12
8
20
(60)
(40)
(100)
0
20
20
(0)
(100)
(100)
p*
OR
IK 95%
0,05).
Universitas Sumatera Utara
4.2.
Pembahasan
Penelitian dilakukan terhadap kelompok kasus 20 blok paraffin jaringan
kista ovarium benigna yang diperoleh dari tindakan operasi ginekologi kasus
kista ovarium jinak. Sedangkan subjek penelitian kelompok kontrol sebanyak 20
blok paraffin jaringan ovarium normal yang diperoleh dari tindakan operasi
ginekologi kasus non kista ovarium benigna.
Hasil yang diperoleh bahwa pada kelompok kista ovarium jinak lebih
banyak dengan usia 20-50 tahun sebanyak 14 orang (70%) kemudian dengan
usia 50 tahun masing-masing 3 orang (15%). Pada kelompok
ovarium normal lebih banyak dengan usia >50 tahun sebanyak 12 orang (60%)
dan lainnya dengan usia 20-50 tahun sebanyak 8 orang (40%). (tabel 4.1.1)
Peningkatan risiko yang dikaitkan dengan kista ovarium adalah
bertambahnya usia, menarche dini dan menopause terlambat. Proses
pertambahan
usia
akan
memungkinkan
perpanjangan
waktu
untuk
menyebabkan perubahan genetik secara acak dalam epitel permukaan
ovarium. Stimulasi yang berulang pada epitel permukaan ovarium akan
menyebabkan perubahan. Teori patogenesis kista ovarium ini disebut dengan
hipotesis “incessant ovulation”. Proses perbaikan jaringan epitel ovarium akibat
periode panjang ovulasi yang berulang dan siklik menyebabkan proliferasi
seluler yang cukup sering. Hal ini akan dapat memicu adanya mutasi gen p53
pada fase DNA. Sehingga peristiwa ini dianggap berkontribusi terhadap proses
tumorigenesis kista ovarium.43,44 Pada penelitian ini dijumpai paling banyak
pada usia 20 – 50 tahun dimana hal tersebut berkaitan dengan usia reproduktif
pasien dengan adanya proses ovulasi yang terus berlangsung pada setiap
siklus menstruasi sehingga memperbesar peluang terbentuknya kista ovarium.
Universitas Sumatera Utara
Dari usia menarche baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dijumpai usia menarche ≤12 tahun masing-masing 17 orang
(85%) dan 15 orang (75%). (Tabel 4.1.1). Hal ini sejalan dengan teori incessant
ovulation yang menunjukkan bahwa pada pasien dengan menarche yang dini
terjadi peningkatan risiko kista ovarium.43,44
Dari jumlah paritas, pada kelompok kista ovarium jinak terbanyak
dengan paritas ≥1 sebanyak 14 orang (70%) sedangkan kelompok ovarium
normal seluruhnya dengan paritas ≥1 (100%). (Tabel 4.1.1). Suatu penelitian
mendapatkan bahwa wanita nullipara akan memiliki dua kali risiko yang lebih
tinggi terkena kista ovarium, tetapi alasan pastinya belum sepenuhnya jelas.
Risiko ini akan menurun dengan riwayat melahirkan dan stabil pada wanita
yang melahirkan sebanyak enam kali. Risiko akan menurun pada wanita yang
melahirkan yang memberikan ASI dimana hal ini mungkin memiliki efek
perlindungan dengan memperpanjang periode amenore.31,41,42
Dari indeks massa tubuh baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dengan indeks massa tubuh normoweight masing-masing 14
orang (70%) dan 15 orang (75%). (Tabel 4.1.1). Meningkatnya distribusi lemak
tubuh bagian atas, juga merupakan faktor risiko terjadinya kista ovarium.
Diduga stimulasi dari estrogen ekstraovarian khususnya dari jaringan adiposa
berperan dalam perkembangan kista ovarium.35
Distribusi histopatologi kista ovarium benigna, dimana terbanyak jenis epitel
(85%) yaitu cystadenoma musinosum (40%), Cystadenoma serosum (35%),
Kista Endometriosis (10%). Sedangkan jenis non epitel hanya sebanyak 15%
yaitu kista dermoid. (Tabel 4.1.2). Hal ini sejalan dengan teori dimana insiden
kista ovarium benigna terbanyak sesuai urutan antara lain kista ovarii simpleks,
Universitas Sumatera Utara
kistadenoma
ovarii
musinosum,
kistadenoma
ovarii
serosum,
kista
endometrioid, kista dermoid.22,25
Kelompok kista ovarium jinak memiliki ekspresi HE4 sebagian besar
positif yaitu 12 orang (60%) dan negatif sebanyak 8 orang (40%). Sedangkan
kelompok ovarium normal seluruhnya memiliki ekspresi HE4 negatif (100%).
Secara statistik dijumpai adanya hubungan yang bermakna antara kelompok
subjek penelitian dengan ekspresi HE4 dengan nilai p < 0,05, dengan odds
ratio untuk kemungkinan ekspresi HE4 negatif sebesar 0,4 (IK 95% 0,23-0,68)
yang berarti bahwa kista ovarium jinak memiliki kemungkinan ekspresi HE4
negatif hanya sekitar 0,4 kali lipat. (Tabel 4.1.3)
Ekspresi dari HE4 pada kista inklusi kortikal dengan epitel tipe Mullerian
dan pada karsinoma ovarium menunjukkan bahwa ekspresi HE4 dapat dapat
timbul pada berbagai tahap awal karsinoma ovarium. Fakta bahwa galur sel
kanker ovarium yang mengekspresikan HE4 endogen dengan RT-PCR
menunjukkan kesempatan untuk memulai karakterisasi dari biologi seluler dari
protein
tersebut.
Studi
imunofluoresensi
menunjukkan
bahwa
HE4
didistribusikan pada regio dari sitoplasma dengan pola perinuklear dari
retikulum endoplasma dan aparatus Golgi.17,81 Adanya temuan positif HE4 pada
kista ovarium jinak tidak sejalan dengan beberapa penelitian sebelumnya Studi
dari Escudero dkk (2011) menunjukkan bahwa HE4 kurang dipengaruhi oleh
jenis kelamin atau status menopause dibandingkan CA-125. HE4 kadarnya
tidak meningkat pada kondisi jinak bila dibandingkan dengan CA-125, termasuk
kondisi ginekologik jinak. Penelitian yang sejalan dengan penelitian ini
diantaranya Drapkin dkk (2005) mendeteksi HE4 pada permukaan sel epitel
pada kista inklusi kortikal pada 11 ovarium yang secara histologis terbukti jinak.
Universitas Sumatera Utara
Ekspresi dari protein HE4 seperti pada penanda ovarium lainnya dapat
diidentifikasi dengan analisa ekspresi gen dan dijumpai pada proses terkait
pembentukan kista inklusi kortikal dan metaplasia Mullerian.18
Hasil penelitian ini tampaknya dapat dijawab oleh model dua pathway
dikembangkan
oleh
Shih
dan
Kurman
(2004)
dalam
usaha
untuk
menggabungkan temuan klinis, histopatologis dan genetik molekuler pada
kanker ovarium. Mereka juga menemukan perbedaan pada TP53 dan mutasi
KRAS yang dijumpai antara tumor serosa borderline (SBT) dan karsinoma
serosa. SBT menunjukkan subset tumor ovarium serosa yang non invasif,
tampaknya berkembang dari kistadenoma serosa benigna, dan berkembang
sangat perlahan menjadi karsinoma serosa derajat rendah. SBT tidak memiliki
mutasi TP53 yang merupakan karakteristik karsinoma serosa derajat tinggi.
Pengamatan ini menunjukkan formulasi yang mengklasifikasikan seluruh tumor
ovarium sebagai tipe I dan tipe II. Tumor tipe I termasuk seluruh histotipe utama
(serosa, endometrioid, musinosum, sel jernih, dan transisional), menunjukkan
gambaran arsitektural dan inti sel derajat rendah, pertumbuhan yang lambat,
dan dapat dihubungkan dengan lesi prekursor ovarium jinak. Alterasi genetik
utama diantara tumor tipe I adalah mutasi KRAS dan BRAF, dimana keduanya
mengaktivasi jalur sinyal MAPK onkogenik.44
Ekspresi HE-4 positif tertinggi dijumpai pada kelompok cystadenoma
musinosum yaitu sebanyak 2 orang (66,7%). Sedangkan ekspresi HE-4 negatif
terutama dijumpai pada subtipe cystadenoma serosum dan kista endometriosis.
Secara statistik diperoleh kesimpulan bahwa tidak terdapat hubungan antara
jenis subtipe kista ovarium benigna dengan ekspresi immunohistokimia HE-4
(p>0,05). (Tabel 4.1.4). Namun oleh karena ditemukan peningkatan ekspresi
Universitas Sumatera Utara
HE4 pada kista ovarium benigna hal ini menunjukkan bahwa HE4 berperan
pada proses tumorigenesis kista ovarium benigna. Ekspresi dari HE4 dalam
progresi dari neoplasma jinak menjadi borderline hingga maligna belum
dipahami sepenuhnya. Temuan pada tingkat pemeriksaan histopatologis
menunjukkan bahwa HE4 tidak saja di ekspresikan pada tumor ganas ovarium,
tetapi juga pada berbagai lesi jinak ovarium. Temuan sebelumnya telah
menunjukkan HE4 menunjukkan ekspresi kuat pada karsinoma serous dan
endometrioid. HE4 pada studi Georgakopoulos dkk (2012) menunjukkan
ekspresi
kuat
pada
clear
cell
carcinoma,
borderline
serous
tumors,
endometriosis, dan mucinous cystadenoma ovarii. Pada tuba fallopii dan
karsinoma tuba fallopii menunjukkan peningkatan level ekspresi HE4. HE4 di
ekspresikan secara kuat pada karsinoma primer dari tuba fallopi dan sel – sel
sekretori dan interkalasi jinak tuba fallopii, pada kista inklusi kortikal, dan pada
sel mesotelial. Meskipun ekspresi HE4 dapat terlihat pada berbagai jaringan
kista ovarium jinak, mukosa tuba normal, dan sel mesotelial dapat
menyingkirkan kegunaan HE4 sebagai penanda untuk skrining primer, namun
ekspresi yang kuat pada karsinoma ovarium dan tuba menunjukkan bahwa HE4
dapat berguna sebagai penanda yang sensitif untuk rekurensi penyakit.
Ekspresi yang kuat pada beberapa lesi ovarium jinak menunjukkan bahwa HE4
mungkin memiliki keterbatasan spesifisitas sebagai penanda tumor ovarium.90
Universitas Sumatera Utara
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1.
Simpulan
1. Subjek penelitian kelompok kista ovarium jinak terbanyak dengan usia
20-50 tahun, usia menarche ≤12 tahun, paritas ≥1, IMT normal
sedangkan kelompok ovarium normal terbanyak dengan usia >50 tahun,
usia menarche ≤12 tahun, paritas ≥1, IMT normal.
2. Distribusi histopatologi kista ovarium benigna terbanyak dengan jenis
epitel.
3. Ada hubungan yang bermakna antara kista ovarium benigna dengan
ekspresi HE4 dengan OR sebesar 0,4.
4. Tidak ada hubungan yang bermakna antara jenis histopatologi kista
ovarium benigna dengan ekspresi HE4.
5.2.
Saran
Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai HE4 untuk lebih memahami
perannya pada patofisiologi terjadinya kista ovarium jinak.
Universitas Sumatera Utara
METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan penelitian
Penelitian ini merupakan suatu penelitian observasional analitik dengan
rancangan case control. Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaan ekspresi
imunohistokimia Human Epididymis Protein 4 terhadap blok paraffin jaringan
kista ovarium jinak dan ovarium normal.
Dalam penelitian ini, tidak diberikan perlakuan terhadap variabel, namun
hanya dilihat hasil pulasan immunohistokimia HE4. Pengukuran variabelnya
hanya dilakukan satu kali dan pada satu saat.
3.2. Tempat dan waktu penelitian
`Penelitian ini dilakukan di Departemen Obstetri dan Ginekologi Fakultas
Kedokteran USU, dan pemeriksaan imunohistokimia dilakukan di Laboratorium
Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara
Medan. Penelitian ini dilakukan bulan Mei hingga Juni 2017.
3.3.
Subjek Penelitian
Objek penelitian kelompok kasus adalah blok paraffin jaringan kista
ovarium benigna yang diperoleh dari operasi ginekologi kista ovarium benigna.
Objek penelitian kelompok kontrol adalah blok paraffin jaringan ovarium
normal yang diperoleh dari operasi ginekologi non kista ovarium, seperti pada
pasien menopause yang menjalani operasi total abdominal histerektomi dan
bisalfingoooforektomi atas indikasi hiperplasia endometrium, mioma uteri,
Universitas Sumatera Utara
karsinoma endometrium stadium dini, yang memiliki hasil histopatologi ovarium
dalam batas normal.
3.4.
Besar Sampel Penelitian
Besar sampel penelitian dihitung secara statistik dengan rumus87 :
dimana :
Zα = nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai α
yang ditentukan. Nilai α=0,10 Zα= 1,64
Zβ=
nilai baku normal dari tabel Z yang besarnya bergantung pada nilai β
yang ditentukan. Nilai β=0,20 Zβ= 0,84
P2=
Proporsi pada kista ovarium benigna = 0,2 25
Q2=
1-P2 = 0,8
P1=
Proporsi pada kelompok yang nilainya merupakan ketetapan peneliti =
0,8
Q1=
1-P1 = 0,2
P1-P2= Selisih proporsi minimal yang dianggap bermakna= 0,6
P=
Proporsi total =
= 0,5
Q=
1-P = 0,5
n1=
Besar sampel kelompok 1 (kasus)
n2=
Besar sampel kelompok 2 (kontrol)
Universitas Sumatera Utara
Maka perhitungan besar sampel penelitian berdasarkan rumus tersebut
didapatkan besar sampel minimal untuk masing-masing kelompok adalah n1=
n2= 18,63 dibulatkan 19 sampel (jumlah sampel masing-masing kasus dan
kontrol), sehingga total besar sampel minimal pada penelitian ini adalah 38
sampel.
Namun
pada
penelitian
ini
akan
dilakukan
pemeriksaan
imunohistokimia HE4 pada blok paraffin kista ovarium benigna sebanyak 20
sampel, dan blok paraffin jaringan ovarium normal sebanyak 20 sampel,
sehingga total akan diperiksa sebanyak 40 sampel.
3.5.
Kriteria Penelitian
3.5.1. Kriteria Inklusi
3.5.1.1.
Kelompok Kasus
Blok parafin jaringan kista ovarium benigna yang memenuhi kriteria inklusi
sebagai berikut :
1. Wanita dengan kista ovarium benigna
2. Leukosit < 11.000/mm3 , tidak dijumpai fokal infeksi
3. Tidak mempunyai riwayat tumor non ginekologis
4. Tidak mempunyai penyakit ginjal
3.5.1.2.
Kelompok Kontrol
Blok parafin jaringan ovarium normal yang diperoleh pasien menopause yang
menjalani operasi total abdominal histerektomi dan bisalfingoooforektomi atas
indikasi hiperplasia endometrium, mioma uteri, karsinoma endometrium stadium
Universitas Sumatera Utara
dini, yang memiliki hasil histopatologi ovarium dalam batas normal serta
memenuhi kriteria inklusi sebagai berikut :
1. Wanita yang menjalani pembedahan Total Abdominal Histerektomi –
Bisalfingoooforektomi dengan diagnosa non kista ovarium.
2. Tidak mempunyai penyakit ginjal.
3. Tidak mempunyai penyakit tumor non ginekologis lainnya.
3.5.2. Kriteria Eksklusi
Kriteria Eksklusi untuk kelompok kasus dan kontrol adalah :
1. Sediaan tidak dapat dianalisa oleh sebab pembuatan blok paraffin yang
tidak baik atau blok paraffin telah rusak.
2. Tidak memenuhi kriteria inklusi
3.6.
Etika Penelitian
Penelitian ini diajukan ke Komisi Etika Penelitian Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara untuk mendapatkan Ethical Clearence, setelah
mendapatkan persetujuan dari Departemen Patologi Anatomi Fakultas
Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan untuk pemeriksaan sampel blok
paraffin di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara Medan.
3.7.
Cara Kerja Penelitian
1. Setelah mendapatkan persetujuan dari komisi etik dalam melakukan
penelitian,
penelitian
dimulai
dengan
mengumpulkan
data
dari
Departemen Patologi Anatomi RSUP Haji Adam Malik, RSU dr. Pirngadi
Medan, dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara
Universitas Sumatera Utara, berupa blok paraffin kista ovarium benigna
dan ovarium normal.
2. Dari data histopatologi tersebut, diambil data rekam medik tentang
identitas lengkap dan karakteristik pasien.
3. Dilakukan
pewarnaan
imunohistokimia.
Prosedur
imunohistokimia
dilakukan di Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran
Universitas
Sumatera
Utara
imunohistokimia Human HE4
dengan
melakukan
pewarnaan
Antibody (R & D system). Dengan
prosedur pelaksanaan sebagai berikut :
a. Deparafinisasi slide (dengan Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3) masingmasing dikerjakan selama 5 menit
b. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolute, alkohol
95%, alkohol 80%, alkohol 70%) selama 4 menit
c. Lalu dicuci dengan air mengalir selama 5 menit
d. Masukkan slide ke dalam PT Link Deko Epitope Retrieval : set up
pretreat 65°C, running time 98°C selama 15 menit
e. Pap pen, segera masukkan dalam Tris Buffered Saline (TBS) pH
7,4 selama 9 menit
f. Prosedur pewarnaan menurut tabel dibawah ini:
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.7. Prosedur Pewarnaan
LANGKAH
Pretreatment
PENCUCIAN/
INSTRUKSI
WAKTU
Sesuai dengan petunjuk dari data
3x2 menit
sheet antibody primer
Jaringan Primer
Aplikasi
reagensia
dan
inkubasi
3x2 menit
selama 5 menit pada suhu ruangan
Parafin Blok
Aplikasi
reagensia
dan
inkubasi
selama 5 menit pada suhu ruangan
Antibodi Primer
Sesuai dengan petunjuk dari data
3x2 menit
sheet antibody primer
PolyVue PlusTM
Aplikasi
Enhancer
selama 10 menit pada suhu ruangan
PolyVue PlusTM
Aplikasi
HRP
selama 10 menit pada suhu ruangan
DAB/ Plus
Aplikasi
reagensia
reagensia
reagensia
dan
dan
dan
inkubasi
inkubasi
inkubasi
3x2 menit
3x2 menit
3x2 menit
selama 5 menit pada suhu ruangan
Mayer’s
Aplikasi
Hematoxylin
selama 2 menit pada suhu ruangan
reagensia
dan
inkubasi
3x2 menit
lalu dicuci dengan air
Dehidration/
Sesuai metode rutin laboratorium
N/A
Clearing/ Mounting
Universitas Sumatera Utara
3.8.
Alat, Bahan Penelitian dan Instrumen Penelitian
3.8.1. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah : Mikrotom,
waterbath. Hot plate, Freezer, inkubator, staining jar, rak kaca objek,
kaca objek, rak inkubasi, Pensil Diamond, Pipet Mikro, timbangan bahan
kimia, kertas saring, pengukur waktu, gelas Erlenmeyer, gelas beker,
tabung sentrifuge, microwave, thermolyte stirrer, kaca penutup, entelan
dan mikroskop cahaya.
3.8.2. Bahan Penelitian
o
Blok paraffin yang telah didiagnosa dengan pulasan Hematoksilin Eosin
sebagai jaringan kista ovarium.
o
Pulasan immunohistokimia menggunakan metode The EnVision + Dual
Link System kit, teknik pulasan IHK 2 langkah. Antibodi primer yang
digunakan
adalah
Mouse
monoclonal
Hu-antibody
HE4
dengan
pengenceran 1 : 20.
The Envision + Dual Link System kit terdiri dari :
o 1 Botol Dual endogenous enzyme block
( 15 ml)
o 1 Botol Labelled polymer –HRP
( 15 ml)
o 1 Botol DAB + Substrat Buffer
( 18 ml)
o 1 Botol DAB + Chromogen
( 1 ml)
o
Larutan PBS :
o NaCl 87,5 gr + KH2PO4 1,92 gr dalam aquadest 800 ml
o Tambahkan dengan Na2HPO42H2O 15,33 gr, aduk sampai larut
o Tambahkan aquadest sampai 1 liter
Universitas Sumatera Utara
o Bilas akan digunakan, harus diencerkan 10x.
o Larutan Buffer Sitrat :
o Citric acid 2,1 gr dilarutkan dalam 1 liter aquadest.
o Ditetesi dengan NaOH 2M sampai tercapai pH 6.
o Larutan DAB + Substrat-kromogen (1 ml larutan cukup untuk 10 jaringan)
:
o Langkah 1 : Masukkan ke aliquot 1 ml Substrat Buffer secukupnya ke
dalam kontainer ( tergantung dari jumlah spesimen yang akan
dikerjakan)
o Langkah 2 : Untuk setiap 1 mL buffer, tambahkan setetes (20 μL) cairan
DAB + Kromogen, campurkan segera.
o Larutan DAB + Substrat kromogen ini hanya stabil dalam ± 5 hari bila
disimpan dalam suhu 2-8⁰C
3.8.3. Instrumen Penelitian
Instrumen penelitian yang akan digunakan adalah hasil pulasan
immunohistokimia HE4 terhadap sampel sediaan jaringan kista ovarium
benigna. Untuk penelitian terhadap pulasan immunohistokimia HE4 adalah
sebagai berikut:
o Kontrol Positif: Jaringan yang telah diketahui positif terhadap HE4
pada penelitian terdahulu (dalam hal ini jaringan fibro adenoma
mammae)
o Kontrol negatif : Kista Ovarium dengan antibodi primer
o Positif : Warna coklat yang tampil pada sitoplasma sel epitel maupun
stroma
Universitas Sumatera Utara
o Dilakukan interpretasi sediaan tersebut oleh dua orang ahli Patologi
Anatomi. Pemeriksaan Histopatologi dilakukan dengan menggunakan
mikroskop cahaya 400x
o Kemudian dilakukan analisis data ekspresi imunohistokimia HE4
masing-masing kelompok penelitian.
o Penilaian imunohistokimia untuk ekspresi HE4 menggunakan skor
Allred karena sistem ini mempunyai sensitifitas dan spesifisitas lebih
baik dibandingkan dengan penilaian secara konvensional. Skor ini
adalah hasil penjumlahan skor persentase dari sel yang terwarnai
atau Proportion Score (PS) dan skor intensitas pewarnaannya atau
Intensity Score (IS).
Tabel 3.8.3.1. Penilaian Proportion Score (PS) dan Intensity Score (IS).88
Observasi PS
Tidak ada yang terwarnai
Kurang dari 1% sel terwarnai
1 - 10% sel terwarnai
11 - 33% sel terwarnai
33 - 66% sel terwarnai
66 - 100% sel terwarnai
PS
atau
IS
0
1
2
3
4
5
Observasi IS
Tidak terwarnai
Intensitas pewarnaan lemah
Intensitas pewarnaan sedang
Intensitas pewarnaan kuat
Universitas Sumatera Utara
Tabel 3.8.3.2. Interpretasi Score Allred88
Score total
0–2
≥3
Interpretasi
Negatif
Positif
IHK HE 4, 40x (+ atau ++)
No. slide: O/3926/16
IHK HE 4, 100x (+++)
No. slide: O/4374/16
Universitas Sumatera Utara
3.9.
Analisis Data
Analisa data dan uji statistik dilakukan secara terkomputerisasi. Hasil
penelitian akan disajikan ke dalam tabel distribusi frekuensi. Untuk menganalisa
perbedaan akurasi dua observer akan dihitung nilai kappa, dimana jika validitas
>75% maka tidak ditemukan perbedaan bermakna antara kedua pengamatan
observer. Hubungan antar variabel dilakukan uji statistik Chi square dengan
derajat kepercayaan 95% dan p 50 tahun
Paritas
jumlah kelahiran yang
dilihat dari rekam
Virgo
pernah dialami
medis
Nullipara
Nominal
Paritas ≥1
Usia
umur pasien saat
kalender dalam tahun
Menarche
mendapatkan haid
melalui anamnesis
≤12 tahun >12 tahun.
Nominal
Ordinal
pertama kali
Indeks Massa
Suatu pengukuran
Alat pengukur berat
WHO :
tubuh (IMT)
yang menghubungkan
badan/ timbangan
Underweight :
(membandingkan)
dalam satuan
< 18,5
berat badan dengan
Kilogram serta alat
Normal :
tinggi badan
pengukur tinggi
18,5-24,9
badan dalam satuan
Overweight:
meter dan kalkulator
25-29,9
untuk menghitung
Obese :
indeks massa tubuh
> 30
Universitas Sumatera Utara
3.11. Alur Penelitian
Data Laporan Rekam Medik
Diagnosa dan Data Umum
Pasien
Kriteria Inklusi dan Eksklusi
Sampel Blok Parafin
3. Jaringan Ovarium
Jaringan Kista Ovarium
Benigna
Jaringan Ovarium
Normal
Pewarnaan Imunohistokimia Human Epididymis Protein 4
Pembacaan Ekspresi Imunohistokimia Human Epididymis Protein 4
Analisa Data
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1.
Hasil Penelitian
Penelitian ini menggunakan subjek penelitian kelompok kasus sebanyak
20 blok paraffin jaringan kista ovarium benigna yang diperoleh dari tindakan
operasi ginekologi kasus kista ovarium jinak. Sedangkan subjek penelitian
kelompok kontrol sebanyak 20 blok paraffin jaringan ovarium normal yang
diperoleh dari tindakan operasi ginekologi kasus non kista ovarium benigna.
Pengamatan hasil pulasan immunohistokimia HE4 dilakukan oleh dua
orang observer. Untuk menganalisa perbedaan akurasi dua observer digunakan
nilai kappa, dimana didapatkan nilai uji Kappa sebesar 85,5%. Karena tidak ada
perbedaan antara kedua observer, maka pada penelitian ini digunakan hasil
pemeriksaan dari observer 1.
4.1.1. Karakteristik Subjek Penelitian
Gambaran karakteristik subjek penelitian berdasarkan usia, usia
menarche, paritas, Indeks massa tubuh, dijelaskan pada tabel di bawah ini.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 4.1.1. Karakteristik Subjek Penelitian Berdasarkan Usia, Usia
Menarche, Paritas, dan Indeks Massa Tubuh.
Karakteristik
Usia (tahun)
50
Usia Menarche (tahun)
≤12
>12
Paritas
Virgo
Nullipara
≥1
Indeks Massa Tubuh
Normoweight
Overweight
Obese
Kista Ovarium Jinak
Ovarium normal
(n%)
(n%)
3 (15)
14 (70)
3 (15)
0 (0)
8 (40)
12 (60)
17 (85)
3 (15)
15 (75)
5 (25)
4 (20)
2 (10)
14 (70)
0 (0)
0 (0)
20 (100)
14 (70)
4 (20)
2 (10)
15 (75)
5 (25)
0 (0)
Tabel di atas menunjukkan bahwa pada kelompok kista ovarium jinak
lebih banyak dengan usia 20-50 tahun sebanyak 14 orang (70%) kemudian
dengan usia 50 tahun masing-masing 3 orang (15%). Pada
kelompok ovarium normal lebih banyak dengan usia >50 tahun sebanyak 12
orang (60%) dan lainnya dengan usia 20-50 tahun sebanyak 8 orang (40%).
Dari usia menarche baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dijumpai usia menarche ≤12 tahun masing-masing 17 orang
(85%) dan 15 orang (75%).
Dari jumlah paritas, pada kelompok kista ovarium jinak terbanyak
dengan paritas ≥1 sebanyak 14 orang (70%) sedangkan kelompok ovarium
normal seluruhnya dengan paritas ≥1 (100%).
Universitas Sumatera Utara
Dari indeks massa tubuh baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dengan indeks massa tubuh normoweight masing-masing 14
orang (70%) dan 15 orang (75%).
4.1.2. Distribusi Histopatologi Kista Ovarium Benigna
Gambaran subjek penelitian berdasarkan klasifikasi kista ovarium
benigna dapat dilihat pada tabel di bawah ini :
Tabel 4.1.2. Distribusi Histopatologi Kista Ovarium Benigna
Jumlah
Histopatologi Kista Ovarium Benigna
N
(%)
Epitel
8
40
Cystadenoma musinosum
7
35
Cystadenoma serosum
2
10
Kista Endometriosis
Non Epitel
3
15
Kista Dermoid
Tabel di atas menunjukkan distribusi histopatologi kista ovarium jinak,
dimana terbanyak jenis epitel (85%) yaitu Cystadenoma musinosum (40%),
Cystadenoma serosum (35%), Kista Endometriosis (10%). Sedangkan jenis
non epitel hanya sebanyak 15% yaitu kista dermoid.
Universitas Sumatera Utara
4.1.3. Ekspresi Immunohistokimia HE4 Pada Jaringan Kista Ovarium
Benigna dan Ovarium Normal.
Hasil pengamatan terhadap ekspresi imunohistokimia HE4 pada jaringan
kista ovarium benigna dan ovarium normal tampak pada tabel dibawah ini.
4.1.3. Ekspresi Immunohistokimia HE4 Pada Jaringan Kista Ovarium
Jinak dan Ovarium Normal.
Hasil pengamatan terhadap ekspresi imunohistokimia HE4 pada jaringan
kista ovarium jinak dan ovarium normal tampak pada tabel dibawah ini.
Tabel 4.1.3. Ekspresi
Immunohistokimia
HE4
Pada
Jaringan
Kista
Ovarium Jinak dan Ovarium Normal.
Ekspresi HE4
(Skor Allred)
Subjek
Penelitian
Kista Ovarium
Jinak
Ovarium normal
Positif
Negatif
Total
n (%)
n (%)
N (%)
12
8
20
(60)
(40)
(100)
0
20
20
(0)
(100)
(100)
p*
OR
IK 95%
0,05).
Universitas Sumatera Utara
4.2.
Pembahasan
Penelitian dilakukan terhadap kelompok kasus 20 blok paraffin jaringan
kista ovarium benigna yang diperoleh dari tindakan operasi ginekologi kasus
kista ovarium jinak. Sedangkan subjek penelitian kelompok kontrol sebanyak 20
blok paraffin jaringan ovarium normal yang diperoleh dari tindakan operasi
ginekologi kasus non kista ovarium benigna.
Hasil yang diperoleh bahwa pada kelompok kista ovarium jinak lebih
banyak dengan usia 20-50 tahun sebanyak 14 orang (70%) kemudian dengan
usia 50 tahun masing-masing 3 orang (15%). Pada kelompok
ovarium normal lebih banyak dengan usia >50 tahun sebanyak 12 orang (60%)
dan lainnya dengan usia 20-50 tahun sebanyak 8 orang (40%). (tabel 4.1.1)
Peningkatan risiko yang dikaitkan dengan kista ovarium adalah
bertambahnya usia, menarche dini dan menopause terlambat. Proses
pertambahan
usia
akan
memungkinkan
perpanjangan
waktu
untuk
menyebabkan perubahan genetik secara acak dalam epitel permukaan
ovarium. Stimulasi yang berulang pada epitel permukaan ovarium akan
menyebabkan perubahan. Teori patogenesis kista ovarium ini disebut dengan
hipotesis “incessant ovulation”. Proses perbaikan jaringan epitel ovarium akibat
periode panjang ovulasi yang berulang dan siklik menyebabkan proliferasi
seluler yang cukup sering. Hal ini akan dapat memicu adanya mutasi gen p53
pada fase DNA. Sehingga peristiwa ini dianggap berkontribusi terhadap proses
tumorigenesis kista ovarium.43,44 Pada penelitian ini dijumpai paling banyak
pada usia 20 – 50 tahun dimana hal tersebut berkaitan dengan usia reproduktif
pasien dengan adanya proses ovulasi yang terus berlangsung pada setiap
siklus menstruasi sehingga memperbesar peluang terbentuknya kista ovarium.
Universitas Sumatera Utara
Dari usia menarche baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dijumpai usia menarche ≤12 tahun masing-masing 17 orang
(85%) dan 15 orang (75%). (Tabel 4.1.1). Hal ini sejalan dengan teori incessant
ovulation yang menunjukkan bahwa pada pasien dengan menarche yang dini
terjadi peningkatan risiko kista ovarium.43,44
Dari jumlah paritas, pada kelompok kista ovarium jinak terbanyak
dengan paritas ≥1 sebanyak 14 orang (70%) sedangkan kelompok ovarium
normal seluruhnya dengan paritas ≥1 (100%). (Tabel 4.1.1). Suatu penelitian
mendapatkan bahwa wanita nullipara akan memiliki dua kali risiko yang lebih
tinggi terkena kista ovarium, tetapi alasan pastinya belum sepenuhnya jelas.
Risiko ini akan menurun dengan riwayat melahirkan dan stabil pada wanita
yang melahirkan sebanyak enam kali. Risiko akan menurun pada wanita yang
melahirkan yang memberikan ASI dimana hal ini mungkin memiliki efek
perlindungan dengan memperpanjang periode amenore.31,41,42
Dari indeks massa tubuh baik kelompok kista ovarium jinak dan ovarium
normal, terbanyak dengan indeks massa tubuh normoweight masing-masing 14
orang (70%) dan 15 orang (75%). (Tabel 4.1.1). Meningkatnya distribusi lemak
tubuh bagian atas, juga merupakan faktor risiko terjadinya kista ovarium.
Diduga stimulasi dari estrogen ekstraovarian khususnya dari jaringan adiposa
berperan dalam perkembangan kista ovarium.35
Distribusi histopatologi kista ovarium benigna, dimana terbanyak jenis epitel
(85%) yaitu cystadenoma musinosum (40%), Cystadenoma serosum (35%),
Kista Endometriosis (10%). Sedangkan jenis non epitel hanya sebanyak 15%
yaitu kista dermoid. (Tabel 4.1.2). Hal ini sejalan dengan teori dimana insiden
kista ovarium benigna terbanyak sesuai urutan antara lain kista ovarii simpleks,
Universitas Sumatera Utara
kistadenoma
ovarii
musinosum,
kistadenoma
ovarii
serosum,
kista
endometrioid, kista dermoid.22,25
Kelompok kista ovarium jinak memiliki ekspresi HE4 sebagian besar
positif yaitu 12 orang (60%) dan negatif sebanyak 8 orang (40%). Sedangkan
kelompok ovarium normal seluruhnya memiliki ekspresi HE4 negatif (100%).
Secara statistik dijumpai adanya hubungan yang bermakna antara kelompok
subjek penelitian dengan ekspresi HE4 dengan nilai p < 0,05, dengan odds
ratio untuk kemungkinan ekspresi HE4 negatif sebesar 0,4 (IK 95% 0,23-0,68)
yang berarti bahwa kista ovarium jinak memiliki kemungkinan ekspresi HE4
negatif hanya sekitar 0,4 kali lipat. (Tabel 4.1.3)
Ekspresi dari HE4 pada kista inklusi kortikal dengan epitel tipe Mullerian
dan pada karsinoma ovarium menunjukkan bahwa ekspresi HE4 dapat dapat
timbul pada berbagai tahap awal karsinoma ovarium. Fakta bahwa galur sel
kanker ovarium yang mengekspresikan HE4 endogen dengan RT-PCR
menunjukkan kesempatan untuk memulai karakterisasi dari biologi seluler dari
protein
tersebut.
Studi
imunofluoresensi
menunjukkan
bahwa
HE4
didistribusikan pada regio dari sitoplasma dengan pola perinuklear dari
retikulum endoplasma dan aparatus Golgi.17,81 Adanya temuan positif HE4 pada
kista ovarium jinak tidak sejalan dengan beberapa penelitian sebelumnya Studi
dari Escudero dkk (2011) menunjukkan bahwa HE4 kurang dipengaruhi oleh
jenis kelamin atau status menopause dibandingkan CA-125. HE4 kadarnya
tidak meningkat pada kondisi jinak bila dibandingkan dengan CA-125, termasuk
kondisi ginekologik jinak. Penelitian yang sejalan dengan penelitian ini
diantaranya Drapkin dkk (2005) mendeteksi HE4 pada permukaan sel epitel
pada kista inklusi kortikal pada 11 ovarium yang secara histologis terbukti jinak.
Universitas Sumatera Utara
Ekspresi dari protein HE4 seperti pada penanda ovarium lainnya dapat
diidentifikasi dengan analisa ekspresi gen dan dijumpai pada proses terkait
pembentukan kista inklusi kortikal dan metaplasia Mullerian.18
Hasil penelitian ini tampaknya dapat dijawab oleh model dua pathway
dikembangkan
oleh
Shih
dan
Kurman
(2004)
dalam
usaha
untuk
menggabungkan temuan klinis, histopatologis dan genetik molekuler pada
kanker ovarium. Mereka juga menemukan perbedaan pada TP53 dan mutasi
KRAS yang dijumpai antara tumor serosa borderline (SBT) dan karsinoma
serosa. SBT menunjukkan subset tumor ovarium serosa yang non invasif,
tampaknya berkembang dari kistadenoma serosa benigna, dan berkembang
sangat perlahan menjadi karsinoma serosa derajat rendah. SBT tidak memiliki
mutasi TP53 yang merupakan karakteristik karsinoma serosa derajat tinggi.
Pengamatan ini menunjukkan formulasi yang mengklasifikasikan seluruh tumor
ovarium sebagai tipe I dan tipe II. Tumor tipe I termasuk seluruh histotipe utama
(serosa, endometrioid, musinosum, sel jernih, dan transisional), menunjukkan
gambaran arsitektural dan inti sel derajat rendah, pertumbuhan yang lambat,
dan dapat dihubungkan dengan lesi prekursor ovarium jinak. Alterasi genetik
utama diantara tumor tipe I adalah mutasi KRAS dan BRAF, dimana keduanya
mengaktivasi jalur sinyal MAPK onkogenik.44
Ekspresi HE-4 positif tertinggi dijumpai pada kelompok cystadenoma
musinosum yaitu sebanyak 2 orang (66,7%). Sedangkan ekspresi HE-4 negatif
terutama dijumpai pada subtipe cystadenoma serosum dan kista endometriosis.
Secara statistik diperoleh kesimpulan bahwa tidak terdapat hubungan antara
jenis subtipe kista ovarium benigna dengan ekspresi immunohistokimia HE-4
(p>0,05). (Tabel 4.1.4). Namun oleh karena ditemukan peningkatan ekspresi
Universitas Sumatera Utara
HE4 pada kista ovarium benigna hal ini menunjukkan bahwa HE4 berperan
pada proses tumorigenesis kista ovarium benigna. Ekspresi dari HE4 dalam
progresi dari neoplasma jinak menjadi borderline hingga maligna belum
dipahami sepenuhnya. Temuan pada tingkat pemeriksaan histopatologis
menunjukkan bahwa HE4 tidak saja di ekspresikan pada tumor ganas ovarium,
tetapi juga pada berbagai lesi jinak ovarium. Temuan sebelumnya telah
menunjukkan HE4 menunjukkan ekspresi kuat pada karsinoma serous dan
endometrioid. HE4 pada studi Georgakopoulos dkk (2012) menunjukkan
ekspresi
kuat
pada
clear
cell
carcinoma,
borderline
serous
tumors,
endometriosis, dan mucinous cystadenoma ovarii. Pada tuba fallopii dan
karsinoma tuba fallopii menunjukkan peningkatan level ekspresi HE4. HE4 di
ekspresikan secara kuat pada karsinoma primer dari tuba fallopi dan sel – sel
sekretori dan interkalasi jinak tuba fallopii, pada kista inklusi kortikal, dan pada
sel mesotelial. Meskipun ekspresi HE4 dapat terlihat pada berbagai jaringan
kista ovarium jinak, mukosa tuba normal, dan sel mesotelial dapat
menyingkirkan kegunaan HE4 sebagai penanda untuk skrining primer, namun
ekspresi yang kuat pada karsinoma ovarium dan tuba menunjukkan bahwa HE4
dapat berguna sebagai penanda yang sensitif untuk rekurensi penyakit.
Ekspresi yang kuat pada beberapa lesi ovarium jinak menunjukkan bahwa HE4
mungkin memiliki keterbatasan spesifisitas sebagai penanda tumor ovarium.90
Universitas Sumatera Utara
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1.
Simpulan
1. Subjek penelitian kelompok kista ovarium jinak terbanyak dengan usia
20-50 tahun, usia menarche ≤12 tahun, paritas ≥1, IMT normal
sedangkan kelompok ovarium normal terbanyak dengan usia >50 tahun,
usia menarche ≤12 tahun, paritas ≥1, IMT normal.
2. Distribusi histopatologi kista ovarium benigna terbanyak dengan jenis
epitel.
3. Ada hubungan yang bermakna antara kista ovarium benigna dengan
ekspresi HE4 dengan OR sebesar 0,4.
4. Tidak ada hubungan yang bermakna antara jenis histopatologi kista
ovarium benigna dengan ekspresi HE4.
5.2.
Saran
Dibutuhkan penelitian lebih lanjut mengenai HE4 untuk lebih memahami
perannya pada patofisiologi terjadinya kista ovarium jinak.
Universitas Sumatera Utara