VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE L SKRIPSI

  

VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM

KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM

SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE

L SKRIPSI

 

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

  Program Studi Ilmu Farmasi

  

 

 

 

  Oleh: Laurentius Dian Ardiyanto

  NIM : 048114013

   

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

  

2008

   

  

VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM

KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM

SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE

 

  

SKRIPSI

 

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

  Program Studi Ilmu Farmasi

  

 

 

 

  Oleh: Laurentius Dian Ardiyanto

  NIM : 048114013

  

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008

  

Skripsi

  

VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM

KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM

SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE

 

 

 

  

Yang diajukan oleh:

Laurentius Dian Ardiyanto

NIM : 048114013

         

 

 

     

 

telah disetujui oleh

  Pembimbing Jeffry Julianus, M.Si Tanggal : ........................................

  

Pengesahan Skripsi Berjudul

  

VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM

KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM

SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE

Oleh :

  

Laurentius Dian Ardiyanto

NIM : 048114013

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

  

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal : 22 Mei 2008

Mengetahui Fakultas Farmasi

  Universitas Sanata Dharma Dekan (Rita Suhadi, M.Si., Apt) Pembimbing :

  (Jeffry Julianus, M.Si) Panitia Penguji : Tanda Tangan 1. Jeffry Julianus, M.Si .......................

  2. Christine Patramurti, M.Si, Apt. .......................

  3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. .......................

  Untuk k para e Wit emanue th hope. elku terc ..... cinta

  

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Laurentius Dian Ardiyanto

  Nomor Mahasiswa : 048114013

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

  VALIDASI METODE KOLORIMETRI DENGAN PEREAKSI ALUMINIUM KLORIDA UNTUK PENETAPAN KADAR FLAVONOID TOTAL DALAM SEDIAAN GEL BASIS NATRIUM CARBOXYMETHYLCELLULOSE

  

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada

Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam

bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara

terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan

akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya

selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

  Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta Pada tanggal : 27 Mei 2008 Yang menyatakan ( Laurentius Dian Ardiyanto )

  

PRAKATA

Alleluia…Alleluia…Alleluia...

  Puji syukur kepada Allah Bapa, Putra dan Roh kudus atas penyertaannya dari awal penelitian hingga laporan akhir ini selesai. Laporan akhir penelitian ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm).

  Berbagai kesulitan telah berhasil dilewati dan akhirnya ucapan terimakasih yang setulus-tulusnya dihaturkan kepada pihak-pihak yang telah memberikan bantuan hingga akhir penelitian.

  Penulis mengucapkan terimakasih kepada :

  1. Papa, Mama, dan Ayu atas kasih sayang dan doanya yang menguatkan

  2. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

  3. Jeffry Julianus, M.Si selaku pembimbing skripsi atas segala bimbingan dan arahannya selama penelitian berlangsung

  4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. dan Yohanes Dwiatmaka, M.Si.selaku dosen penguji atas kritik, saran, dan bantuannya hingga laporan ini selesai

  5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. atas diskusinya yang banyak membantu penulis selama penelitian

  6. Rini Dwiastuti, S. Farm., Apt. selaku ketua Tea Project atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk berpartisipasi dalam penelitian

  7. Romo Drs. P. Sunu Hardijanto, S.J., S.Si, M.Sc. atas diskusi-diskusinya tentang statistik dan etika penelitian

  8. Enade Perdana Istyastono, S.F., Apt. dan A. Nora Iska Harnita M.Si, Apt. atas bantuannya untuk memperoleh literatur untuk penelitian ini

  9. Teman-teman Tea Project Agung ‘Simbah’, Resty ‘Simak’, Yoyo, Dona ‘Donce’, Ika ‘Monyi’, Tere, Rinta, Selvi, dan Fhery atas kerjasamanya.

  Terutama untuk Resty atas bantuannya menyediakan sampel untuk penelitian dan Selvi partner penelitian hingga akhir.

  10. Mas Kunto, Pak Parlan, Pak Prapto, dan Mas Sarwanto atas segala bantuan selama penulis bekerja di laboratorium.

  11. Pipit, Ayu, Rudy, Desy, Silvia ‘Cipi’ atas kebersamaan selama studi di Fakultas Farmasi USD

  12. Rohkaters 04, gereja kecilku atas suka duka dan pengalaman iman yang mendewasakan

  13. Teman-teman di Fakultas Farmasi terutama FST 04 dan kelas A 04

  14. Semua pihak yang membantu selama penulis menyelesaikan penelitian ini yang tidak dapat disebutkan satu-persatu.

  Tak ada gading yang tak retak, untuk itu segala kritik dan saran terhadap penelitian ini amat diharapkan. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi para pembaca.

  Penulis

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

  Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

  Yogyakarta, 27 Mei 2008 Penulis

  Laurentius Dian Ardiyanto

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL .......................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iii HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iv HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... v HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................................................... vi PRAKATA .......................................................................................................... vii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. ix DAFTAR ISI ....................................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xvi

  INTISARI ........................................................................................................... xvii

  

ABSTRACT ......................................................................................................... xviii

  BAB I. PENDAHULUAN .................................................................................. 1 A. Latar Belakang ...................................................................................... 1 B. Permasalahan ......................................................................................... 3 C. Tujuan Penelitian ................................................................................... 3 D. Manfaat Penelitian ................................................................................ 3 E. Keaslian Karya ...................................................................................... 3 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 5 A. Flavonoid .............................................................................................. 5

  1. Sifat-sifat fisika-kimia flavonoid ....................................................... 5

  2. Reaksi kimia flavonoid ...................................................................... 6

  3. Flavonoid teh hijau ............................................................................ 7

  B. Kuersetin ............................................................................................... 7

  C. Analisis Sediaan Gel ............................................................................. 8

  D. Deskripsi Senyawa Eksipien Penyusun Formula Gel ........................... 9

  1. Natrium carboxymethylcellulose ....................................................... 9

  2. Asam sitrat ......................................................................................... 10

  3. Propilen glikol ................................................................................... 10

  4. Metil paraben ..................................................................................... 11

  5. Etanol ................................................................................................. 11

  E. Spektrofotometer UV-Vis ..................................................................... 11

  F. Kolorimetri ............................................................................................ 14

  1. Penetapan kadar flavonoid secara kolorimetri .................................. 15

  2. Absorpsi radiasi elektromagnetik oleh senyawa kompleks ............... 16

  G. Parameter Validitas Metode Analisis .................................................... 16

  1. Akurasi .............................................................................................. 17

  2. Presisi ................................................................................................ 17

  3. Spesifisitas ......................................................................................... 17

  4. Batas deteksi ...................................................................................... 18

  5. Batas kuantitasi .................................................................................. 18

  6. Linearitas ........................................................................................... 18

  7. Range ................................................................................................. 18

  H. Keterangan Empiris ............................................................................... 19

  BAB III. METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 21 A. Jenis dan rancangan penelitian .............................................................. 21 B. Variabel penelitian ................................................................................ 21 C. Definisi Operasional .............................................................................. 21 D. Bahan Penelitian ................................................................................... 22 E. Alat Penelitian ....................................................................................... 22 F. Tatacara Penelitian ................................................................................. 22

  1. Pembuatan pelarut dan pereaksi ........................................................ 22

  2. Pembuatan sampel ............................................................................. 23

  3. Pembuatan blangko ........................................................................... 23

  4. Pembuatan larutan baku .................................................................... 23

  5. Penentuan operating time (OT) ......................................................... 24

  6. Penetapan panjang gelombang maksimum ....................................... 24

  7. Pembuatan kurva baku ...................................................................... 24

  8. Preparasi sampel ................................................................................ 25

  9. Penetapan kadar flavonoid dalam sampel ......................................... 26

  G. Analisis Hasil ........................................................................................ 26

  BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 27 A. Optimasi Kondisi Pengukuran .............................................................. 27

  1. Penentuan operating time (OT) ......................................................... 27

  2. Penentuan panjang gelombang maksimum ....................................... 28

  B. Pembuatan Kurva baku ......................................................................... 30

  C. Preparasi Sampel ................................................................................... 31

  1. Isolasi analit dari sampel ................................................................... 32

  2. Tahap hidrólisis ................................................................................. 34

  3. Ekstraksi cair-cair .............................................................................. 35

  D. Penetapan Kadar Flavonoid dalam Sampel........................................... 36

  E. Analisis Validitas Metode ..................................................................... 38

  1. Spesifisitas ......................................................................................... 38

  2. Akurasi .............................................................................................. 38

  3. Presisi ................................................................................................ 39

  4. Linearitas ........................................................................................... 39

  BAB V. KESIMPULAN, SARAN DAN KETERBATASAN ........................... 41 A. Kesimpulan ........................................................................................... 41 B. Saran ...................................................................................................... 41 C. Keterbatasan .......................................................................................... 41 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 42 LAMPIRAN ........................................................................................................ 45 BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 52

  

DAFTAR TABEL

  Tabel I. Daftar beberapa reagen untuk flavonoid ........................................... 6 Tabel II. Formula gel untuk penelitian ............................................................ 9 Tabel III. Kategori metode analisis dan persyaratan validasi ........................... 19 Tabel IV. Hubungan kadar kuersetin dengan absorbansi .................................. 30 Tabel V. Data % recovery dan koefisien variansi metode ............................... 38

  

DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Rangka dasar flavonoid ................................................................... 5 Gambar 2. Sistem penomoran pada cincin flavonoid ........................................ 5 Gambar 3. Sruktur kimia kuersetin ................................................................... 8 Gambar 4. Struktur kimia natrium carboxymethylcellulose .............................. 10 Gambar 5. Struktur kimia asam sitrat ................................................................ 10 Gambar 6. Struktur kimia propilen glikol ......................................................... 10 Gambar 7. Struktur kimia metil paraben ........................................................... 11 Gambar 8. Diagram transisi elektron ................................................................ 14 Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan aluminium klorida dalam suasana asam .......................................... 15 Gambar 10. Spektrum operating time kompleks kuersetin-AlCl

  28 3 ................................... Gambar 11. Spektrum panjang gelombang maksimum kompleks kuersetin-AlCl ................................................................................ 29

  3 Gambar 12. Kurva baku kuersetin ....................................................................... 31

  Gambar 13. Ikatan hidrogen natrium carboxymethylcellulose membentuk cross link ...................................................................... 32 Gambar 14. Endapan CMC-Na yang terbentuk pada akhir proses isolasi .......... 34 Gambar 15. Reaksi hidrolisis flavonoid .............................................................. 35 Gambar 16. Alur pengerjaan sampel gel ............................................................. 37

  

DAFTAR LAMPIRAN

  Lampiran 1. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar larutan baku ........... 45 Lampiran 2. Penimbangan dan contoh perhitungan kadar teoritis sampel ......... 47 Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan % recovery ..................................... 48 Lampiran 4. Perhitungan koefisien variansi (CV) .............................................. 50 Lampiran 5. Gambar endapan CMC-Na yang terbentuk .................................... 51

  

INTISARI

  Untuk melengkapi penelitian optimasi formula sediaan gel sunscreen teh hijau dengan gelling agent natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) dikembangkan suatu metode analisis kuantitatif yang dapat digunakan dalam kontrol kualitas. Metode kolorimetri dengan pereaksi Aluminium klorida yang digunakan untuk menetapkan kadar flavonoid total diadaptasi untuk maksud ini. Adaptasi suatu metode analisis dengan sampel yang berbeda membutuhkan proses validasi kembali untuk menjaga validitas metode. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui akurasi dan presisi metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida untuk penetapan kadar flavonoid dalam bentuk sediaan gel.

  Penelitian ini difokuskan pada proses preparasi sampel yang terdiri dari tiga tahap, isolasi analit dari basis gel menggunakan aseton, hidrolisis untuk memecah ikatan glikosida dengan HCl 25%, dan ekstraksi cair – cair untuk memisahkan aglikon dengan glikon. Proses ini diharapkan mampu mempertahankan validitas metode.

  Hasil penelitian menunjukkan metode ini memiliki akurasi dan presisi yang dapat diterima. Akurasi ditunjukkan dengan nilai % recovery sebesar 91,09%. Presisi ditunjukkan dengan nilai CV sebesar 5,25%. Hasil ini membuktikan bahwa metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida memiliki validitas yang baik ketika digunakan pada sediaan gel. Kata kunci : gel, natrium carboxymethylcellulose, kolorimetri, aluminium klorida, akurasi, presisi

  

ABSTRACT

  To complete research of optimization formula of green tea gel dosage forms as sunscreen, a quantitative analysis method which can be used in quality kontrol had been developed. Colorimetry method with aluminium chloride as reagent for total flavonoid assay had been adapted for this purpose. Adaptation some analytical method with different sample require revalidation process to maintain method validity. The aim of this research is to find out accuration and precision of colorimetry method with aluminium chloride reagents for quantitative analysis of flavonoids in gel dosage forms.

  This research had focused in sample preparation included three steps, analite isolation from gel base using acetone, hydrolysis to brake glycosidic bonds with HCl 25%, and liquid – liquid extraction to separate aglicon and glicon. This process had expected to maintain method validity.

  Result of this research show that this methods has acceptable accuration and precision. Accuration showed by 90,53% for % recovery value. Precision showed by 5,378% for coefficient of variance value. This result proved that colorimetry method with aluminium chloride as reagent has good validity when it used in gel dosage forms. Keywords : gel, carboxymethylcellulose sodium, colorimetry, aluminium chloride, accuration, precision

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Svobodova et al. (2003) dalam artikelnya memberikan penjelasan tentang

  sejumlah senyawa fenolik alam dengan struktur yang digambarkan sebagai suatu fenol (cincin aromatik yang berikatan dengan gugus hidroksil) seperti asam kafeat, asam ferulat, kuersetin, apigenin, genistein, resveratrol, asam nordihidroguaiaretat, asam karnosat, silimarin, polifenol teh, dan tanin. Senyawa- senyawa fenolik tersebut terbukti mempunyai efek protektif terhadap kerusakan kulit yang diinduksi radiasi UV. Untuk mempermudah penggunaan senyawa- senyawa fenolik alam tersebut, Wijayanti (2008) telah melakukan penelitian optimasi formula sediaan gel teh hijau sebagai dengan basis natrium

  carboxymethylcellulose .

  Dengan adanya perkembangan, terutama berkaitan dengan GMP (Good

  

Manufacturing Practice ), formulasi sediaan yang baik hendaknya juga didukung

  dengan kontrol kualitas yang baik pula. Bidang analisis kuantitatif terutama, memainkan peranan yang penting dalam kontrol kualitas. Dalam kaitannya dengan penelitian Wijayanti (2008), untuk melengkapi hasil penelitian tersebut, maka perlu disusun suatu metode analisis kuantitatif yang dapat digunakan dalam kontrol kualitas sediaan gel yang telah dikembangkan.

  Polifenol teh hijau yang bertanggungjawab terhadap efek sunscreen dalam sediaan gel hasil optimasi Wijayanti (2008), merupakan senyawa alam yang digolongkan dalam kelas flavonoid. Syah (2006) menyebutkan empat polifenol utama dalam teh hijau yaitu katekin, epikatekin, epigallokatekin, dan epigallokatekingalat. Ditinjau dari struktur kimianya keempat polifenol tersebut merupakan flavonoid (Robinson, 1991). Oleh karenanya metode analisis kuantitatif flavonoid dapat menjadi metode analisis yang rasional dalam kontrol kualitas sediaan gel teh hijau.

  Aluminium klorida (AlCl ) diketahui dapat membentuk kompleks

  3

  berwarna dengan gugus hidroksi fenolik yang bertetangga dengan gugus karbonil dan dengan gugus orto dihidroksi fenolik dalam senyawa flavonoid (Markham, 1982). Gugus ini dimiliki oleh senyawa-senyawa flavonoid yang ditemukan dalam teh (Anonim, 1999).

  Penelitian Pertiwi (2006), telah membuktikan validitas analisis kuantitatif flavonoid secara kolorimetri dengan pereaksi AlCl . Selain itu peneliti yang

  3

  bersangkutan juga telah menggunakannya pada penetapan kadar flavonoid total dalam beberapa fraksi teh. Penggunaan metode tersebut untuk analisis kuantitatif sampel sediaan bentuk gel membutuhkan beberapa penyesuaian untuk menjamin validitas metode. Akurasi dan presisi yang dipengaruhi oleh proses preparasi sampel menjadi parameter utama untuk menunjukkan validitas metode ketika diterapkan dalam analisis dalam sampel gel. Untuk mengetahui validitas metode kolorimetri dengan pereaksi AlCl pada penetapan kadar flavonoid total dalam

  3 sediaan gel teh hijau, maka perlu dilakukan penelitian ini.

B. Permasalahan

  Apakah penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau secara kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida mempunyai akurasi dan presisi yang baik?

C. Tujuan Penelitian

  Mengetahui akurasi dan presisi penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel teh hijau secara kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida.

D. Manfaat Penelitian

  Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah:

  a. Manfaat teoritis Memberikan pengetahuan akan metode penetapan kadar flavonoid dalam sediaan gel b. Manfaat praktis

  Menyediakan metode untuk kontrol kualitas sediaan gel dengan basis natrium

  carboxymethylcellulose terutama dengan kandungan flavonoid

E. Keaslian Karya

  Pertiwi (2006) telah melakukan penelitian penetapan kadar flavonoid total terhitung sebagai kuersetin dengan menggunakan metode kolorimetri dalam teh hijau dan teh hitam [merkX].

  Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah pada sampel yang digunakan. Penelitian Pertiwi (2006) menggunakan produk teh hijau dan teh hitam sebagai sampel. Penelitian ini menggunakan sampel berupa sediaan gel. Sejauh pengetahuan penulis penelitian validasi metode kolorimetri dengan pereaksi aluminium klorida untuk penetapan kadar flavonoid total dalam sediaan gel basis natrium carboxymethylcellulose belum pernah dilakukan.

   

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Flavonoid Flavonoid ditemukan pada berbagai macam tumbuhan dengan berbagai

  struktur yang semuanya memiliki rangka dasar 15 atom karbon dan tersusun dalam konfigurasi C –C –C . Konfigurasi tersebut menggambarkan dua gugus

  6

  3

  6

  benzena yang dihubungkan tiga atom karbon, dapat berupa rantai alifatik atau rantai siklik yang membentuk cincin piran sebagai cincin ketiga. Sistem penomoran cincin A dan C menggunakan angka biasa, sedangkan cincin B menggunakan angka aksen. Flavonoid banyak ditemukan terikat sebagai glikosida dengan struktur flavonoid-O-glikosida atau flavonoid-C-glikosida (Riyanto, 1990).

  Gambar 1. Rangka dasar flavonoid Gambar 2. Sistem penomoran pada cincin flavonoid 1. Sifat-sifat fisika-kimia flavonoid

  Glikosida mudah larut dalam air dan alkohol, Sebaliknya sebagian besar aglikon flavonoid larut dalam pelarut organik nonpolar (Bruneton, 1993). Ikatan dengan gula (glikon) dapat meningkatkan kelarutan dari aglikon flavonoid dalam pelarut polar namun menjadikannya kurang reaktif (Markham, 1982).

  Flavonoid, seperti senyawa fenol lainnya, mudah mengalami reaksi oksidasi pada suasana netral dan basa. Stabilitas flavonoid diperoleh pada suasana asam, tetapi dalam suasana asam baik panas atau dingin dalam waktu yang lama, glikosida dapat terhidrolisis (Robinson, 1991).

  Flavonoid dapat mengalami perubahan kimia karena panas, enzim, keberadaan air dan pH. Untuk mencegahnya, bahan baku yang masih segar

  o

  biasanya dipanaskan hingga suhu 100 C dengan oven untuk menghentikan reaksi enzimatik dan menghilangkan air (Riyanto, 1990).

2. Reaksi kimia flavonoid

  Flavonoid dapat bereaksi dengan beberapa reagen untuk keperluan analisis kualitatif maupun kuantitatif. Oleh karena flavonoid biasa ditemukan dalam bentuk glikosida, maka terlebih dahulu perlu dilakukan hidrolisis yang akan memisahkan glikon dengan aglikon flavonoid. Hidrolisis dapat dilakukan dengan tiga macam cara, yaitu dengan katalis asam, enzim, atau basa (Riyanto, 1990).

  

Tabel 1. Daftar beberapa reagen untuk flavonoid

Nama Reagen Sasaran

  Natrium metoksida gugus yang peka terhadap basa identifikasi gugus hidroksil Natrium asetat anhidrat paling basa gugus hidroksi dan keton yang

  Aluminium klorida bertetangga, gugus orto dihidroksi dua gugus hidroksi pada posisi

  Asam borat anhidrat orto (Markham, 1982; Riyanto, 1990) Kondisi hidrolisis flavonoid berbeda untuk jenis flavonoid-O-glikosida dan flavonoid-C-glikosida. Flavonoid-O-glikosida lebih mudah dihidrolisis dibandingkan flavonoid-C-glikosida. Jenis glikon dan tempat glikon itu terikat pada inti flavonoid juga menentukan kondisi untuk hidrolisis (Markham, 1982).

3. Flavonoid teh hijau

  Teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) mengandung sejumlah flavonoid golongan flavanol terutama katekin dan senyawa turunannya seperti epikatekin, epigallokatekin, dan epigallokatekingalat (Syah, 2006). Selain itu terdapat pula flavonoid golongan flavonol seperti kuersetin, kaempferol, mirisetin, dan kuercitrin serta beberapa golongan flavonoid yang lain (Anonim, 1999). Katekin, yang merupakan flavonoid utama dalam teh, ditemukan lebih banyak dalam teh hijau dibandingkan dalam teh hitam. Hal ini disebabkan enzim polifenol oksidase yang mengoksidasi katekin diinaktivasi pada proses pembuatan teh hijau, sedangkan pada pembuatan teh hitam, katekin dibiarkan teroksidasi membentuk senyawa baru yang memiliki warna merah kecoklatan (Syah, 2006).

B. Kuersetin Kuersetin termasuk dalam flavonoid golongan flavonol (Bruneton, 1993).

  Senyawa ini larut dalam aseton, asam asetat dan pirimidin; sangat sukar larut dalam air panas dan dietil eter; tidak larut dalam air dingin (Anonim, 2005)

  _{HO O} OH _{OH OH O} OH

Gambar 3. Struktur kimia kuersetin

C. Analisis Sediaan Gel

  Gel tersusun atas sejumlah kecil komponen padatan yang terdispersi dalam sejumlah besar cairan. Komponen padat dari gel membentuk jaringan tiga dimensi yang membentuk rigiditas gel. Oleh karena itu, meskipun sebagian besar komponennya berupa cairan, gel memiliki kemampuan untuk mempertahankan bentuknya dengan pemberian sedikit tekanan. Padatan yang lazim digunakan dalam gel adalah polimer meskipun beberapa gel tersusun atas padatan inorganik.

  Contoh polimer yang biasa digunakan sebagai gelling agent antara lain carbomer, poloxamer, CMC-Na, Hidroxy Propyl Methyl Cellulose (HPMC), dan karaginan (Swarbick and Boylan, 1992)

  Untuk memperoleh analit, yang merupakan komponen gel, sistem dispersi dari gel perlu dipisahkan terlebih dahulu. Penggunaan ekstraksi padat – cair atau elektrolit, mampu memisahkan zat terdispersi dan medium dispers gel. Pelarut-pelarut yang digunakan dalam ekstraksi padat - cair menyesuaikan dengan sifat kelarutan dari zat terdispersi gel. Untuk keperluan memecah sediaan gel ini digunakan pelarut yang tidak melarutkan zat terdispersi agar diperoleh endapan (Gillard et.al, 1985; Rohman, 2007).

  Elektrolit dapat digunakan untuk mengendapkan zat terdispersi yang memiliki sifat terionkan. Elektrolit yang digunakan adalah elektrolit dengan sifat yang berlawanan dengan sifat ion zat terdispersi. Polimer kationik dapat diendapkan dengan penambahan senyawa anionik begitu pula sebaliknya (Gillard

  , 1985).

  et.al

  D. Deskripsi Senyawa Eksipien Penyusun Formula Gel Tabel 2. Formula gel untuk penelitian

  Natrium Carboxymethylcellulose (CMC-Na)

  4 Asam sitrat 0,5 Propilen Glikol

  10 Metil paraben 0,3 Etanol 11,7 Fraksi teh hijau 0,03 Aquades 72,5

  (Wijayanti, 2008) 1.

   Natrium carboxymethylcellulose

  Natrium carboxymethylcellulose (CMC-Na) yang juga sering disebut sebagai carboxymethylcellulose (CMC) atau cellulose gum merupakan gelling

  agent turunan selulosa (Zatz and Kushla, 1996). CMC-Na terdispersi dalam air

  pada berbagai temperatur membentuk larutan koloidal yang jernih. Materi ini praktis tidak larut dalam aseton, etanol (95%), eter dan toluen (Parsons, 2005).

  Gambar 4. Struktur kimia natrium carboxymethylcellulose 2. Asam sitrat

  Asam sitrat digunakan secara luas sebagai pemberi suasana asam, antioksidan, atau buffer dalam berbagai sediaan farmasi. Senyawa ini larut 1 dalam 1,5 bagian ethanol (95%) dan 1 dalam kurang dari 1 bagian air; agak sukar larut dalam eter (Amidon, 2005).

  

Gambar 5. Struktur kimia asam sitrat

3. Propilen glikol

  Propilen glikol digunakan sebagai antimikroba, humectant, plasticizer, atau co-solvent. Senyawa ini dapat bercampur dengan aseton, kloroform, etanol (95%), gliserin dan air; larut 1 dalam 6 bagian eter ( Owen and Weller, 2005).

  

Gambar 6. Struktur kimia propilen glikol

4. Metil paraben

  Metil paraben digunakan sebagai antimikroba dalam produk makanan, dan sediaan farmasi. Senyawa ini dapat digunakan sendiri atau dikombinasikan dengan paraben yang lain.

  Metil paraben mudah larut dalam etanol (95%), dan eter; agak sukar larut dalam gliserin. Kelarutan dalam air meningkat dengan kenaikan suhu. Pada suhu kamar 1 bagian metil paraben larut dalam 400 bagian air (Johnson and Steer, 2005).

  O OH O

   

Gambar 7. Struktur kimia metil paraben

5.

   Etanol Etanol biasa digunakan sebagai pelarut dalam berbagai sediaan farmasi.

  Senyawa ini dapat bercampur dengan kloroform, eter, gliserin dan air (Owen, 2005).

F. Spektrofotometer UV-Vis

  Spektrofotometer memiliki kemampuan menentukan jumlah analit dalam suatu sampel berdasarkan berapa banyak cahaya yang diabsorpsi oleh analit tersebut. Cahaya, yang merupakan radiasi elektromagnetik, diabsorpsi oleh molekul analit dalam sampel dan menyebabkan terjadinya eksitasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi. Peristiwa absorpsi ini terjadi melalui satu atau lebih dari beberapa cara di bawah ini :

  1. Transisi elektronik (electronic transition) Energi dari radiasi elektromagnetik mempromosikan elektron pada orbital ikatan (bonding orbital) menuju orbital anti-ikatan (antibonding orbital) yang memiliki energi lebih tinggi.

  2. Transisi vibrasional (vibrational transition) Energi radiasi elektromagnetik bekerja meningkatkan vibrasi atau osilasi dari atom yang membentuk ikatan kimia.

  3. Transisi rotasional (rotational transition) Energi radiasi elektromagnetik meningkatkan rotasi dari atom yang membentuk ikatan kimia.

  Dari ketiga cara tersebut, transisi elektronik adalah yang paling berperan dalam analisis pada daerah UV-Vis (Cairns, 2003).

  Oleh karena elektron pada kondisi tereksitasi kurang stabil, maka elektron akan kembali pada kondisi dasar (ground state) yang memiliki tingkat energi lebih rendah. Pada saat itu elektron melepaskan energi dalam bentuk panas. Peristiwa inilah yang bertanggungjawab pada proses pembentukan warna (Christian, 2004). Elektron dalam molekul diklasifikasikan menjadi empat tipe :

  1. Elektron pada kulit yang tertutup (closed-shell electrons) Elektron tipe ini tidak berperan dalam pembentukan ikatan dan memiliki energi eksitasi yang sangat tinggi sehingga tidak berperan dalam absorpsi pada area UV-Vis.

  2. Elektron ikatan kovalen tunggal (covalent single-bond electrons) Elektron tipe ini disebut juga elektron sigma (

  σ). Elektron σ ini memiliki

  energi eksitasi yang tinggi sehingga tidak berperan dalam absorpsi pada area UV-Vis.

3. Pasangan elektron bebas (n)

  Elektron tipe ini memiliki energi eksitasi yang lebih rendah dari elektron

  σ dan

  dapat berperan dalam absorpsi pada area UV-Vis. Contohnya adalah pasangan elektron bebas pada atom N, O, S dan halogen.

  4. Elektron pada orbital phi (

  π)

  Elektron tipe ini adalah yang paling mudah tereksitasi dan berperan penting dalam pembentukan spektrum pada daerah UV-Vis.

  (Christian, 2004) Peristiwa transisi elektron dalam molekul menuju tingkat energi yang lebih tinggi digolongkan menjadi 4 macam yaitu transisi

  σ- σ*, transisi n- σ*,

  transisi n-

  π*, dan transisi π- π*. Dari keempat transisi tersebut transisi n- π* dan

π- π* merupakan jenis transisi yang berperan dalam analisis pada daerah UV-Vis

  (Rohman, 2007)

    σ*

    π* n  

    π

    σ

   

Gambar 8. Diagram transisi elektron

  Aspek kuantitatif spektrofotometer dinyatakan dalam hukum Lambert- Beer yang secara matematis ditulis menurut persamaan berikut :

  1 A ‐log T log T abc

  Dimana : A : absorbansi T : transmitan

  a : konstanta absorptivitas b : jarak (tebal kuvet) c : konsentrasi

  (Christian, 2004)

G. Kolorimetri

  Suatu senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang ingin ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel, perlu diubah terlebih dahulu menjadi senyawa berwarna (Rohman, 2007). Pengubahan senyawa ini mampu meningkatkan selektivitas dan sensitivitas metode (Fell, 1986). Penggunaan reagen tertentu mampu merubah analit menjadi senyawa baru yang mengabsorpsi pada panjang gelombang visibel. Syarat dari reagen ini adalah : a. Reaksinya selektif dan sensitif

  b. Reaksi berlangsung cepat, bersifat kuantitatif, dan reprodusibel c. Produk berwarna yang dihasilkan stabil selama proses analisis berlangsung (Rohman, 2007) 1.

   Penetapan kadar flavonoid secara kolorimetri Senyawa flavonoid memberikan absorpsi pada panjang gelombang UV.

  Ketika flavonoid akan ditetapkan kadarnya pada panjang gelombang visibel, maka reagen tertentu perlu ditambahkan untuk mengubahnya menjadi senyawa berwarna. Salah satu reagen yang lazim digunakan adalah aluminium klorida (AlCl ). Senyawa flavonoid yang memiliki gugus hidroksi fenolik yang

  3

  bertetangga dengan gugus karbonil dan gugus dihidroksi fenolik mampu bereaksi membentuk kompleks dengan AlCl . Gugus hidroksi fenolik yang bertetangga

  3

  dengan gugus karbonil membentuk kompleks tahan asam sedangkan gugus _{OH O Al +} dihidroksi fenolik membentuk kompleks tidak tahan asam (Markham, 1982). _{OH O OH OH HO O HO O OH O OH O AlCl 3 OH O Al 2+ HCl} HO O _{OH O Al 2+ O}

  quercetin

Gambar 9. Reaksi pembentukan kompleks antara kuersetin dengan

Aluminium klorida dalam suasana asam (Markham, 1982)

  Kompleks yang terbentuk antara AlCl dengan flavonoid merupakan

  3

  senyawa koordinasi. Senyawa ini terbentuk oleh ikatan antara ion logam sebagai atom pusat dengan suatu ion atau molekul netral sebagai ligan (Brady, 1998).

  Reaksi pembentukan kompleks ini sering diklasifikasikan sebagai reaksi asam- basa Lewis. Dalam hal ini, ligan berfungsi sebagai basa Lewis yang mendonorkan pasangan elektron kepada ion logam sebagai asam Lewis dan membentuk kompleks (Amiji, 2003).

2. Absorpsi radiasi elektromagnetik oleh senyawa kompleks

  Absorpsi radiasi elektromagnetik senyawa kompleks pada daerah UV-Vis terjadi melalui salah satu atau lebih peristiwa transisi, yaitu eksitasi ion logam, eksitasi molekul ligan, dan transfer muatan. Dua proses yang pertama tidak memberikan peran yang signifikan dalam analisis kuantitatif senyawa kompleks.

  Untuk kepentingan analisis kuantitatif, transfer muatan memegang peranan penting dalam absorpsi radiasi sinar UV-Vis. Ketika senyawa kompleks menyerap radiasi, elektron dari ligan berpindah ke ion logam atau sebaliknya. Transisi ini meliputi promosi elektron dari level

  π dalam ligan atau dari orbital ikatan σ menuju orbital kosong (unoccupied orbital) dari ion logam, atau promosi elektron ikatan σ menuju orbital π yang kosong dari ligan (Christian, 2004).

H. Parameter Validitas Metode Analisis

  Validasi metode analisis diperlukan untuk menjamin bahwa prosedur yang dilakukan dengan cara yang benar memberikan hasil yang sesuai dengan tujuan analisis (Anonim, 2004a). Parameter yang harus dipenuhi suatu metode agar dinyatakan valid adalah akurasi, presisi, spesifisitas, batas deteksi, batas kuantitasi, linearitas dan range (Anonim, 2004b).

  1. Akurasi Akurasi merupakan kedekatan nilai terukur dengan nilai sebenarnya.

  Akurasi metode analisis ditetapkan dalam range metode tersebut (Anonim, 2004b). Akurasi dihitung sebagai persen perolehan kembali (% recovery) .

  Ada tiga metode penentuan akurasi :

  a. Menganalisa sampel yang telah diketahui konsentrasinya dan membandingkan nilai terukur dengan nilai sebenarnya.

  b. Spiked – placebo recovery method. Sejumlah zat aktif murni ditambahkan pada blanko formulasi (formula tanpa zat aktif) dan hasil analisis dibandingkan dengan nilai teoritis.

  c. Metode standar adisi. Pada metode ini, suatu sampel dianalisis, sejumlah zat aktif murni ditambahkan lalu dianalisis kembali. Perbedaan dua hasil analisis tersebut dibandingkan dengan hasil teoritis.

  (Anonim, 2004a) 2.

   Presisi

  Presisi menyatakan kedekatan hasil analisis satu dengan yang lain ketika dilakukan pada sampel yang sama dan homogen. Standar deviasi atau standar deviasi relatif (RSD), disebut juga koefisien variansi (CV), digunakan untuk menyatakan presisi (Anonim, 2004b).

  3. Spesifisitas

  Spesifisitas didefinisikan sebagai kemampuan untuk membedakan dan mengukur suatu analit dari komponen-komponen lain yang ada dalam sampel (Anonim, 2004b). Spesifisitas harus dibuktikan dengan data yang menyatakan ketiadaan senyawa pengganggu yang mengacaukan hasil analisis seperti senyawa pengotor (impurities), degradasi produk atau komponen lain dalam sampel (Anonim, 2004a).

  4. Batas deteksi

  Batas deteksi merupakan jumlah analit terendah yang masih dapat dideteksi namun tidak dapat dikuantifikasi dengan nilai yang tepat. (Anonim, 2004b).

  5. Batas kuantitasi

  Batas kuantitasi merupakan kadar terendah suatu analit yang masih dapat dihitung dan memberikan akurasi dan presisi yang dapat diterima (Anonim, 2004b).

  6. Linearitas

  Linearitas merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan jumlah analit dalam sampel (Mulya dan Hanwar, 2003). Linearitas ditentukan dengan membuat plot hubungan antara kadar dengan respon analisis lalu ditentukan koefisien korelasi antar keduanya (Anonim, 2004a).

  7. Range Range merupakan rentang kadar terendah dan tertinggi suatu analit yang

  masih dapat dihitung dan memberikan akurasi dan presisi yang baik. Range memiliki satuan yang sama dengan satuan yang digunakan pada hasil analisis (Anonim, 2004b).

  Tabel III. Kategori metode analisis dan persyaratan validasi

  Kategori

  II I

  III IV Kuantitatif Limit test

  Akurasi Ya Ya * * Tidak Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak

  Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya

• Batas deteksi Tidak Tidak Ya Tidak Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak * Tidak Linearitas Ya Ya Ya * Tidak Range Ya Ya * * Tidak * Mungkin dibutuhkan tergantung sifat dari metode analisis

  United States Pharmacopeia (USP) 28 membedakan metode analisis

  menjadi 4 kategori dan masing-masing kategori memiliki persyaratan parameter validasi yang berbeda.