Identifikasi Alel CYP2A6*4 pada Isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua Indonesia dengan Metode Polymerase Chain Reaction - USD Repository

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

IDENTIFIKASI ALEL CYP2A6*4 PADA ISOLAT DNA PEROKOK RAS
KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Progam Studi Farmasi

Oleh:
Elisa Gitaningtyas
NIM : 158114131

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

IDENTIFIKASI ALEL CYP2A6*4 PADA ISOLAT DNA PEROKOK RAS
KULIT HITAM PAPUA INDONESIA DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN REACTION
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Progam Studi Farmasi

Oleh:
Elisa Gitaningtyas
NIM : 158114131

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018

i

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

iv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HALAMAN PERSEMBAHAN

Skripsi ini saya persembahkan kepada Tuhan Yesus Kristus yang selalu
menyertai dan memberkati setiap langkah saya dari awal penyusunan,
penelitian dan momen final pada ujian.
Papa, Mama, Adik, Eyang dan Mbah di Salatiga yang tak henti-henti memberi
dukungan moral, doa dan materi. Tante, Om, Adik Oscar dan Nora di Jogja
sudah menjadi orangtua dan rumah kedua bagi saya, terimakasih sudah
menerima dan mendukung saya layaknya anak dan saudara kandung.

Kepada sahabat baik yang di Jogja, Salatiga, Solo, Semarang dan dimanapun
kalian berada terimakasih telah ada dalam suka duka, rollcoaster kehidupan
saya yang tidak terduga.
Tak lupa untuk almamater tercinta Universitas Sanata Dharma yang senantiasa
memberi ilmu, hendaknya dapat berguna bagi nusa dan bangsa.

v

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PRAKATA
Penulis menghaturkan puji dan syukur kehadirat Tuhan Yesus, atas cinta

kasih-Nya penulis dapat menyusun dan menyelesaikan penelitian skripsi yang
berjudul Identifikasi alel CYP2A6*4 pada perokok ras kulit hitam papua dengan
metode polymerase Chain reaction untuk memenuhi persyaratan memperoleh gelar
Sarjana Farmasi ( S.Farm) Progam Studi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma. Dalam penyusunan skripsi ini tidak lepas dari campur tangan dan
bantuan dari berbagai pihak,

melalui naskah prakata ini penulis hendak

menghaturkan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada
1. Dr Yustina selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
2. Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku Ketua Progam Studi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, serta selaku Dosen Pembimbing atas
ilmu, dukungan, semangat, arahan dan kasih sayang selama proses
penelitian dari awal hingga tahap akhir penyusunan naskah skripsi.
3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc selaku Kepala Laboratorium
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, serta selaku Dosen Penguji
yang telah memberikan ilmu, kritik dan saran sehingga penelitian ini
semakin maju dan berkembang ke arah yang positif.

4. Maywan Hariono Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan
ilmu, kritik dan saran sehingga penelitian ini semakin maju dan berkembang
ke arah yang positif.
5. Setyaningsih, selaku Dosen Pembimbing Akademik atas arahan dan
bimbingan dari awal saat menjadi mahasiswa baru hingga saat ini.
6. Pak kayat, Pak Parlan, Pak Bimo, dan Pak Bima selaku laboran yang
membantu proses penelitian dari awal hingga akhir.
7. Segenap dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah
berdedikasi penuh dengan semagat dan sabar dalam membimbing dan
mentransfer ilmu pengetahuan.
8. Segenap staff dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
yang ikut andil dalam menjalankan kegiatan akademik.

vii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ix

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR ISI

COVER ........................................................................................................... i
HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................................ v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................... vii
PRAKATA........................................................................................................ viii
DAFTAR ISI .................................................................................................... x
DAFTAR TABEL............................................................................................. xi
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xii
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... xiii
ABSTRAK ........................................................................................................ xiv
ABSTRACT ....................................................................................................... xv
PENDAHULUAN............................................................................................. 1
METODE PENELITIAN.................................................................................. 3
HASIL DAN PEMBAHASAN......................................................................... 6

KESIMPULAN................................................................................................. 15
SARAN............................................................................................................. 15
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 15
LAMPIRAN...................................................................................................... 18
BIOGRAFI PENULIS ...................................................................................... 28

x

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR TABEL

Tabel I.

Frekuensi alel CYP2A6 pada Ras Kulit Hitam Papua Indonesia...........12

Tabel II. Tingkat Ketergantungan Terhadap Nikotin Berdasarkan Skor FTND..14

xi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR GAMBAR
Gambar

1.

Hasil

analisis

kualitatif

isolat

DNA

menggunakan

teknik

elektroforesis......................................................................................................... 7
Gambar 2. Posisi penempelan primer pada sekuen basa nukleotida CYP2A6*1..8
Gambar 3. Urutan nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*4......10
Gambar 4. Elektroforegram produk PCR pada berbagai isolat DNA perokok ras
kulit hitam Papua .................................................................................................11

xii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian............................................................19
Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certification of Analysis........................20
Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix.............................21
Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers..............................22
Lampiran 5.Data Subjek......................................................................................23
Lampiran 6. Elektroforegram Analisis Kualitatif Isolat DNA..............................25
Lampiran 7. Elektroforegram Produk PCR..........................................................26
Lampiran 8. Frekuensi alel...................................................................................27

xiii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRAK
Nikotin adalah zat psikoaktif dalam rokok yang bertanggung jawab atas
ketergantungan merokok tembakau pada individu. Enzim sitokrom P450 (CYP)
2A6 merupakan salah satu enzim yang banyak terdapat pada hepar, yang terutama
bertanggungjawab terhadap metabolisme nikotin.
Enzim sitokromP450 (CYP)
2A6 dikode oleh gen CYP2A6 yang memiliki tingkat polimorfisme yang tinggi
pada populasi Asia. Polimorfisme pada CYP2A6 dapat menyebabkan perubahan
aktivitas dan bentuk dari enzim CYP2A6. CYP2A6*4 (whole gene deletion)
merupakan salah satu bentuk polimorfisme pada CYP2A6 yang mengalami
penurunan aktivitas metabolik nikotin yang lebih rendah dibandngkan dengan
individu dengan CYP2A6*1 (wildtype). Polimorfisme CYP2A6*4 banyak terdapat
pada perkokok berkulit gelap. Metode yang digunakan untuk mengidentifikasi
adaanya polimorfisme pada CYP2A6 ialah menggunakan PCR (Polymerase Chain
Reaction) yang merupakan metode amplifikasi DNA dengan teknik menggunakan

DNA polimerase. Pada penelitian ini juga menggunakan metode elektroforesis
untuk menganalisis produk amplifikasi PCR dan mengetahui frekuensi varian
CYP2A6*4 pada isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua Indonesia .

Kata kunci : Nikotin, CYP2A6*4, ras Papua, Metode PCR, Metode
elektrofores

xiv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ABSTRACT
Nicotine is a psychoactive substance in cigarettes that is responsible for the
dependence of tobacco smoking on individuals. Cytochrome P450 (CYP) 2A6
enzyme is one of the many enzymes found in the liver, which is primarily responsible
for nicotine metabolism. Enzyme cytochrom P450 (CYP) 2A6 is encoded by the
CYP2A6 gene which has a high level of polymorphism in the Asian population.
Polymorphism in CYP2A6 can cause changes in the activity and conformation of
the CYP2A6 enzyme. CYP2A6 * 4 (whole gene deletion) is a form of polymorphism
in CYP2A6 which has a lower decrease in nicotine metabolic activity compared to
individuals with CYP2A6 * 1 (wildtype). CYP2A6 * 4 polymorphisms are common
in dark-skinned smokers. The method used to identify the presence of polymorphism
in CYP2A6 is to use PCR (Polymerase Chain Reaction) by amplificying using DNA
polymerase techniques. In this study also used electrophoresis method to analyze
PCR amplification products and determine the frequency of CYP2A6 * 4 variants
in smoker DNA isolates of Indonesian Papuan black race.
Keywords: Nicotine, CYP2A6 * 4, Papuan race, PCR method, electrophoresis
method

xv

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PENDAHULUAN
Merokok

menjadi

salah

satu

masalah

kesehatan

yang

memiliki

kemampuan merusak tubuh manusia. Perhimpunan dokter spesialis kardiovaskuler
menyatakan

meskipun

rokok

sampai

saat

ini

belum

terbukti

langsung

mempengaruhi tekanan darah, namun kebiasaan merokok merupakan salah satu
faktor risiko penyakit kardiovaskular (Perdosi, 2015). Kebiasaan merokok dapat
disebabkan karena faktor lingkungan. Menurut penelitian Liem (2014) merokok
dikarenakan pengaruh keluarga dan masyarakat sekitar dalam lingkungan hidup
yang memiliki kebiasaan merokok. Penelitian lain yang dilakukan Minematsu et al
(2006) menyatakan bahwa kebiasaan merokok tidak hanya dipengaruhi oleh faktor
lingkungan namun juga faktor genetik. Asap rokok (tembakau) mengandung lebih
dari 4000 bahan kimia dan 69 diantaranya merupakan senyawa karsinogenik
(Tobacco Control Center Indonesia, 2010). Salah satu zat kimia yang terkandung
dalam rokok adalah nikotin. Nikotin bertanggung jawab terhadap ketergantungan
merokok pada individu. Konsentrasi nikotin yang rendah dalam plasma dan cairan
serebrospinal dapat meningkatkan keinginan untuk merokok secara terus menerus.
Kadar nikotin dalam plasma dipengaruhi oleh aktivitas proses metabolisme nikotin
yang dikatalisis oleh enzim CYP2A6 (Minematsu et al, 2006).
CYP2A6 merupakan salah satu enzim yang banyak terdapat pada hepar.
CYP2A6 merupakan salah satu enzim utama yang bertanggung jawab terhadap
metabolisme

nikotin.

CYP2A6

merupakan

enzim yang

memediasi

proses

metabolisme nikotin menjadi kotinin dan kemudian dioksidasi menjadi trans
hidroksi kotinin (Hukkanen et al., 2005). Gen CYP2A6 menyandi enzim CYP2A6
yang menurut penelitian Hukkanen et al (2005) memiliki polimorfisme yang tinggi.
Polimorfisme

adalah

fenomena

munculnya

variasi bentuk

dari gen

yang

menghasilkan dua atau lebih varian dan masing-masing varian memiliki frekuensi
yang cukup tinggi (Maggert, 2012). Polimorfisme gen CYP2A6 menjadi penyebab
utama variasi aktivitas enzimatik antar individu sehingga penting untuk dilakukan
karakterisasi enzimatik (Kitagawa, 2001). Penelitian Raunio dan Rahnasto-Rilla
(2012) menyatakan bahwa pada saat ini terdapat 38 variasi alel dan beberapa
diantarnya mengalami single nucleotide polymorphisms (SNPs), perubahan varian

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

genetik tersebut menyebabkan perubahan aktivitas dan bentuk dari enzim CYP2A6,
salah satu bentuk variannya adalah CYP2A6*4.
CYP2A6*4 banyak terdapat pada populasi Asia dibandingkan pada
populasi lain (Schoedel et al., 2004; Hukkanen et al., 2005). Polimorfisme
CYP2A6*4 yang berupa whole gen deletion menyebabkan penurunan aktivitas
enzimatik sehingga kadar nikotin dalam plasma seorang perokok yang mempunyai
alel CYP2A6*4 lebih tinggi dibandingkan pada alel CYP2A6*1. Sehingga akan
menurunkan risiko seorang perokok terhadap efek ketergantungan pada nikotin
dibandingkan dengan perokok yang mempunyai gen CYP2A6 normal (CYP2A6*1/
wild type) (Ando et al, 2003; Ariyoshi et al., 2002; Fujieda et al., 2004; Minematsu
et al., 2006; Rao et al., 2000).
Penelitian lain yang dilakukan Benowitz et al (1999) menyatakan ras
memiliki

pengaruh

yang

siginifikan

terhadap

proses

metabolisme

nikotin,

penelitian tesebut menyatakan bahwa metabolisme nikotin pada perokok berkulit
hitam lebih rendah daripada perokok berkulit putih (Haiman et al., 2006). Hal
tersebut didukung

penelitian Nakajima et al (2006) yang menyatakan bahwa

frekuensi polimorfisme CYP2A6*4 banyak ditemukan pada ras kulit hitam.
Sehingga perokok ras kulit hitam diduga akan memiliki tingkat ketergantungan
merokok yang lebih rendah karena hanya membutuhkan nikotin dalam jumlah
kadar yang rendah untuk mempertahankan kadarnya dalam plasma darah.
Indonesia merupakan negara yang memiliki berbagai macam ras dan suku dengan
karakteristik warna kulit yang beragam. Salah satunya adalah provinsi Papua
dengan masyarakat asli yang memiliki kulit cenderung gelap. Oleh karena itu, pada
penelitian ini digunakan subjek uji perokok ras kulit hitam Papua untuk
mengindentifikasi adanya polimorfisme pada gen CYP2A6 yaitu alel CYP2A6*4.
Tujuan

utama

dari

penelitian

ini

adalah

mengidentifikasi

adanya

polimorfisme pada isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua Indonesia yaitu
berupa varian alel CYP2A6*4 dengan menggunakan metode Polymerase Chain
Reaction (PCR) yang merupakan metode untuk mengamplifikasi segmen DNA
dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Secara garis besar, PCR terdiri
dari tiga tahapan utama yaitu denaturasi, annealing dan extension. (Somma and

2

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Querci, 2000). Pada metode PCR dibutuhkan primer yang berperan untuk
mengawali proses amplifikasi molekµL DNA dan gen target yang yang ingin
diamplifikasi (Marchesi et al, 1998) dan juga diperlukan komponen lain seperti
templat DNA, dNTPs (deoxynucleotide triphosphastes), enzim DNA polimerase,
buffer PCR dan magnesium klorida yang merupakan parameter-parameter yang
berkontribusi dalam proses PCR.
METODE PENELITIAN
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebanyak 30 isolat
DNA perokok ras Papua yang telah di isolasi oleh Prabowo (2017). Primer forward:
5' CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3', primer reverse: 5' CGC AGG TAC
TGG GTG CTT GGT AG 3', Promega Go Taq Green Master Mix, Tris-BorateEDTA Buffer (10x), 1% gel agarose, larutan gel red (0,44 mg/mL), 100 bp DNA
Ladder (Smo-BIO), DNA loading dye, etanol 96% (Sigma Chemical Co., St. Louis),
aqua bidestilata steril (Ikapharmindo).
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Thermal cycler Perkin
Elmer 2400, satu set Elektroforesis (Biorad), UV Transilluminator (Fisher
Scientific), dispossable gloves, microtubes (0,2 mL), hot plate (Ika Combing-red),
timbangan analitik (Metler toledo), mikropipet 1 µL dan 10 µL (Socorex Swiss),
mikropipet 10 µL dan 20 µL (Socorex Swiss), erlenmeyer 250 mL (Pirex), labu
takar 50 mL dan 100 mL (Iwaki pyrex), ice box, gelas beaker 200 mL (Iwaki pyrex),
kamera DSLR.
Penyiapan Gel Agarose
Pembuatan agarose 1,5 % dilakukan dengan cara menimbang 1,5 g agarose
yang kemudian dilarutkan dalam larutan TBE 1X sebanyak 100 mL. Larutan
tersebut dipanaskan menggunakan hot plate dengan dilakukan pengadukan hingga
terlarut dan mendidih, dan ditambahkan 1,0 µL larutan gel red dengan dilakukan
pengadukan hingga homogen. Larutan sebanyak 25 mL dituang ke dalam cetakan
gel yang telah diberi sisiran pada tepi gel. Setelah gel mengeras sisiran dicabut atau
dilepas sehingga terbentuk sumuran. Konsentrasi agarose 1,5% digunakan untuk

3

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

mengidentifikasi hasil PCR, sedangkan untuk mengidentifikasi kemurnian isolat
DNA menggunakan agarose dengan konsentrasi 1%.
Analisis Kemurnian Isolat DNA
Penelitian ini menggunakan isolat DNA yang berasal dari subjek uji dalam
penelitian yang dilakukan oleh Prabowo (2017), dengan kriteria subjek uji
merupakan perokok aktif minimal selama 5 tahun, berjenis kelamin laki-laki,
keturunan ras kulit hitam Papua asli minimal third degree relativies (kakek dan
nenek orang Papua asli), rentang usia 20 sampai 40 tahun dan berdomisili di
Yogyakarta. Subjek uji yang sedang menggunakan terapi pengobatan rutin atau
sedang menjalani pengobatan untuk berhenti merokok dalam sebulan terakhir,
pasien dengan penyakit yang mengharuskan beristirahat total selama ≥ 10 hari
dalam sebulan terakhir, seperti heart diseases, renal failure, pulmonary diseases,
pasien dengan penyakit hepar seperti hepatitis, sirosis hati, dan hepatoma tidak
dapat dimasukkan dalam kriteria subjek uji yang digunakan pada penelitian.
Analisis

kemurnian

isolat

DNA

dengan

metode

elektroforesis

menggunakan gel agarose 1,0% sebagai fase diam yang telah ditambahkan dengan
gel red. Gel Agarose 1,0% yang sudah keras diletakkan kedalam gel tray
elektroforesis yang berisi TBE 1X hingga permukaan agarose 1,0% terendam.
Analisis dilakukan dengan menyiapkan sebanyak 2,0 µL isolat DNA, 3,0 µL,
aquabidest dan 1,0 µL loading dye diperoleh campuran dengan volume akhir
sejumlah 6,0 µL yang kemudian dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarose
1,0% menggunakan mikropipet. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan kondisi
tegangan 110 Volt dan running selama 45 menit, hasil elektroforesis dideteksi
menggunakan lampu UV Trasilluminator dan didokumentasikan dengan kamera.
Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR
Amplifikasi fragmen DNA dari alel CYP2A6*4 dilakukan dengan
menggunakan primer forward: 5' CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3',
primer reverse: 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3'. Amplifikasi isolat
DNA dengan PCR dilakukan menggunakan promega Go Taq Green Master Mix
(berisi Taq DNA polimerase, dNTPs, MgCl2 , dan buffer) dengan volume akhir
campuran 25,0 µL, yang terdiri dari reagen 12,50 µL, primer forward 1,250 µL,

4

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

primer reverse 1,25µL,

isolat DNA 5,0 µL, dan

nuclease-free water 5 µL.

Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler parkin elmer 2400).
Kondisi PCR yang digunakan ialah intial denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit
dilanjutkan dengan denaturasi pada 98°C selama 20 detik, annealing pada suhu 62,6
°C selama 15 detik dan ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus amplifikasi
tersebut dilakukan sebanyak 30 kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi
pada suhu 72°C selama 5 menit .
Analisis Produk PCR dengan Teknik Elektroforesis
Untuk melihat keberhasilan amplifikasi isolat DNA yang dilakukan
dengan metode PCR, dilakukan elektroforesis menggunakan gel agarose 1,5%
sebagai fase diam yang telah ditambahkan dengan gel red. Gel agarose 1,5% yang
sudah mengeras diletakkan dalam gel tray elektroforesis yang berisi TBE 1X
hingga permukaan agarose 1,5 % terendam. Kemudian dilakukan pencampuran
produk PCR sebanyak 5 µL dan loading dye 1,0 µL dan diambil menggunakan
mikropipet dengan volume akhir 6 µL yang dimasukkan kedalam sumuran agarose
1,5%. Pada salah satu sumuran pada gel tersebut diisi dengan DNA ladder 4,0 µL.
Dilakukan elektroforesis dengan dengan kondisi tegangan 110 Volt dan running
selama 45

menit,

hasil elektroforesis

dievaluasi menggunakan lampu

UV

Trasilluminator. Adanya alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dapat dideteksi dengan
menggunakan metode elektroforesis. Produk yang terbentuk pada 350 bp
menunjukkan alel CYP2A6*1,

namun jika tidak

terbentuk

produk

maka

menunjukkan adanya alel CYP2A6*4.
Analisis Hasil
Hasil elektroforesis dengan panjang pita 350 bp menunjukkan adanya alel
CYP2A6*1 dan jika hasil elektroforesis tidak terdeteksi menunjukkan adanya alel
CYP2A6*4. Frekuensi alel CYP2A6*1 dan alel CYP2A6*4 dihitung dengan
persamaan :
𝐹𝑟𝑒𝑘𝑢𝑒𝑛𝑠𝑖 =

𝐹𝑟𝑒𝑘𝑢𝑒𝑛𝑠𝑖 =

jumlah alel CYP2A6 ∗ 1 yang diperoleh
𝑥100%
jumlah seluruh alel (30)

jumlah alel CYP2A6 ∗ 4 yang diperoleh
jumlah seluruh alel (30)

5

𝑥100%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian terdapat tiga tahapan untuk mendeskripsikan hasil dari
penelitian yaitu, analisis kualitatif kemurnian isolat DNA, amplifikasi CYP2A6*4
dan analisis produk Polymerase Chain Reaction

(PCR)

menggunakan metode

elektroforesis. Pada penelitian ini digunakan metode PCR

untuk mengamplifikasi

isolat DNA yang dianalisis ada tidaknya polimorfisme yang berupa varian alel
CYP2A6*4 pada isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua. CYP2A6*4 dipilih
sebagai alel yang akan diidentifikasi karena pada penelitian Nakajima et al (2006)
disebutkan bahwa pada perokok ras kulit hitam ditemukan frekuensi polimorfisme
CYP2A6*4 yang cukup tinggi dan dapat memberikan manfaat teoritis terkait
adanya variasi alel (polimorfisme) pada isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua
Indonesia.

Sehingga

dapat

dijadikan

dasar

edukasi dalam mengupayakan

pengurangan angka ketergantungan merokok sesuai dengan profil metabolisme
pada individu.
Analisis Kualitatif Isolat DNA
Isolat DNA yang digunakan merupakan hasil isolasi DNA oleh Prabowo
(2017). Analisis kemurnian isolat DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis
yang kemudian diamati menggunakan lampu UV transilluminator. Isolat DNA
yang digunakan memiliki pita dengan panjang lebih dari 3000 bp. Pita hasil analisis
seharusnya menghasilkan pita tunggal (single band) dan tebal, namun apabila pita
yang dihasilkan tidak sesuai maka ada indikasi cemaran atau sudah mengalami
degradasi saat proses penyimpanan (Patramurti et al., 2014). Hasil yang didapatkan
menunjukkan hasil pita yang tipis dan

single band hal ini menunjukkan bahwa

isolat DNA yang digunakan belum mengalami degradasi/ kerusakan dan bebas dari
kontaminan (Gambar 1).

6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

7

6

5

4

3

2

1

M

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA menggunakan teknik elektroforesis

Keterangan :
M
1,3,5,6,7
2,5
Kondisi elektroforesis
volume injeksi 6 µL

: 100 bp + 3K bp DNA ladder sebagai marker
: isolat DNA dengan pita tunggal dan tipis
: isolat DNA dengan pita tunggal dan sangat tipis
: Fase diam agarose 1%, fase gerak larutan TBE 1X,

Analisis produk PCR dengan Teknik Elektroforesis
Polimorfisme pada CYP2A6 menyebabkan variasi pada gen CYP2A6,
sehingga terjadi perbedaan aktivitas dari enzim dalam memetabolisme nikotin.
Terdapat tiga tipe kelompok berdasarkan aktivitas metabolismenya yaitu NM
(normal metabolizer), IM (intermediate metabolizer) dan SM (slow metabolizer).
CYP2A6*1 merupakan bentuk alel normal dan aktif CYP2A6, sedangkan salah satu
bentuk polimorfismenya yaitu alel CYP2A6*4

yang merupakan alel yang

mengalami penurunan aktivitas metabolisme hingga ≤ 50% (Audrain-McGovern J

et al., 2007).

Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi fragmen

DNA dari alel

CYP2A6*4 dilakukan dengan menggunakan primer forward: 5' CCT CAT CAC
ACA CAA CTT CCT C 3', primer reverse: 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT
GGT AG 3'. Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan dengan menggunakan
Promega Go Taq Green Master Mix. Volume akhir campuran PCR 25 µL dengan
komponen sebagai berikut, reagen 12,5 µL, primer forward 1,25 µL, primer reverse

7

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

1,25 µL, isolat DNA 5,0 µL dan nuclease-free water 5,0 µL dan dengan kadar
genomik DNA yang digunakan kurang lebih 50 ng. Pada penelitian dilakukan
optimasi penentuan suhu annealing dengan hasil suhu optimal 62,1°C, sedangkan
kondisi pada tahapan PCR yang lainnya adalah intial denaturasi pada suhu 95°C
selama 5 menit dilanjutkan dengan denaturasi pada 98°C selama 20 detik, dan
ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik. Siklus amplifikasi dilakukan sebanyak 30
kali dan selanjutnya diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.
Terdapat tiga tahapan dalam proses PCR yang meliputi, denaturasi,
annealing dan ekstensi. Pada tahap pertama DNA mengalami denaturasi pada suhu
yang tinggi supaya terjadi pemisahan untai ganda menjadi untai tunggal (single
strand). Tahap kedua ialah annealing, pada tahap ini terjadi penurunan suhu dan
terjadi proses penempelan primer pada template DNA yang kemudian digunakan
untuk membuat salinan yang identik seperti target template DNA yang diinginkan.
Tahap ketiga ekstensi, pada tahapan ini terjadi pada tahap akhir penempelan primer
pada DNA template target, enzim DNA polimerase memanjangkan DNA template
target dan membentuk salinan untai DNA yang komplementer (Joshi et al, 2011).
Pada tiga tahap tersebut, tahap annealing merupakan tahapan yang kritis pada siklus
PCR. Tahap ini sangat penting karena jika primer tidak menempel pada DNA
template target maka tidak terbentuk salinan DNA seperti yang diharapkan. Situs
penempelan primer untuk menghasilkan produk CYP2A6*1 dengan ukuran 350 bp
diilustrasikan seperti pada Gambar 2 .
Primer forward

5’
CCTCATCACACACAACTTCCTC

3’
CTACCAAGCACCCA GTA CCTGCG
GATGGTTCGTGGGTCATGGA CGC
3’
5’

GAGTAGTGTGTGTTGAAGGA G

Primer reverse
Gambar 2. Posisi penempelan primer pada sekuen basa nukleotida CYP2A6*1
Keterangan :
: arah penempelan primer forward
: arah penempelan primer reverse

Keberhasilan PCR ditentukan oleh spesifitas primer. Primer yang spesifik
akan menempel pada DNA target, sehingga akan dihasilkan produk yang sesuai

8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

dengan target peneliti (McPherson and Moller, 2006). Pada penelitian ini dilakukan
desain primer untuk mengamplifikasi CYP2A6*1. Sesuai dengan guidelilne
protokol desain primer, primer yang spesifik memiliki 18-30 pasang basa
nukleotida, primer dengan panjang basa nukleotida kurang dari persyaratan tersebut
akan mudah terjadi hibridisasi sekunder, susunan basa nukleotida G dan C tidak
dianjurkan lebih dari 4 dalam setiap susunannya. Primer yang baik hendaknya
memiliki melting temperature yang optimum umumnya 52-58 °C, akan tetapi batas
melting temperature pada primer adalah kurang dari 65 °C, selain itu primer
diharuskan memiliki komposisi basa nukleotida GC 45-60% dari jumlah total
susunan basa nukleotida. Pada primer juga ditetapkan basa nukleotida G dan C
sebagai the end atau menempati posisi akhir dari primer supaya mencegah
terbentuknya strand

yang tidak diinginkan (Abd-Esalam, 2003). Primer yang

digunakan pada penelitian ini adalah primer forward 5’ CCT CAT CAC ACA CAA
CTT CCT C 3’ dan primer reverse 5' CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG. Primer

tersebut kemudian akan menghasilkan produk dengan panjang sebanyak 350 bp.
Variasi pada posisi urutan basa nukleotida 350 yang ditandai dengan pewarnaan
warna kuning (gambar 3) menunjukkan adanya variasi alel yang kemudian
menyebabkan tidak terbentuknya produk PCR yang berisikan isolat DNA dengan
variasi alel CYP2A6*4. Hal tersebut terjadi karena primer yang mengamplifikasi
CYP2A6*1 tidak dapat melakukan annealing pada alel CYP2A6*4 karena adanya
perubahan jenis basa nukleotida G (CYP2A6*1/ wild type) menjadi basa nukleotida
A (CYP2A6*4) yang ditunjukkan oleh warna kuning pada gambar 3.

9

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

CYP2A6*1CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTT
CYP2A6*4CCTCATCACACACAACTTCCTCCTCCCTACCAGGGCACCGAAGTGTT
CYP2A6*1CTATGCTGGGCTCTGTGCTGAGAGACCCCAGTTTCTTCTCCAACCCC
CYP2A6*4CTATGCTGGGCTCCGTGCTGAGAGACCCCAGCTTCTTCTCCAACCCT
CYP2A6*1GGACTTCAATCCCCAGCACTTCCTGAATGAGAAGGGGCAGTTTAAGA
CYP2A6*4GGACTTCAATCCCCAGCATTTCCTGGATGACAAGGGGCAGTTTAAGA
CYP2A6*1AGTGATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGC
CYP2A6*4AGTGATGCTTTTGTGCCCTTTTCCATCGGTAAGAGACCACTGTTTGC
CYP2A6*1CCAGGCCACGGCTCACACCAGCAGGGGCCTCCCTCACCCTCCTCCCC
CYP2A6*4CCAGGCCACTGCTCACACCAGCAGGCGCCTCCCTCACCCACCTCCCC
CYP2A6*1TCTGCGGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGA
CYP2A6*4TCTGCGGTGTAGCCTGGTATTTCTCCAGCTTGGAAGTTCCTGTTAGA
CYP2A6*1CTACCCTTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCA
CYP2A6*4CTACCCTTGAGCCAGCAGCTGATACTTCCTTAACTACCAAGCACCCA
CYP2A6*1CCCAAGTGTCATGTACCTGCG
CYP2A6*4CCCAAGTGTCATGTACCTGCA
Gambar 3. Urutan basa nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*4
Produk PCR kemudian dianalisis menggunakan teknik elektroforesis yang
dievaluasi dengan menggunakan kamera. Pada penelitian ini didapatkan hasil
bentuk pita tunggal dan tebal pada posisi 350 bp yang menunjukkan bahwa produk
PCR tersebut merupakan isolat DNA dengan tipe alel aktif yaitu CYP2A6*1 dan
juga didapatkan hasil adanya pita yang tidak terbentuk atau tidak terekspresi pada
gel agarose yang menunjukkan bahwa produk PCR tersebut merupakan isolat DNA
dengan alel CYP2A6*4 ( Gambar 4)

10

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

M

1

2

3

4

5

6

7

Produk PCR
panjang 350 bp
dengan pita
yang tunggal
dan tebal

Produk PCR
yang tidak
terdapat hasil
ekspresi pita
tunggal dan
tebal.

Gambar 4. Elektrogam produk PCR pada berbagai isolat DNA perokok ras kulit
hitam Papua
Keterangan :
M
: 100 bp +3 k bp DNA ladder sebagai marker
1-7
: Produk PCR dari isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua
Dengan kondisi elektroforesis menggunakan agarose 1.5% sebagai fase diam, TBE 1X
sebagai fase gerak, volume injeksi 6 µL, tegangan 110 volt dan running selama 45 menit

Adanya alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dapat diidentifikasi dengan
menggunakan metode elektroforesis. Adanya produk yang terbentuk dengan
panjang basa nukleotida 350bp

menunjukkan alel CYP2A6*1, namun jika tidak

terbentuk produk maka menunjukkan adanya alel CYP2A6*4. Pada gambar 4 pita
yang terekspresi mengalami pola pembentukan pita yang tidak seragam dan
fenomena curved DNA band (smilling effects), hal ini dapat disebabkan karena
kondisi elektroforesis yang kurang tepat yaitu tingkat voltase yang terlampau tinggi,
menurut Magdeldin (2012) tingkat voltase optimum pada elektroforesis adalah 5-8
V/cm. Voltase yang digunakan pada penelitian adalah 110 V dan sudah sesuai
dengan ketentuan kondisi elektroforesis, sehingga fenomena ini dapat disebabkan
oleh faktor lain seperti terjadinya gel shift effect yaitu peristiwa munculnya ikatan
antara DNA dengan protein seperti ligase, fosfatase, dan enzim retriksi yang
menghambat migrasi DNA pada gel dan juga dapat disebabkan kadar garam pada
sampel yang tinggi serta adanya gelembung pada sampel pada saat dilakukan
elektroforesis. Pada penelitian ini didapatkan hasil terdapat adanya 8 produk PCR

11

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

yang tidak terekspresi pada saat proses analisis dengan metode elektroforesis yang
dilihat dengan bantuan uv transiluminator, hal ini menunjukkan adanya 8 isolat
DNA pada produk PCR mengandung variasi alel CYP2A6*4 dengan frekuensi
26,6% dan 22 produk lainnya dengan frekuensi 73,3% terbentuk pita pada 350 bp
menunjukkan bahwa isolat DNA pada produk tersebut mengandung tipe alel aktif
/ wild type yaitu CYP2A6*1. Hal ini menunjukkan sebanyak 8 subjek uji isolat
DNA perokok ras kulit hitam Papua indonesia memiliki aktivitas metabolisme yang
lebih lambat dibandingkan individu lainnya yang memiliki alel CYP2A6*1 (wild
type). Sehingga dapat menyebabkan potensi tingkat ketergantungan akan merokok
tembakau akan lebih rendah dibandingkan individu dengan tipe alel aktif
CYP2A6*1. Pada penelitian juga melakukan aktivitas penelusuran penelitian yang
dilakukan oleh Prabowo (2017) untuk melihat variasi alel yang muncul pada isolat
DNA perokok ras kulit hitam Papua Indonesia, pada penelitian tersebut didapatkan
hasil tidak ditemukannya variasi alel CYP2A6*9 pada subjek uji. Sehingga
didapatkan hasil pada perokok ras kulit hitam Papua Indonesia memiliki frekuensi
variasi alel CYP2A6*9 sebesar 0% (Tabel 1.).
Tabel 1. Frekuensi alel CYP2A6 pada ras kulit hitam Papua Indonesia
Alel
CYP2A6*1
CYP2A6*4
CYP2A6*9

Jumlah

Frekuensi
22
8
0

73,3%
26,6%
0%

Ketergantungan merokok dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan.
Faktor genetik berupa adanya polimorfisme pada CYP2A6 berpengaruh terhadap
aktivitas CYP2A6 dalam memetabolisme nikotin. Adanya polimorfisme pada
CYP2A6 dengan bentuk alel non aktif seperti CYP2A6*4 dan CYP2A6*9
menyebabkan aktivitas enzimatik yang lebih rendah sehingga, pada individu
dengan genotipe CYP2A6*1/*4, CYP2A6*4/*9 dan CYP2A6*1/*4/*9 masuk
dalam kategori slow metabolizers ( Mwenifumbo et al., 2008 and Sceoedel et al.,
2004). Individu dengan aktivitas enzimatik yang lebih rendah memiliki

12

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

kadar nikotin yang terjaga dalam plasma sehingga menyebabkan penurunan potensi
ketergantungan

merokok

dibandingkan

individu

dengan

alel

aktif

normal

CYP2A6*1.
Pada tabel 2 menunjukkan hubungan tingkat ketergantungan terhadap
nikotin berdasarkan skor FagerstrrÖm Test for Nicotine Dependence (FTND).
Kuisioner FTND merupakan metode yang digunakan dalam penelitian yang
dilakukan oleh Nugroho (2017) untuk menganalisis tingkat ketergantungan rokok
ras kulit hitam Papua Indonesia. Berdasarkan penelitian Heatherton (1991)
pengukuran efek ketergantungan rokok pada subyek uji dilakukan berdasarkan nilai
FTND yang didapatkan melalui kuisioner diberikan pada subyek uji sebelum
melakukan pengambilan darah. Dalam FTND terdapat penggolongan subyek
berdasarkan skor yang diperoleh untuk memperlihatkan tingkat ketergantungan
merokok pada subyek uji. Pada tabel tersebut menunjukkan hasil genotipe yang
muncul pada isolat DNA perokok ras kulit hitam Papua Indonesia hanya
CYP2A6*1/*4 dan CYP2A6*1/*1 yang kemudian dihubungan dengan perolehan
skor FTND sesuai dengan penelitian yang dilakukan Nugroho (2017). Hanya dua
jenis genotipe yang muncul karena pada penelitian yang dilakukan Prabowo (2017)
didapatkan hasil frekuensi varian alel CYP2A6*9 sebesar 0% pada subyek uji,
sehingga tingkat ketergantungan merokok subyek uji tidak dipengaruhi oleh
CYP2A6*9.

13

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Tabel 2. Tingkat ketergantungan terhadap nikotin berdasarkan skor FTND
Skor

Tingkat
ketergantungan

Jumlah

Genotype

-

-

3
1
3
2
10
1
3
1
3
1
2
-

CYP2A6*1/*4
CYP2A6*1/*1
CYP2A6*1/*1
CYP2A6*1/*4
CYP2A6*1/*1
CYP2A6*1/*1
CYP2A6*1/*1
CYP2A6*1/*4
CYP2A6*1/*1
CYP2A6*1/*4
CYP2A6*1/*1
-

0
1

Sangat rendah

2
3
Rendah
4
5

Sedang

6

Tinggi

7
8-10

Sangat tinggi

Pada penelitian alel yang teridentifikasi adalah CYP2A6*1/*4, terdapat
pada kategori tingkat ketergantungan sangat rendah pada tiga subjek uji, tingkat
ketergantungan rendah pada dua subjek uji,

tingkat ketergantungan sedang pada

satu subjek uji dan tingat ketergantungan tinggi pada satu subjek uji. Dua kategori
rendah dan sangat rendah tersebut sesuai dengan teori karena bentuk polimorfisme
alel non aktif CYP2A6*4 menyebabkan turunnya aktivitas metabolisme nikotin
hingga kurang dari 50% (Akrodou, 2015), sehingga individu dengan variasi
CYP2A6*4

memiliki

tingkat

ketergantungan

merokok

yang

lebih

rendah

dibandingkan dengan CYP2A6*1 (wild type), akan tetapi pada penelitian
didapatkan hasil terdapat

alel non

aktif pada individu

dengan

kategori

ketergantungan sedang dan tinggi hal ini kemungkinan dapat disebabkan oleh
faktor lingkungan seperti kebudayaan, ekonomi, tingkat pendidikan dan gaya hidup
dalam lingkungan tempat tinggal yang dapat mempengaruhi kebiasaan merokok
(Akrodou ,2015). Pada penelitian Nugroho (2017) didapatkan jumlah kedua
kategori ketergantungan rendah dan sangat rendah pada 23 subjek uji sedangkan
pada penelitian hanya terdapat 8 subyek uji dengan jenis alel CYP2A6*4.
Perbedaan antara jumlah alel non aktif yang terekspresi dan nilai tingkat
ketergantungan perokok ras kulit hitam Papua Indonesa dikarenakan pada
14

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

penelitian mengidentifikasi dua jenis alel non aktif, sedangkan Nakajima (2006)
menyatakan ada beberapa jenis alel non aktif seperti CYP2A6 *4, *7, *9, *10, dan
*19. Penelitian ini belum cukup untuk mengkorelasikan hubungan antara faktor
genetik dengan ketergantungan merokok dikarenakan sedikitnya jumlah alel yang
diidentifikasi.
KESIMPULAN
Hasil penelitian amplifkasi salah satu variasi alel CYP2A6 yaitu alel
CYP2A6*4 pada isolat DNA perokok berjenis kelamin laki-laki ras kulit hitam
Papua Indonesia yaitu ditemukan adanya polimorfisme yaitu terdapat 8 sampel
isolat DNA yang memiliki variasi alel CYP2A6*4 dengan frekuensi 26,6%.
SARAN
Pada penelitian selanjutnya, peneliti menyarankan adanya peningkatan
jumlah subjek uji untuk mengidentifikasi alel CYP2A6*4 serta peningkatan jumlah
identifikasi polimorfisme

CYP2A6

dengan

tipe

alel

yang

berbeda

yang

mempengaruhi proses metabolisme nikotin pada ras kulit hitam Papua Indonesia.
DAFTAR PUSTAKA
Abd-Elsalam. K.A. 2003. Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design
. African Journal of Biotechnology. 2 (5); 91-95.
Akrodou Y.M. 2015. CYP2A6 polymorphisms may strengthen individualized
treatment for nicotine dependence. Scientifica . 2015:1-7
Ando M, Hamajima N, Ariyoshi N, Kamataki T, Matsuo K, Ohno Y. 2003.
Association of CYP2A6 gene deletion with cigarette smoking status in
Japanese adults. J Epidemiol. 13(3):176–81.
Ariyoshi N, Miyamoto M, Umetsu Y, Kunitoh H, Dosaka-Akita H, Sawamura Y-I,
et al. Genetic polymorphism of CYP2A6 gene and tobacco-induced lung
cancer risk in male smokers. Cancer. 2002. Epidemiol biomarkers Prev a
Publ Am Assoc Cancer Res cosponsored by Am Soc Prev
Oncol.11(9):890–4
Audrain-McGovern J., et al., 2007. The Role of CYP2A6 Emergence in the of
Nicotine Dependence in Adolescents, PEDIATRICS, 119(1)
Benowitz, N.L., Perez-Stable, E.J., Fong I., Herrera, B., Jacob ,PI., Ethnic
differences in N-glucuronidation of nicotine and cotinine. J Pharmacol
Exp Ther. 291(3):1196-1203.
B-Rao C., 2001. Sample size consideration in genetic polymorphism studies.
Human Heredity, 52:191-200.
Fujieda M, Yamazaki H, Saito T, Kiyotani K, Gyamfi MA, Sakurai M, et al. 2004.
Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of

15

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese
smokers. Carcinogenesis. 25(12):2451–8.
Haiman, C.A., Stram, D.O., Wilkens, L. R., Pike, M.C., Kolonel, L. N., Henderson,
B. E., et al,. 2006 . Ethnic and racial differences in the smoking-related
risk of lung cancer. New England Journal of Medicine, 354:333-342
Handoyo, D., dan Rudiretna, A. 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase
Chain Reaction (PCR).General Principles and Implementation of
Polymerase. 9(1):17–29.
Heatherton, T.F., Kozlpwski, L.T., Frecker, R.C & Fagerstrom, K.O. 1991. Ther
Fagerstrom Test for Nicotine Dependence: A reevision od the Fagerstrom
Tolerance Questionnaire. British Journal of addictions. 86.
Hukkanen, J., Jacob III, P. & Benowitz, N.L. 2005. Metabolism and Disposition
Kinetics of Nicotine. The American Society for Pharmacology and
Experimental Therapeutics. 57(1)
Joshi M., & Deshpande J.2010. Polymerase Chain Reaction: Methods, Principles
And Application. International Journal of Biomedical Research.(5). 8197
Liem, A., 2014. Pengaruh Media Massa, Keluarga, dan Teman terhadap Perilaku
Merokok. Makara Hubs-Asia. 18 (1): 41-52.
Magdeldin, S., 2012, Gel Electrophoresis- Principles and Basic. Croatia; InTech.
49.
Maggert, K. A., 2012, Genetics: Polymorphisms, Epigenetics, and Something In
Between, Genetic Research International, 1-9.
McPherson, M.J., and Moller, S.G. 2006. PCR, 2 end edition, New York: Taylor &
Francis, 292.
Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom, & W.G.
Wade. 1998. Design and Evaluation of Useful Bacterium Specific PCR
Primer that Amplify Genes Coding for Bacterial 16S-rRNA.Applied and
Environmental Microbiology. 64: 795–799.
Minematsu, N., Nakamura N., Furuuchi, M., Nakajima T., Takahashi., Tateno H.,
and Ishuzaka, 2006. Limitation of ciggarette consumotion by , limitation
of ciggarette consumotion by CYP2A6*4, *7 and *9 polymorphisms.
European Respiratory Journal
Nakajima, M., Fukami,T., Yamanaka,H., Higasi,E., Sakai,H., Yoshida, R., et al
(2006). Comprehensive evaluation of variability in nicotine metabolism
and CYP2A6 polymorphic allels in four ethnic popµLations. 277, 1010–
1015 6. Clinical pharmacology& therapeutics. 80(3):282-97
Nugroho R.T., 2017. Penagaruh Polimorfisme Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6)
alel *9 Terhadap Ketergantungan Rokok pada Subyek Uji Ras Kulit
Hitam Papua Indonesia. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta
Patramurti, C., Sugiyanto, Nurrochmad, A., and Martono, S., 2014, Polymorphism
of Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6*1 adn CYP2A6*4) Among Javanese
Indonesian Smoker and Non Smoker, Indonesian Journal of Pharmacy,
26(1), 11-19.

16

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

POKDI Stroke Perhimpunan Dokter Spesialis Saraf Indonesia (PERDOSSI). 2011.
Guideline Stroke, Bagian Ilmu Saraf RSUD FakµLtas Kedokteran UR.
Prabowo D.A., 2017. Identifikasi Gen Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) Alel *9 pada
Subjek Uji Perokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia. Skripsi. Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta
Rao Y, Homann E, Zia M, Bodin L, Zeman M, Sellers EM, et al. 2000.
Duplications and defects in the CYP2A6 gene: identifi cation, genotyping,
and in vivo eff ects on smoking. Mol Pharmacol.58(4):747–55
Raunio, H. and Rahnasto-Rilla, M., 2012, CYP2A6: Genetics, Structure,
RegµLation, and Function, Drugs Metabolism and Drug Interactions,
27(2), 73-88.
Schoedel, K A., Hofmfmann, E B., Rao, Y., Sellers, M E., Tyndale, R F., 2004,
Ethnic Variation in CYP2A6 and Association of Genetically Slow
Nicotine Metabolism and Smoking in AdµLt Caucasians, Lippincott
Williams & Wilkins Pharmacogenetics 14 (9) :615-619
Somma, M., Querci, M., 2000, The Analysis of Food Samples for the Presence of
Genetically Modified Organisms Session 6 The Polymerase Chain
Reaction (PCR), JRC European Comission, Europe
Yoshida R, Nakajima M, Watanabe Y, Kwon J-T, Yokoi T. 2002. Genetic
polymorphisms in human CYP2A6 gene causing impaired nicotine
metabolism. Br J Clin Pharmacol.54(5):511–7.

17

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

LAMPIRAN

18

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian

19

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis

20

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 3. Usage Information of Go Tag Green Master Mix

21

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladder and Markers

22

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 5. Data Subjek
Tingkat
Ketergantungan
Rokok

Skor
FTND

Genotip

1p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

2p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

3p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

4p

1

CYP2A6*1/*4

Sangat rendah

5p

6

CYP2A6*1/*1

Tinggi

6p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

8p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

9p

1

CYP2A6*1/*4

Sangat rendah

10p

4

CYP2A6*1/*4

Rendah

11p

2

CYP2A6*1/*1

Sangat rendah

12p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

13p

3

CYP2A6*1/*4

Rendah

14p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

15p

1

CYP2A6*1/*1

Sangat rendah

16p

2

CYP2A6*1/*1

Sangat rendah

17p

6

CYP2A6*1/*1

Tinggi

18p

4

CYP2A6*1/*1

Rendah

19p

5

CYP2A6*1/*1

Sedang

20p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

21p

3

CYP2A6*1/*4

Rendah

23p

4

CYP2A6*1/*1

Rendah

24p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

26p

2

CYP2A6*1/*1

Sangat rendah

27p

5

CYP2A6*1/*1

Sedang

Subjek

23

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

28p

1

CYP2A6*1/*4

Sangat rendah

29p

5

CYP2A6*1/*4

Sedang

30p

5

CYP2A6*1/*1

Sedang

31p

4

CYP2A6*1/*1

Rendah

32p

3

CYP2A6*1/*1

Rendah

33p

6

CYP2A6*1/*4

Tinggi

24

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 6. Elektroforegram Analisis Kualitatif Isolat DNA
M

1

2

3

4

5

6

7

21

20

19

18

17

16

15

M

33

32

31

30

29

14

13

28

M

25

27

12

11

10

9

26

25

24

23

8

22

M

M

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 7. Elektrogram Produk PCR
7

21

6

5

4

3

2

20

19

18

17

16

29

M

30

1

M

15

M

26

14

13

28

27

12

26

11

10

9

8

25

24

23

22

33

32

31

M

M

M

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Lampiran 8. Frekuensi alel
Frekuensi alel CYP2A6*1

=

=

jumlah alel CYP2A6∗1 yang diperoleh
jumlah seluruh alel ( 30)

22
30

𝑥100%

𝑥100%

= 73,3%

Frekuensi alel CYP2A6*4

=

=

jumlah alel CYP2A6∗4 yang diperoleh
jumlah seluruh alel ( 30)

8

30

𝑥100%

= 26,6%

27

𝑥100%

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama lengkap Elisa Gitaningtyas, lahir di
Kabupaten Semarang tanggal 28

Mei 1997,

yang

merupakan anak pertama dari pasangan suami istri Sigit
Novianto S.E dan Setyaningsih S.E M.M,. Penulis telah
menempuh

pendidikan

formal

yaitu

dari

bangku

pendidikan tingkat TK, Sekolah Dasar dan Sekolah
Menengah Pertama di lembaga pendidikan

Sekolah

Kristen Satya Wacana dibawah naungan Universitas Satya Wacana Salatiga
(UKSW) pada tahun 2001-2012 dan dilanjutkan pendidikan Sekolah Menengah
Akhir Negeri Satu Salatiga pada tahun 2012-2015. Penulis melanjutkan pendidikan
pada bangku Perguruan Tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada tahun 2015. Selama perkuliahan penulis aktif dalam berbagai
kepanitian yaitu Cara Belajar Insan Aktif (CBIA) sebagai koordinator divisi acara
tahun 2016 dan ketua pada tahun 2017, panitia Pelepasan Wisuda II tahun 2016
sebagai anggota divisi dana dan keuangan (DDU), panitia Seminar Nasional
sebagai anggota divisi acara pada tahun 2016 dan sebagai koordinator divisi acara
pada tahun 2017, panitia Herbal Cosmetic Competition pada tahun 2017 sebagai
koordinator divisi acara, panitia FACTION tahun 2017 sebagai anggota divisi
sponsorship dan panitia Job Fair Farmasi tahun 2018, serta mengikuti organisasi
Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (JMKI) pada tahun 2016/2017 sebagai
anggota divisi pengabdian masyarakat dan pada tahun 2017/2018 sebagai wakil
komisaris. Bukan hanya aktif dalam organisasi dan kepanitiaan, penulis pada tahun
2017 merupakan anggota Progam Kreativitas Mahasiswa yang didanai oleh
KEMENRISTEKDIKTI

sehingga

mendapatkan

predikat

sebagai mahasiswa

berprestasi, serta pernah menajdi asisten dosen pada praktikum Biologi Sel
Molekuler dan Anatomi Fisiologi Manusia.

28