Deteksi Mutasi Daerah RRDR Gen rpoB Pada Isolat DNA Sputum Pasien Multidrug Resistant Mycobacterium Tuberculosis (MDR-TB) Dengan Metode Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP).

DETEKSI MUT
UTASI DAERAH RRDR GEN rp
rpoB PADA
ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTI
TIDRUG
RESISTANT
NT Mycobacterium tuberculosis (M
(MDR-TB)
DENGAN
AN METODE POLYMERASE CH
CHAIN
REACTIONON-RESTRICTION FRAGMENT L
LENGTH
POL
POLYMORPHISM (PCR-RFLP))
Skripsi

M
MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA
1208505055

JURUSAN FARMASI
UAN ALAM
FAKULTAS MA
ATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHU
UNIVERSITAS UDAYANA
2016

DETEKSI MUT
rpoB PADA
UTASI DAERAH RRDR GEN rp
ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTI
TIDRUG
RESISTANT
(MDR-TB)
NT Mycobacterium tuberculosis (M
DENGAN
CHAIN
AN METODE POLYMERASE CH
REACTIONLENGTH
ON-RESTRICTION FRAGMENT L
POL
POLYMORPHISM (PCR-RFLP))
Skripsi

M
MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA
1208505055

JURUSAN FARMASI
UAN ALAM
FAKULTAS MA
ATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHU
UNIVERSITAS UDAYANA
2016

i

ii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang
Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan
skripsi yang berjudul “DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpoB
PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANT
Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE
CHAIN

REACTION-RESTRICTION

FRAGMENT

LENGTH

POLYMORPHISM (PCR-RFLP)” tepat pada waktunya. Skripsi ini diajukan
sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan
Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
Penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari dukungan, bantuan,
serta bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung.
Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada:
1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana.
2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan
Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana.
3. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I
yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan
semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan tugas akhir I ini.
4. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang juga
telah banyak membimbing demi kelancaran penyusunan tugas akhir I ini.
5. Seluruh teknisi di Laboratorium Biologi Molekular FK UNUD, khususnya
Mbok Nanik, Mok Echi, dan Bu Komang yang telah banyak memberi bantuan
dan dukungan.
6. Bagian/SMF Mikrobiologi Klinik FK UNUD/RSUP Sanglah yang telah
membantu dalam pengadaan sampel pada penelitian ini.
7. Seluruh dosen beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah banyak

iii

memberikan ilmu serta dukungan sejak awal penulis mengenyam pendidikan
di jurusan ini.
8. Kedua orangtua penulis, I Gede Putu Wirajaya dan Ni Luh Made Adi
Gunasih, yang tak pernah henti memberi dukungan, doa, dan semangat.
9. Keluarga besar penulis yang selalu memberi dukungan serta motivasi bagi
penulis.
10. Tim Tugas Akhir TB Ratih, Linda, Dektri, Widya, dan Ebi yang telah menjadi
teman diskusi dan berbagi suka duka selama pembuatan Tugas Akhir.
11. Teman-teman mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas
Udayana, khususnya Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama penulis.
12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu.
Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat
membangun dari berbagai pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan
datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Bukit Jimbaran, Juni 2016

Penulis

iv

DAFTAR ISI

Halaman
HALAMAN SAMPUL ..............................................................................

i

LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................

ii

KATA PENGANTAR ...............................................................................

iii

DAFTAR ISI..............................................................................................

v

DAFTAR SINGKATAN ...........................................................................

viii

DAFTAR ISTILAH ...................................................................................

x

DAFTAR TABEL......................................................................................

xiii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................

xiv

DAFTAR LAMPIRAN..............................................................................

xv

ABSTRAK ................................................................................................

xvi

BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ......................................................................

1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................

5

1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................

6

1.4 Manfaat Penelitian ................................................................

6

1.4.1 Manfaat Keilmuan........................................................

6

1.4.2 Manfaat Praktis ............................................................

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mycobacterium tuberculosis .................................................

7

2.2 Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) .....................

7

v

2.3 Resistensi RIF .......................................................................

9

2.4 Mutasi Gen ............................................................................

11

2.4.1 Point mutation..............................................................

12

2.4.2 Frameshift mutation .....................................................

14

2.5 Enzim Restriksi .....................................................................

15

2.6 Pemilihan Enzim Restriksi ...................................................

19

2.7 PCR ......................................................................................

20

2.8 PCR-RFLP ............................................................................

23

2.9 Elektroforesis ........................................................................

26

BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian ............................................................

29

3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian ................................................

30

3.3 Bahan Penelitian....................................................................

30

3.4 Alat Penelitian.......................................................................

31

3.5 Prosedur Penelitian................................................................

31

3.5.1 Pemilihan Enzim Restriksi...........................................

31

3.5.2 Isolasi DNA dari Spesimen Sputum Pasien .................

32

3.5.3 Amplifikasi Gen rpoB MDR-TB dengan PCR ............

33

3.5.4 Deteksi Produk PCR ....................................................

33

3.5.5 Digesti Produk PCR dengan Enzim Restriksi PvuII ....

34

3.5.6 Deteksi Hasil Digesti Produk PCR ..............................

34

3.5.7 Interpretasi Hasil ..........................................................

35

vi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pemilihan Enzim Restriksi secara In Silico ..........................

36

4.2 Isolasi DNA M. tuberculosis.................................................

42

4.3 Amplifikasi Fragmen 990-1496 pb Gen rpoB M. tuberculosis
dengan Teknik PCR dan Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa ...............................................................

45

4.4 Optimasi Digesti Produk PCR dengan Enzim PvuII ............

50

4.5 Digesti Produk PCR rpoB dengan Enzim Restriksi PvuII ....

55

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan ...........................................................................

61

5.2 Saran......................................................................................

61

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

63

LAMPIRAN...............................................................................................

71

vii

DAFTAR SINGKATAN

A

: Adenine

ACP

: acyl carrier protein

BSA

: bovine serum albumin

BSC

: biological safety cabinet

BTA

: Basil tahan asam

C

: Cytosine

DNA

: Deoxyribose nucleic acid

DST

: Drug susceptibility testing

dATP

: deoksiadenosin trifosfat

dCTP

: deoksisitidin trifosfat

dGTP

: deoksiguanosin trifosfat

dNTPs

: Deoxynucleotide triphospates

dTTP

: deoksitimidin trifosfat

dsDNA

: Double stranded deoxyribose nucleic acid

EDTA

: Ethylene diamine tetraacetic acid

FI

: Fidelity index

G

: Guanine

INH

: Isoniazid

kpb

: kilo pasang basa

LJ

: Lowenstein-Jensen

MDGs

: Millenium Development Goals

viii

MDR-TB

: Multidrug Resistant-Tuberculosis

MIC

: Minimum inhibitory concentration

mRNA

: Messenger ribonucleic acid

Mtb

: Mycobacterium tuberculosis

OAT

: Obat antituberkulosis

Pb

: pasang basa

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PCR-SSCP

: Polymerase

Chain

Reaction



Single-Stranded

Conformational Polymorphism
PCR-RFLP

: Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment
Length Polymorphism

RIF

: Rifampisin

RNA

: Ribonucleic acid

RRDR

: Rifampicin Resistant Determinant Regio

RT-PCR

: Real Time-Polymerase Chain Reaction

ssDNA

: Single stranded deoxyribose nucleic acid

T

: Thymine

TB

: Tuberkulosis

TBE

: Tris-Boric Acid-EDTA

WHO

: World Health Organization

ix

DAFTAR ISTILAH

Amplifikasi DNA

: perbanyakan DNA

Amplikon

: produk amplifikasi DNA

Building block

: unit monomer penyusun komponen

Comb

: alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk
kolom (well) pada gel agarosa

Chamber

: wadah untuk meletakkan gel agarosa

DNA polimerase

: enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA

DNA templat

: DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen
atau gen yang akan digandakan

DNA ladder

: DNA dengan ukuran yang diketahui dan digunakan
sebagai

pembanding

ukuran

DNA

lain

dalam

elektroforesis
Gen

: urutan DNA yang menyandi suatu protein

GenBank

: database utama dalam biologi molekuler yang dikelola
oleh NCBI

Genom

: keseluruhan materi genetik (DNA/RNA) pada makhluk
hidup

In vitro

: percobaan dilakukan menyerupai sistem in vivo agar
dapat memberikan hasil yang sama dengan proses in vivo

In silico

: dilakukan pada komputer

x

Kodon

: deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi
tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam
amino tertentu

Mutasi

: terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang
lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat
menyebabkan perubahan sifat fenotip

Nukleotida

: unit monomer pembentuk DNA

Open reading frame : segmen dari urutan nukleotida yang diawali dengan start
kodon dan diakhiri dengan stop kodon dan memiliki
panjang yang cukup untuk mengkode protein
PCR

: teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan
reaksi enzimatis

Primer

: oligonukleotida

pendek

yang

mempunyai

urutan

nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida
DNA templat
Resistensi

: kemampuan bakteri untuk bertahan terhadap adanya obat
yang dengan konsentrasi normal dapat membunuh atau
menghambat pertumbuhannya

Sekuen

: urutan DNA

Sekuensing

: proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu
molekul DNA

Transkripsi

: proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai
templat

xi

Tray

: alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa

Wildtype

: organisme yang memunculkan karakter dalam populasi
aslinya

xii

DAFTAR TABEL

Halaman
Tabel 2.1 Mutasi gen yang berperan terhadap resistensi OAT..................

9

Tabel 2.2 Frekuensi mutasi pada kodon di daerah RRDR ........................

10

Tabel 2.3 Perbedaan tipe enzim restriksi ...................................................

17

Tabel 2.4 Rentang pemisahan pada gel agarosa ........................................

28

Tabel 4.1 Enzim restriksi dengan situs restriksi pada titik mutasi daerah
RRDR ........................................................................................

xiii

37

DAFTAR GAMBAR

Halaman
Gambar 2.1 Contoh missense mutation ....................................................

13

Gambar 2.2 Contoh nonsense mutation ....................................................

13

Gambar 2.3. Contoh frameshift mutation akibat delesi dan insersi ...........

14

Gambar 2.4 Mekanisme pemotongan DNA oleh enzim restriksi .............

16

Gambar 2.5 Pemotongan enzim restriksi tipe II pada untai DNA ............

18

Gambar 2.6 Tiga tahapan utama PCR.......................................................

22

Gambar 2.7 Mutasi gen yang menyebabkan inaktivasi situs pengenalan
enzim restriksi........................................................................

25

Gambar 2.8 Contoh elektroforegram hasil pemotongan produk PCR
dengan enzim restriksi spesifik (Fratamico et al., 2005).......

25

Gambar 3.1 Skema rancangan penelitian..................................................

29

Gambar 4.1 Peta restriksi enzim PvuII pada fragmen rpoB 990-1496pb..

40

Gambar 4.2 Elektroforegram produk PCR hasil optimasi suhu annealing
primer.....................................................................................

46

Gambar 4.3 Elektroforegram produk PCR fragmen 990-1496pb DNA
Mtb Isolat H37Rv, 134, DNA sputum...................................

48

Gambar 4.4 Elektroforegram produk PCR fragmen 990-1496pb DNA
Mtb Isolat P10, P11, P16 .......................................................

48

Gambar 4.5 Elektroforegram hasil optimasi digesti produk PCR ...........

54

Gambar 4.6 Elektroforegram produk digesti isolat M. tuberculosis........

56

Gambar 4.7 Elektroforegram hasil optimasi formula digesti isolat P11..

58

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Lampiran 1. Pembuatan Larutan ................................................................

71

Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv...............

71

Lampiran 3. Sekuen Nukleotida Gen rpoB M. tuberculosis H37Rv..........

73

Lampiran 4. Daftar enzim restriksi yang memotong pada fragmen 990
-1496pb gen rpoB Mtb H37Rv (GenBank U12205.1) ..........

75

Lampiran 5. Daftar ukuran fragmen restriksi dari hasil pemotongan
enzim restriksi pada fragmen 990-1496pb gen rpoB Mtb
H37Rv ..................................................................................

77

Lampiran 6. Formula amplifikasi fragmen 990-1496 pb gen rpoB M.
tuberculosis dan formula optimasi digesti produk PCR .......

79

Lampiran 7. Surat keterangan kelaikan etik .............................................

80

xv

ABSTRAK
Resistensi terhadap rifampisin diketahui sebagai surrogate marker
kejadian MDR-TB. Sebagian besar isolat M. tuberculosis yang resisten terhadap
rifampisin mengalami mutasi di daerah sepanjang 81 pb pada gen rpoB atau
disebut dengan Rifampin Resistance Determining Region (RRDR). Berbagai
metode molekuler telah dikembangkan untuk deteksi MDR-TB secara cepat
berdasarkan kejadian mutasi pada daerah RRDR. Penelitian ini merupakan
penelitian eksploratif laboratoris yang bertujuan untuk mendeteksi mutasi daerah
RRDR dari isolat DNA sputum pasien MDR-TB dengan metode PCR-RFLP
menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Sampel penelitian diperoleh dari
koleksi kultur isolat Bagian Mikrobiologi Klnik RSUP Sanglah. Tahapan
penelitian yang dilakukan meliputi pemilihan enzim restriksi, isolasi DNA M.
tuberculosis H37Rv, amplifikasi fragmen 990-1496 gen rpoB M. tuberculosis,
deteksi produk PCR, digesti produk PCR dengan enzim restriksi PvuII, dan
deteksi hasil digesti produk PCR. Amplifikasi fragmen 990-1496 pb gen rpoB M.
tuberculosis dilakukan terhadap DNA isolat H37Rv, 134, P10, P11, P16, DNA
sputum pasien A dan B.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa enzim PvuII dapat mendeteksi
mutasi pada kodon 510 dan 511 daerah RRDR M. tuberculosis dengan teknik
PCR-RFLP. Beradasarkan elektroforegram hasil digesti, mutasi pada kodon 510
ditemukan pada isolat 134, sedangkan pada isolat P10, P11, dan P16 tidak
ditemukan adanya mutasi pada kodon 510 maupun 511. Namun, primer pada
penelitian ini belum mampu mengamplifikasi fragmen 990-1496 pb gen rpoB M.
tuberculosis secara spesifik dari isolat DNA sputum pasien MDR-TB.
Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa PCR-RFLP dengan enzim
PvuII terbukti dapat digunakan untuk deteksi mutasi kodon 510 dan 511 daerah
RRDR M. tuberculosis. Mutasi pada kodon 510 hanya ditemukan pada isolat 134.
Kata kunci : MDR-TB, RRDR, mutasi, PCR-RFLP; DNA sputum

xvi

ABSTRACT
Resistance to rifampicin is known as surrogate marker of MDR-TB. Most
of rifampicin resistant M. tuberculosis isolates have mutations in 81 bp of rpoB
gene called Rifampin Resistance Determining Region (RRDR). Various molecular
techniques have been developed for rapid detection of MDR-TB based on
evidence of mutations in RRDR. The aim of this laboratory explorative
experiment is to detect mutation in the region of RRDR from DNA isolate of
MDR-TB respiratory specimens using PCR-RFLP method with proper restriction
enzyme. The samples were obtained from isolate culture collection in Clinical
Microbiology Department of Sanglah Hospital. Several steps were conducted,
which are: selection of restriction enzyme, DNA isolation of M. tuberculosis
H37Rv isolate, amplification of fragment 990-1496 bp of M. tuberculosis rpoB
gene, detection of PCR products, digestion of PCR products using a selected
restriction enzyme (PvuII), and detection of restriction fragment as a result of
PCR product digestion. In the amplification process, DNA isolates of M.
tuberculosis H37Rv, P10, P11, P16, 134, DNA isolate of MDR-TB patient’s
sputum A and B were used as DNA template.
The result of this experiment showed that PvuII enzyme could detect
mutation of codon 510 and 511 in the region of RRDR using PCR-RFLP.
Mutation at codon 510 has been detected in isolate 134 while there were no
mutation of codon 510 and 511 detected in P10, P11, and P16 isolates. However,
the primer used in this experiment was unable to amplify fragment 990-1496 bp
of M. tuberculosis rpoB gene specifically from DNA isolate of MDR-TB patient’s
sputum.
In conclusion, this experiment has proved the ability of PCR-RFLP with
PvuII enzyme to detect mutation in codon 510 and 511 of RRDR M. tuberculosis.
Mutation at codon 510 was only found in isolate 134.
Keywords : MDR-TB, RRDR, mutation, PCR-RFLP; DNA of sputum

xvii

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
Multidrug resistant tuberculosis (MDR-TB) merupakan salah satu fenomena
resistensi tuberkulosis (TB). MDR-TB didefinisikan sebagai keadaan resistensi
terhadap setidaknya Isoniazid (INH) dan Rifampisin (RIF) yang merupakan obat
antituberkulosis (OAT) lini pertama (WHO, 2012). World Health Organization
(WHO) memperkirakan terdapat 480.000 kasus baru MDR-TB dan 190.000
kematian akibat MDR-TB di seluruh dunia pada tahun 2014. Dari jumlah kasus
MDR-TB di dunia, 3,3% diantaranya merupakan kasus baru dan sekitar 20%
merupakan kasus MDR-TB yang telah diobati sebelumnya (WHO, 2015). Dari
jumlah kasus baru MDR-TB, diperkirakan hanya 7% yang berhasil didiagnosis.
Pada 27 negara dengan angka kejadian MDR-TB tertinggi diperkirakan hanya 1%
dari kasus baru MDR-TB yang dapat dideteksi dengan drug susceptibility testing
(DST) karena keterbatasan kapasitas laboratorium. Akibatnya, pasien MDR-TB
memperoleh terapi yang tidak tepat dan risiko transmisi strain MDR-TB
meningkat (O’Grady et al., 2011).
RIF merupakan salah satu OAT lini pertama yang poten dengan mekanisme
kerja mengikat β-subunit RNA polimerase sehingga menghambat transkripsi dan
elongasi

RNA

mikobakteri.

Mycobacterium

Pada

tuberculosis

(Mtb),

monoresistensi terhadap RIF jarang ditemukan dan lebih dari 90% isolat Mtb yang
resisten RIF juga resisten terhadap INH. Oleh karena itu, resistensi terhadap RIF

1

2

dikatakan sebagai surrogate marker kejadian MDR-TB. Dari kejadian resistensi
RIF, diketahui bahwa sebanyak 95-98% kasus disebabkan karena mutasi pada
daerah Rifampicin Resistant Determinant Regio (RRDR) gen rpoB Mtb (Yam et
al., 2004). RRDR merupakan fragmen 81 pb yang meliputi kodon 507-533 pada
area inti gen rpoB (Ramaswamy dan Musser, 1998).
Deteksi MDR-TB secara cepat dan akurat sangat penting untuk penentuan
regimen antibiotik yang tepat dan pencegahan penyebaran epidemi MDR-TB
(Leung et al., 2003). Selama ini, kultur bakteri dari spesimen biologis pasien
masih menjadi pilihan utama untuk penegakan diagnosis MDR-TB. Metode
tersebut memerlukan waktu hingga 6 minggu untuk mendapatkan hasil pengujian
karena kemampuan tumbuh Mtb yang bervariasi (Osorio et al. 2011). Hal tersebut
akan menjadi kendala penegakan diagnosis MDR-TB, sehingga metode deteksi
MDR-TB yang lebih efektif dan efisien perlu dikembangkan untuk mempermudah
dokter menentukan regimen terapi yang tepat.
Berbagai metode molekuler telah dikembangkan untuk deteksi resistensi
OAT pada Mtb secara cepat dengan pendekatan adanya mutasi pada DNA Mtb
yang bertanggung jawab terhadap kejadian resistensi OAT (Mathuria et al., 2009).
Penggunaan metode molekuler dapat mempercepat penegakan diagnosis MDRTB dan lebih spesifik dibandingkan metode konvensional dengan kultur bakteri.
Beberapa metode telah dilaporkan dapat digunakan untuk deteksi mutasi pada
daerah RRDR gen rpoB Mtb, antara lain PCR-SSCP (del Valle et al., 2001), RTPCR (Marin et al., 2004), PCR-DNA Sequencing (Yam et al., 2004), nested PCR
(Wijaya, 2013; Pradnyaniti, 2013) dan microarray (Yao et al., 2010).

3

Pemanfaatan metode molekuler untuk deteksi mutasi pada kasus resistensi
OAT masih terkendala pada beberapa hal, seperti sensitivitas rendah pada PCRSSCP (del Valle et al., 2001), penggunaan teknik serta alat yang khusus, dan
diperlukannya personel yang terlatih pada RT-PCR, PCR-DNA Sequencing, dan
microarray (Marin et al., 2004; Yam et al., 2004; Yao et al., 2010). Pada metode
nested PCR juga memerlukan tahapan PCR sebanyak dua kali sehingga dapat
mempengaruhi waktu dan biaya deteksi mutasi. Walaupun pemanfaatan metode
molekuler mampu mempersingkat waktu deteksi mutasi, beberapa diantaranya
masih belum mampu menghilangkan tahapan kultur Mtb karena sampel DNA
yang digunakan berasal dari hasil subkultur isolat klinik Mtb. Hal tersebut
mengakibatkan tetap diperlukannya fasilitas dan kapasitas laboratorium yang
memadai untuk melakukan deteksi resistensi (Wilson, 2011).
Polymerase chain reaction – restrictrion fragment length polymorphism
(PCR-RFLP) merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk deteksi
mutasi gen pada kasus resistensi antibiotik. PCR-RFLP adalah salah satu varian
teknik analisis PCR yang didasarkan pada mekanisme pemotongan DNA secara
spesifik oleh enzim restriksi endonuklease, sehingga dalam metode ini diperlukan
enzim restriksi yang secara spesifik mengenali urutan nukleotida daerah mutasi
(Leonard, 2007). PCR-RFLP memiliki beberapa keuntungan, antara lain relatif
murah, mudah dalam hal pengerjaan dan interpretasi, serta hanya memerlukan
peralatan dasar PCR (Caws et al., 2007). Penelitian mengenai penggunaan PCRRFLP dalam deteksi mutasi gen dalam kasus resistensi telah dilakukan untuk

4

deteksi mutasi pada gen katG yang merupakan penyebab resistensi Mtb terhadap
INH (Leung et al., 2003; Ahmad dan Mokaddas, 2003; Caws et al., 2007).
Penelitian yang dilakukan Caws et al. (2007) pada kultur isolat MDR-TB di
Vietnam serta penelitian yang dilakukan Ahmad dan Mokaddas (2003) pada isolat
MDR-TB di Kuwait menunjukan bahwa PCR-RFLP dengan enzim restriksi
MspA1I dapat digunakan untuk deteksi mutasi kodon 315 gen katG Mtb. Enzim
restriksi MspA1I merupakan enzim yang memiliki situs restriksi pada urutan
C(AC)G▼ C(GT)G. Dengan urutan situs restriksi tersebut, enzim MspA1I akan
spesifik mendeteksi adanya mutasi karena mengenali urutan nukleotida pada
daerah mutasi kodon 315 gen katG Mtb (Ahmad dan Mokaddas, 2003). Sementara
itu, penelitian yang dilakukan Leung et al. (2003) menunjukan bahwa PCR-RFLP
dengan enzim restriksi MspI (C▼ CGG) dapat digunakan untuk deteksi langsung
mutasi Ser315Thr (AGC→ACC) pada gen katG dari isolat DNA sputum pasien.
Penelitian tersebut menunjukan bahwa PCR-RFLP dapat digunakan untuk deteksi
langsung dari spesimen biologis seperti sputum pasien tanpa proses kultur Mtb.
Penggunaan PCR-RFLP untuk deteksi mutasi daerah RRDR gen rpoB Mtb
belum pernah dilaporkan, walaupun metode tersebut memiliki beberapa
keuntungan dan telah diaplikasikan untuk deteksi mutasi gen katG Mtb.
Amplifikasi daerah RRDR gen rpoB dengan teknik PCR juga telah banyak
dilakukan, sehingga primer dan kondisi PCR dari penelitian yang telah dilakukan
dapat digunakan dalam metode PCR-RFLP karena pada dasarnya sekuen target
yang akan dipotong dengan enzim restriksi akan diamplifikasi terlebih dahulu
dengan teknik PCR. Pada penelitian Wijaya (2013) dan Pradnyaniti (2013) telah

5

dilakukan amplifikasi daerah 990-1496 pb gen rpoB dari kultur isolat MDR-TB di
Bali. Sehingga, primer dan kondisi PCR pada penelitian tersebut dapat digunakan
untuk proses PCR pada metode PCR-RFLP. Pemilihan enzim restriksi merupakan
salah satu tahap yang penting untuk dapat melakukan deteksi mutasi dengan
metode tersebut karena diperlukan enzim restriksi yang memiliki situs restriksi
pada daerah DNA yang mengalami mutasi.
Berdasarkan latar belakang diatas, maka dalam penelitian ini dilakukan
penentuan enzim restriksi yang sesuai untuk deteksi mutasi daerah RRDR gen
rpoB Mtb serta dilakukan deteksi mutasi pada daerah RRDR dari isolat DNA
MDR-TB di Bali dengan metode PCR-RFLP pada kondisi PCR dan penggunaan
primer yang telah dioptimasi dari penelitian sebelumnya.

1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang diatas, maka dapat dirumuskan masalah
sebagai berikut.
1. Enzim restriksi apakah yang dapat digunakan untuk deteksi mutasi
daerah RRDR gen rpoB Mtb dengan metode PCR-RFLP?
2. Apakah terjadi mutasi pada daerah RRDR gen rpoB Mtb dari isolat DNA
MDR-TB yang diidentifikasi dengan metode PCR-RFLP?

6

1.3 Tujuan Penelitian
Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut.
1. Untuk mengetahui enzim restriksi dapat digunakan pada deteksi mutasi
daerah RRDR gen rpoB Mtb dengan metode PCR-RFLP.
2. Untuk mengetahui ada tidaknya mutasi pada daerah RRDR gen rpoB
Mtb dari isolat DNA MDR-TB yang diidentifikasi dengan metode PCRRFLP.

1.4 Manfaat Penelitian
1.4.1 Manfaat Keilmuan
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai titik
mutasi pada daerah RRDR gen rpoB Mtb yang dapat dideteksi dengan metode
PCR-RFLP serta enzim restriksi yang sesuai untuk deteksi mutasi tersebut
menggunakan spesimen sputum pasien MDR-TB.
1.4.2 Manfaat Praktis
Informasi mengenai kemampuan metode PCR-RFLP untuk deteksi mutasi
pada daerah RRDR gen rpoB Mtb dapat dimanfaatkan dalam perancangan
diagnostic kit untuk deteksi MDR-TB dengan cepat dan mudah serta langsung
menggunakan spesimen sputum pasien TB tanpa memerlukan tahapan kultur Mtb.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium

tuberculosis

(Mtb)

merupakan

jenis

bakteri

yang

menyebabkan penyakit TB. Mtb pertama kali ditemukan oleh Robert Koch pada
tahun 1882. Bakteri Mtb termasuk ke dalam genus Mycobacterium dengan bentuk
sel basiler. Karakteristik dari bakteri dalam genus tersebut adalah struktur dinding
sel yang kaya akan kandungan lipid sehingga membentuk barrier yang hidrofobik
dan memiliki permeabilitas rendah serta menyediakan proteksi terhadap agen
antimikroba (Chan et al., 2006). Struktur dinding sel tersebut menyebabkan
sulitnya pewarnaan terhadap bakteri dalam genus tersebut. Namun ketika dapat
terwarnai akan dapat mempertahankan hasil pewarnaan pada kondisi asam
mineral encer sehingga pewarnaan Mycobacterium dikenal sebagai pewarnaan
basil tahan asam (BTA). Kultur bakter Mtb biasanya dilakukan pada media
Lowenstein-Jensen (LJ) dengan suhu optimum 37oC dan pH 6,8 selama masa
inkubasi hingga 6 minggu. Waktu multiplikasi bakteri ini sangat lambat, yaitu
berkisar 14-16 jam. Mtb akan mati pada pemanasan 60oC selama 15-20 menit
(Vasanthakumari, 2007).

2.2 Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB)
MDR-TB adalah penyakit tuberkulosis yang disebabkan oleh strain
Mycobacterium tuberculosis yang resisten sekurang-kurangnya terhadap RIF dan

7

8

INH (WHO, 2012). Pada tahun 2012, WHO mencanangkan program post-2015
global TB strategy sebagai tinjak lanjut atas tercapainya program Millenium
Development Goals (MDGs) 2015 dalam hal pengendalian Tuberkulosis (TB).
Tujuan program tersebut adalah untuk menghentikan epidemi TB secara global
pada tahun 2035. Peningkatan kasus resistensi obat antituberkulosis; OAT
merupakan ancaman utama terhadap keberhasilan program pengendalian TB
(WHO, 2015).
RIF dan INH termasuk ke dalam obat lini pertama atau primer pada infeksi
Mtb. Pengobatan MDR-TB dilakukan dengan OAT lini kedua. Pengobatan ini
lebih lama, lebih mahal dan regimen terapinya lebih rumit. Pasien MDR-TB
membutuhkan waktu beberapa bulan lebih lama, bahkan mungkin mencapai 2
hingga 3 tahun untuk menjadi kultur negatif dibandingkan dengan pasien TB
tanpa MDR (Dipiro et al., 2008). Beberapa efek yang potensial terjadi pada
pengobatan MDR TB yaitu pasien mendapatkan pengobatan yang tidak adekuat
dalam waktu lama, peningkatan resiko kegagalan pengobatan atau kematian,
seleksi terhadap strain yang resisten terhadap OAT, pasien tetap terinfeksi, dan
meningkatkan penyebaran penyakit (Tessema, et al., 2012).
Kejadian resistensi OAT dapat terjadi karena ketidaksesuaian regimen dosis
terapi, ketidaktaatan pasien, dan ketersediaan OAT yang rendah sehingga
pengobatan TB menjadi tidak adekuat. Secara molekuler, diketahui bahwa
mekanisme resistensi terjadi karena adanya mutasi pada gen pengkode target OAT
atau protein tertentu yang berperan dalam aktivasi OAT dalam tubuh. Beberapa
penelitian telah dilakukan untuk mengetahui mutasi pada gen-gen yang berperan

9

dalam mekanisme resistensi OAT terutama pada kasus MDR-TB. Beberapa
mutasi gen yang berperan terhadap kejadian resistensi OAT pada MDR-TB
ditunjukkan pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Mutasi gen yang berperan terhadap resistensi OAT (Zhang dan Yew,
2009; Da Silva dan Palomino, 2011)
Gen yang
Mekanisme
Frekuensi
Mengalami
OAT
Produk Gen
Kerja Obat
Mutasi
Mutasi
INH

Inhibisi

katG

biosintesis asam inhA
mikolat

ahpC

Katalase persksidase

50-95%

Anoyl-ACP reduktase

8-43%

Alkil hidroksi-

-

peroksidase reduktase

RIF

Inhibisi sintesis
RNA

kasA

-

-

ndh

-

-

rpoB

Subunit β dari RNA 95%
polimerase

2.3 Resistensi RIF
RIF merupakan agen bakterisidal yang bekerja dengan cara berinteraksi
dengan RNA polimerase DNA-dependent untuk menghambat transkripsi dan
pemanjangan rantai RNA. Dari empat subunit RNA polimerase, subunit yang
mengkode gen rpoB merupakan yang paling penting karena dengan terjadinya
mutasi genetik pada unit ini, RIF tidak dapat berikatan dengan enzim RNA
polimerase dan menyebabkan resistensi bakteri M. tuberculosis terhadap RIF
(Raoot dan Dev, 2012).
Daerah yang paling sering mengalami mutasi dan menyebabkan resistensi
terhadap RIF disebut sebagai RRDR. Segmen tersebut mencakup kodon 507

10

hingga 533. Mutasi pada segmen ini didominasi oleh perubahan nukleotida
tunggal yang menghasilkan substitusi asam amino tunggal, walaupun delesi dan
insersi juga terjadi dalam frekuensi yang rendah (Raoot dan Dev, 2012). Frekuensi
mutasi pada gen rpoB bervariasi pada berbagai daerah geografis. Selain itu, titik
mutasi juga mempengaruhi tingkat resistensi Mtb terhadap RIF ketika data mutasi
dicocokan dengan hasil DST (Wang et al., 2013). Frekuensi mutasi beberapa
kodon pada daerah RRDR dapat dilihat pada Tabel 2.2 berikut.

Tabel 2.2 Frekuensi mutasi pada kodon di daerah RRDR
No.

Kodon

1
2
3
4
5
6
7
8
9

533
531
526
522
516
513
511
510
Lainnya

Frekuensi Mutasia
0
3,7
12,1
0
3,1
0
0
0
0











7,7 %
66,6 %
29,7%
5,3 %
18,2%
11,1%
9,4%
47,7%b
18,8%

Keterangan :
a = Chen et al., 2010
b = Saeed et al., 2009; Bestanabad et al., 2011; Agdamag et al., 2003
Missense mutations pada kodon 526 hingga 531 telah dilaporkan memiliki
peran krusial pada tingginya angka kejadian resistensi terhadap RIF. Mutasi pada
kodon 513, 526, dan 531 berkaitan dengan tingkat resistensi yang tinggi pada RIF
sedangkan mutasi pada kodon 516 dikaitkan dengan tingat resistensi yang rendah
pada RIF. Hal tersebut dikarenakan isolat yang mengalami mutasi pada kodon 516
menunjukkan nilai MIC yang lebih rendah secara signifikan dibandingkan isolat

11

yang mengalami mutasi pada kodon 513, 526, dan 531 (del-Valle et al., 2001).
Hasil penelitian Bodmer et al. (1995) menunjukkan bahwa isolat M. tuberculosis
yang mengalami mutasi pada kodon 513, 526, dan 531 memiliki nilai MIC
rifampisin, rifabutin, dan rifapentin yang tinggi (> 8 mg/L) bila dibandingkan
dengan isolat wildtype. Sementara itu, hasil penelitian Ma et al. (2006) dan Wang
et al. (2013) menunjukkan bahwa mutasi pada kodon 533 tidak menujukkan
korelasi dengan kejadian resistensi RIF.
Penelitian yang dilakukan terhadap isolat MDR-TB di Bali menunjukan
adanya mutasi gen rpoB pada kodon 418, 510, 516, 526, dan 531 (Pradnyaniti,
2013; Rusyanthini, 2013; Wijaya, 2013). Jenis mutasi yang ditemukan pada isolat
MDR-TB tersebut adalah mutasi titik yang menyebabkan perubahan asam amino
(missense mutation). Selain pada daerah RRDR, beberapa mutasi di luar daerah
RRDR juga dikaitkan dengan kejadian resistensi RIF. Namun, frekuensi
terjadinya mutasi sangat kecil. Siu et al. (2011) telah mengidentifikasi dua mutasi
yang jarang terjadi di luar daerah RRDR yaitu pada kodon 146 (V146F) dan
kodon 572 (I572F). Mutasi pada kodon 572 juga diidentifikasi oleh del-Valle et
al. (2001).

2.4 Mutasi Gen
Mutasi didefinisikan sebagai perubahan urutan basa nukleotida pada untaian
molekul DNA sebagai akibat dari penggantian, penambahan, atau pengurangan
pasang basa pada molekul DNA. Mutasi dapat disebabkan oleh adanya paparan
mutagen yang menyebabkan kerusakan pada molekul DNA atau kesalahan pada

12

saat proses replikasi DNA. Apabila mutasi terjadi pada untaian DNA yang
berperan dalam proses sintesis protein maka mutasi tersebut dapat menyebabkan
terbentuknya protein yang memiliki sekuen asam amino abnormal (Chatterjea dan
Shinde, 2012; Lieberman dan Marks, 2013). Secara garis besar, mutasi dibedakan
menjadi 2 jenis yaitu mutasi titik (point mutation) dan frameshift mutation.
2.4.1 Point mutation
Mutasi titik (point mutation) melibatkan perubahan pada nukleotida
tunggal sehingga sering disebut sebagai substitusi nukelotida. Mutasi titik
dibedakan menjadi 2 jenis berdasarkan perubahan jenis basa nukelotida yang
terjadi, yaitu transisi dan tranversi. Transisi merupakan subtitusi basa nukleotida
purin menjadi purin (A→G atau G→A) atau pirimidin menjadi pirimidin (C→T
atau T→C). Sedangkan transversi adalah subtitusi basa nuklotida purin mennjadi
primidin atau sebaliknya (Chatterjea dan Shinde, 2012; Young, 2010).
Berdasarkan efeknya terhadap asam amino atau protein yang dihasilkan, subtitusi
basa nukleotida tunggal dapat menyebabkan 3 jenis mutasi yaitu sebagai berikut.
a. Silent mutation adalah adanya substitusi basa nukelotida dalam suatu kodon
pada jenis mutasi ini tidak menyebakan adanya perubahan asam amino yang
dikode kodon tersebut. Misalnya pada asam amino valin yang dikode oleh
empat kodon yang berbeda, yaitu GUU, GUA, GUC, dan GUG. Adanya
substitusi pada basa nukleotida ketiga dari tiap kodon tersebut tidak akan
menyebabkan perubahan asam amino (Young, 2012).
b. Missense

mutation

adalah

adanya

substitusi

basa

nukleotida

yang

menyebabkan perubahan sekuen asam amino sehingga dapat menyebabkan

13

perubahan struktur protein dan mungkin juga menyebabkan perubahan fungsi
protein. Missense mutation yang menyebabkan perubahan sekuen asam amino
tanpa merubah fungsi protein yang dihasilkan disebut missense mutation
konservatif. Sedangkan missense mutation non-konservatif menyebabkan
terjadinya perubahan fungsi protein (Young, 2012; Richards dan Hawley,
2011). Contoh missense mutation adalah mutasi pada kodon CAC (histidin)
menjadi CUC (leusin) yang ditunjukkan pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Contoh missense mutation (Richards dan Hawley, 2011)

Gambar 2.2 Contoh nonsense mutation (Richards dan Hawley, 2011)

14

c. Nonsense mutation adalah subtitusi pada basa nukleotida dalam suatu kodon
yang menyebabkan terbentuknya kodon stop (UAG, UGA, atau UAA).
Nonsense mutation menyebabkan terjadinya terminasi lebih awal pada proses
translasi sehingga protein yang dihasilkan terpotong dengan sekuen asam
amino yang tidak lengkap (truncated protein) dan bersifat inaktif. Apabila
nonsense mutation terjadi pada daerah awal reading frame dari gen, maka
protein mungkin sama sekali tidak dihasilkan (Richards dan Hawley, 2011).
Contoh nonsense mutation ditunjukkan pada Gambar 2.2.

(a)

(b)
Gambar 2.3 Contoh frameshift mutation akibat (a) delesi dan (b) insersi
(Chatterjea dan Shinde, 2012)

2.4.2 Frameshift mutation
Frameshfit mutation melibatkan adanya proses insersi (penambahan) atau
delesi (pengurangan) dari urutan basa nukelotida sehingga terjadi perubahan

15

reading frame. Perubahan reading frame akan menyebabkan terbentuknya sekuen
asam amino yang berbeda dari sekuen asam amino yang seharusnya dihasilkan,
sehingga terbentuk protein baru yang lebih panjang atau lebih pendek dari protein
yang seharusnya dihasilkan (Chatterjea dan Shinde, 2012; Richards dan Hawley,
2011). Contoh perubahan reading frame pada frameshift mutation ditunjukkan
pada Gambar 2.3.

2.5 Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan enzim yang berperan dalam pemotongan untai
double helix DNA secara spesifik pada urutan basa nukleotida tertentu. Enzim
restriksi yang tersedia saat ini umumnya diperoleh dari bakteri dan archae (Khan,
2012). Enzim restriksi akan berikatan pada urutan nukleotida spesifik atau yang
dikenal dengan situs pemotongan spesifik (situs restriksi) pada DNA target yang
selanjutnya akan memotong DNA pada daerah tersebut. Enzim restriksi
berinteraksi dengan DNA melalui ikatan hidrogen multiple (umumnya 10-15) dan
beberapa ikatan van der Waals. Situs pengenalan spesifik enzim restriksi
umumnya terdiri dari empat hingga enam urutan basa nukleotida dan urutan
tersebut dapat membentuk pola palindrom. Pola palindrom merupakan urutan basa
nukleotida yang sama dari arah yang berlawanan (Clark dan Pazdernik, 2015;
Walker dan Rapley, 2005).
Sebagian besar enzim restriksi bekerja optimum pada pH 7,4. Beberapa
enzim memerlukan buffer dengan pH tertentu bergantung pada pH optimal enzim
dan persyaratan kekuatan ionik yang dibutuhkan untuk restriksi. Komponen utama

16

buffer untuk reaksi enz
enzim restriksi adalah natrium klorida (NaCl)
l) dan magnesium
(Mg2+). Magnesium da
dalam buffer reaksi enzim restriksi mutlakk di
diperlukan karena
ion magnesium diper
perlukan sebagai kofaktor enzim untuk dapat
pat berfungsi saat
substrat. Pada beberapa enzim juga diperlukan dithi
restriksi DNA substra
dithitheritol (DTT)
bilkan enzim dan mencegah inaktivasi enzim
im selama proses
yang akan menstabil
2016). Setiap produsen enzim restriksi um
umumnya telah
digesti (Brown, 2016
si optimal digesti masing-masing enzim rest
restriksi sehingga
menentukan kondisi
nzim restriksi akan disertai dengan larutan buf
buffer yang sesuai
dalam pembelian enz
im tersebut dan informasi aktivitas enzim pa
pada buffer yang
untuk aktivitas enzim
buffer tersebut biasanya tersedia dalam konse
konsentrasi 10X yang
disediakan. Larutan buf
diencerkan menjadi larutan buffer 1X untuk
uk digunakan pada
kemudian dapat dienc
ksi (Karcher, 1995).
digesti enzim restriksi

iksi (Pingoud dan
kanisme pemotongan DNA oleh enzim restriksi
Gambar 2.4 Mekani
ch, 2001
2001)
Jelstch,

17

Mekanisme pemotongan oleh enzim restriksi dapat dilihat pada Gambar 2.4.
Secara umum, proses pemotongan DNA oleh enzim restriksi diawali dengan
interaksi nonspesifik antara enzim restriksi dengan DNA khususnya pada gugus
fosfat. Selanjutnya, enzim restriksi bergerak sepanjang untai DNA melalui difusi
linier hingga situs pengenalan spesifik ditemukan. Pada saat enzim restriksi
menemukan situs pengenalan spesifik, molekul air akan dilepas dan terbentuk
ikatan hidrogen antara enzim restriksi dengan basa nukleotida pada situs
pengenalan. Setelah kompleks spesifik DNA-enzim restriksi terbentuk, masingmasing DNA dan enzim restriksi akan mengalami perubahan konformasi untuk
aktivasi reaksi katalisis. Kemudian, enzim restriksi dengan bantuan Mg2+ akan
memotong ikatan fosfodiester (reaksi katalisis) pada tiap untai DNA. Pemotongan
ikatan fosfodiester tersebut akan menyebabkan terpotongnya untai DNA sesuai
dengan posisi pemotongan (Williams, 2003; Pingoud dan Jeltsch, 2001).

Tabel 2.3 Perbedaan tipe enzim restriksi (Stenesh, 1998)
Enzim restriksi
Tipe I
Situs pemotongan

Tipe II

Tipe III

1-10 kpb dari situs

Dalam situs

24-26 pb dari situs

pengenalan

pengenalan

pengenalan

Subunit

Multisubunit

Subunit tunggal

Multisubunit

Kebutuhan ATP

Ya

Tidak

Tidak

Berdasarkan daerah pemotongan, jumlah subunit, dan kebutuhan ATP pada
proses restriksi maka enzim restriksi dibagi menjadi tiga tipe yang ditnjukkan
pada Tabel 2.3. Dari ketiga tipe tersebut, enzim restriksi tipe II merupakan enzim

18

restriksi yang paling sering dimanfaatkan dalam bidang biologi molekuler. Hal
tersebut dikarenakan situs pemotongan enzim restriksi tipe II berada dalam situs
pengenalannya, sehingga pemotongan DNA menjadi sangat spesifik pada sekuen
tertentu (Stenesh, 1998). Selain itu, enzim restriksi tipe II umumnya memiliki
situs pengenalan yang palindrom (Clark dan Pazdernik, 2015).

Gambar 2.5 Pemotongan enzim restriksi tipe II pada untai DNA (Clark dan
Pazdernik, 2015)

Enzim restriksi tipe II dapat memotong untai DNA dengan dengan
menghasilkan dua tipe fragmen, yaitu blunt end dan sticky end. Pada mekanisme
pemotongan blunt end, enzim tersebut memotong DNA tepat pada posisi yang
sama sehingga menghasilkan dua fragmen DNA dengan ujung untai ganda.
Sedangkan pada mekanisme pemotongan sticky end, enzim tersebut memotong
pada urutan yang sama dari situs pengenalan namun pada posisi yang tidak sama
tepat sehingga akan menghasilkan dua fragmen DNA dengan ujung untai tunggal
pendek (Clark dan Pazdernik, 2015). Mekanisme pemotongan tersebut dapat
dilihat pada Gambar 2.5.

19

2.6 Pemilihan Enzim Restriksi
Berbagai jenis enzim restriksi telah berhasil diidentifikasi dari organisme
prokariot dan beberapa diantaranya telah dimanfaatkan dalam penelitian biologi
molekuler. Setiap enzim restriksi memiliki karakterisitk tersendiri, sehingga
dalam pemanfaatannya perlu diperhatikan berapa kriteria pemilihan enzim
restriksi. Menurut Gerstein (2001), beberapa kriteria yang perlu dipertimbangkan
dalam pemilihan enzim retriksi adalah titik pemotongan yang dikehendaki pada
DNA, star activity, sensitivitas terhadap metilasi, dan kemampuan enzim restriksi
memotong jenis sampel DNA yang digunakan.
Titik pemotongan yang dikehendaki pada DNA merupakan pertimbangan
utama dalam pemilihan enzim restriksi karena setiap enzim restriksi memiliki
situs restriksi yang spesifik. Jumlah situs restriksi pada sampel DNA juga perlu
dipertimbangkan karena situs restriksi yang terlalu banyak dapat menyebaban
proses restriksi berlangsung lebih lama dan terjadi partial digestion (Gerstein,
2001). Berdasarkan titik pemotongan yang dikehendaki, maka ukuran fragmen
yang dihasilkan juga harus diperhatikan. Ukuran fragmen yang dihasilkan akan
menjadi pertimbangan dalam pemilihan metode yang digunakan pada analisis
fragmen restriksi. Umumnya, metode analisis fragmen yang digunakan adalah
elektroforesis. Pada elektroforesis, konsentrasi dan jenis gel yang digunakan
sangat menentukan resolusi pemisahan DNA untuk analisis fragmen restriksi
(Brown, 2016).
Star activity merupakan kemampuan enzim restriksi untuk dapat memotong
urutan DNA yang mirip dengan situs restriksinya pada kondisi tertentu (kondisi

20

reaksi tidak optimal). Star activity dapat disebabkan oleh pH buffer yang tinggi,
waktu inkubasi yang lama, konsentrasi enzim yang tinggi, konentrasi gliserol
yang tinggi, dan adanya pelarut organik. Pada enzim EcoRI pada kondisi pH
buffer yang tinggi diketahui dapat memotong pada urutan N▼ AATTC, walaupun
situs restriksinya pada kondisi spesifik adalah G▼ AATTC (Gerstein, 2001).
Menurut Wei et al. (2008), star activity diinyatakan dengan nilai fidelity index
(FI) yaitu rasio jumlah tertinggi enzim yang tidak menimbulkan star activity
terhadap jumlah minimum enzim yang diperlukan untuk mendigesti DNA secara
keseluruhan (complete digestion). Semakin tinggi nilai FI suatu enzim, maka
potensi adanya star activity akan semakin besar. Untuk mencgeah terjadinya star
activity, maka kondisi kondisi reaksi restriksi harus diatur dengan buffer yang
sesuai agar tercapai kondisi optimal.

2.7 PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik amplifikasi segmen
nukleotida spesifik secara in vitro. Teknik PCR merupakan teknik yang sensitif,
selektif, dan cepat dalam amplifikasi segmen nukleotida yang diinginkan. PCR
didasarkan pada proses enzimatik oleh DNA polimerase pada replikasi DNA.
Pada Replikasi DNA terjadi reaksi polimerisasi nukleotida menggunakan untaian
DNA sebagai cetakan (template) dengan bantuan enzim DNA polimerase serta
diperlukan suatu primer yang akan menginisiasi polimerisasi rantai nukleotida.
PCR melibatkan siklus reaksi polimerisasi yang berulang untuk menghasilkan

21

salinan segmen nukleotida dengan kuantitas tinggi walaupun jumlah sampel
nukleotida yang digunakan sangat kecil (Stephenson, 2010; Gupta, 2008).
PCR pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis dan koleganya pada
tahun 1985. Pada awalnya amplifikasi sekuen DNA dengan PCR dilakukan
menggunakan primer oligonukleotida spesifik dan enzim DNA polimerase
bakteri. Pada perkembangannya, diketahui bahwa penggunaan DNA polimerase
termostabil

dapat

meningkatkan

efektivitas

amplifikasi

hingga

mampu

menghasilkan salinan DNA target lebih dari 107 kali lipat walaupun sekuen target
hanya tersedia satu dari 100.000 untai DNA pada reaksi. Dengan berbagai
perbaikan teknik dan variasi penggunaan PCR, saat ini PCR telah dimanfaatkan
dalam berbagai hal seperti deteksi penyakit infeksi, studi mekanisme inflamasi,
analisis mutasi, dan deteksi tumor (Cagle dan Allen, 2009).
Proses PCR dibagi menjadi tiga tahap dasar, yaitu: (1) denaturasi; (2)
penempelan primer oligonukleotida pada sekuen target (annealing); dan (3)
pemanjangan primer-sekuen target dengan bantuan DNA polimerase (extension).
Tahapan dasar PCR tersebut akan terulang sejalan dengan pengulangan siklus
PCR. Ketiga tahapan dasar PCR tersebut dapat dilihat pada Gambar 2.6.
Pada tahap denaturasi, double-stranded DNA (dsDNA) didenaturasi menjadi
single-stranded DNA (ssDNA). Faktor utama yang mempengaruhi tahapan ini
adalah melting temperature atau suhu yang diperlukan dari untai double helix
DNA untuk dapat terdenaturasi menjadi ssDNA. Melting temperature ditentukan
berdasakan komposisi nukleotida terutama komposisi guanin-sitosin (GC). Hal
tersebut dikarenakan komposisi GC memiliki ikatan hidrogen yang lebih kuat

22

sehingga memerlukan energi yang lebih besar untuk terdisosiasi dibandingkan
ikatan hidrogen pada adenin-timin. Denaturasi awal umumnya dilakukan pada
suhu 94oC selama 6 hingga 8 menit. Pada siklus berikutnya umumnya proses
denaturasi diperpendek menjadi 1 hingga 2 menit (Bartlett et al., 2015).

Gambar 2.6 Tiga tahapan utama dalam PCR (Bartlett et al., 2015)

Ketika DNA sampel telah terdenaturasi menjadi ssDNA, akan proses
annealing terjadi yaitu primer oligonukleotida menempel pada sekuen target
secara spesifik. Suhu annealing biasanya ditentukan melalui optimasi. Tahap
annealing biasanya berlangsung selama 1 hingga 2 menit. Setelah primer
menempel pada sekuen target, maka akan terjadi polimerisasi (pemanjangan)

23

untai DNA komplementer sehingga dihasilkan salinan sekuen DNA target atau
yang disebut sebagai amplikon. Proses polimerisasi tersebut merupakan tahapan
ekstensi. Tahapan tersebut ditentukan oleh dua faktor utama, yaitu suhu dan
panjang ekstensi. Faktor suhu berkaitan dengan aktivitas optimum DNA
polimerase dan panjang ekstensi ditentukan berdasarkan aktivitas DNA
polimerase dan panjang sekuen target. Secara umum, tahap ekstensi dilakukan
pada suhu 72oC dengan waktu 1 menit per kilo pasang basa (kpb) nukleotida.
Waktu ekstensi bersifat spesifik untuk tiap reaksi dan ditentukan melalui optimasi.
Dengan adanya pengulangan siklus PCR, maka jumlah amplikon yang akan
dihasilkan dari satu molekul DNA target dinyatakan dengan 2x, yang mana x
menyatakan jumlah siklus PCR yang dilakukan (Bartlett et al., 2015).
Untuk melaksanakan proses PCR, diperlukan beberapa komponen reaksi.
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA;
sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan
enzim DNA polimerase (Handoyo dan Rudiretna, 2001).

2.8 PCR-RFLP
PCR-RFLP merupakan salah satu varian teknik analisis PCR yang
didasarkan pada mekanisme pemotongan DNA secara spesifik oleh enzim
restriksi endonuklease. Suatu enzim restriksi endonuklease memiliki situs
pemotongan yang spesifik. Adanya polimorfisme pada untaian DNA akan

24

menyebabkan perubahan pada situs pengenalan enzim restriksi, sehingga ketika
DNA yang mengalami polimorfisme didigesti dengan enzim restriksi tertentu
akan menghasilkan fragmen DNA yang berbeda dibandingkan fragmen DNA
normal (Leonard, 2007). Analisis produk PCR dengan enzim restriksi dapat
dilakukan untuk identifikasi adanya polimorfisme DNA antarindividu dan untuk
deteksi mutasi pada amplikon (Walker dan Rapley, 2005).
Apabila terjadi mutasi pada DNA dan mutasi tersebut menyebabkan adanya
perubahan situs pengen

Dokumen baru

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

110 3491 16

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

39 891 43

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

39 805 23

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

18 526 24

PENGARUH PENERAPAN MODEL DISKUSI TERHADAP KEMAMPUAN TES LISAN SISWA PADA MATA PELAJARAN ALQUR’AN HADIS DI MADRASAH TSANAWIYAH NEGERI TUNGGANGRI KALIDAWIR TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

26 677 23

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

57 1176 14

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

60 1068 50

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

19 672 17

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

28 948 30

KREATIVITAS GURU DALAM MENGGUNAKAN SUMBER BELAJAR UNTUK MENINGKATKAN KUALITAS PEMBELAJARAN PENDIDIKAN AGAMA ISLAM DI SMPN 2 NGANTRU TULUNGAGUNG Institutional Repository of IAIN Tulungagung

39 1165 23