Alat HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sebagai Alat Modern Dalam Kromatografi
This page was exported from - Karya Tulis Ilmiah
Export date: Sat Sep 2 22:41:55 2017 / +0000 GMT
Alat HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sebagai Alat Modern
Dalam Kromatografi
Suatu alat dan metode yang menggunakan hubungan HPLC ?CL telah dikembangkan untuk penentuan N, N dimethylaniline dan
phenol dalam air yang telah tercemar oleh limbah berdasarkan pada kekuatan chemiluminescense, kalsium sianida pada medium
yang bersifat alkali. Sebuah alat yang telah digunakan untuk penetapan N, N Dymethulaniline adalah dengan sebuah alat penemuan
ultraviolet, (HPLC/UVD). Ditemukan melalui sebuah pengujian kadar logam spektrophometer untuk penetapan N,
N-dimethulaniline berdasarkan kumurniannya. Bagaimanapun juga, phenol dan N, N dymethylaniline, terkadang terdapat pada air
secara bersamaan anatara N, N dymethylamiline dan phenol dan juga untuk penetapan N, N dymethylaniline.Dymethylaniline
(DMA) adalah sisa reaksi pada lanjutan membuat bahan celup. Dan juga seperti sebuah pelarut pada sifat alkali yang menggantikan
sebuah pengatur keseimbangan. Tetapi menunjukkan resiko besar bagi kesehatan karena saat ini air, udara, dan pasti antibiotik
(pelican dan cephalosporin) seperti pada kotoran yang tidak murni dan menghasilkan tenaga public. Parnafasan akut (jangka pendek)
menjadikan dimethylaniline memiliki hasil yang memiliki pengaruh pada pusat sistem syaraf peredaran darah dan gejala pusing,
cynosis dan kebingungan yang melanda manusia. Konferensi Pemerintah Amerika dan Industri Kesehatan mengumumkan batas
kecepatan dimethylaniline sudah diambang batas TLV (ACGIH TLV) hingga mencapai 5 ppm pada tahun 1994.Phenol adalah
material kimia yang sangat penting dalam memproduksi phenolic, tetapi itu dapat berpengaruh pada udara, tanah, dan air.
Konsentrasi yang sangat tinggi pada phenol dapat menyebabkan kematian jika dihirup berlebihan atau setelah diserap kulit. Sistem
penyerapan yang menyebabkan sawan, rusak hati, dan kerusakan ginjal, dalam pemeriksaan sehingga pengukuran yang berhubungan
yang dapat menyeleksi dan metode peka terhadap sensivitas dymethylaniline dan fenol.Karena sensivitas dan selektivitasnya yang
tinggi serta jarak yang bekerja berupa suatu garis lurus. Analisa dengan mengunakan alat HPLC-Cl telah menjadikan sebuah tehnik
yang menarik untuk analisi biomedical dan berhubungan dengan obat-obatan, tetapi bukan untuk menentukan sample yang
berhubungan dengan lingkungan. Pada umunya, analisis Cl yang diakibatkan oleh reaksi analit dengan reaksi Cl, atau
hambatan/kepekaan Cl denga hasil reaksi analit dan reagen Cl atau oksidan sebelumnya yang terlibat dalam reaksi Cl.Oleh sebab
banyaknya kerugian yang akan timbul apabila suatu perairan itu tercemar, maka alat HPLC sangatlah membantu untuk mengetahui
lebih dini apakah suatu perairan itu tercemar atau untuk mengantisipasi keburukan yang akan terjadi nantinya. Perkembangan alat
kromatografi sangatlah membatu dalam kehidupan dan kelangsungan hidup manusia.Hal yang menarik pada alat HPLC adalah
kecepatan, ketelitian dan kemampuannya memisah-misahkan suatu campuran yang kompleks. Campuran yang dapat
dipisah-pisahkan, meliputi molekul-molekul, senyawa-senyawa ionik, senyawa-senyawa yang tak stabil (yang jika diuapkan akan
mengalami peruraian) dan juga senyawa-senyawa dengan massa rumus besar. Termasuk contoh dari senyawa-senyawa tersebut
antara lain asam-asam amino, asam nukleat, hidrokarbon, karbohidrat, pestisida, steroid, antibiotik danjuga senyaqa-senyawa
anorganik. Dengan demikian, pemakaian alat HPLC dalam analisis dapat meliputi hampir semua bidang, seperti farmasi, kedoteran,
bioteknologi, biokimia, minyak bumi, pencearan air, dan sebagainya.Pada rangkaian alat HPLC, bagian alat yang memegang peran
yang sangat penting adalah kolom. Setalah sampel terpisah-pisah dan kelaur dari kolom, maka komponen sampel akan masuk ke
dalam suatu detektor. Detektor akan mengukur kadar masing-masing komponen yang responnya akan diolah oleh prosesor dan
ditampilkan oleh rekorder berupa suatu kromatogram. Detektor yang sudah dikembangkan antara lain Detektor UV (UV-Detector),
Detektor Fluoresensi (Fluoresence Detector), Detektor Indeks Bias (Refraktive Index Detector), Detektor Konduktivitas
(Conductivity Detector). Detektor yang digunakan disesuaikan denga senyawa/zat yang dianalisis.HPLC Merk Shimadzu seri
LC-6A merupakan HPLC yang memiliki komponen-komponen yang lengkap, dioperasikan dengan suatu sistem kontrol yang
mengendalikan semua komponen, pompa, oven kolom, sistem injeksi, detektor, prosessor dan printer. HPLC ini mempunyai injektor
yang dapat bekerja secara otomatis, dapat menginjeksikan sampel sampai 100 sampel secara otomatis. Jika semua parameter sudah
di set, solvent (phase gerak) sudah disiapkan cukup, alat ini dapat melakukan analisis sendiri, hasilnya akan muncul dalam
kromatogram termasuk perhitung luas masing-masing puncak kromatogram.Prinsip Kerja Prinsip kerja HPLC sebenarnya tidak
berbeda dengan prinsip-prinsip kromatografi yang lain, yaitu pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara melewatkan
sampel pada suatu kolom, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing komponen-komponen tersebut dengan
suatu detektor. Kerja detektor bermacam-macam, tetapi pada dasarnya membandingkan respon dari komponen sampel dengan
respon dari larutan standar. Dengan kata lain, penentuan kadar pada dasarnya adalah membandingkan respon sampel dengan respom
standar. Untuk analisis dengan HPLC diperlukan standar yang betul-betul murni, biasanya disebut HPLC grade. Untuk mendapatkan
hasil analisis yang tepat juga diperlukan phase gerak dengan kemurnian tinggi. Bagian-Bagian Alat HPLCPada dasarnya instrumen
HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder. 1. Tandon (Reservoir)
Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih. Reservoir yang baik disertai degessing system
Output as PDF file has been powered by [ Universal Post Manager ] plugin from www.ProfProjects.com
| Page 1/3 |
This page was exported from - Karya Tulis Ilmiah
Export date: Sat Sep 2 22:41:55 2017 / +0000 GMT
yang berfungsi untuk mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Gas terlarut tersebut antara lain oksigen. Degassing dilakukan dengan
mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu.
Debu dan partikulat yang terbawa oleh solvent dapat menyumbat kolom. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer
yang dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum. Untuk memperoleh pemisahan yang optimum dianjurkan
menggunakan solvent yang masih baru. 2. Pompa Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratan: a) Dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360
atm) b) Tekanan yang dihasilkan bebas pulsa. c) Dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit. d) Dapat
mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. e) Tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon). Ada
beberapa jenis pompa, antara lain : a. Reciprocating pump: Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang
bergerak maju mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi. b. Displacement Pump: Terdiri dari semacam alat
suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250 ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston. c. Pneumatic Pump:
Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas. Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi.
Sistim pemompaan ini dapat diatur secara manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase
gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua
atau lebih solvent. Kemudian langkah selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh
masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari
waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system. Pompa perlu
dirawat dengan baik, antara lain: a. Menggunakan solvent yang bebas debu/ partikulat. b. Pompa jangan dibiarkan kering, sehingga
tidak terjadi geseran yang bisa mengakibatkan kebocoran pompa. c. Bila dalam solvent terdapat garam-garam, maka setelah selesai
menggunakan alat ini, pompa harus dialiri air (aquadest) sampai bersih kemudian dibilas dengan methanol agar tidak terjadi
pengendapan garam dalam dinding pompa. d. Jangan menjalankan pompa dalam keadaan kering. 3. Katup Injector: Bagian ini
merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom. Ada beberapa sistem
injeksi: a. Syringe Injection; Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai 1500 psi. b.
Stop Flow Injection: Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke dalam ruang injeksi
(atau disebut mixing chamber, sementara itu aliran fase gerak dihentikan. Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali
dan sampel akan terbawa. c. Auto sampler (disebut juga Auto Injector) Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control
system. Sampel ditaruh dalam wadah seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot
secara otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak. Pada auto sampler ini dapat
dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan sistem HPLC akan bekerja sendiri melakukan analisis, termasuk mencuci sendiri sistem
injeksinya setelah melakukan injeksi. 4. Kolom (Column): a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran partikel isi kolom. Kolom
merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk
memisah-misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari stainless steel yang dibor halus atau dari gelas.
Untuk yang dibuat dari gelas pada umumnya kurang terhadap tekanan, hanya dipakai di bawah 600 psi dan di pasaran tersedia
bermacam-macam jenis kolom dari berbagai pabrik. Ukuran kolom antara 10 sampai 30 cm, berbentuk lurus, diameter dalam 4
sampai 10 mm dan ukuran partikel dalam kolom 5 sampai 10 um. Ada juga kolom dengan ukuran yang lebih kecil, panjang 3 sampai
7,5 cm; diameter dalam 1 sampai 4,6 mm, ukuran partikel 3 sampai 5 um. Dalam pemakaian yang berhati-hati, digunakan kolom
pengaman (grand column) yang dipasang sebelum kolom analitik. Kolom ini berisi packing yang sama dengan kolom analitik,
ukurannya kolom lebih pendek dengan partikel yang ukurannya lebih besar. Kolom ini akan menahan debu partikulat yang ikut
terelusi sehingga umur kolom analitik lebih panjang. Contoh perbandingan waktu dan hasil kolom panjang dan pendek untuk
campuran theobromine, theophyline, BHET, caffein yang menunjukkan bahwa kolom, pendek dapat memisahkan sampel hanya
dalam waktu 120 detik (2 menit), sedang kolom panjang perlu waktu 6 menit. Kolom analitik ada pula yang dapat diatur suhunya.
Sebenarnya yang diatur bukan kolomnya tetapi ruang dimana kolom ditempatkan. Ruang ini disebut column oven dan kolomnya
disebut thermostat column. Dengan cara seperti ini dapat diatur suhu kolom 1000 sampai 1500. b. Jenis Column Packing (Isi Kolom)
Ada dua jenis packing kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel porous dan partikel pelliculer. Isi
kolom yang berbentuk pellicular terdiri dari partikel berbentuk bola, non porous terbuat dari gelas atau polimer. Partikel ini dilapis
dengan suatu lapisan tipis yang porous dari silika, alumina atau penukar ion. Pelapisan dapat dilakukan dengan penambahan phase
diam yang akan ditahan oleh partikel secara absorbsi atau dengan jalan mereaksikan bagian permukaan partikel tersebut dengan
bahan organik tertentu. Dari reaksi ini dihasilkan suatu lapisan permukaan yang mempunyai sifat tertentu. Lapisan yang terbentuk
selanjutnya disebut phase terikat (bonded phase). Packing kolom yang berupa silika, permukaannya terdiri dari silika yang
dihidrolisis, baik dengan pemanas atau perendaman dalam HCL sehingga gugus silanol bersifat polar. Untuk mendapatkan
Output as PDF file has been powered by [ Universal Post Manager ] plugin from www.ProfProjects.com
| Page 2/3 |
This page was exported from - Karya Tulis Ilmiah
Export date: Sat Sep 2 22:41:55 2017 / +0000 GMT
permukaan dengan gugus yang sifatnya non polar dapat diikatkan siloxane. Ini diperoleh dengan menghidrolisis permukaan silika
dengan organochlorosilan.5. Detektor Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-pisah dan
keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu
detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis. a. Detektor UV Prinsip
kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati
kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh
sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini
sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa
digunakan adalah 254 nm. b. Detektor Fluoresensi Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV
yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar Fluoresensi
ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Detektor ini lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar
laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang
menghasilkan zat yang dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino. c. Detektor Indeks Refraksi
(Refraksi Index Detector = RID) Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua larutan
suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat. 6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu
tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat
menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya. Kelebihan dari alat HPLC adalah :? Mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.? Mudah melahsanakannya.? Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi.?
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis? Resolusi yang baik.? Dapat digunakan bermacan-macam
detektor.? Kolom dapat digunakan kembali.? Mudah melakukan ?sample recovery?.
Output as PDF file has been powered by [ Universal Post Manager ] plugin from www.ProfProjects.com
| Page 3/3 |
Export date: Sat Sep 2 22:41:55 2017 / +0000 GMT
Alat HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Sebagai Alat Modern
Dalam Kromatografi
Suatu alat dan metode yang menggunakan hubungan HPLC ?CL telah dikembangkan untuk penentuan N, N dimethylaniline dan
phenol dalam air yang telah tercemar oleh limbah berdasarkan pada kekuatan chemiluminescense, kalsium sianida pada medium
yang bersifat alkali. Sebuah alat yang telah digunakan untuk penetapan N, N Dymethulaniline adalah dengan sebuah alat penemuan
ultraviolet, (HPLC/UVD). Ditemukan melalui sebuah pengujian kadar logam spektrophometer untuk penetapan N,
N-dimethulaniline berdasarkan kumurniannya. Bagaimanapun juga, phenol dan N, N dymethylaniline, terkadang terdapat pada air
secara bersamaan anatara N, N dymethylamiline dan phenol dan juga untuk penetapan N, N dymethylaniline.Dymethylaniline
(DMA) adalah sisa reaksi pada lanjutan membuat bahan celup. Dan juga seperti sebuah pelarut pada sifat alkali yang menggantikan
sebuah pengatur keseimbangan. Tetapi menunjukkan resiko besar bagi kesehatan karena saat ini air, udara, dan pasti antibiotik
(pelican dan cephalosporin) seperti pada kotoran yang tidak murni dan menghasilkan tenaga public. Parnafasan akut (jangka pendek)
menjadikan dimethylaniline memiliki hasil yang memiliki pengaruh pada pusat sistem syaraf peredaran darah dan gejala pusing,
cynosis dan kebingungan yang melanda manusia. Konferensi Pemerintah Amerika dan Industri Kesehatan mengumumkan batas
kecepatan dimethylaniline sudah diambang batas TLV (ACGIH TLV) hingga mencapai 5 ppm pada tahun 1994.Phenol adalah
material kimia yang sangat penting dalam memproduksi phenolic, tetapi itu dapat berpengaruh pada udara, tanah, dan air.
Konsentrasi yang sangat tinggi pada phenol dapat menyebabkan kematian jika dihirup berlebihan atau setelah diserap kulit. Sistem
penyerapan yang menyebabkan sawan, rusak hati, dan kerusakan ginjal, dalam pemeriksaan sehingga pengukuran yang berhubungan
yang dapat menyeleksi dan metode peka terhadap sensivitas dymethylaniline dan fenol.Karena sensivitas dan selektivitasnya yang
tinggi serta jarak yang bekerja berupa suatu garis lurus. Analisa dengan mengunakan alat HPLC-Cl telah menjadikan sebuah tehnik
yang menarik untuk analisi biomedical dan berhubungan dengan obat-obatan, tetapi bukan untuk menentukan sample yang
berhubungan dengan lingkungan. Pada umunya, analisis Cl yang diakibatkan oleh reaksi analit dengan reaksi Cl, atau
hambatan/kepekaan Cl denga hasil reaksi analit dan reagen Cl atau oksidan sebelumnya yang terlibat dalam reaksi Cl.Oleh sebab
banyaknya kerugian yang akan timbul apabila suatu perairan itu tercemar, maka alat HPLC sangatlah membantu untuk mengetahui
lebih dini apakah suatu perairan itu tercemar atau untuk mengantisipasi keburukan yang akan terjadi nantinya. Perkembangan alat
kromatografi sangatlah membatu dalam kehidupan dan kelangsungan hidup manusia.Hal yang menarik pada alat HPLC adalah
kecepatan, ketelitian dan kemampuannya memisah-misahkan suatu campuran yang kompleks. Campuran yang dapat
dipisah-pisahkan, meliputi molekul-molekul, senyawa-senyawa ionik, senyawa-senyawa yang tak stabil (yang jika diuapkan akan
mengalami peruraian) dan juga senyawa-senyawa dengan massa rumus besar. Termasuk contoh dari senyawa-senyawa tersebut
antara lain asam-asam amino, asam nukleat, hidrokarbon, karbohidrat, pestisida, steroid, antibiotik danjuga senyaqa-senyawa
anorganik. Dengan demikian, pemakaian alat HPLC dalam analisis dapat meliputi hampir semua bidang, seperti farmasi, kedoteran,
bioteknologi, biokimia, minyak bumi, pencearan air, dan sebagainya.Pada rangkaian alat HPLC, bagian alat yang memegang peran
yang sangat penting adalah kolom. Setalah sampel terpisah-pisah dan kelaur dari kolom, maka komponen sampel akan masuk ke
dalam suatu detektor. Detektor akan mengukur kadar masing-masing komponen yang responnya akan diolah oleh prosesor dan
ditampilkan oleh rekorder berupa suatu kromatogram. Detektor yang sudah dikembangkan antara lain Detektor UV (UV-Detector),
Detektor Fluoresensi (Fluoresence Detector), Detektor Indeks Bias (Refraktive Index Detector), Detektor Konduktivitas
(Conductivity Detector). Detektor yang digunakan disesuaikan denga senyawa/zat yang dianalisis.HPLC Merk Shimadzu seri
LC-6A merupakan HPLC yang memiliki komponen-komponen yang lengkap, dioperasikan dengan suatu sistem kontrol yang
mengendalikan semua komponen, pompa, oven kolom, sistem injeksi, detektor, prosessor dan printer. HPLC ini mempunyai injektor
yang dapat bekerja secara otomatis, dapat menginjeksikan sampel sampai 100 sampel secara otomatis. Jika semua parameter sudah
di set, solvent (phase gerak) sudah disiapkan cukup, alat ini dapat melakukan analisis sendiri, hasilnya akan muncul dalam
kromatogram termasuk perhitung luas masing-masing puncak kromatogram.Prinsip Kerja Prinsip kerja HPLC sebenarnya tidak
berbeda dengan prinsip-prinsip kromatografi yang lain, yaitu pemisahan komponen-komponen sampel dengan cara melewatkan
sampel pada suatu kolom, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing komponen-komponen tersebut dengan
suatu detektor. Kerja detektor bermacam-macam, tetapi pada dasarnya membandingkan respon dari komponen sampel dengan
respon dari larutan standar. Dengan kata lain, penentuan kadar pada dasarnya adalah membandingkan respon sampel dengan respom
standar. Untuk analisis dengan HPLC diperlukan standar yang betul-betul murni, biasanya disebut HPLC grade. Untuk mendapatkan
hasil analisis yang tepat juga diperlukan phase gerak dengan kemurnian tinggi. Bagian-Bagian Alat HPLCPada dasarnya instrumen
HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder. 1. Tandon (Reservoir)
Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih. Reservoir yang baik disertai degessing system
Output as PDF file has been powered by [ Universal Post Manager ] plugin from www.ProfProjects.com
| Page 1/3 |
This page was exported from - Karya Tulis Ilmiah
Export date: Sat Sep 2 22:41:55 2017 / +0000 GMT
yang berfungsi untuk mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Gas terlarut tersebut antara lain oksigen. Degassing dilakukan dengan
mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring debu.
Debu dan partikulat yang terbawa oleh solvent dapat menyumbat kolom. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer
yang dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum. Untuk memperoleh pemisahan yang optimum dianjurkan
menggunakan solvent yang masih baru. 2. Pompa Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom
dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratan: a) Dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360
atm) b) Tekanan yang dihasilkan bebas pulsa. c) Dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit. d) Dapat
mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi. e) Tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon). Ada
beberapa jenis pompa, antara lain : a. Reciprocating pump: Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang
bergerak maju mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi. b. Displacement Pump: Terdiri dari semacam alat
suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250 ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston. c. Pneumatic Pump:
Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas. Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi.
Sistim pemompaan ini dapat diatur secara manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase
gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua
atau lebih solvent. Kemudian langkah selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh
masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari
waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system. Pompa perlu
dirawat dengan baik, antara lain: a. Menggunakan solvent yang bebas debu/ partikulat. b. Pompa jangan dibiarkan kering, sehingga
tidak terjadi geseran yang bisa mengakibatkan kebocoran pompa. c. Bila dalam solvent terdapat garam-garam, maka setelah selesai
menggunakan alat ini, pompa harus dialiri air (aquadest) sampai bersih kemudian dibilas dengan methanol agar tidak terjadi
pengendapan garam dalam dinding pompa. d. Jangan menjalankan pompa dalam keadaan kering. 3. Katup Injector: Bagian ini
merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom. Ada beberapa sistem
injeksi: a. Syringe Injection; Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai 1500 psi. b.
Stop Flow Injection: Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke dalam ruang injeksi
(atau disebut mixing chamber, sementara itu aliran fase gerak dihentikan. Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali
dan sampel akan terbawa. c. Auto sampler (disebut juga Auto Injector) Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control
system. Sampel ditaruh dalam wadah seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot
secara otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak. Pada auto sampler ini dapat
dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan sistem HPLC akan bekerja sendiri melakukan analisis, termasuk mencuci sendiri sistem
injeksinya setelah melakukan injeksi. 4. Kolom (Column): a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran partikel isi kolom. Kolom
merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk
memisah-misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari stainless steel yang dibor halus atau dari gelas.
Untuk yang dibuat dari gelas pada umumnya kurang terhadap tekanan, hanya dipakai di bawah 600 psi dan di pasaran tersedia
bermacam-macam jenis kolom dari berbagai pabrik. Ukuran kolom antara 10 sampai 30 cm, berbentuk lurus, diameter dalam 4
sampai 10 mm dan ukuran partikel dalam kolom 5 sampai 10 um. Ada juga kolom dengan ukuran yang lebih kecil, panjang 3 sampai
7,5 cm; diameter dalam 1 sampai 4,6 mm, ukuran partikel 3 sampai 5 um. Dalam pemakaian yang berhati-hati, digunakan kolom
pengaman (grand column) yang dipasang sebelum kolom analitik. Kolom ini berisi packing yang sama dengan kolom analitik,
ukurannya kolom lebih pendek dengan partikel yang ukurannya lebih besar. Kolom ini akan menahan debu partikulat yang ikut
terelusi sehingga umur kolom analitik lebih panjang. Contoh perbandingan waktu dan hasil kolom panjang dan pendek untuk
campuran theobromine, theophyline, BHET, caffein yang menunjukkan bahwa kolom, pendek dapat memisahkan sampel hanya
dalam waktu 120 detik (2 menit), sedang kolom panjang perlu waktu 6 menit. Kolom analitik ada pula yang dapat diatur suhunya.
Sebenarnya yang diatur bukan kolomnya tetapi ruang dimana kolom ditempatkan. Ruang ini disebut column oven dan kolomnya
disebut thermostat column. Dengan cara seperti ini dapat diatur suhu kolom 1000 sampai 1500. b. Jenis Column Packing (Isi Kolom)
Ada dua jenis packing kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel porous dan partikel pelliculer. Isi
kolom yang berbentuk pellicular terdiri dari partikel berbentuk bola, non porous terbuat dari gelas atau polimer. Partikel ini dilapis
dengan suatu lapisan tipis yang porous dari silika, alumina atau penukar ion. Pelapisan dapat dilakukan dengan penambahan phase
diam yang akan ditahan oleh partikel secara absorbsi atau dengan jalan mereaksikan bagian permukaan partikel tersebut dengan
bahan organik tertentu. Dari reaksi ini dihasilkan suatu lapisan permukaan yang mempunyai sifat tertentu. Lapisan yang terbentuk
selanjutnya disebut phase terikat (bonded phase). Packing kolom yang berupa silika, permukaannya terdiri dari silika yang
dihidrolisis, baik dengan pemanas atau perendaman dalam HCL sehingga gugus silanol bersifat polar. Untuk mendapatkan
Output as PDF file has been powered by [ Universal Post Manager ] plugin from www.ProfProjects.com
| Page 2/3 |
This page was exported from - Karya Tulis Ilmiah
Export date: Sat Sep 2 22:41:55 2017 / +0000 GMT
permukaan dengan gugus yang sifatnya non polar dapat diikatkan siloxane. Ini diperoleh dengan menghidrolisis permukaan silika
dengan organochlorosilan.5. Detektor Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-pisah dan
keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati suatu
detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis. a. Detektor UV Prinsip
kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati
kolom lalu dilewatkan Flow-cell. Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi oleh
sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini
sifatnya spesifik, artinya hanya dapat digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang biasa
digunakan adalah 254 nm. b. Detektor Fluoresensi Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV
yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar Fluoresensi
ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati. Detektor ini lebih sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar
laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang
menghasilkan zat yang dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino. c. Detektor Indeks Refraksi
(Refraksi Index Detector = RID) Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua larutan
suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir semua zat. 6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu
tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat
menghitung luas kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya. Kelebihan dari alat HPLC adalah :? Mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.? Mudah melahsanakannya.? Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi.?
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis? Resolusi yang baik.? Dapat digunakan bermacan-macam
detektor.? Kolom dapat digunakan kembali.? Mudah melakukan ?sample recovery?.
Output as PDF file has been powered by [ Universal Post Manager ] plugin from www.ProfProjects.com
| Page 3/3 |