Efek Antibakteri Ekstrak Etanol Siwak (Salvadora Persica) Sebagai Alternatif Bahan Irigasi Saluran Akar Terhadap Enterococcus Faecalis (Secara In Vitro) Chapter III VI
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Rancangan dan Jenis Penelitian
3.1.1
Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Posttest
Only Control Group Design
3.1.2
Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental
laboratorium.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
3.2.1
Lokasi Penelitian
Lokasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1.
Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU
2.
Laboratorium Lembaga Pusat Penyakit Tropis UNAIR
3.2.2
Waktu Penelitian
Waktu penelitian ini adalah 6 bulan (Agustus 2012 -Januari 2013)
3.3 Populasi dan Sampel
3.3.1
Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri Enterococcus faecalis
3.3.2
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah koloni adalah bakteri
Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah diisolasi dan dibiakkan dengan media
Mueller Hinton Agar (MHA).
Penentuan besar sampel sesuai dengan SOP (Standard Operational
Procedure) yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis, Universitas Airlangga.
Jumlah pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus Walton
T Federer (1991):
(t-1) (r-1) ≥ 15
Keterangan:
t = jumlah kelompok perlakuan dalam penelitian
r = banyak replikasi (perlakuan ulang)
Pada penelitian ini digunakan 5 perlakuan, yakni ekstrak etanol siwak dengan
konsentrai 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Oleh karena itu banyak replikasi pada
penelitian ini adalah sebagai berikut.
(t-1) (r-1) ≥ 15
(5-1) (r-1) ≥ 15
4 (r-1) ≥ 15
r-1 ≥ 15 : 4
r-1 ≥ 3,75
r ≥ 3,75 + 1
r ≥ 4,75
Dari perhitungan di atas diperoleh hasil bahwa banyaknya replikasi pada
penelitian ini adalah minimal sebanyak 4,75 kali atau dibulatkan menjadi 5 kali
dengan rincian sebagai berikut:
1. Pada penentuan nilai KHM, jumlah keseluruhan sampel adalah 27 sampel
yakni:
a. Kelompok 1: ekstrak etanol siwak 20%: 5 sampel
b. Kelompok 2: ekstrak etanol siwak 10%: 5 sampel
c. Kelompok 3: ekstrak etanol siwak 5%: 5 sampel
d. Kelompok 4: ekstrak etanol siwak 2,5%: 5 sampel
e. Kelompok 5: ekstrak etanol siwak 1,25%: 5 sampel
f. Kelompok 6: kontrol Mc Farland: 1 sampel
g. Kelompok 7: kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E.
faecalis): 1 sampel
2. Pada penentuan nilai KBM, jumlah keseluruhan sampel adalah 27 sampel
yakni:
a. Kelompok 1: ekstrak etanol siwak 20%: 5 sampel
b. Kelompok 2: ekstrak etanol siwak 10%: 5 sampel
c. Kelompok 3: ekstrak etanol siwak 5%: 5 sampel
d. Kelompok 4: ekstrak etanol siwak 2,5%: 5 sampel
e. Kelompok 5: ekstrak etanol siwak 1,25%: 5 sampel
f. Kelompok 6: kontrol Mc Farland : 1 sampel
g. Kelompok 7: kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E.
faecalis): 1 sampel
3.4 Variabel dan Definisi Operasional
3.4.1
Variabel Penelitian
Variabel bebas
Ekstrak etanol batang siwak 20%,
10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%
Variabel terkendali
a. Jenis dan asal batang siwak
(Salvadora persica) (Sewak AlMuslimTM diproduksi di Riyadh,
Saudi Arabia)
b. Berat batang siwak sebelum
pengeringan (1 kg) dan setelah
pengeringan (415 mg)
c. Lama dan suhu pengeringan siwak (1
minggu pada suhu 40oC)
d. Volume etanol yang dipakai (6 liter)
e. Konsentrasi etanol yang dipakai
(70%)
f. Waktu perendaman siwak (15 menit)
g. Suhu saat perendaman siwak (25oC)
h. Waktu perkolasi (2 minggu)
i. Nomor kertas saring yang dipakai
(Whatman No.42)
j. Jumlah kertas saring saat perlokasi (3
lapis)
k. Kecepatan tetes cairan dalam
perkolator (20 tetes/menit)
l. Suhu penguapan rotavapor (46oC)
m. Waktu penguapan rotavapor (10 jam)
n. Media pertumbuhan bakteri yaitu
Mueller Hinton Broth dan Mueller
Hinton Agar
o. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media
p. E. faecalis ATCC 29212
q. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke
media (MHA=50 µl, MHB=1 ml)
r. Suhu inkubasi (37oC)
s. Teknik pembiakan E.faecalis
t. Waktu pembiakan E.faecalis (24 jam)
u. Waktu pengamatan (24 jam)
Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri E.faecalis
pada media MHB dan MHA
dengan penentuan nilai KHM dan
KBM
Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan (kondisi tanah dan
iklim) tempat tumbuh batang siwak
b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama
tumbuh
d. Lama penyimpanan siwak sampai
proses ekstraksi
e. Suhu penyimpanan siwak sampai
proses ekstraksi
f. Lama pengiriman dari bahan coba
sampai ke Laboratorium Pusat
Penyakit Tropis Surabaya
g. Suhu saat pengiriman dari bahan
coba sampai ke Laboratorium Pusat
Penyakit Tropis Surabaya
h. pH lingkungan saat dilakukan uji
sensitivitas bakteri
3.4.2 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanol batang siwak 20%,
10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%.
3.4.3 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah Pertumbuhan bakteri E.faecalis
pada media MHB dan MHA dengan penentuan nilai KHM dan KBM
3.4.4 Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Jenis dan asal batang siwak (Salvadora persica) (Sewak Al-MuslimTM
diproduksi di Riyadh, Saudi Arabia)
b. Berat batang siwak sebelum pengeringan (1 kg) dan setelah pengeringan
(415 mg)
c. Lama dan suhu pengeringan siwak (1 minggu pada suhu 40oC)
d. Volume etanol yang dipakai (6 liter)
e. Konsentrasi etanol yang dipakai (70%)
f. Waktu perendaman siwak (15 menit)
g. Suhu saat perendaman siwak (25oC)
h. Waktu perkolasi (2 minggu)
i. Nomor kertas saring yang dipakai (Whatman No.42)
j. Jumlah kertas saring saat perlokasi (3 lapis)
k. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator (20 tetes/menit)
l. Suhu penguapan rotavapor (46oC)
m. Waktu penguapan rotavapor (10 jam)
n. Media pertumbuhan bakteri yaitu Mueller Hinton Broth (MHB) dan
Mueller Hinton Agar (MHA)
o. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media
p. E. faecalis ATCC 29212
q. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke media (MHA=50 µl, MHB=1 ml)
r. Suhu inkubasi (37oC)
s. Teknik pembiakan E.faecalis
t. Waktu pembiakan E.faecalis (24 jam)
u. Waktu pengamatan (24 jam)
3.4.5 Variabel Tidak Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Lingkungan (kondisi tanah dan iklim) tempat tumbuh batang siwak
b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama tumbuh
d. Lama penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
e. Suhu penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
f. Lama pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
Surabaya
g. Suhu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis Surabaya
h. pH lingkngan saat dilakukan uji sensitivitas bakteri
3.4.6 Definisi Operasional
NO
VARIABEL
DEFINISI OPERASIONAL
Variabel Bebas
1.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak melarutkan 200 mg ekstrak etanol
kental batang siwak dalam 1 ml
20%
Mueller Hinton Broth (MHB)
2.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
10%
ekstrak etanol siwak 20% dan
dilarutkan dalam 1 ml MHB
3.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 10% dan
5%
dilarutkan dalam 1 ml MHB
4.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 5% dan
2,5%
dilarutkan dalam 1 ml MHB
5.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 2,5% dan
1,25%
dilarutkan dalam 1 ml MHB
CARA UKUR
SKALA
UKUR
ALAT
UKUR
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Electronic
balance dan
mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
NO
VARIABEL
Variabel Tergantung
1.
KHM
(Kadar
Hambat
Minimal)
2.
KBM
(Kadar
Bunuh Minimal)
DEFINISI
OPERASIONAL
Konsentrasi minimal
bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri yang
tampak secara visual
Konsentrasi minimal
bahan coba yang dapat
membunuh
99,9%
bakteri
HASIL UKUR
SKALA
UKUR
Dalam satuan
CFU/ml
(Colony forming
unit/milliliter)
Rasio
Visual dengan
menggunakan
mikroskop
Dalam satuan
CFU/ml
(Colony forming
unit/milliliter)
Rasio
Visual dengan
menggunakan
mikroskop
(Metode
Drop
Plate
Mile Mesra)
3.5 Metode Pelaksanaan Penelitian
3.5.1
Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah:
1. Batang siwak 1 kg
2. Etanol 70% 6 liter (Kimia Farma, Indonesia)
3. Akuades 1 liter (Kimia Farma, Indonesia)
4. E. faecalis ATCC 29212 (MediMark®Europe, France)
5. Media Mueller Hinton (Difco, USA)
3.5.2
Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah:
1. Timbangan (Home Line, China)
2. Timbangan analitik (Vibra, Japan)
3. Kertas perkamen 3 kajang
4. Blender (Panasonic, Japan)
5. Kapas 250 gram (Bio Panca, Indonesia)
6. Kertas saring (Whatman no. 42, England)
7. Aluminium foil 1 gulungan (Total Wrap, Indonesia)
8. Perkolator
9. Erlenmeyer (Pyrex, USA)
10. Vaccum rotavapor (Stuart, 2010)
ALAT
UKUR
11. Electronic balance (Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument
Company, USA)
12. Autoklaf (Tomy, Japan)
13. Vortex/whirli mixer (Iwaki model TM-100, Japan)
14. Inkubator CO2 (Sanyo, Japan)
15. Pipet mikro (Gilson, France)
16. Piring petri (Pyrex, Japan)
17. Ose dan spiritus
18. Kaca pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan)
3.5.3
Prosedur Penelitian
3.5.3.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Siwak
Proses pembuatan ekstrak etanol siwak (Lampiran 2) dilakukan berdasarkan
Standar Operasional Prosedur Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU
dan panduan Farmakope Indonesia tahun 1995 dengan langkah-langkah sebagai
berikut.
a. Pembuatan simplisia
Batang siwak dikeluarkan dari kemasannya dan ditimbang sebanyak 1 kg.
Batang siwak kemudian dipotong kecil-kecil dan dikeringkan di dalam lemari
pengering dengan suhu 40o selama 14 hari. Tanaman dikatakan sudah kering apabila
batang siwak telah mudah dipatahkan. Batang siwak yang telah dikeringkan tersebut
kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 415 gram batang siwak yang telah kering.
Selanjutnya batang siwak kering tersebut dimemarkan dengan alat penggiling
tradisional dan dihaluskan dengan blender, dan didapat serat-serat halus batang siwak
(simplisia).
b. Proses maserasi
Sebanyak 300 gram simplisia diletakkan ke dalam bejana tertutup dan
dimaserasi dengan 1500 ml cairan penyari (etanol 70%) selama 15 menit dengan suhu
25oC.
c. Proses perkolasi
Setelah 24 jam, perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas
secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut
diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah
direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hatihati sambil sesekali ditekan dengan sendok dan di atasnya dilapisi selapis kertas
saring. Kemudian etanol 70% dituangkan ke dalam perkolator dan massa disaring
dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas
simplisia masih terdapat selapis cairan penyari untuk mengetahui apakah perkolator
sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil
dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes
dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit. Tambahkan berulang-ulang
cairan penyari (etanol 70%) secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan
penyari di atas simplisia (pada penelitian ini total etanol 70% yang dituangkan ke
dalam simplisia adalah sebanyak 6 liter), hingga diperoleh ekstrak cair (jumlah
ekstrak cair yang dihasilkan adalah sebanyak 5 liter).
d. Ekstrak cair diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5
jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari hingga konsistensi seperti madu. Ekstrak yang
telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik.
e. Kemudian dibuat pengenceran dengan menggunakan MHB. Hasilnya
didapat ekstrak senyawa aktif siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Ekstrak etanol
batang siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup lalu disimpan di tempat yang
sejuk.
2 cm
Gambar 7. Batang siwak dalam
kemasan
Gambar 8. Bagian siwak
yang diambil
Gambar 9. Penimbangan
siwak
Gambar 12. Siwak yang telah
dikeringkan
Gambar 13. Siwak dimemarkan
dengan alat penggiling
tradisional
Gambar 18. Penguapan
ekstrak cair
dengan vacuum
rotavapor
Gambar 11. Pengeringan
Gambar 10. Pemotongan
siwak dalam
siwak
lemari pengering
Gambar 14. Penghalusan siwak
dengan blender
Gambar 17. Proses
perkolasi
siwak
Gambar 15. Simplisia
siwak
Gambar 16. Perendaman
simplisia
3.5.3.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak batang siwak dalam etanol ditimbang menggunakan electronic
balance dan massaya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara
dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth (MHB). Mula-mula dilarutkan 200
miligram ekstrak etanol kental batang siwak ke dalam 1 ml MHB untuk mendapatkan
konsentrasi 20% ekstrak etanol batang siwak. Kemudian diambil setengah dari
konsentrasi 20% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB agar diperoleh konsentrasi 10%,
dan seterusnya sampai didapat konsentrasi 1,25%. Masing-masing konsentrasi
dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label.
3.5.3.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton
Agar (MHA). Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian
dituangkan ke dalam petri (20 ml/petri) lalu media disterilkan dalam autoklaf selama
15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121oC. Kemudian media dimasukkan ke
dalm inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau
tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan specimen
(Lampiran 3).
3.5.3.4 Pembiakan Spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E. faecalis ATCC 29212
yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga
didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil
beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9%
hingga konsentrasi 106 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit) atau setara dengan 0,5
Mc Farland Standard (Lampiran 3).
3.5.3.5 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol batang siwak yang diuji dalam penelitian ini adalah
20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol
batang siwak dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, diambil 1 ml lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan
menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut
kemudian dicampur dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam
pada inkubator CO2. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan
bantuan spektrofotometer, lalu dibandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol
untuk menentukan nilai KHM.
3.5.3.6 Penentuan KBM Bahan Coba
Penentuan KBM bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan
jumlah koloni menggunakan metode Drop Plates Miles Mesra yaitu ekstrak etanol
batang siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Setelah diinkubasi pada prosedur
penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur dengan
vortex dan diambil 50 µl dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke
dalam MHA (Lampiran 4), dilakukan 5 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit.
Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam.
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan
pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri (Lampiran 5). Apabila
bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni
bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri
pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali.
Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan yang dilakukan perhitungan
jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka
faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan
bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan
faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar (CFU/ml). Contoh cara
penghitungan koloni bakteri pada bahan coba dengan metode Drop Plate Miles
Mesra adalah:
a. Ambil 50 µl bahan coba dengan mikropipet dan diteteskan pada MHA.
Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada media dihitung.
b. Jika tetesan berjumlah 5 koloni, maka jumlah kuman pada sampel cair
tersebut adalah 5 x 1 (faktor pengenceran) x 20 (faktor pengali) = 100 CFU/ml.
3.6 Pengolahan dan Analisis Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis dengan memakai uji statistik yaitu:
1. Uji analisis varians satu arah (ANOVA) untuk mengetahui efek
antimikroba ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan E. faecalis.
2. Uji Least Significant Difference (LSD) untuk melihat perbedaan efek
antimikroba antar kelompok perlakuan.
BAB 4
HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstrak Kental Siwak
Sebelum diekstrak, siwak yang digunakan diidentifikasi di Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa siwak yang
digunakan pada penelitian ini adalah dari jenis Salvadora persica dengan suku
Salvadoraceae (Lampiran 6). Adapun ekstrak kental siwak diperoleh dari ekstrak cair
batang siwak yang diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5
jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari. Penguapan dengan vacuum rotavapor
dilakukan selama 2 hari karena jumlah keseluruhan ekstrak cair yang diperoleh
adalah 5 liter, sampai diperoleh ekstrak kental dengan konsistensi seperti madu.
Ekstrak kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik dan diperoleh hasil
ekstrak kental siwak berwarna coklat kehitaman sebanyak 58,669 gram (Gambar 19).
Kemudian ekstrak kental siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup dan
disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 19. Ekstrak kental siwak hasil
penguapan dengan vacuum
rotavapor
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis,
nilai KHM dan KBM ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada
media pertumbuhan bakteri yang dilakukan secara visual dengan bantuan mikroskop.
Nilai KHM diperoleh dari konsentrasi minimal ekstrak etanol siwak yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri yang tampak secara visual. Sedangkan nilai KBM
diperoleh dari konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
Setelah dilakukan pengujian ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan
bakteri E. faecalis pada media pertumbuhan bakteri diperoleh hasil yakni pada media
yang diberi ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20%, koloni bakteri E. faecalis
berjumlah lebih sedikit daripada jumlah koloni yang ada pada kontrol Mc. Farland.
Sedangkan pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi
10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri dengan bentuk
koloni bakteri yang tidak tampak jelas karena koloni bakteri tersebut saling tumpang
tindih satu sama lain sehingga memberikan hasil TBUD (Tidak Bisa Untuk
Dihitung).
(a)
(b)
Gambar 20. Pertumbuhan E. faecalis pada media yang diberi ekstrak etanol siwak (a) Ekstrak etanol
siwak 20%, (b) Ekstrak etanol siwak 1,25% dengan salah satu bagian diperbesar
(a)
(b)
(d)
(e)
(c)
Gambar 21. Pertumbuhan E. faecalis pada media yang diberi ekstrak etanol siwak (a) Ekstrak etanol
siwak 20%, (b) Ekstrak etanol siwak 10%, (c) Ekstrak etanol siwak 5%, (d) Ekstrak
etanol siwak 2,5%, (e) Ekstrak etanol siwak 1,25%
Pada gambar di atas dapat dilihat bahwa pada media pertumbuhan bakteri
(MHA) yang diberikan ekstrak etanol siwak 20%, terlihat koloni E. faecalis yang
berbentuk bulat kecil berwarna putih kekuningan (Gambar 20a (tanda panah) dan
Gambar 21a). Sedangkan pada media yang diberikan ekstrak etanol siwak 10%, 5%,
2,5%, dan 1,25% (Gambar 20b) bentuk koloni tidak tampak jelas lagi karena koloni
saling tumpang tindih satu sama lain (Gambar 21b, 21c, 21d, 21e). Adapun hasil
penghitungan bakteri yang dilakukan pada masing-masing perlakuan dapat dilihat
pada tabel berikut.
Tabel 1. Hasil uji antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis pada
konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%.
1
2
3
4
5
Kontrol
Mc.
Farland
(CFU/ml)
*
20%
3,18.103
0,66.103
1,38.103
2,44.103
3,52.103
2,92.105
10%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
5%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
2,5%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
1,25%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
Replikasi (CFU/ml)*
Bahan
Uji
Ekstrak
etanol
siwak
Konsentrasi
Kontrol
negatif
(CFU/ml)
Mean
(Ratarata)
(CFU/ml)
0
2,236.103
Keterangan: 0 = steril, tidak ada pertumbuhan bakteri; TBUD = Tidak Bisa Untuk Dihitung, * = dikali
faktor pengencer (x20), CFU/ml = Colony Forming Unit per milliliter
Tabel 1 menunjukkan hasil uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan
konsentrasi 20%,10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% terhadap pertumbuhan E. faecalis. Pada
konsentrasi 20% ditemukan adanya bakteri pada media dengan nilai yang bervariasi
pada setiap replikasi yakni pada replikasi ke-1 dijumpai E. faecalis sebanyak 3,18.103
CFU/ml, pada replikasi ke-2 dijumpai E. faecalis sebanyak 0,66.103 CFU/ml, pada
replikasi ke-3 dijumpai E. faecalis sebanyak 1,38.103 CFU/ml, pada replikasi ke-4
dijumpai E. faecalis sebanyak 2,44.103 CFU/ml, pada replikasi ke-5 dijumpai E.
faecalis sebanyak 3,52.103 CFU/ml. Nilai mean (rata-rata) dari pertumbuhan E.
faecalis yang diberikan ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20% adalah
2,236.103 CFU/ml. Jumlah rata-rata bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya
pada ekstrak etanol siwak 20% dibandingkan dengan bakteri yang ada pada kontrol
Mc.
Farland
adalah
sebanyak
2,89264.105
CFU/ml
(99,23%)
(2,92.105-
2,236.103=2,89264.105=99,23% dari kontrol Mc. Farland ).
Sementara pada konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% dijumpai
pertumbuhan koloni bakteri dengan jumlah yang sangat banyak dan dikategorikan ke
dalam TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung). Hasil dikategorikan TBUD jika jumlah
koloni > 300 sehingga perhitungan jumlah koloni tidak dapat dilanjutkan karena akan
memberikan hasil yang bias. Sedangkan pada kontrol Mc. Farland (E. faecalis tanpa
diberikan ekstrak etanol siwak) ditemukan E. faecalis sebanyak 2,92.105 CFU/ml dan
pada kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E. faecalis) tidak ditemukan
bakteri (steril) (Lampiran 7).
Berdasarkan data hasil penelitian di atas, diperoleh hasil bahwa konsentrasi
minimal ekstrak etanol siwak yang dapat menghambat pertumbuhan E. faecalis pada
penelitian ini adalah sebesar 20%. Sedangkan nilai KBM pada penelitian ini tidak
dapat ditentukan karena tidak ada bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
E. faecalis.
Adapun secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji
statistik parametrik dengan menggunakan uji ANOVA dan LSD karena data yang
tersedia tidak semua direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam
kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD), serta data yang tersedia tersebut tidak
terdistribusi normal. Syarat data yang terdistribusi normal adalah pada uji normalitas
akan menghasilkan bentuk histogram yang simetris.
Gambar 22. Histogram uji normalitas
Pada histogram di atas terlihat bahwa puncak batang yang paling tinggi tidak
berada simetris (di tengah) sehingga dapat disimpulkan bahwa data hasil penelitian
ini tidak terdistribusi dengan normal. Oleh karena data yang dihasilkan tidak
terdistribusi normal maka tidak dapat dilakukan uji statistik parametrik seperti
ANOVA dan LSD, namun dengan menggunakan uji non-parametrik, yakni uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.
Dari hasil uji statistik dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis dan uji MannWhitney diperoleh hasil bahwa ekstrak etanol batang siwak (Salvadora persica)
memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Enterococcus faecalis dengan pvalue (=0.0001) 300 koloni). Jika
jumlah koloni bakteri yang tumbuh > 300 koloni, maka penghitungan koloni bakteri
tidak dilanjutkan karena akan memberikan hasil yang bias. Oleh sebab itu, hasil pada
konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% termasuk ke dalam kategori TBUD. Akan
tetapi, ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20% ini tidak dapat dikategorikan
sebagai nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) karena ada selang konsentrasi yakni
antara 10% ke 20% yang tidak diuji efek antibakterinya. Peneliti menduga, apabila
dilakukan uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi di antara 10%
dan 20%, kemungkinan akan diperoleh nilai KHM dengan konsentrasi yang lebih
kecil dari 20%.
Sedangkan nilai KBM diperoleh dari konsentrasi minimal bahan coba yang
dapat membunuh 99,9% bakteri. Pada hasil penghitungan jumlah koloni bakteri,
tidak satupun dari konsentrasi ekstrak etanol siwak yang mampu membunuh hingga
99,9% bakteri. Oleh karena itu, nilai KBM pada penelitian ini tidak dapat ditentukan.
Nilai KBM tidak dapat diperoleh diduga karena peneliti tidak memulai uji efek
antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap Enterococcus faecalis dimulai dari
konsentrasi tertinggi, yakni 100%. Akibatnya, hasil penelitian ini hanya terbatas pada
konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% saja. Oleh karena itu, apabila
konsentrasi ekstrak etanol siwak dinaikkan di atas 20%, kemungkinan besar nilai
KBM akan diperoleh. Terlebih lagi pada penelitian ini, pada konsentrasi 20%, ekstrak
etanol siwak telah dapat membunuh 99,23% Enterococcus faecalis.
Adapun secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji
statistik parametrik dengan menggunakan uji ANOVA dan LSD karena data yang
tersedia tidak semua direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam
kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD), serta data yang tersedia tersebut tidak
terdistribusi normal. Syarat data yang terdistribusi normal adalah pada uji normalitas
akan menghasilkan bentuk histogram yang simetris. Oleh karena data yang dihasilkan
tidak terdistribusi normal, maka tidak dapat dilakukan uji statistik parametrik seperti
ANOVA dan LSD, namun dengan menggunakan uji non-parametrik, yakni uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney. Dari hasil uji statistik dengan menggunakan
uji Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney diperoleh hasil bahwa ekstrak etanol siwak
(Salvadora persica) memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Enterococcus
faecalis dengan p-value (=0.0001)
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Rancangan dan Jenis Penelitian
3.1.1
Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Posttest
Only Control Group Design
3.1.2
Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental
laboratorium.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
3.2.1
Lokasi Penelitian
Lokasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1.
Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU
2.
Laboratorium Lembaga Pusat Penyakit Tropis UNAIR
3.2.2
Waktu Penelitian
Waktu penelitian ini adalah 6 bulan (Agustus 2012 -Januari 2013)
3.3 Populasi dan Sampel
3.3.1
Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri Enterococcus faecalis
3.3.2
Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah koloni adalah bakteri
Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah diisolasi dan dibiakkan dengan media
Mueller Hinton Agar (MHA).
Penentuan besar sampel sesuai dengan SOP (Standard Operational
Procedure) yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis, Universitas Airlangga.
Jumlah pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus Walton
T Federer (1991):
(t-1) (r-1) ≥ 15
Keterangan:
t = jumlah kelompok perlakuan dalam penelitian
r = banyak replikasi (perlakuan ulang)
Pada penelitian ini digunakan 5 perlakuan, yakni ekstrak etanol siwak dengan
konsentrai 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Oleh karena itu banyak replikasi pada
penelitian ini adalah sebagai berikut.
(t-1) (r-1) ≥ 15
(5-1) (r-1) ≥ 15
4 (r-1) ≥ 15
r-1 ≥ 15 : 4
r-1 ≥ 3,75
r ≥ 3,75 + 1
r ≥ 4,75
Dari perhitungan di atas diperoleh hasil bahwa banyaknya replikasi pada
penelitian ini adalah minimal sebanyak 4,75 kali atau dibulatkan menjadi 5 kali
dengan rincian sebagai berikut:
1. Pada penentuan nilai KHM, jumlah keseluruhan sampel adalah 27 sampel
yakni:
a. Kelompok 1: ekstrak etanol siwak 20%: 5 sampel
b. Kelompok 2: ekstrak etanol siwak 10%: 5 sampel
c. Kelompok 3: ekstrak etanol siwak 5%: 5 sampel
d. Kelompok 4: ekstrak etanol siwak 2,5%: 5 sampel
e. Kelompok 5: ekstrak etanol siwak 1,25%: 5 sampel
f. Kelompok 6: kontrol Mc Farland: 1 sampel
g. Kelompok 7: kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E.
faecalis): 1 sampel
2. Pada penentuan nilai KBM, jumlah keseluruhan sampel adalah 27 sampel
yakni:
a. Kelompok 1: ekstrak etanol siwak 20%: 5 sampel
b. Kelompok 2: ekstrak etanol siwak 10%: 5 sampel
c. Kelompok 3: ekstrak etanol siwak 5%: 5 sampel
d. Kelompok 4: ekstrak etanol siwak 2,5%: 5 sampel
e. Kelompok 5: ekstrak etanol siwak 1,25%: 5 sampel
f. Kelompok 6: kontrol Mc Farland : 1 sampel
g. Kelompok 7: kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E.
faecalis): 1 sampel
3.4 Variabel dan Definisi Operasional
3.4.1
Variabel Penelitian
Variabel bebas
Ekstrak etanol batang siwak 20%,
10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%
Variabel terkendali
a. Jenis dan asal batang siwak
(Salvadora persica) (Sewak AlMuslimTM diproduksi di Riyadh,
Saudi Arabia)
b. Berat batang siwak sebelum
pengeringan (1 kg) dan setelah
pengeringan (415 mg)
c. Lama dan suhu pengeringan siwak (1
minggu pada suhu 40oC)
d. Volume etanol yang dipakai (6 liter)
e. Konsentrasi etanol yang dipakai
(70%)
f. Waktu perendaman siwak (15 menit)
g. Suhu saat perendaman siwak (25oC)
h. Waktu perkolasi (2 minggu)
i. Nomor kertas saring yang dipakai
(Whatman No.42)
j. Jumlah kertas saring saat perlokasi (3
lapis)
k. Kecepatan tetes cairan dalam
perkolator (20 tetes/menit)
l. Suhu penguapan rotavapor (46oC)
m. Waktu penguapan rotavapor (10 jam)
n. Media pertumbuhan bakteri yaitu
Mueller Hinton Broth dan Mueller
Hinton Agar
o. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media
p. E. faecalis ATCC 29212
q. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke
media (MHA=50 µl, MHB=1 ml)
r. Suhu inkubasi (37oC)
s. Teknik pembiakan E.faecalis
t. Waktu pembiakan E.faecalis (24 jam)
u. Waktu pengamatan (24 jam)
Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri E.faecalis
pada media MHB dan MHA
dengan penentuan nilai KHM dan
KBM
Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan (kondisi tanah dan
iklim) tempat tumbuh batang siwak
b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama
tumbuh
d. Lama penyimpanan siwak sampai
proses ekstraksi
e. Suhu penyimpanan siwak sampai
proses ekstraksi
f. Lama pengiriman dari bahan coba
sampai ke Laboratorium Pusat
Penyakit Tropis Surabaya
g. Suhu saat pengiriman dari bahan
coba sampai ke Laboratorium Pusat
Penyakit Tropis Surabaya
h. pH lingkungan saat dilakukan uji
sensitivitas bakteri
3.4.2 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanol batang siwak 20%,
10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%.
3.4.3 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah Pertumbuhan bakteri E.faecalis
pada media MHB dan MHA dengan penentuan nilai KHM dan KBM
3.4.4 Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Jenis dan asal batang siwak (Salvadora persica) (Sewak Al-MuslimTM
diproduksi di Riyadh, Saudi Arabia)
b. Berat batang siwak sebelum pengeringan (1 kg) dan setelah pengeringan
(415 mg)
c. Lama dan suhu pengeringan siwak (1 minggu pada suhu 40oC)
d. Volume etanol yang dipakai (6 liter)
e. Konsentrasi etanol yang dipakai (70%)
f. Waktu perendaman siwak (15 menit)
g. Suhu saat perendaman siwak (25oC)
h. Waktu perkolasi (2 minggu)
i. Nomor kertas saring yang dipakai (Whatman No.42)
j. Jumlah kertas saring saat perlokasi (3 lapis)
k. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator (20 tetes/menit)
l. Suhu penguapan rotavapor (46oC)
m. Waktu penguapan rotavapor (10 jam)
n. Media pertumbuhan bakteri yaitu Mueller Hinton Broth (MHB) dan
Mueller Hinton Agar (MHA)
o. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media
p. E. faecalis ATCC 29212
q. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke media (MHA=50 µl, MHB=1 ml)
r. Suhu inkubasi (37oC)
s. Teknik pembiakan E.faecalis
t. Waktu pembiakan E.faecalis (24 jam)
u. Waktu pengamatan (24 jam)
3.4.5 Variabel Tidak Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Lingkungan (kondisi tanah dan iklim) tempat tumbuh batang siwak
b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama tumbuh
d. Lama penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
e. Suhu penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
f. Lama pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis
Surabaya
g. Suhu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit
Tropis Surabaya
h. pH lingkngan saat dilakukan uji sensitivitas bakteri
3.4.6 Definisi Operasional
NO
VARIABEL
DEFINISI OPERASIONAL
Variabel Bebas
1.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak melarutkan 200 mg ekstrak etanol
kental batang siwak dalam 1 ml
20%
Mueller Hinton Broth (MHB)
2.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
10%
ekstrak etanol siwak 20% dan
dilarutkan dalam 1 ml MHB
3.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 10% dan
5%
dilarutkan dalam 1 ml MHB
4.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 5% dan
2,5%
dilarutkan dalam 1 ml MHB
5.
Ekstrak etanol Ekstrak yang diperoleh dengan
batang siwak mengambil 1/2 dari konsentrasi
ekstrak etanol siwak 2,5% dan
1,25%
dilarutkan dalam 1 ml MHB
CARA UKUR
SKALA
UKUR
ALAT
UKUR
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Electronic
balance dan
mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
Sesuai SOP Lab. Rasio
Pusat
Penyakit
Tropis UNAIR
Mikropipet
NO
VARIABEL
Variabel Tergantung
1.
KHM
(Kadar
Hambat
Minimal)
2.
KBM
(Kadar
Bunuh Minimal)
DEFINISI
OPERASIONAL
Konsentrasi minimal
bahan coba yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri yang
tampak secara visual
Konsentrasi minimal
bahan coba yang dapat
membunuh
99,9%
bakteri
HASIL UKUR
SKALA
UKUR
Dalam satuan
CFU/ml
(Colony forming
unit/milliliter)
Rasio
Visual dengan
menggunakan
mikroskop
Dalam satuan
CFU/ml
(Colony forming
unit/milliliter)
Rasio
Visual dengan
menggunakan
mikroskop
(Metode
Drop
Plate
Mile Mesra)
3.5 Metode Pelaksanaan Penelitian
3.5.1
Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah:
1. Batang siwak 1 kg
2. Etanol 70% 6 liter (Kimia Farma, Indonesia)
3. Akuades 1 liter (Kimia Farma, Indonesia)
4. E. faecalis ATCC 29212 (MediMark®Europe, France)
5. Media Mueller Hinton (Difco, USA)
3.5.2
Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah:
1. Timbangan (Home Line, China)
2. Timbangan analitik (Vibra, Japan)
3. Kertas perkamen 3 kajang
4. Blender (Panasonic, Japan)
5. Kapas 250 gram (Bio Panca, Indonesia)
6. Kertas saring (Whatman no. 42, England)
7. Aluminium foil 1 gulungan (Total Wrap, Indonesia)
8. Perkolator
9. Erlenmeyer (Pyrex, USA)
10. Vaccum rotavapor (Stuart, 2010)
ALAT
UKUR
11. Electronic balance (Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument
Company, USA)
12. Autoklaf (Tomy, Japan)
13. Vortex/whirli mixer (Iwaki model TM-100, Japan)
14. Inkubator CO2 (Sanyo, Japan)
15. Pipet mikro (Gilson, France)
16. Piring petri (Pyrex, Japan)
17. Ose dan spiritus
18. Kaca pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan)
3.5.3
Prosedur Penelitian
3.5.3.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Siwak
Proses pembuatan ekstrak etanol siwak (Lampiran 2) dilakukan berdasarkan
Standar Operasional Prosedur Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU
dan panduan Farmakope Indonesia tahun 1995 dengan langkah-langkah sebagai
berikut.
a. Pembuatan simplisia
Batang siwak dikeluarkan dari kemasannya dan ditimbang sebanyak 1 kg.
Batang siwak kemudian dipotong kecil-kecil dan dikeringkan di dalam lemari
pengering dengan suhu 40o selama 14 hari. Tanaman dikatakan sudah kering apabila
batang siwak telah mudah dipatahkan. Batang siwak yang telah dikeringkan tersebut
kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 415 gram batang siwak yang telah kering.
Selanjutnya batang siwak kering tersebut dimemarkan dengan alat penggiling
tradisional dan dihaluskan dengan blender, dan didapat serat-serat halus batang siwak
(simplisia).
b. Proses maserasi
Sebanyak 300 gram simplisia diletakkan ke dalam bejana tertutup dan
dimaserasi dengan 1500 ml cairan penyari (etanol 70%) selama 15 menit dengan suhu
25oC.
c. Proses perkolasi
Setelah 24 jam, perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas
secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut
diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah
direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hatihati sambil sesekali ditekan dengan sendok dan di atasnya dilapisi selapis kertas
saring. Kemudian etanol 70% dituangkan ke dalam perkolator dan massa disaring
dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas
simplisia masih terdapat selapis cairan penyari untuk mengetahui apakah perkolator
sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil
dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes
dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit. Tambahkan berulang-ulang
cairan penyari (etanol 70%) secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan
penyari di atas simplisia (pada penelitian ini total etanol 70% yang dituangkan ke
dalam simplisia adalah sebanyak 6 liter), hingga diperoleh ekstrak cair (jumlah
ekstrak cair yang dihasilkan adalah sebanyak 5 liter).
d. Ekstrak cair diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5
jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari hingga konsistensi seperti madu. Ekstrak yang
telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik.
e. Kemudian dibuat pengenceran dengan menggunakan MHB. Hasilnya
didapat ekstrak senyawa aktif siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Ekstrak etanol
batang siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup lalu disimpan di tempat yang
sejuk.
2 cm
Gambar 7. Batang siwak dalam
kemasan
Gambar 8. Bagian siwak
yang diambil
Gambar 9. Penimbangan
siwak
Gambar 12. Siwak yang telah
dikeringkan
Gambar 13. Siwak dimemarkan
dengan alat penggiling
tradisional
Gambar 18. Penguapan
ekstrak cair
dengan vacuum
rotavapor
Gambar 11. Pengeringan
Gambar 10. Pemotongan
siwak dalam
siwak
lemari pengering
Gambar 14. Penghalusan siwak
dengan blender
Gambar 17. Proses
perkolasi
siwak
Gambar 15. Simplisia
siwak
Gambar 16. Perendaman
simplisia
3.5.3.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak batang siwak dalam etanol ditimbang menggunakan electronic
balance dan massaya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara
dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth (MHB). Mula-mula dilarutkan 200
miligram ekstrak etanol kental batang siwak ke dalam 1 ml MHB untuk mendapatkan
konsentrasi 20% ekstrak etanol batang siwak. Kemudian diambil setengah dari
konsentrasi 20% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB agar diperoleh konsentrasi 10%,
dan seterusnya sampai didapat konsentrasi 1,25%. Masing-masing konsentrasi
dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label.
3.5.3.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton
Agar (MHA). Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian
dituangkan ke dalam petri (20 ml/petri) lalu media disterilkan dalam autoklaf selama
15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121oC. Kemudian media dimasukkan ke
dalm inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau
tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan specimen
(Lampiran 3).
3.5.3.4 Pembiakan Spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E. faecalis ATCC 29212
yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga
didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil
beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9%
hingga konsentrasi 106 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit) atau setara dengan 0,5
Mc Farland Standard (Lampiran 3).
3.5.3.5 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol batang siwak yang diuji dalam penelitian ini adalah
20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol
batang siwak dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, diambil 1 ml lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan
menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut
kemudian dicampur dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam
pada inkubator CO2. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan
bantuan spektrofotometer, lalu dibandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol
untuk menentukan nilai KHM.
3.5.3.6 Penentuan KBM Bahan Coba
Penentuan KBM bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan
jumlah koloni menggunakan metode Drop Plates Miles Mesra yaitu ekstrak etanol
batang siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Setelah diinkubasi pada prosedur
penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur dengan
vortex dan diambil 50 µl dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke
dalam MHA (Lampiran 4), dilakukan 5 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit.
Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam.
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan
pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri (Lampiran 5). Apabila
bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni
bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri
pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali.
Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan yang dilakukan perhitungan
jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka
faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan
bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan
faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar (CFU/ml). Contoh cara
penghitungan koloni bakteri pada bahan coba dengan metode Drop Plate Miles
Mesra adalah:
a. Ambil 50 µl bahan coba dengan mikropipet dan diteteskan pada MHA.
Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada media dihitung.
b. Jika tetesan berjumlah 5 koloni, maka jumlah kuman pada sampel cair
tersebut adalah 5 x 1 (faktor pengenceran) x 20 (faktor pengali) = 100 CFU/ml.
3.6 Pengolahan dan Analisis Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis dengan memakai uji statistik yaitu:
1. Uji analisis varians satu arah (ANOVA) untuk mengetahui efek
antimikroba ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan E. faecalis.
2. Uji Least Significant Difference (LSD) untuk melihat perbedaan efek
antimikroba antar kelompok perlakuan.
BAB 4
HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstrak Kental Siwak
Sebelum diekstrak, siwak yang digunakan diidentifikasi di Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia (LIPI). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa siwak yang
digunakan pada penelitian ini adalah dari jenis Salvadora persica dengan suku
Salvadoraceae (Lampiran 6). Adapun ekstrak kental siwak diperoleh dari ekstrak cair
batang siwak yang diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5
jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari. Penguapan dengan vacuum rotavapor
dilakukan selama 2 hari karena jumlah keseluruhan ekstrak cair yang diperoleh
adalah 5 liter, sampai diperoleh ekstrak kental dengan konsistensi seperti madu.
Ekstrak kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik dan diperoleh hasil
ekstrak kental siwak berwarna coklat kehitaman sebanyak 58,669 gram (Gambar 19).
Kemudian ekstrak kental siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup dan
disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 19. Ekstrak kental siwak hasil
penguapan dengan vacuum
rotavapor
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis,
nilai KHM dan KBM ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada
media pertumbuhan bakteri yang dilakukan secara visual dengan bantuan mikroskop.
Nilai KHM diperoleh dari konsentrasi minimal ekstrak etanol siwak yang mampu
menghambat pertumbuhan bakteri yang tampak secara visual. Sedangkan nilai KBM
diperoleh dari konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
Setelah dilakukan pengujian ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan
bakteri E. faecalis pada media pertumbuhan bakteri diperoleh hasil yakni pada media
yang diberi ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20%, koloni bakteri E. faecalis
berjumlah lebih sedikit daripada jumlah koloni yang ada pada kontrol Mc. Farland.
Sedangkan pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi
10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri dengan bentuk
koloni bakteri yang tidak tampak jelas karena koloni bakteri tersebut saling tumpang
tindih satu sama lain sehingga memberikan hasil TBUD (Tidak Bisa Untuk
Dihitung).
(a)
(b)
Gambar 20. Pertumbuhan E. faecalis pada media yang diberi ekstrak etanol siwak (a) Ekstrak etanol
siwak 20%, (b) Ekstrak etanol siwak 1,25% dengan salah satu bagian diperbesar
(a)
(b)
(d)
(e)
(c)
Gambar 21. Pertumbuhan E. faecalis pada media yang diberi ekstrak etanol siwak (a) Ekstrak etanol
siwak 20%, (b) Ekstrak etanol siwak 10%, (c) Ekstrak etanol siwak 5%, (d) Ekstrak
etanol siwak 2,5%, (e) Ekstrak etanol siwak 1,25%
Pada gambar di atas dapat dilihat bahwa pada media pertumbuhan bakteri
(MHA) yang diberikan ekstrak etanol siwak 20%, terlihat koloni E. faecalis yang
berbentuk bulat kecil berwarna putih kekuningan (Gambar 20a (tanda panah) dan
Gambar 21a). Sedangkan pada media yang diberikan ekstrak etanol siwak 10%, 5%,
2,5%, dan 1,25% (Gambar 20b) bentuk koloni tidak tampak jelas lagi karena koloni
saling tumpang tindih satu sama lain (Gambar 21b, 21c, 21d, 21e). Adapun hasil
penghitungan bakteri yang dilakukan pada masing-masing perlakuan dapat dilihat
pada tabel berikut.
Tabel 1. Hasil uji antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis pada
konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%.
1
2
3
4
5
Kontrol
Mc.
Farland
(CFU/ml)
*
20%
3,18.103
0,66.103
1,38.103
2,44.103
3,52.103
2,92.105
10%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
5%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
2,5%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
1,25%
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
Replikasi (CFU/ml)*
Bahan
Uji
Ekstrak
etanol
siwak
Konsentrasi
Kontrol
negatif
(CFU/ml)
Mean
(Ratarata)
(CFU/ml)
0
2,236.103
Keterangan: 0 = steril, tidak ada pertumbuhan bakteri; TBUD = Tidak Bisa Untuk Dihitung, * = dikali
faktor pengencer (x20), CFU/ml = Colony Forming Unit per milliliter
Tabel 1 menunjukkan hasil uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan
konsentrasi 20%,10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% terhadap pertumbuhan E. faecalis. Pada
konsentrasi 20% ditemukan adanya bakteri pada media dengan nilai yang bervariasi
pada setiap replikasi yakni pada replikasi ke-1 dijumpai E. faecalis sebanyak 3,18.103
CFU/ml, pada replikasi ke-2 dijumpai E. faecalis sebanyak 0,66.103 CFU/ml, pada
replikasi ke-3 dijumpai E. faecalis sebanyak 1,38.103 CFU/ml, pada replikasi ke-4
dijumpai E. faecalis sebanyak 2,44.103 CFU/ml, pada replikasi ke-5 dijumpai E.
faecalis sebanyak 3,52.103 CFU/ml. Nilai mean (rata-rata) dari pertumbuhan E.
faecalis yang diberikan ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20% adalah
2,236.103 CFU/ml. Jumlah rata-rata bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya
pada ekstrak etanol siwak 20% dibandingkan dengan bakteri yang ada pada kontrol
Mc.
Farland
adalah
sebanyak
2,89264.105
CFU/ml
(99,23%)
(2,92.105-
2,236.103=2,89264.105=99,23% dari kontrol Mc. Farland ).
Sementara pada konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% dijumpai
pertumbuhan koloni bakteri dengan jumlah yang sangat banyak dan dikategorikan ke
dalam TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung). Hasil dikategorikan TBUD jika jumlah
koloni > 300 sehingga perhitungan jumlah koloni tidak dapat dilanjutkan karena akan
memberikan hasil yang bias. Sedangkan pada kontrol Mc. Farland (E. faecalis tanpa
diberikan ekstrak etanol siwak) ditemukan E. faecalis sebanyak 2,92.105 CFU/ml dan
pada kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E. faecalis) tidak ditemukan
bakteri (steril) (Lampiran 7).
Berdasarkan data hasil penelitian di atas, diperoleh hasil bahwa konsentrasi
minimal ekstrak etanol siwak yang dapat menghambat pertumbuhan E. faecalis pada
penelitian ini adalah sebesar 20%. Sedangkan nilai KBM pada penelitian ini tidak
dapat ditentukan karena tidak ada bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
E. faecalis.
Adapun secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji
statistik parametrik dengan menggunakan uji ANOVA dan LSD karena data yang
tersedia tidak semua direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam
kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD), serta data yang tersedia tersebut tidak
terdistribusi normal. Syarat data yang terdistribusi normal adalah pada uji normalitas
akan menghasilkan bentuk histogram yang simetris.
Gambar 22. Histogram uji normalitas
Pada histogram di atas terlihat bahwa puncak batang yang paling tinggi tidak
berada simetris (di tengah) sehingga dapat disimpulkan bahwa data hasil penelitian
ini tidak terdistribusi dengan normal. Oleh karena data yang dihasilkan tidak
terdistribusi normal maka tidak dapat dilakukan uji statistik parametrik seperti
ANOVA dan LSD, namun dengan menggunakan uji non-parametrik, yakni uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.
Dari hasil uji statistik dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis dan uji MannWhitney diperoleh hasil bahwa ekstrak etanol batang siwak (Salvadora persica)
memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Enterococcus faecalis dengan pvalue (=0.0001) 300 koloni). Jika
jumlah koloni bakteri yang tumbuh > 300 koloni, maka penghitungan koloni bakteri
tidak dilanjutkan karena akan memberikan hasil yang bias. Oleh sebab itu, hasil pada
konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% termasuk ke dalam kategori TBUD. Akan
tetapi, ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20% ini tidak dapat dikategorikan
sebagai nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) karena ada selang konsentrasi yakni
antara 10% ke 20% yang tidak diuji efek antibakterinya. Peneliti menduga, apabila
dilakukan uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi di antara 10%
dan 20%, kemungkinan akan diperoleh nilai KHM dengan konsentrasi yang lebih
kecil dari 20%.
Sedangkan nilai KBM diperoleh dari konsentrasi minimal bahan coba yang
dapat membunuh 99,9% bakteri. Pada hasil penghitungan jumlah koloni bakteri,
tidak satupun dari konsentrasi ekstrak etanol siwak yang mampu membunuh hingga
99,9% bakteri. Oleh karena itu, nilai KBM pada penelitian ini tidak dapat ditentukan.
Nilai KBM tidak dapat diperoleh diduga karena peneliti tidak memulai uji efek
antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap Enterococcus faecalis dimulai dari
konsentrasi tertinggi, yakni 100%. Akibatnya, hasil penelitian ini hanya terbatas pada
konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% saja. Oleh karena itu, apabila
konsentrasi ekstrak etanol siwak dinaikkan di atas 20%, kemungkinan besar nilai
KBM akan diperoleh. Terlebih lagi pada penelitian ini, pada konsentrasi 20%, ekstrak
etanol siwak telah dapat membunuh 99,23% Enterococcus faecalis.
Adapun secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji
statistik parametrik dengan menggunakan uji ANOVA dan LSD karena data yang
tersedia tidak semua direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam
kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD), serta data yang tersedia tersebut tidak
terdistribusi normal. Syarat data yang terdistribusi normal adalah pada uji normalitas
akan menghasilkan bentuk histogram yang simetris. Oleh karena data yang dihasilkan
tidak terdistribusi normal, maka tidak dapat dilakukan uji statistik parametrik seperti
ANOVA dan LSD, namun dengan menggunakan uji non-parametrik, yakni uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney. Dari hasil uji statistik dengan menggunakan
uji Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney diperoleh hasil bahwa ekstrak etanol siwak
(Salvadora persica) memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Enterococcus
faecalis dengan p-value (=0.0001)