Hubungan Polimorfisme Gen Matriks Metaloproteinase-12 Dengan Kejadian Penyakit Paru Obstruktif Kronik Dibandingkan Dengan Non Penyakit Paru Obstruktif Kronik Chapter III V

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian
Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian analitik dengan menggunakan
desain case-control.

3.2 Tempat Penelitian
Amplifikasi DNA dan digesti enzim restriksi dilaksanakan di Laboratorium
Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.3 Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai April 2015 sampai bulan Juli 2016.

3.4 Populasi Penelitian
Penderita PPOK dan non PPOK.

3.5 Sampel Penelitian
Sampel berasal dari penelitian Dr.dr. Amira Permatasari Tarigan, Sp.P dalam
bentuk isolat DNA sebesar 30 sampel PPOK dan 30 sampel non PPOK.

3.6 Variabel Penelitian
Variabel Bebas: Polimorfisme gen MMP-12
Variabel Tergantung: Penyakit Paru Obstruktif Kronik.

Universitas Sumatera Utara

3.7 Besar Sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jenis penelitian case-control:
2
Zα√2PQ+Zβ√P1Q1+P2Q2
n1 = n2 =
(P1-P2)
dimana: P1

= 0,23 (frekuensi penderita PPOK (0,23%) (Li et al., 2012).

P2

= 0,50 (perkiraan proporsi trial)

P

= ½ (P1+P2)

Q

= 0,64 (1- P)

Q1

= 0,79 (1- P1)

Q2

= 0,50 (1- P2)

Zα

= 1,96 (Nilai standar normal deviasi untuk α)

Zβ

= 0,84 (Nilai standar normal deviasi untuk β)

n1 = n2 = 30.
Besar sampel yang telah memenuhi syarat untuk penderita PPOK (kasus) adalah
30 dan non PPOK (kontrol) adalah 30.

3.8 Kriteria Inklusi dan Eksklusi
Kriteria sampel penelitian kelompok kasus dan kontrol adalah kriteria untuk
bahan biologi tersimpan yang berada di Laboratorium Terpadu FK USU yang
merupakan sampel penelitian Dr. dr. Amira Permatasari Tarigan, Sp.P

Universitas Sumatera Utara

* Untuk PPOK Kriteria Inklusi:
1. Penderita PPOK yang sudah dipastikan dengan hasil pemeriksaan spirometri:
VEP1/KVP≤70%, 15 menit setelah diberikan salbutamol Inhaler dosis terukur
dua semprot dengan alat bantu (spacer), derajat menurut GOLD : ringan-sangat
berat.

2. Umur penderita ≥ 40 tahun
3. Laki-laki
4. Perokok aktif atau mantan perokok dengan riwayat merokok ≥ 200 Indeks
Brinkman
5. Bersedia mengikuti prosedur penelitian dan diambil sampel darahnya,
dinyatakan secara tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian.
Kriteria Eksklusi:
1. Penderita asma, TB paru atau penyakit paru lainnya
2. Keadaan umum penderita dalam keadaan lemah (kaheksia)
3. Terdapat kesulitan dalam pengambilan darah

* Untuk non PPOK Kriteria Inklusi :
1.

Normal faal paru yang sudah dipastikan dengan hasil pemeriksaan spirometri:
VEP1/KVP ≥ 70%

2.

Umur penderita ≥ 40 tahun

3.

Laki-laki

4.

Perokok aktif atau mantan perokok dengan riwayat merokok ≥ 200 Indeks
Brinkman

Universitas Sumatera Utara

5.

Bersedia mengikuti prosedur penelitian dan diambil sampel darahnya,
dinyatakan secara tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian.

Kriteria Eksklusi :
1.

Penderita penyakit paru seperti TB, Bronkitis kronik atau penyakit paru lain.

2.

Keadaan umum penderita dalam keadaan lemah (kaheksia)

3.

Terdapat kesulitan dalam pengambilan darah

4.

Mempunyai keluarga yang berpenyakit PPOK

3.9 Definisi Operasional
No.

1.

Variabel

Definisi Operasional

Polimorfisme Gen

Kriteria:

MMP-12

dalam

perbedaan
lokus

yang

Cara

Alat

Skala

Hasil

Ukur

Ukur

Ukur

Ukur

alel

Analisa

UV

Nominal

homozigot

sama

Elektro

Reader

AA, GG dan

dengan gen MMP-12

heterozigot
foresis
AG
gel
agarosa

2.

PPOK

Sudah

ditetapkan

-

-

Nominal

-

-

-

Nominal

-

sebelumnya oleh ahli paru
3.

Non-PPOK

Sudah

ditetapkan

sebelumnya oleh ahliparu

Universitas Sumatera Utara

1.10. Pelaksanaan Penelitian
3.10.1 Isolasi DNA
Alat dan bahan :
1. Sarung tangan
2. Pipet automatic 1000µl, 100µl
3. Tabung ependorf 1,5ml
4. Sentrifus
5. Vortex
6. Tips steril berbagai ukuran
7. Stopwatch
8. Kulkas
9. Kertas label
10. Pena tahan air
11. Kit ekstraksi DNA [the Wizard® Genomic DNA Purification Kit, (Promega
Corporation USA)].

Cara Kerja :
1. Label dan kode tabung ependorf untuk sampel darah
2. Darah EDTA disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit
3. Pisahkan plasmanya, lalu ambil 300µl leukosit dan masukkan kedalam tabung
ependorf 1,5ml kemudian ditambah 900µl EL bufer dan campur dengan cara
dibolak-balik secara perlahan
4. Inkubasi selama 10 menit didalam kulkas lalu disentrifus pada kecepatan 13.000
rpm selama 3 menit

Universitas Sumatera Utara

5. Buang supernatan dengan hati-hati agar endapan tidak ikut terbuang dan tahapan
2-4 diulang sampai 3x dan terlihat warna supernatan menjadi jernih dan endapan
berwarna putih
6. Setelah diperoleh endapan yang berwarna putih atau supernatan yang jernih,
buang supernatan dan endapan divortex selama 20 detik
7. Tambahkan 300µl nuclei lysis solution dan campurkan dengan cara dibolakbalik
8. Tambahkan 100µl protein precipitation, dan vortex selama 20 detik
9. Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit
10. Pindahkan supernatan kedalam tabung ependorf yang berisi 300µl isopropanol,
lalu dibolak-balik sampai terlihat benang-benang DNA
11. Campuran disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit
12. Buang supernatan dan tambahkan larutan etanol 70%
13. Sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit
14. Setelah proses sentrifugasi selesai, etanol diaspirasikan menggunakan pipet dan
dikeringkan selama 1 jam
15. Setelah kering, tambahkan 100µL DNA rehidration solution dan inkubasi pada
suhu 4oC selama 1 malam. DNA dapat disimpan di freezer pada suhu -20oC
sampai proses PCR-RFLP dilaksanakan.

Universitas Sumatera Utara

3.10.2 Amplifikasi isolat DNA dengan Polymerase Chain Reaction
Alat dan Bahan :
1. Mesin PCR/Thermal Cycler
2. Mikropipet
3. Tabung PCR
4. Tabung ependorf 1,5 ml
5. Tip steril berrbagai ukuran
6. Mesin sentrifugasi
7. PCR mix (Go Taq® Green Master Mix (Promega USA)]
8. Sampel DNA
9. Primer forward MMP-12: 5’GTCAAGGGATGATATCAGCT-3’
10. Primer reverse MMP-12: 5’CTTCTAAACGGATCAATTCAG-3’
11. Kertas label dan pena

Cara Kerja :
1. Label tabung PCR sesuai dengan kode nomor sampel
2. Buat campuran master mix untuk reaksi PCR dengan total volume 21µl untuk
setiap sampel DNA yang terdiri dari 12,5µl master mix, 1µl masing-masing
primer forward dan reverse, dan 6,5 µl nuclease free water
3. Tambahkan 4µl isolat DNA sampel pada campuran master mix dan masukkan ke
dalam mesin PCR (thermal cycler)
4. MMP-12 pada sampel DNA diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR
(thermal cycler) dengan suhu pre-denaturasi 95oC selama 5 menit, diikuti 28
siklus denaturasi pada suhu 94oCselama 45 detik, annealing pada suhu 53oC

Universitas Sumatera Utara

selama 30 detik, dan elongasi pada suhu 72oC selama 45 detik, dan tahap akhir
pada suhu 72o C selama 10 menit (Li et al., 2012)
5. Hasil elektroforesis pada agarose 2% akan terlihat fragmen DNA sebesar 137
bp (Li et al.,2012)

3.10.3 Digesti amplifikat DNA dengan Enzim Restriksi
Alat dan Bahan :
1. Enzim Restriksi Pvu II (Thermoscientific®)
2. Buffer G
3. Nuclease Free Water
4. Produk PCR
5. Tabung ependorf 1,5ml
6. Mikropipet
7. Inkubator
8. Stopwatch
9. Kertas label dan pena tahan air

Cara Kerja :
1. Label tabung ependorf 1,5 ml sesuai kode nomor sampel
2. Buat campuran reaksi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
dengan total volume 10µl untuk setiap sampel yang terdiri dari 2,5µl produk
PCR, 0,3µl enzim Pvu II, 1,5µl Buffer G dan 6,2µl nuclease free water
3. Inkubasi selam 1 jam pada suhu 37oC didalam inkubator

Universitas Sumatera Utara

4. Dilakukan elektroforesis pada agarose 2% maka akan terlihat 2 band pada
homozigot AA (137bp, 119bp), 3 band pada heterozigot AG (137bp, 119bp,
18bp) dan 2 band pada homozigot GG (119bp, 18bp) (Li et al.,2012)

3.10.4 Visualisasi Hasil Restriksi dengan Elektroforesa Gel Agarosa
Alat dan Bahan :
1. Top Vision Agarosa 100 g(Thermo scientific®)
2. TAE Buffer 1 x
3. Flask Beaker 250 ml
4. Magnetic Hot Stirrer
5. Timbangan Digital
6. Ethidium Bromide
7. Aluminium Foil
8. Gel Casting Tray
9. Gel Comb
10. Gel Documentation
11. Loading Dye dan Marker DNA

Cara Kerja :
1. Untuk membuat gel, timbang 0,7g agarosa dalam 35 ml TAE Buffer (Li et al.,
2012). Panaskan dan aduk diatas magnetic hot stirrer hingga larutan mendidih
dan berwarna jernih.
2. Matikan pemanasnya dan ditambahkan 1µl ethidium bromide dan diaduk
kembali

Universitas Sumatera Utara

3. Cairan dituang ke dalam casting tray dengan gel comb dan biarkan sampai
mengeras
4. Setelah gel mengeras cabut gel comb perlahan-lahan
5. Pipet loading dye 2µl dan marker DNA 5µl, 3µl produk PCR dan produk RFLP
masing-masing 10µl ke dalam sumur-sumur gel
6. Catat posisi sampel pada sumur-sumur gel
7. Jalankan elektroforesis selama 60 menit dengan tegangan 80 volt
8. Pindahkan gel ke dalam gel documentation untuk analisa dan dokumentasi hasil
elektroforesis

3.11 Kerangka Operasional
DNA pasien dan kontrol yang sudah ada

Non-PPOK
n=30

PPOK
n=30
Genotyping
dengan PCR

RFLP
Polimorfisme

Homozigot
AA

Homozigot

Heterozigot

GG

AG

Universitas Sumatera Utara

3.12 Analisa Data
Data akan dianalisa secara statistik dengan menggunakan SPSS. Distribusi
genotip dan frekuensi alel yang akan diuji signifikansinya dengan menggunakan chisquare test (x2), sedangkan distribusi genotip dan frekuensi alel individu dengan
kejadian PPOK akan dianalisa menggunakan analisis Hardy Weinberg Equilibrium
(HWE). Hasil analisa dikatakan signifikan jika nilai p0,05) seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.1

Tabel 4.1 Hubungan Antara Polimorfisme Gen MMP-12 dengan Kejadian PPOK
PPOK

TOTAL

NONPPOK

POLIMORFISME

Nilai p*
n

%

n

%

n

%

AG

2

6.7%

1

3.3%

3

5.0%

AA

28

93.3%

29

96.7%

57

95.0%

GG

0

0

0

0

0

0

30

100.0%

30

100.0%

60

100.0%

TOTAL

0.5

*Significant with Fisher exact test

Universitas Sumatera Utara

Tabel 4.2 Analisa Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium dengan menggunakan
HWE calculator pada penderita PPOK
Genotypes

AA

AG

GG

Observed

28

2

0

Expected

28.03

1.93

0.03

H-W Freq

(93.44%)

(6.44%)

(0.11%)

Compute Exp. HW Equilibrium
Freq.
& Chi2P-Value
Clear Form Values

P-Value =0.8502
Allele
Frequencies

AA = 58

AG = 2

(96.67%)

(3.33%)

Tabel 4.3 Analisa Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium dengan menggunakan
HWE calculator pada penderita non PPOK
Genotypes

AA

AG

GG

Observed

29

1

0

Expected

29.01

0.98

0.01

Compute Exp. HW Equilibrium
Freq.
& Chi2P-Value

H-W Freq

(96.69%)

(3.28%)

(0.03%)
Clear Form Values

P-Value =0.926
Allele
Frequencies

AA = 59

AG = 1

(98.33%)

(1.67%)

Berdasarkan analisa dengan menggunakan HWE calculator pada penderita
PPOK dan non PPOK, total HW freq keduanya berjumlah 100% yang artinya penelitian

Universitas Sumatera Utara

ini tidak menyimpang dari Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium. Berdasarkan analisa
HWE tidak terdapat hubungan yang signifikan pada frekuensi gen MMP-12 yang
dinyatakan dengan nilai p≥0,05 (seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.2 dan 4.3) yang
berarti bahwa populasi yang diteliti sesuai dengan HWE.

4.2 Pembahasan
Pada hasil penelitian ini polimorfisme gen MMP-12 -82 A/G tidak berperan secara
signifikan dalam menentukan seseorang terkena PPOK atau non PPOK. Penelitian ini
menunjukkan hasil yang tidak signifikan (nilai p=0,5). Hal ini sejalan dengan penelitian
Li et al (2012) yang menemukan pada populasi di Cina Han dengan nilai p=0,537 yang
berarti bahwa hasil yang diperoleh juga tidak signifikan (p>0,05).
Sejalan dengan penelitian Schirmer et al (2009) pada populasi Brazilia (p=0,11)
dan Zhou et al (2013) pada populasi Kaukasia (p=0,877) juga mendapatkan hasil yang
tidak signifikan (p>0,05) yang artinya tidak menemukan hubungan antara MMP-12
dengan kejadian PPOK.
Karakteristik sampel (PPOK dan non PPOK) pada penelitian ini adalah populasi
seluruh orang Indonesia dengan berbagai macam suku. Karakteristik pada penelitian Li
et al (2012) adalah populasi orang Cina suku Han dengan kebudayaannya. Kelompok
suku Han ini merupakan salah satu suku yang ada pada bangsa Cina.
Karakteristik sampel pada penelitian Schirmer et al (2009) adalah populasi
orang Brazilia dari Pusat Rehabilitasi Paru dan Rumah Sakit Umum Brazil.
Karakteristik pada penelitian Zhou et al (2013) adalah populasi orang Kaukasia.
Hal yang sebaliknya ditemukan oleh Hunninghake et al (2009) pada populasi
dengan tingkat resiko yang tinggi (p=0,07) menemukan polimorfisme gen MMP-12 -

Universitas Sumatera Utara

82A/G adalah faktor resiko PPOK. Haq et al (2010) pada populasi Eropa (p=0,03)
menemukan bahwa alel AG pada Polimorfisme Nukleotida Tunggal (SNP) positif
berhubungan dengan perokok dewasa sebagai faktor penyebab PPOK.
Karakteristik sampel pada penelitian Hunninghake et al (2009) pada populasi
dengan tingkat resiko tinggi PPOK, yaitu dari Pusat Penelitian Genetik Asma Kosta
Rika (GACRS), Program Managemen Asma pada Anak (CAMP), Pusat Penelitian
PPOK Boston (BAMSE), Pusat Pemulihan Nasional Emfisema (NETT), Studi Kohort
pada Perokok Lovelace, dan Penelitian PPOK berdasarkan Usia Normatif (NAS).
Karakteristik sampel pada penelitian Haq et al (2010) adalah populasi Eropa
secara keseluruhan (Kaukasia berkulit putih) meliputi Barselona (Spanyol), Bristol
(Inggris), Dublin (Irlandia), Edinburgh (Inggris), Leiden (Belanda) dan Pisa (Italia).
Pada hasil penelitian ini tidak tampak band 18bp dari homozigot GG. Hal ini
dikarenakan berat molekulnya sebesar 18bp sangat kecil dan juga kecepatan
elektroforesisnya sangat tinggi dalam gel agarosa sehingga tidak ditemukan (Li et al.,
2012).
Isolat DNA tersimpan yang digunakan pada penelitian ini tidak dilakukan
pengukuran kalibrasinya. Bahan biologi tersimpan ini masih dalam keadaan yang cukup
baik, dibuktikan dari hasil amplifikasi isolat DNA pengukuran PCR dan RFLP pada
analisa elektroforesa gel agarosa 2% tampak band pada 137bp dan 119 bp.
MMP-12

merupakan

famili

endopeptidase

dalam

golongan

makrofag

metaloelastase yang memiliki kemampuan untuk memecah dinding matriks ektraselular
(ECM). Gen MMP-12 ini adalah regulator yang penting dari degradasi jaringan ikat dan
oleh karena itu berhubungan langsung dalam remodeling jaringan. MMP-12 juga
mendegradasi ECM menjadi kolagen, elastin, proteoglikan, laminin dan fibronektin.

Universitas Sumatera Utara

Peningkatan aktivitas MMP-12 berhubungan dengan penghancuran dan remodeling dari
matriks ekstraselular, seperti invasi tumor, penyakit peridontal, reumatoid artritis, dan
penyakit vaskular (obstruktif kronik) (Haq et al., 2010).
Polimorfisme MMP-12 -82A/G dalam area promotor telah terbukti memiliki
efek pada ekspresi MMP-12. Pembawa alel A pada gen MMP-12 memiliki aktivitas
transkripsi yang lebih tinggi dari pembawa alel G (Schirmer et al., 2009). Polimorfisme
tersebut di area promotor dengan alel A akan mempengaruhi pengikatan faktor
transkripsi Aktivator Protein-1 (AP-1) yang berhubungan dengan peningkatan aktivitas
transkripsi (Wieczorek et al., 2013).
Vlaykova dan Dimov (2011) dan Nguyen et al (2013), menyatakan bahwa
substitusi alel A→G pada posisi -82 di area yang berdekatan dengan elemen AP-1
binding site dan itu menunjukkan bahwa polimorfisme mempengaruhi pengikatan faktor
transkripsi AP-1. Afinitas ikatan yang lebih tinggi dari AP-1 ke alel A berhubungan
dengan aktivitas promotor MMP-12 yang lebih tinggi pada sel makrofag. Polimorfisme
MMP-12 -82A/G telah diselidiki berhubungan dengan resiko terjadinya PPOK.
Nakamura, 2011 juga menemukan bahwa alel A berhubungan dengan penurunan
fungsi paru pada polimorfisme -82A/G. Hal tersebut juga berkaitan dengan
ketidakseimbangan protease-antiprotease dan stres oksidatif.
Hunninghake et al., 2009 menemukan bahwa alel minor dari Single Nucleotide
Polymorphism (SNP) di MMP-12 (-82A→G) positif berhubungan dengan penurunan
fungsi paru pada perokok dewasa sebagai faktor risiko pada PPOK.
Berdasarkan HWE pada penelitian ini berada dalam keseimbangan dengan
signifikansi nilai p HWE > 0,05. HWE menyatakan distribusi frekuensi alel dalam suatu
populasi selalu konstan yaitu berada dalam satu kesetimbangan. HWE berfungsi sebagai

Universitas Sumatera Utara

prediksi alel suatu populasi pada masa depan sehingga berkaitan pada penelitian yang
berhubungan dengan polimorfisme.
Terdapat beberapa jenis dari golongan gen MMP lain yang secara teori
berhubungan secara signifikan dengan kejadian PPOK, misalnya MMP-1 dan MMP-9.
Berdasarkan teori oksidan-antioksidan dan protease-antiprotease juga berhubungan
dengan patogenesis PPOK.
Berdasarkan temuan-temuan tersebut, telah diperoleh hasil yang berbeda yaitu
ada yang mendapatkan hasil positif dan berhubungan dengan kejadian PPOK (p0,05). Hal ini disebabkan pada
populasi Indonesia yang diteliti pada studi ini hanya ditemukan distribusi genotip
Homozigot AA dan Heterozigot AG sedangkan homozigot GG tidak ditemukan.
Berdasarkan hasil yang paradoks tersebut, tidak terdapat hubungan yang signifikan yang
dapat kita simpulkan.

Universitas Sumatera Utara

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian polimorfisme gen MMP-12 dengan menggunakan
sampel isolat DNA tersimpan penderita PPOK dan non PPOK dengan analisa statistik
dan beberapa pembahasan dapat disimpulkan bahwa:
1. Tidak terdapat hubungan antara polimorfisme gen MMP-12 dengan kejadian
PPOK dan non PPOK
2. Pada PPOK ditemukan distribusi genotip Homozigot AA berjumlah 28 dan
Heterozigot AG berjumlah 2
3. Pada non PPOK ditemukan distribusi genotip Homozigot AA berjumlah 29 dan
Heterozigot AG berjumlah 1
4. Isolat DNA tersimpan pada penelitian ini masih dalam kondisi cukup baik dan
masih bisa digunakan untuk penelitian selanjutnya
5. Untuk analisa elektroforesis hasil RFLP dengan enzim restriksi Pvu II lebih
baik menggunakan

agarose 4% untuk memaksimalkan visualisasi, karena

diantara band 137bp dan 119bp merupakan jarak yang tidak terlalu jauh.
6. Tidak ditemukan satupun alel GG pada distribusi genotip polimorfisme gen
MMP-12 baik pada PPOK maupun non PPOK

Universitas Sumatera Utara

5.2 Saran
1. Dilakukan penelitian lanjutan pada analisis polimorfisme gen MMP yang lain
untuk melihat hubungannya dengan kejadian PPOK
2. Dilakukan penelitian lanjutan untuk mencari polimorfisme PPOK dari faktor
yang lain seperti oksidan-antioksidan dan protease-antiprotease.

Universitas Sumatera Utara