KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) Kelompok 16

ANALISIS INSTRUMENTAL KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

   Disusun Oleh: Kelompok 16

  

1. Dina Marliza

Nim: 1548201072

  

2. Natasha Sekar Seruni

Nim: 1548201076 Prodi: Farmasi III B Dosen Pengampu: Lili Andriani S.Pd, M.Si

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN HARAPAN IBU JAMBI

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

1. PENGERTIAN

  High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT) adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran

2. PRINSIP KERJA

  Prinsip kerja dari HPLC adalah pemisahan absoprsi dan desorpsi yang berulang kali dari komponen yang dipisahkan. Pada saat komponen tersebut dibawa oleh fase gerak mengalir sepanjang kolom. Pemisahan ini terjadi karena adanya perbedaan kecepatan migrasi dari masing-masing komponen yang didasarkan oleh adanya perbedaan koofisien distribusi dari komponen tersebut antara kedua fasa.

  Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut : fasa gerak cair dialirkan dengan bantuan pompa melalui kolom ke detektor. Cuplikan di masukkan kedalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen- komponen cairan. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keuar dari kolom lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah

  peak menyatakan jumlah komponen dedangkan luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran.

3. JENIS-JENIS KCKT/HPLC

• Kromatografi Adsorbsi  Kromatografi fase terikat
• Kromatografi penukaran ion
• Kromatografi pasangan ion
• Kromatografi Eksklusi ukuran
• Kromatografi Afinitas

4. KOMPONEN INSTRUMEN KCKT/HPLC

  Komponen instrumen yang sangat berperan penting dalam kinerja HPLC adalah sebagai berikut:

a. Wadah Fase Gerak.

  Wadah fase gerak berisi fase gerak yang digunakan untuk memisahkan komponen sampel.

  b. Fase Gerak.

  Fase gerak KCKT berupa zat cair, disebut juga eluent atau pelarut. Fase gerak berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam KCKT merupakan salah satu faktor penentuan keberhasilan proses pemisahan.

  Persyaratan fasa gerak KCKT:

  a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis b) Zat cair harus murni sekali.

  c) Zat cair mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.

  d) Zat cair tidak kental. Kekentalan tidak melebihi 0.5 cp.

  Sesuai dengan detektor. Contoh, untuk detektor refractiv index pelarul harus punyai indeks bias yang berbeda dengan solut. Untuk detektor UV, pelarut tidak boleh menyerap cahaya pada panjang gelombang yang dipakai.

  e) Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. biasanya polarut disaring degan saringan nilon berukuran diamcter pori 0.45 ul pompa vakum biasanya digunakan untuk menyaring partikel kotoran sekaligus menghilangkan gas dari pelarut. Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi:

• Fasa normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam
• Fasa Terbalik : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam

  Fase normal HPLC

  Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

  Fase balik HPLC

  Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.

  Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa- senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

c. Pompa

  Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu:

   Pompa Reciprocating.

  Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas.  Pompa Syringe Memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

  d. Injektor (injector) Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

  a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

  b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60- 70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

  c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. e. Kolom (Column) Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

• Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
• Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm.

  Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan Liquid Solid Chromatography, (LSC), Liquid Liquid Chromatography (LLC) Ion Exchange Chromatography(IEC), Exclution Chromatography (EC).

  f. Fase Diam

  Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil

  benzena. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugu

  silanol (Si-OH)

  g. Detektor

  Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia.

  Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Batasan utamanya adalah sensitivitas; batasan pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut.

   Detektor Spektrofotometri Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.

   Detektor fluorometri Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.  Detektor elektrokimia

  Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

  5. TEKNIK PEMISAHAN DALAM KCKT/HPLC

  a) Sistem Isokratik Merupakan suatu teknik pemisahan dimana selama proses analisis berlangsung, fase gerak atau komposisi fase gerak tidak berubah, artinya polaritasnya tetap

  b) Sistem Gradient Merupakan suatu teknik pemisahan dimana selama proses analisis berlangsung, komposisi fase gerak berubah secara berperiodik. Teknik ini dilakukan dengan tujuan memisahkan campuran dengan polaritas yang sangat beragam.

  6. KEGUNAAN KCKT/HPCL

• Pemisahan sejumlah senyawa oganil, anorgannik maupun senyawa biologis
• Analisis ketidakmurnian (Impurities)
• Analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil)  Penentuan molekul-molekul nertal, ionik, maupun zwitter ion.
• Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam

7. KEUNTUNGAN KCKT/HPCL

  Keuntungan analisis menggunakan KCKT adalah membutuhkan waktu analisis yang relatif cepat daya pisah baik, sensitif hingga kadar nanogram/mililiter, pemilihan kolom dan eluen bervariasi, kolom dapat dipakai kembali, dapat digunakan untuk men senyawa dengan molekul besar dan kecil, dapat menganalisis sampel yang termolabil karena dilakukan pada suhu kamar, dan dapat menganalisis campuran yang mcmpunya titik didih sangat tinggi.

DAFTAR PUSTAKA

  

iakses pada tanggal 7 November 2016. iakses pada tanggal 7 November 2016. iakses pada

  tanggal 7 November 2016