POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7: STUDI IN VITRO DAN IN SILICO SKRIPSI

POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI

STUDI

IN VITRO DAN IN SILICO

SKRIPSI

Untuk memenuhi sebagian persyaratan Mencapai derajat sarjana S-1

Diajukan Oleh:

Latifah

1008010102

Fakultas Farmasi

Universitas Muhammadiyah Purwokerto

Purwokerto

2014

iii

INTISARI

LATIFAH. Potensi Citrulline Sebagai Agen Kokemoterapi Doxorubicin Pada Sel Kanker Payudara MCF-7: Studi In Vitro dan In Silico Dibawah bimbingan NUNUK ARIES NURULITA dan ASMIYENTI DJALIASRIN DJALIL

Latar Belakang: Doxorubicin adalah agen kemoterapi kanker payudara pilihan

pertama yang masih banyak digunakan. Namun doxorubicin dapat menimbulkan efek toksik terhadap sel normal tubuh berupa kardiotoksis. Doxorubicin dapat menghambat endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) yang menyebabkan produksi Nitric oxide (NO) berkurang. Sehingga terjadi vasokontriksi dan toksik pada jantung.

Citrulline adalah asam amino non esensial yang merupakan hasil metabolisme

– arginine. Penambahan citrulline secara eksogen daengan bantuan L arginosuccinate dapat mengubah citrulline menjadi arginine yang diindikasikan dapat memproduksi NO dengan bantuan NOS. Sehingga terjadi relaksasi otot polos.

Tujuan penelitian: Untuk menentukan potensi sitotoksik antara citrulline tunggal

dan kombinasi yang dikombinasikan dengan doxorubicin terhadap sel kanker payudara MCF-7 serta mengetahui interaksi antara citrulline dengan arginase secara

in silico.

Metode Penelitian: Uji sitotoksik dilakukan menggunakan metode MTT.

Konsentrasi larutan citrulline yang digunakan untuk sitotoksik tunggal adalah 5, 20, 25, 50, 75, 100 µM dan 25, 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 nM. Sedangkan konsentrasi kombinasi yang digunakan adalah 50, 100, 250, dan 500 nM untuk

citrulline dan doxorubicin dengan masa inkubasi 24 jam. Pengamatan apoptosis

dilakukan dengan metode double staining. Sedangkan uji docking dilakukan dengan metode PLANTS.

Hasil: IC citrulline dan doxorubicin masing

– masing adalah 744.243 nM dan .

2375.688 nM Kombinasi doxorubicin dan citruline tidak menimbulkan efek sitotoksik. Uji apoptosis menunjukkan adanya induksi kematian sel secara apoptosis. Uji docking dilakukan dengan metode PLANTS dan diperoleh hasil berupa best score.

Best score menyatakan energi interaksi. Energi interaksi protein arginase dengan ligan dan citrulline dengan masing-masing adalah -19,997 dan -17,5506.

Kesimpulan: Citrulline memiliki efek sitotoksik pada sel kanker payudara MCF-7

pada penggunaan tunggal namun tidak pada kombinasi. Ikatan citrulline dengan protein arginase tidak lebih kuat dibandingkan dengan ligannya.

Kata kunci : citrulline, arginase, sel MCF-7, docking, PLANTS v

ABSTRACT LATIFAH. Cytotoxicity Potential of Citrulline as a co-Chemotherapy Agent in Breast Cancer Cell MCF-7: In vitro and In silico studies Under direction NUNUK ARIES NURULITA and ASMIYENTI DJALIASRIN DJALIL.

Background: Doxorubicin is a first line chemotherapy agent that used widely in the world. Doxorubicin has toxic effect in cell normal. Doxorubicin can inhibit endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) that can reduce production of Nitric Oxide (NO) caused vasoconstriction. Citrulline is a non essential amino acid and product of arginine. Exogenous citrulline with L-arginosuccinate change citrulline to arginine that indicated produce NO caused smooth muscle relaxation.

Objective: This research was aimed to determine the cytotoxic potential of citrulline

and combination with doxorubicin in breast cancer MCF-7 and also showed

interaction of citrulline and arginase by in silico study.

Methods: Cytotoxic effect by using MTT method Concentrastiom of citrulline use two series. First series are 5, 20, 25, 50, 75, 100 µM and second series are 25, 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 nM. Concentration combination of citrulline and doxorubicin use 50, 100, 250, dan 500 nM with an incubation period of 24 hours.

A .

poptosis effect by using double staining method While docking test was conducted

. using PLANTS Results: IC citrulline and doxorubicin, respectively 744.243 nM 2375.688 nM.

50 Combination of citrulline and doxorubicin did not showed cytotoxic effect. Test

showed apoptosis induction of apoptotic cell death. Docking test was conducted using PLANTS and resulted in the best score obtained. Best score interaction energy states. Interaction the energy of arginase with ligand and citrulline, respectively - 19,9997 and -17,5506.

Conclusion: Single citrulline has cytotoxic effects better than combination in breast

-7 cancer cells MCF and citrulline ties with arginase is not stronger than the ligand.

Key word : citrulline, arginase, sel MCF-7, docking, PLANTS

vi MOTTO Tujuan hidup adalah menjalani hidup dengan tujuan

vii

PERSEMBAHAN

Alhamdulillah, Maha suci Allah yang telah melimpahkan ridha dan karuniaNya yang tiada henti dan terima kasih kepada semua yang telah membantu dan membimbingku hingga mencapai tahap ini. Skripsi ini kupersembahkan untuk kalian semua yang menyayangiku.

Alm. Ayah dan Ibu tercinta, yang selalu menginspirasiku, memberikan doa, dukungan semangat dan tak pernah lelah memberikan nasehat padaku.
Adik – adikku tersayang Dzulkifli dan Dzakiyyah yang selalu memberikan semangat dan dukungan.
Agung Pratama terima kasih telah mengajariku banyak hal. Terima kasih untuk segalanya.
Sahabat-sahabatku, Anis, Via, Tantri, wening, Mutia, dan Prita terima kasih selalu menghibur dan mememaniku selama ini.
Teman-teman seperjuangan di kampus, Ayu, Dwi, Dewi, Novi, Wulan,

Richam tetap semangat ya. Terima kasih atas tawa, canda, tangis, harapan yang telah kalian berikan selama ini. viii

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat, hidayah serta inayahNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian (skripsi) yang berjudul “POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI

DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7: STUDI IN VITRO

DAN IN SILICO ”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh gelar S1 di fakultas farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Oleh karena itu pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Rektor Universitas Muhammadiyah Purwokerto

2. Dr. Nunuk Aries Nurulita, M.Si.,Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi dan dosen pembimbing I, yang telah memberikan bimbingan, arahan dan petunjuk dalam penyusunan skripsi ini dengan penuh kesabaran, ketekunan, sehingga dapat diselesaikan dengan baik.

3. Dr. Asmiyenti Djaliasrin Djalil, M.Si. selaku dosen pembimbing II, yang telah memberikan petunjuk dan motivasi yang tinggi, sehingga penyusunan skripsi ini dapat terlaksana hingga selesai.

4. Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini.

5. Prof. dr. H. Supargiyono, DTMH. S.U., Ph.D., Sp.ParK. yang telah memberikan perkuliahan mengenai kultur sel kepada penulis sehingga penulis dapat memahami tentang penelitian ini lebih dari sebelumnya.

6. Ibu Rumbiwati yang telah membimbing dan membantu jalannya penelitian ini.

7. Kedua orang tuaku tercinta yang telah memberikan dukungan moral, material dan spiritual. ix

8. Siti Komerawati dan Agustina Olivia Nezar yang telah berjuang bersama, terima kasih atas kerjasama, kesabaran serta suka dukanya selama penelitian berlangsung.

9. Teman-teman seperjuangan Fakultas Farmasi Kelas B angkatan 2010 (Ayu, Dewi, Dwi, Novi, Wulan, Richam), terima kasih atas kekompakan dan kebersamaannya selama ini.

10. Kekasihku Agung Pratama dan sahabat

– sahabatku Mutia, Anis, Via, Tantri, Wening, dan Prita terima kasih atas dukungan dan do’a serta waktu yang selama ini telah diberikan.

11. Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat saya sebutkan satu- persatu.

Penulis telah berusaha semaksimal mungkin agar penyusunan skripsi ini dapat tersusun dengan sempurna, namun penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak penyusunan skripsi ini tidak akan berjalan baik. Dengan segala kerendahan hati dan lapang dada, penulis menerima kritik dan saran yang membangun dari para pembaca untuk kesempurnaan di masa datang.

Purwokerto, Maret 2014 Penulis x

RIWAYAT HIDUP

Nama : Latifah Tempat, Tanggal Lahir : Jakarta, 13 Januari 1993 Nama Orang Tua:

a. Ayah : Alm. Ismail

b. Ibu : Lulis Praptiwi Riwayat Pendidikan

a. : SD Negeri 05 Semper Timur tahun 1998 - 2004 Sekolah Dasar b.

Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 8 Purwokerto tahun 2004 – 2007

– 2010

c. : SMA Negeri 2 Purwokerto tahun 2007 Sekolah Menengah Atas

d. : Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Perguruan Tinggi

Purwokerto xi

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN ............................................................................. ii HALAMAN PENGESAHAN .............................................................................. iiI SURAT PERNYATAAN ..................................................................................... iv

INTISARI .............................................................................................................. v ABSTRACT ......................................................................................................... vi MOTTO ............................................................................................................... vii PERSEMBAHAN ................................................................................................ viii PRAKATA ........................................................................................................... ix RIWAYAT HIDUP ............................................................................................... xi DAFTAR ISI ........................................................................................................ xii DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv DAFTAR GAMBA R ................................................................................................... xv

............................................................................................. xvi

DAFTAR SINGKATAN DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................... xvii

BAB I PENDAHULUAN

Latar Belakang ............................................................................... 1
Perumusan Masalah ....................................................................... 2
Tujuan Penelitian ........................................................................... 3
Manfaat Penelitian ......................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Kanker Payudara ............................................................................ 4
Sel MCF-7 ...................................................................................... 6
Kokemoterapi ................................................................................. 6
Doxorubicin .................................................................................... 7
Ctrulline ......................................................................................... 9
Arginase…………………………………………………………... 12 xii

Metode Docking .............................................................................. 12

BAB III METODE PENELITIAN

Jenis dan Rancangan Penelitian ..................................................... 14
Variabel Penelitian .......................................................................... 14
Definisi Variabel Operasional ........................................................ 14
Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 15
Bahan dan Alat ...............................................................................>Bahan ........................................................................................ 15
Bahan Utama ....................................................................... 15
Agen Kemoterapi ................................................................ 15
Sel MCF-7 cell line ............................................................. 15
Bahan Uji Sitotoksisitas ...................................................... 16
Bahan Uji Apoptosis ........................................................... 16
Bahan Docking Molecular ..................................................>Alat ............................................................................................ 17
Cara Penelitian ...............................................................................
Pembuatan Larutan Uji ............................................................. 17
Uji Sitotoksisitas Citrulline dan Doxorubicin Tunggal dengan

Metode MTT ............................................................................. 17

Uji Sitotoksisitas Kombinasi Doxorubicin dan Citrulline……. 18
Uji Apoptosis Tunggal dan Kombinasi ..................................... 18
Docking .....................................................................................
Analisis Hasil ................................................................................. 19
Uji Sitotoksisitas ....................................................................... 19
Analisis Apoptosis .................................................................... 19
Analisis Docking ....................................................................... 19

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

Potensi Sitotoksik Citrulline dan Doxorubicin Tunggal ................ 21 xiii

Potensi Sitotoksik Kombinasi Citrulline dan Doxorubicin ............. 27
Potensi Apoptosis Citrulline dan Doxorubicin ............................... 29
Docking Molekuler .......................................................................... 31

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan .................................................................................... 35
Saran ............................................................................................... 35 DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Persen viabilitas citrulline terhadap MCF-7 ....................................... 23 Tabel 2. Persen viabilitas doxorubicin terhadap MCF-7 .................................. 23 Tabel 3. Persen viabilitas citrulline terhadap MCF-7 ....................................... 26 Tabel 4. Persen viabilitas sel MCF-7 yang diberi perlakuan citrulline dan

doxorubicin ........................................................................................ 28

Tabel 5. Skor docking terhadap protein 4IXV .................................................. 34 v

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi MCF-7 di bawah mikroskop .........................................

6 Gambar 2. Struktur doxorubicin .......................................................................

7 Gambar 3. Struktur kimia citrulline ..................................................................

9 Gambar 4. Perkiraan skema siklus regulasi L

– citrulline / L- arginine .......... 11

Gambar 5. Struktur arginase (4IXV) ................................................................ 16 Gambar 6. Struktur native ligan (Beta-mercaptoethanol ) ............................... 17 Gambar 7. Reduksi MTT di dalam sel hidup oleh enzim reduktase di dalam mitokondria menghasilkan kristal formazan ................................... 21 Gambar 8. Morfologi sel MCF-7 diamati di mikroskop cahaya ...................... 23 Gambar 9. Perbandingan morfologi sel MCF-7 yang digunakan dengan

ATCC.. ............................................................................................ 25 Gambar 10. Hubungan % viabilitas dengan konsentrasi doxorubicin dengan

citrulline tunggal.. ........................................................................... 27

Gambar 11. Morfologi sel MCF-7 setelah perlakuan kombinasi doxorubicin dan citrulline ................................................................................... 28 Gambar 12. Hubungan % viabilitas dengan konsentrasi doxorubicin tunggal dan kombinasi doxorubicin.. ........................................................... 28 Gambar 13. Efek perlakuan kombinasi doxorubicin

– citrulline terhadap
– penghambatan pertumbuhan sel MCF-7 pada konsentrasi 50 nM 500 nM.. .......................................................................................... 29

Gambar 14. Morfologi sel akibat perlakuan citrulline dan doxorubicin setelah pengecatan dengan menggunakan double staining.. ....................... 31 Gambar 15. Visualisasi protein 4IXV menggunakan aplikasi YASARA. ........ 33 Gambar 16. Visualisasi ligan BME menggunakan aplikasi YASARA .............. 33 Gambar 17. Hasil RMSD BME .......................................................................... 34 xvi

DAFTAR SINGKATAN

FBS (Fetal Bovine Serum) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MTT {(3-(4,5-dimethylthyazoyl-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) PBS (Phosphate Buffered Saline) DMEM (

Dulbecco’s Modified Ecgle Medium)

SDS (Sodium Duodecyl Sulphate) NOS (Nitric Oxide Synthase) nNOS (neural Nitric Oxide Synthase) eNOS (endhothelial Nitric Oxide Synthase) iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) NO (Nitric Oxide) BME (Beta-mercaptoethanol) xvii

POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7: STUDI IN VITRO DAN IN SILICO SKRIPSI