3.Isolasi Kasein Susu & Penentuan Kadar Protein

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERCOBAAN IX UJI AKTIVITAS ENZIM GLUKOAMILASE

  

OLEH:

NAMA : AGUNG WIBAWA MAHATVA YODHA STAMBUK : F1C1 08 006 KELOMPOK : I ASISTEN :

  

LABORATORIUM KIMIA JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALUOLEO

KENDARI

2011

BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel

  hidup. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah (1) dapat meningkatkan produk beribu kali lebih tinggi; (2) bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu yang relatif rendah; dan (3) bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu (Azmi, 2006).

  Enzim glukoamilase (EC. 3.2.1.3) atau sering disebut amiloglukosidase atau α-1,4-glukano glukohidrolase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu menghidrolisa ikatan α-1,4 pada rantai amilosa, amilopektin, glikogen, dan pullulan ( Azwar D. dan R. Erwanti, 2000). Glukoamilase dapat diproduksi dalam skala industri melalui fermentasi kultur cair maupun fermentasi padat. Fermentasi dengan media cair lebih menguntungkan, tetapi biaya operasional dan alat yang digunakan lebih mahal. Fermentasi dengan media padat mempunyai keunggulan lebih sederhana dalam pelaksanaannya, biaya operasional dan peralatan fermentasi lebih murah, tetapi untuk menjaga kondisi fermentasi sesuai dengan apa yang diinginkan seperti kehomogenan media, aerasi sangat sulit untuk dilakukan .

  Produksi glukosa hasil aktivitas glukoamilase diukur dengan spektrofotometer dengan metode Smogy-Nelson pada panjang gelombang 550 nm, yang dibandingkaan dengan glukosa standar

  B. Permasalahan

  Permasalahan dalam praktikum ini yaitu bagaimanakah aktivitas enzim glukoamilase yang diproduksi oleh mikroba ?

  C. Tujuan

  Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk menguji aktivitas enzim glukoamilase yang diproduksi oleh mikroba.

  D. Manfaat

  Manfaat dari praktikum ini yaitu untuk menambah pengetahuan uji aktivitas enzim glukoamilase yang diproduksi oleh mikroba.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel. Bekerja dengan

  urutan-urutan yang teratur, enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrient, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi kimiawi dan yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana. Di antara sejumlah enzim yang berpartisi di dalam metabolisme terdapat sekelompok khusus yang dikenal sebagai enzim pengatur yang dapat mengenali berbagai isyarat metabolik dan mengubah kecepatan katalitiknya sesuai dengan isyarat yang diterima. Melalui aktivitasnya, sistem enzim terkoordinasi dengan baik, menghasilkan suatu hubungan yang harmonis di antara sejumlah aktivitas metabolik yang berbeda, yang diperlukan untuk menunjuang kehidupan (Lehninger, 1982).

  Reaksi kimia dipengaruhi oleh suhu. Reaksi yang menggunkana katalis enzim juga dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Di samping itu, karena enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila proses denaturasi terjadi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatamn reaksinya ikut menurun (Poedjiadi, 1994).

  Fermentasi mempunyai pengertian aplikasi metabolisme mikroba untuk mengubah bahan baku menjadi produk yang bernilai lebih tinggi, seperti asam- asam organik, protein sel tunggal, antibiotika dan biopolimer. Fermentasi merupakan proses yang relatif murah yang pada hakekatnya telah lama dilakukan oleh nenek moyang kita secara tradisional dengan produk-produknya yang sudah biasa dimakan orang sampai sekarang, seperti tempe, oncom, tape, dan lain-lain. Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur terendam

  

submerged. Kultur permukaan yang menggunakan substrat padat atau semi padat

banyak digunakan untuk memproduksi berbagai jenis asam organik dan enzim.

  Fermentasi media padat ini sering disebut proses ‘koji’, misalnya proses koji untuk memproduksi enzim yang dibutuhkan dalam pembuatan shoyu (kecap kedelai), miso, sake, asam-asam organik dan sebagainya. (Muhiddin et al, 2001).

  Pati (starch) adalah karbohidrat penyimpan energi pada tanaman. Pati merupakan komponen padi-padian, kentang, jagung. Dalam bentuk inilah glukosa disimpan oleh tanaman untuk keperluan mendatang. Pati tersusun dari unit-unit glukosa yang dihubungkan oleh ikatan 1,4- -glikosida, walaupun rantai ini dapat pula mempunyai percabangan karena adanya ikatan 1,6-  -glikosida. Hidrolisis parsial pada pati menghasilkan maltosa, dan hidrolisis selengkapnya akan memberikan D-glukosa. Pati dapat dipisahkan dengan macam-macam pelarut dan teknik pengendapan menjadi dua bagian, yaitu amilosa dan amilopektin. Pada amilosa, yang menyusun 20% pati, unit-unit glukosa (50-300) membentuk rantai lurus yang berikatan menurut 1,4. Amilopektin (amylopectin) bercabang banyak. Sekalipun setiap molekul dapat mempunyai 300-500 unit glukosa, rantai dengan ikatan 1,4 hanya terdapat rata-rata sepanjang 25-30 unit glukosa. Rantai-rantai demikian mempunyai percabangan melalui ikatan 1,6.

  Karena strukturnya yang banyak bercabang, butir pati mengembang dan membentuk larutan koloid dalam air (Hart,1983).

  Pada fungi, studi yang rinci mengenai pemurnian α-amilase terbatas hanya pada sedikit spesies fungi. Meskipun demikian, Amirul et al memproduksi α- glukosidase, α-amilase, dan dua bentuk glukoamilase dari Aspergillus niger yang tumbuh pada medium cair yang mengandung pati tapioka sebagai sumber karbon.

  Di sisi lain, saat α-amilase telah banyak diproduksi dari strain genus Bacillus, beberapa usaha telah dilakukan untuk pemurnian dan karakterisasinya, baik dari strain mesofilik maupun termofilik (El-Safey et al, 2004).

  Proses perubahan karbohidrat menjadi glukosa secara enzimatik, melibatkan kelompok enzim amilase. Oleh karena itu, enzim amilase banyak diisolasi, diteliti, dan dipelajari sifat dan karakteristiknya. Gasperik et al telah mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim amilase yang diproduksi secara ekstraselular dari kultur cair Endomycopsis fibuligera yang mengandung pati sagu. Selanjutnya dilakukan pemisahan dengan metode HPLC menunjukkan bahwa amilase terdiri dari beberapa enzim, diantaranya α-amilase (EC 3.2.1.1) dan amiloglukosidase (EC 3.2.1.3). Disamping itu mereka menemukan bahwa α-amilase dan amiloglukosidase memiliki perbedaan stabilitas termal. Amiloglukosidase tampaknya lebih stabil dibandingkan dengan α-amilase. Pengujian aktivitas enzim amiloglukosidase dihitung dari jumlah glukosa yang diperoleh dari hidrolisis pati dan diukur dengan metode Nelson-Somogy. Dari hasil percobaan Gasperik et al menemukan bahwa aktivitas optimum α-amilase dicapai pada pH 5,8 sedang amiloglukosidase dicapai pada pH 5,4 (Ahmad, 2003).

BAB III METODE PRAKTIKUM A. Waktu dan Tempat Praktikum ini dilakukan pada hari Sabtu 09 April 2011, bertempat di Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. B. Alat dan Bahan

• Pembuatan Kurva Standar Protein Hasil Pengamatan

  Dimasukkan 2 ml kedalam tabung reaksi Ditambahkan 8 ml reagen biuret Didiamkan selama 30 menit Diukur absorbansinya pada λ = 530 nm Dibuat kurva standar protein

  BSA 2 mg/ ml BSA 4 mg/ ml

  BSA 6 mg/ ml BSA 8 mg/ ml

  BSA 10 mg/ml

  a. Alat

  Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu tabung reaksi, pipet tetes, pipet volume, filler, labu takar 50 ml, spektonik 20D, botol ampul, water bath dan elektromantel.

  b. Bahan

  Bahan-bahan yang digunakan yaitu crude enzim, enzim 40 %, enzim 80 %, reagen biuret, substrat pati, buffer pH 4, 7 dan 9, DNS, es batu dan akuades.

C. Rancangan Percobaan

1. Penentuan Kadar Protein

• Pembuatan Kurva Standar Glukosa Glukosa Glukosa Glukosa Glukosa Glukosa 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 10 mg/ml 6 mg/ml

  Dimasukkan 2 ml kedalam masing-masing tabung reaksi Ditambahkan 2 ml DNS Didiamkan selama 30 menit Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit Didinginkan pada permukaan es batu

  Hasil Pengamatan Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Dibuat kurva standar glukosa

• Penentuan Kadar Protein 2 ml crude 2 ml enzim 40 2 ml enzim 80 enzim % %

  Masing-masing dimasukkan kedalam tabung reaksi Ditambahkan 8 ml reagen biuret Didiamkan selama 30 menit Diukur absorbansinya pada λ = 530 nm

  Hasil Pengamatan Ditentukan kadar protein enzim

2. Penentuan Aktivitas Enzim Amiloglukosidase

• Karakterisasi pH 4, 7 dan 9 pada suhu kamar

  1 ml buffer pH 4 Dimasukkan dalam tabung reaksi Diinkubasi selama 30 menit Ditambahkan 2 ml DNS Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit Didinginkan pada permukaan air es Diencerkan dengan akuades hingga 10 ml Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Ditentukan aktivitas enzim 1 ml substrat

  Dimasukkan dalam tabung reaksi Ditambahkan 1 ml buffer pH 4 Diinkubasi selama 30 menit Ditambahkan 2 ml DNS Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit Didinginkan pada permukaan air es Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Ditentukan aktivitas enzim

  Hasil Pengamatan

  a. Kontrol substrat

  b. Blanko Hasil Pengamatan

  0,5 ml enzim 40 %

  0,5 ml crude enzim 0,5 ml enzim 80

  %  Masing-masing ditambahkan 1 ml substrat dalam tabung reaksi  Ditambahkan buffer pH 4  Diinkubasi selama 30 menit  Ditambahkan 2 ml DNS  Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit  Didinginkan pada permukaan air es  Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml  Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm  Ditentukan aktivitas enzim

  Hasil Pengamatan 1 ml substrat Dimasukkan dalam tabung reaksi Ditambahkan 1 ml buffer pH 7 Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar Ditambahkan 2 ml DNS Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit Didinginkan pada permukaan air es Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm

• Karakterisasi suhu aktivitas enzim pada pH 7

  Hasil Pengamatan

  c. Aktivitas enzim glukoamilase Keterangan : Dilakukan perlakuan yang sama untuk pH7 dan 9

  1. Suhu Kamar

  a. Kontrol substrat

  0,5 ml enzim 40 %

  0,5 ml crude enzim 0,5 ml enzim 80

  %  Masing-masing ditambahkan 1 ml substrat dalam tabung reaksi  Ditambahkan buffer pH 7  Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar  Ditambahkan 2 ml DNS  Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit  Didinginkan pada permukaan air es  Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml  Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm  Ditentukan aktivitas enzim

  Hasil Pengamatan 1 ml buffer pH 7 Dimasukkan dalam tabung reaksi Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar Ditambahkan 2 ml DNS Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit Didinginkan pada permukaan air es Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Ditentukan aktivitas enzim

  b. Blanko

  c. Aktivitas enzim glukoamilase Keterangan : Dilakukan perlakuan yang sama untuk variasi suhu 50

  o

  C dan 100

  o

  C Hasil Pengamatan

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan

  1. Kurva Standar Protein M (mg/ml) A 2 0,027

  4 0,124 6 0,239 8 0,271 10 0,316

  2. Kurva Standar Maltosa M (mg/ml) A 2 0,556

  4 0,566 6 0,572 8 0,578 10 0,580

  3. Kadar Protein Sampel A

  Crude Enzim 0,084 Fraksi I (40 %) 0,045

  Fraksi II (80 %) 0,069

  4. Karakteristik Suhu Aktif Enzim (pH 7) Suhu (

  o

  C) Absorbansi

  Crude Enzim Fraksi I (40 %) Fraksi II (80%) Kamar

  50 100

  0,111 0,062 0,042

  0,055 0,497 0,452

  0,091 0,024 0,049

  5. Karakteristik pH Aktif Enzim (Suhu Kamar) pH Absorbansi

  Crude Enzim Fraksi I (40 %) Fraksi II (80%)

  4

  7

  9 0,073 0,111 0,140

  0,052 0,055 0,057

  0,027 0,091 0,027

B. Pembahasan

  Protein adalah makromolekul paling berlimpah di dalam sel hidup dan merupakan 50 persen atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel dan semua bagian sel. Protein merupakan senyawa polipeptida dengan berat molekul besar dan tersusun atas unsur-unsur C, H, O, N, serta ada pula yang mengandung unsur S dan P. Molekul protein terdiri atas unit-unit kecil asam amino yang saling bersambung satu sama lain yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan senyawa yang sangat penting dalam semua sel hidup, karena protein merupakan bagian esensial dari protoplasma. Selain itu, protein juga berfungsi mengekspresikan informasi genetik.

  Salah satu jenis protein yang sangat penting adalah enzim. Enzim merupakan kelompok protein yang berperan sangat penting dalam proses aktivitas biologi. Enzim berfungsi sebagai katalisator dalam sel dan sifatnya sangat khas. Dalam jumlah yang sangat kecil enzim dapat mengatur reaksi tertentu sehingga dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan-penyimpangan hasil reaksinya.

  Enzim akan kehilangan aktivitasnya akibat panas, asam atau basa kuat, pelarut organik atau apa saja yang menyebabkan denaturasi protein. Melalui aktivitasnya, sistem enzim terkoordinasi dengan baik menghasilkan suatu hubungan yang harmonis di antara sejumlah aktivitas metabolik yang berbeda, yang diperlukan untuk menunjang kehidupan. Enzim juga biasa disebut sebagai biokatalisator.

  Enzim adalah katalisator sejati. Molekul ini meningkatkan secara nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Beberapa enzim memiliki spesifitas yang hampir absolut bagi substrat tertentu. Penelitian terhadap spesifitas enzim menunjukkan bahwa molekul substrat harus memiliki dua ciri struktural yang jelas, yaitu ikatan kimia spesifik yang dapat diserang oleh enzim dan biasanya beberapa gugus lainnya yaitu gugus pengikat yang berikatan dengan enzim dan mengarahkan molekul substrat dengan tepat pada sisi aktif sehingga ikatan yang rapuh tapi tepat terletak pada posisi yang berhubungan dengan gugus katalitik enzim. Mekanisme kerja enzim biasa digambarkan dengan mekanisme kerja gembok dan anak kunci (lock and key). Karena sifat spesifitasnya, banyak enzim diberi nama berdasarkan substratnya, seperti enzim glukoamilase yang mengkatalisis hidrolisis pati menjadi molekul yang lebih kecil, yakni glukosa.

  Enzim glukoamilase (EC 3.2.1.3) merupakan kelompok enzim dari keluarga amilase. Nama lain dari enzim ini adalah enzim amiloglukosidase. Enzim ini berfungsi mengkatalisis reaksi hidrolisis pati (amilosa dan amilopektin) menjadi molekul karbohidrat yang lebih kecil, yakni berupa monosakarida glukosa. Cara kerja enzim ini adalah dengan memotong pati pada ikatan α1,4 dan α1,6- glikosidik secara teratur dari ujung rantai pati, sehingga produk yang dihasilkan berupa molekul α-D-glukosa.

  Aktivitas enzim merupakan mikromol produk yang dihasilkan setiap 1 menit enzim bekerja. Untuk itu, ekstrak kasar enzim glukoamilase digunakan untuk menghidrolisis larutan pati. Aktivitas enzim glukoamilase tersebut diukur dari konsentrasi produk yang dihasilkan setelah proses hidrolisis selama 10 menit.

  Konsentrasi produk dihitung dengan spektrofotometri menggunakan spektronik

  20D. Agar larutan produk dapat dibaca absorbansinya, maka terlebih dahulu dilakukan penambahan reagen DNS untuk membentuk kompleks berwarna dengan produk (glukosa). Larutan blanko digunakan untuk menghilangkan pembacaan absorbansi pati, air, enzim, dan DNS, sehingga pada saat larutan hasil hidrolisis pati dibaca absorbansinya, hanya absorbansi glukosa yang terbaca oleh alat spektronik 20D. Pembacaan absorbansi dilakukan triplo. Konsentrasi produk kemudian dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear dari kurva standar glukosa. Dari persamaan regresi tersebut, diketahui konsentrasi rata-rata glukosa hasil hidrolisis pati oleh enzim glukoamilase sehingga aktivitas enzim glukoamilase dapat diperoleh.

BAB V PENUTUP A. Simpulan Simpulan dari percobaan ini yaitu bahwa enzim glukoamilase yang dihasilkan oleh mikroba memiliki aktivitas. B. Saran Saran dari praktikan yaitu pelaksanaan praktikum hendaknya dapat lebih baik lagi.

DAFTAR PUSTAKA

  Ahmad, Ahyar. 2003. Purification and Characterization of Amyloglucosidase Enzyme from Endomycopsis fibuligera, ISTECS Journal. Vol. 4. p. 47-55. El-Safey, E.M. dan M.S. Ammar. 2004. Purification and Characterization of α- Amylase Isolated from Aspergillus falvus var. columnaris, Ass. Univ. Bull.

  Environ. Res. Vol. 7 No. 1. p. 93-99.

  Hart, Harold. 1983. Kimia Organik: Suatu Kuliah Singkat. Jakarta: Erlangga. Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Muhiddin, Nurhayani H., Nuryati Juli, dan I Nyoman P. Aryantha. 2001.

  Peningkatan Kandungan Protein Kulit Umbi Ubi Kayu Melalui Proses Fermentasi, JMS. Vol. 6 No. 1. p. 1-12.