Laporan Praktikum Genetika dan Biologi M (4)
LAPORAN LENGKAP PRAKTIKUM
GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER
(ELEKTROFORESIS DNA (SDS-PAGE))
Disusun oleh:
NAMA
:
LASINRANG ADITIA
NIM
:
60300112034
KELAS
:
BIOLOGI A
KELOMPOK
:
V (Lima)
LABORATORIUM BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
2014
@Copyright Lasinrang Aditia
LEMBAR PENGESAHAN
Laporan lengkap praktikum Genetika dan Biologi Molekuler dengan judul
“Elektroforesis DNA (SDS-PAGE)” yang disusun oleh:
Nama
: Lasinrang Aditia
Nim
: 60300112034
Kelas
: Biologi A
Kelmpok
: V (lima)
Telah diperiksa oleh Kordinator Asisten / Asisten dan dinyatakan diterima.
Samata-Gowa,
Desember 2014
Kordinator Asisten
Asisten
(Muhammad Alamsyah)
(Risnawati)
60300110
60300111059
Mengetahui,
Dosen Penanggung Jawab
(Isna Rasdiana Aziz, S.Si, M.Sc.)
@Copyright Lasinrang Aditia
A. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengkarakterisasi, dan purifikasi dari molekul DNA atau RNA
dengan elektroforesis SDS-PAGE.
B. Dasar Teori
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport
atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara
analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein
bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam
medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari
molekul. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan
kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua
molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih
besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. Bila arus listrik dialirkan pada suatu
medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen
protein tersebut akan mulai bermigrasi. Kecepatan molekul yang bergerak pada
medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan
pewarnaan
atau
autoradiografi,
ataupun
dilakukan
kuantifikasi
dengan
densitometer (Magdeldin, 2012).
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ke tidak homogenan atau
gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan
mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk
identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa
yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi
konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan (Martin, 1996).
@Copyright Lasinrang Aditia
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub
positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (anode). Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya
sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary
phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol
bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik.
Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah
kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses
elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997).
Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu :
elektroforesis larutan dan elektroforesis daerah. Pada teknik elektroforesis larutan,
larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu
kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul
diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti
pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah
menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang
berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel
agarose, gel pati, dan kertas sellulose poliasetat (David, 2009).
C. Waktu dan Tempat
Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai
berikut:
Hari/tanggal
: Senin/15 Desember 2014
Waktu
: 08.00-10.00 WITA
Tempat
: Laboratorium Genetika dan Molekuler Lantai II
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar
Samata-Gowa
@Copyright Lasinrang Aditia
D. Alat dan Bahan
a. Alat
Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu beaker glass (10,
250, 500, dan 1000 ml), sarung tangan, spatula, batang pengaduk, gelas ukur,
erlenmeyer, aluminium foil, pipet ukur, pipet, timbangan digital, mikropipet,
sentrifuge, refrigator, pH meter, eppendorf, masker, power supply, plakon,
perangkat elektroforesis SDS-PAGE dan kamera digital.
b. Bahan
Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu ekstrak antigen
OMP, amonium persulfat (APS), akrilamid, aquadest steril, bis-akrilamid,
SDS, Tris base, TEMED, glysin, b-mercapetanol, metanol, NaCl, asam asetat
glasial, bromofenol biru, gliserol, coomassie briliant blue R-250 (CBB R250),
marker protein, dan Tris-HCL.
E. Cara Kerja
Adapun cara kerja pada percobaan ini yaitu:
1. Persiapan Gel
Membersihkan plat kaca dengan aquadest dan etanol
(70%)
Menyusun lempeng kaca serta spacer dan menutup
celah diantaranya menggunakan agar 2% secukupnya
Menyiapkan gel poliakkrilimide-SDS 10%
Menuang campuran gel pemisah ke dalam ruang
antara lempeng kaca dan meneteskan isobutanol dan
biarkan selama 30 menit dan menyiapkan gel
@Copyright Lasinrang Aditia
Setelah gel pemisah berpolimerisasi, menuangkan
campuran gel penumpuk di atasnya dan menyiapkan
sisir plastik (pembentuk sumur sampel)
Setelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepaskan sisir
dari bagian atas dan klem serta spacer bagian bawah
Letakkan lempeng kaca yang berisi gel secara vertikal
pada alat elektroforesis dan klem. Isi tempat dapar
dengan dapar elektroda. Singkirkan gelembung udara
pada bagian bawah gel
2. Persiapan sampel-sampel protein
Memakai sarung tangan dan teknik-teknik keselamatan
laboratorium
Menyiapkan 3 tabung mikrosentrifus dan
menandainya, menambanhkan 450 ml buffer sampel
dan 250 ml b-merkaptoetanol ke setiap tabung
tersebut. Transfer 50 ml sampel protein ke masingmasing tabung
Menvortex pelan-pelan supaya endapannya dicampur
rata dengan buffer
Memasukkan semua tab ung ke dalam waterbath
selama 5 menit setelah itu mensentrifuse semua tabung
selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm
@Copyright Lasinrang Aditia
3. Loading and Running the Gel
Memasukkan 10 ml sampel protein ke dalam sumur
Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply.
Jalankan elektroforesis selama 4 jam
4. Pewarnaan Gel
Setelah waktu untuk menjalankan pemisahan protein
selesai, matikan power supply dan melepaskan kabel
dari elektroforesis
Mengangkat spacer pada kedua sisi lempeng kaca,
kemudian pisahkan lempeng kaca dari gel
Memindahkan ke tempat pencui dan mengganti larutan
pencuci beberapa kali hingga warna latar memudar
dan pita-pita protein terlihat jelas dan terakhir menfoto
hasil gel
F. Hasil Pengamatan
Adapun hasil yang diperoleh dari pengamatan yaitu sebagai berikut ini:
No
1.
Gambar
Keterangan
Mengencerkan buffer dengan
konsentrasi tertentu.
@Copyright Lasinrang Aditia
2.
Menambahkan agarosa.
3.
Malarutkan agarosa.
4.
Mendinginkan larutan.
5.
Mempersiapkan cetakan gel agarosa.
6.
Menuang larutan ke dalam cetakan.
7.
Melepaskan gel agarosa yang telah
memadat dari cetakan.
@Copyright Lasinrang Aditia
8.
9.
10.
11.
Menyiapkan alat elektroforesis.
Memasukkan sampel ke dalam sumur
gel agarosa.
Memasang tutup pengaman.
Menghubungkan alat elektroforesis ke
Power supply dan menjalankannya.
Melepaskan semua kabel dari alat
12.
elektroforesis dan membuka penutup
pengaman.
Memasukkan gel hasil elektroforesis
13.
ke dalam suatu wadah yang berisi
larutan buffer .
@Copyright Lasinrang Aditia
14.
Menambahkan Ethidium Bromida
(EtBr) ke dalam wadah tersebut.
Menggoyangkan wadah hingga
15.
seluruh EtBr tercampur dengan
larutan.
16.
17.
Mendiamkan selama 5-10 menit.
Menyiapkan sinar UVTransilluminator.
Mengangkat gel ke atas UV18.
Transilluminator. Meletakkan dengan
hati-hati, jangan sampai terbentuk
gelembung udara.
@Copyright Lasinrang Aditia
Meletakkan kamera di atas hood.
Memotret fragmen DNA hasil
19.
elektroforesis tanpa menggunakan
flash pada kamera.
20
Hasil dari pewarnaan gel.
G. Pembahasan
Elektroforesis merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan
migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit
dibawah medan listrik. Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel adalah
pemisahan suatu molekul organik dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu
medan listrik. Pemisahan terjadi tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian
DNA atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient
sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah
agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan molekul-molekul
yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya
pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid.
Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya
lebih baik. Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan
Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan
@Copyright Lasinrang Aditia
molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh
prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient.
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini
sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA
sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient
sentrifugasi. Agarosa yang disaring dari ganggang laut merupakan polimer dengan
dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa
sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai
konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal
dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap.
Gel yang biasa digunakan agarosa. Gel agarosa dapat melakukan
pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang
basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik
akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Gel agarosa dibuat dengan
melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan
diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan
kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan
antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke
anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi
DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. Molekul DNA
untai ganda linear, yang diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui
matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam
basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih
besar. Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang
efisien lajunya dari pada molekul yang lebih kecil. Fragmen DNA linear dengan
panjang tertentu bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang
mengandung konsentrasi agarosa berbeda. Cara yang paling mudah untuk
@Copyright Lasinrang Aditia
mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa
berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa
atau poliakrilamid. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui
ukuran fragmen DNA dari produk PCR,memisahkan produk DNA dari hasil
digesti yang berbeda ukuran,lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian
atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam
kegiatan,antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui
ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu,
mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui
aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen
sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat
molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam,
menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein
dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui
PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan
menentukan jumlah fragmen DNA yang dikloning dalam rekombinan plasmid
DNA.
H. Kesimpulan
Adapun kesimpulan pada percobaan ini bahwa elektroforesis merupakan
metode analisis fisika berdasarkan kecepatan migrasi partikel bermuatan yang
terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit dibawah medan listrik. Prinsip
pemisahan dengan elektroforesis gel adalah pemisahan suatu molekul organik dari
campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik. Pemisahan terjadi
tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
@Copyright Lasinrang Aditia
DAFTAR PUSTAKA
David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC
Lisdiyanti. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor:
Warta Biotek, 1997.
Magdeldin, Sameh. Gel Electrophoresis-Principles and Basics. Rijeka: InTech
Publisher, 2012.
Martin, R. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific Publishers
Ltd., 1996.
@Copyright Lasinrang Aditia
GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER
(ELEKTROFORESIS DNA (SDS-PAGE))
Disusun oleh:
NAMA
:
LASINRANG ADITIA
NIM
:
60300112034
KELAS
:
BIOLOGI A
KELOMPOK
:
V (Lima)
LABORATORIUM BIOLOGI
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
2014
@Copyright Lasinrang Aditia
LEMBAR PENGESAHAN
Laporan lengkap praktikum Genetika dan Biologi Molekuler dengan judul
“Elektroforesis DNA (SDS-PAGE)” yang disusun oleh:
Nama
: Lasinrang Aditia
Nim
: 60300112034
Kelas
: Biologi A
Kelmpok
: V (lima)
Telah diperiksa oleh Kordinator Asisten / Asisten dan dinyatakan diterima.
Samata-Gowa,
Desember 2014
Kordinator Asisten
Asisten
(Muhammad Alamsyah)
(Risnawati)
60300110
60300111059
Mengetahui,
Dosen Penanggung Jawab
(Isna Rasdiana Aziz, S.Si, M.Sc.)
@Copyright Lasinrang Aditia
A. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk memisahkan,
mengidentifikasi, mengkarakterisasi, dan purifikasi dari molekul DNA atau RNA
dengan elektroforesis SDS-PAGE.
B. Dasar Teori
Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport
atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara
analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein
bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam
medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari
molekul. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan
kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua
molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih
besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode. Bila arus listrik dialirkan pada suatu
medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen
protein tersebut akan mulai bermigrasi. Kecepatan molekul yang bergerak pada
medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan
asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan
pewarnaan
atau
autoradiografi,
ataupun
dilakukan
kuantifikasi
dengan
densitometer (Magdeldin, 2012).
Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ke tidak homogenan atau
gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan
mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk
identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa
yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi
konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan (Martin, 1996).
@Copyright Lasinrang Aditia
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub
positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (anode). Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya
sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary
phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol
bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik.
Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah
kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses
elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik (Lisdiyanti, 1997).
Teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu :
elektroforesis larutan dan elektroforesis daerah. Pada teknik elektroforesis larutan,
larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu
kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul
diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti
pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah
menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang
berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel
agarose, gel pati, dan kertas sellulose poliasetat (David, 2009).
C. Waktu dan Tempat
Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum ini adalah sebagai
berikut:
Hari/tanggal
: Senin/15 Desember 2014
Waktu
: 08.00-10.00 WITA
Tempat
: Laboratorium Genetika dan Molekuler Lantai II
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar
Samata-Gowa
@Copyright Lasinrang Aditia
D. Alat dan Bahan
a. Alat
Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu beaker glass (10,
250, 500, dan 1000 ml), sarung tangan, spatula, batang pengaduk, gelas ukur,
erlenmeyer, aluminium foil, pipet ukur, pipet, timbangan digital, mikropipet,
sentrifuge, refrigator, pH meter, eppendorf, masker, power supply, plakon,
perangkat elektroforesis SDS-PAGE dan kamera digital.
b. Bahan
Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu ekstrak antigen
OMP, amonium persulfat (APS), akrilamid, aquadest steril, bis-akrilamid,
SDS, Tris base, TEMED, glysin, b-mercapetanol, metanol, NaCl, asam asetat
glasial, bromofenol biru, gliserol, coomassie briliant blue R-250 (CBB R250),
marker protein, dan Tris-HCL.
E. Cara Kerja
Adapun cara kerja pada percobaan ini yaitu:
1. Persiapan Gel
Membersihkan plat kaca dengan aquadest dan etanol
(70%)
Menyusun lempeng kaca serta spacer dan menutup
celah diantaranya menggunakan agar 2% secukupnya
Menyiapkan gel poliakkrilimide-SDS 10%
Menuang campuran gel pemisah ke dalam ruang
antara lempeng kaca dan meneteskan isobutanol dan
biarkan selama 30 menit dan menyiapkan gel
@Copyright Lasinrang Aditia
Setelah gel pemisah berpolimerisasi, menuangkan
campuran gel penumpuk di atasnya dan menyiapkan
sisir plastik (pembentuk sumur sampel)
Setelah gel penumpuk berpolimerisasi, lepaskan sisir
dari bagian atas dan klem serta spacer bagian bawah
Letakkan lempeng kaca yang berisi gel secara vertikal
pada alat elektroforesis dan klem. Isi tempat dapar
dengan dapar elektroda. Singkirkan gelembung udara
pada bagian bawah gel
2. Persiapan sampel-sampel protein
Memakai sarung tangan dan teknik-teknik keselamatan
laboratorium
Menyiapkan 3 tabung mikrosentrifus dan
menandainya, menambanhkan 450 ml buffer sampel
dan 250 ml b-merkaptoetanol ke setiap tabung
tersebut. Transfer 50 ml sampel protein ke masingmasing tabung
Menvortex pelan-pelan supaya endapannya dicampur
rata dengan buffer
Memasukkan semua tab ung ke dalam waterbath
selama 5 menit setelah itu mensentrifuse semua tabung
selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm
@Copyright Lasinrang Aditia
3. Loading and Running the Gel
Memasukkan 10 ml sampel protein ke dalam sumur
Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply.
Jalankan elektroforesis selama 4 jam
4. Pewarnaan Gel
Setelah waktu untuk menjalankan pemisahan protein
selesai, matikan power supply dan melepaskan kabel
dari elektroforesis
Mengangkat spacer pada kedua sisi lempeng kaca,
kemudian pisahkan lempeng kaca dari gel
Memindahkan ke tempat pencui dan mengganti larutan
pencuci beberapa kali hingga warna latar memudar
dan pita-pita protein terlihat jelas dan terakhir menfoto
hasil gel
F. Hasil Pengamatan
Adapun hasil yang diperoleh dari pengamatan yaitu sebagai berikut ini:
No
1.
Gambar
Keterangan
Mengencerkan buffer dengan
konsentrasi tertentu.
@Copyright Lasinrang Aditia
2.
Menambahkan agarosa.
3.
Malarutkan agarosa.
4.
Mendinginkan larutan.
5.
Mempersiapkan cetakan gel agarosa.
6.
Menuang larutan ke dalam cetakan.
7.
Melepaskan gel agarosa yang telah
memadat dari cetakan.
@Copyright Lasinrang Aditia
8.
9.
10.
11.
Menyiapkan alat elektroforesis.
Memasukkan sampel ke dalam sumur
gel agarosa.
Memasang tutup pengaman.
Menghubungkan alat elektroforesis ke
Power supply dan menjalankannya.
Melepaskan semua kabel dari alat
12.
elektroforesis dan membuka penutup
pengaman.
Memasukkan gel hasil elektroforesis
13.
ke dalam suatu wadah yang berisi
larutan buffer .
@Copyright Lasinrang Aditia
14.
Menambahkan Ethidium Bromida
(EtBr) ke dalam wadah tersebut.
Menggoyangkan wadah hingga
15.
seluruh EtBr tercampur dengan
larutan.
16.
17.
Mendiamkan selama 5-10 menit.
Menyiapkan sinar UVTransilluminator.
Mengangkat gel ke atas UV18.
Transilluminator. Meletakkan dengan
hati-hati, jangan sampai terbentuk
gelembung udara.
@Copyright Lasinrang Aditia
Meletakkan kamera di atas hood.
Memotret fragmen DNA hasil
19.
elektroforesis tanpa menggunakan
flash pada kamera.
20
Hasil dari pewarnaan gel.
G. Pembahasan
Elektroforesis merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan
migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit
dibawah medan listrik. Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel adalah
pemisahan suatu molekul organik dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu
medan listrik. Pemisahan terjadi tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian
DNA atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient
sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah
agarose atau akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan molekul-molekul
yang lebih besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya
pisah dari agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid.
Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya
lebih baik. Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan
Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan
@Copyright Lasinrang Aditia
molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh
prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient.
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini
sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA
sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient
sentrifugasi. Agarosa yang disaring dari ganggang laut merupakan polimer dengan
dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa
sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai
konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal
dalam kekuatan medan listrik dan arah tetap.
Gel yang biasa digunakan agarosa. Gel agarosa dapat melakukan
pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang
basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik
akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Gel agarosa dibuat dengan
melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan
diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan
kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan
antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke
anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi
DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. Molekul DNA
untai ganda linear, yang diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui
matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam
basa. Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih
besar. Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang
efisien lajunya dari pada molekul yang lebih kecil. Fragmen DNA linear dengan
panjang tertentu bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang
mengandung konsentrasi agarosa berbeda. Cara yang paling mudah untuk
@Copyright Lasinrang Aditia
mendeteksi adanya DNA dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa
berfluoresensi yang biasanya digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa
atau poliakrilamid. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui
ukuran fragmen DNA dari produk PCR,memisahkan produk DNA dari hasil
digesti yang berbeda ukuran,lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian
atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam
kegiatan,antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui
ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu,
mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui
aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen
sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat
molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam,
menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein
dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui
PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan
menentukan jumlah fragmen DNA yang dikloning dalam rekombinan plasmid
DNA.
H. Kesimpulan
Adapun kesimpulan pada percobaan ini bahwa elektroforesis merupakan
metode analisis fisika berdasarkan kecepatan migrasi partikel bermuatan yang
terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit dibawah medan listrik. Prinsip
pemisahan dengan elektroforesis gel adalah pemisahan suatu molekul organik dari
campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik. Pemisahan terjadi
tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.
@Copyright Lasinrang Aditia
DAFTAR PUSTAKA
David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC
Lisdiyanti. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Bogor:
Warta Biotek, 1997.
Magdeldin, Sameh. Gel Electrophoresis-Principles and Basics. Rijeka: InTech
Publisher, 2012.
Martin, R. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Oxford: Bros Scientific Publishers
Ltd., 1996.
@Copyright Lasinrang Aditia