BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian - KELARUTAN OIL SLUDGE DENGAN BIOSURFAKTAN Acinetobacter sp. P2(1) DAN VARIASI VOLUME CRUDE ENZIM LIPASE Bacillus sp. LII63B Repository - UNAIR REPOSITORY

BAB III METODE PENELITIAN

  3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

  Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Terpadu, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya pada bulan Maret sampai dengan Juni 2012.

  3.2 Bahan dan Alat Penelitian

3.2.1 Bahan penelitian

  Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

  1. Bahan Isolat Bakteri Isolat yang digunakan adalah Acinetobacter sp. P2(1) dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga sebagai isolat penghasil penghasil bisurfaktan, dan sebagai isolat penghasil crude enzim lipase dari limbah rumah potong hewan daerah Pegirian, Surabaya yaitu Bacillus sp. LII63B.

  2. Sampel Uji Sampel uji yang digunakan adalah sampel oil sudge yang didapatkan dari BPPT (Badan Pengkajian Dan Penerapan Teknologi) Jakarta.

  28

  29

  3. Media dan Bahan Kimia

  a. Media pertumbuhan bakteri Media Nutrient Agar (NA) untuk menumbuhkan Acinetobacter sp. P2(1) dan Bacillus sp. LII63B, media Nutrient Broth (NB) untuk starter bakteri dan media produksi enzim lipase, sumber karbon untuk kultur bakteri dalam produksi biosurfaktan menggunakan limbah tetes tebu (molase),

  Pruthi and Cameotra mineral salts medium (AMS) untuk produksi biosurfaktan.

  b. Bahan Kimia Beberapa bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan media seperti AMS diantaranya yaitu CaCl

  2 , CoCl 2 .6H

  2 O, CuSO 4 .5H

  2 O, FeSO 4 .7H

  2 O,

  3

  3

  2

  4

  2

  

4

  4

  2

  4

  2 HCl, H BO , KH PO , K HPO , KOH, MgSO .7H O, MnSO .H O, NaCl,

  Na

  2 CO 3 , Na

  2 MoO 4 .2H

2 O, Na

  

2 HPO

4 , NaH

  2 PO 4 , NaOH, NH

  4 Cl, (NH 4 )2SO 4 ,

  ZnSO

  4 .7H

2 O. Serta beberapa bahan kimia yang lazim digunakan dalam penelitian mikrobiologi yaitu alkohol dan spirtus.

  c. Bahan Uji untuk Kelarutan oil sludge

  Oil sludge, tween 20, akuades, minyak emersi, aluminium foil, cling wrap, agar powder, solar, kapas, kertas koran, kertas saring Whatman no. 1

  dengan diameter 110 mm, label, dan spiritus.

3.2.2 Alat penelitian

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoclave (Ogawa Seiki), spektrofotometer (spectronic 20 Bausch-Lomb), neraca analitik (Shimadzu AEL-200), shaker incubator, magnetic stirrer, tensiometer Du-Nouy, Plate Heat

  30 Exchanger, oven, waterbath, botol 250 ml dan 500 ml, vortex, kertas pH, spatula kaca, spatula besi, tabung cuvet, tabung falcon, tabung erlenmeyer, mikropipet (100 μM – 1000 µM), tip mikropipet, gelas ukur, jarum ose loop, corong plastik, gelas beaker, tabung reaksi, pipet volume, finn pipet, rak tabung reaksi, dan bunsen.

3.3 Prosedur Penelitian

  Untuk melakukan penelitian kelarutan oil sludge oleh biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan variasi konsentrasi crude enzim lipase Bacillus sp.

  LII63B, dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu;

3.3.1 Pembuatan stok bakteri uji

  Biakan murni Acinetobacter sp. P2(1) dan isolat bakteri penghasil lipase

  Bacillus sp. LII63B dari limbah RPH diperbanyak dalam media NA (Nutrien Agar) miring yang telah dibuat dengan cara melarutkan NA (28g/L) dalam

  akuades, kemudian larutan media di masukkan kedalam tabung reaksi dan di

  o

  sterilkan dengan autoclave pada suhu 121 tekanan 1 atm selama 20 menit, kemudian setelah disterilkan, tabung yang berisi media NA dimiringkan ditunggu hingga media benar-benar padat. Media NA miring yang telah padat kemudian ditanami bakteri dan ditanamkan dengan menggunakan metode streak dan

  o o

  dinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang (27 -33

  C). Koloni yang tumbuh dengan baik digunakan sebagai stok bakteri selama penelitian.

  31

3.3.2 Pembuatan media AMS

  Air mineral sintetis (AMS) yang digunakan merupakan komposisi dari Pruthi dan Cameotra (1997). Media ini dibuat dengan cara melarutkan (NH

  4 )

  2 SO

  4

  (3 g), MgSO

  4 . 7H

  2 O (0,2 g), NaCl (10 g), CaCl 2 (0,01 g), MnSO 4 . H

  2 O (0,001 g),

  3

  3

  4

  2

  4

  2

  2

  2 H BO (0,001 g), ZnSO . 7H O (0,001 g), CuSO . 5H O (0,001 g), CoCl . 6H O

  (0,005 g), dan Na

  2 MoO 4 . 2H

2 O (0,001 g) ke dalam 900 mL akuades. Larutan

  tersebut dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik dan pH larutan dinetralkan dengan penambahan KOH 10% atau HCl 5%. Kemudian disterilkan dan ditambah stok KH

  2 PO 4 (1 g) dan K

  2 HPO 4 (1 g) dalam 50 mL akuades beserta

  4

  2 stok FeSO .7H O (1 g) dalam 50 mL akuades setelah disterilkan secara terpisah.

  3.3.3 Pembuatan kultur bakteri dalam media Nutirent Broth

  Biakan bakteri Acinetobacter sp. P2(1) dan isolat Bacillus sp. LII63B di ambil dua ose kemudian ditanamkan ke dalam 50 mL media NB (Nutrient Broth) steril yang telah dibuat dengan melarutkan (13g/L) dalam akuades, kemudian di tuangkan ke dalam botol berukuran 250 mL dan disterilkan. Kultur bakteri dalam

  o o

  NB di inkubasi pada shaker incubator selama 24 jam pada suhu 27 -33

  C, selanjutnya kultur ditanam ke dalam media kultur masing-masing bakteri.

  3.3.4 Produksi biosurfaktan

  Botol kultur ukuran 500 mL diisi dengan 86,4 mL campuran air mineral sintetis dan 4% substrat molase (v/v), pH larutan harus 7. Media disterilkan dengan autoclave. Kemudian ditambahkan 4,8 mL stok KH

  2 PO 4 dan K

  2 HPO 4 ,

  4,8 mL stok FeSO

  4 . 7H

2 O dan 4% starter bakteri Acinetobacter sp. P2(1) yang

  memiliki nilai OD= 0,5 pada λ=650 nm. Total volume larutan dalam botol 500

  32 mL adalah 100 mL. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam shaker incubator

  o

  pada suhu 28 C, 120 rpm selama 3 hari.

3.3.5 Uji produksi biosurfaktan

  Kultur bakteri Acinetobacter sp. P2(1) yang telah diinkubasi selama 3 hari

  o

  disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm, suhu 4

  C, selama 15 menit untuk memisahkan sel dari supernatan. Supernatan yang diperoleh diuji kemampuannya dalam memproduksi biosurfaktan dengan mengukur tegangan permukaan dan aktivitas emulsifikasi supernatan kultur.

a. Pengukuran tegangan permukaan supernatan kultur

  Sebanyak 10 mL supernatan dari kultur bakteri Acinetobacter sp. P2(1) dimasukkan ke dalam cawan petri yang bersih dan bebas lemak. Pengukuran tegangan permukaan supernatan kultur dilakukan menggunakan tensiometer Du-Nouy.

  Mula-mula cawan petri ditempatkan pada meja sampel yang datar, cincin digantungkan pada pengait yang terdapat pada alat tersebut dan skala diatur pada angka 0. Kemudian, cawan petri berisi sampel dinaikkan perlahan-lahan dengan cara memutar alat pengatur di bagian bawah alat hingga cincin dapat tercelup tepat pada permukaan cairan sampel. Setelah itu, alat pengatur yang ada di sisi lain digerakkan hingga cincin terlepas dari sampel.

  Nilai tegangan permukaan yang didapat adalah nilai skala pada saat cincin terlepas dari sampel (Ni’matuzahroh et al., 2009). Nilai tegangan permukaan sampel dihitung menggunakan rumus. Air akuades dan molase digunakan sebagai kontrol, dinyatakan dalam dyne/cm dan dilaporkan sebagai hasil rata- rata dari 3 ulangan, dengan menggunakan rumus: r = r o x

   

b. Pengukuran aktivitas emulsifikasi

  dengan 1 mL minyak uji. Minyak uji yang digunakan adalah solar. Kemudian campuran dihomogenkan dengan vortex selama 2 menit, dan diamati aktivitas emulsifikasinya setelah 1 jam dan 24 jam.

  33

  Supernatan selanjutnya diekstrak dengan menggunakan amonium sulfat dalam keadaan dingin (dalam penangas es). Volume supernatan kultur yang

  X cairan total tinggi emulsi tinggi

  % Emulsifikasi = 100%

  Aktivitas emulsifikasi diamati dengan mengukur tinggi emulsi (cm) terhadap tinggi total cairan (cm) dikali 100% (Pruthi dan Cameotra, 1997).

  al. (2006). Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 1 mL supernatan ditambah

   di mana, r = tegangan permukaan sampel r o = tegangan permukaan akuades pada t

  Aktivitas emulsifikasi diukur dengan menggunakan metode Suryatmana et

  Penurunan nilai tegangan permukaan (>10 dyne/cm) menunjukkan bahwa bakteri tersebut berpotensi menghasilkan biosurfaktan (Francy et al. 1991).

  o = tegangan permukaan akuades yang terbaca pada alat

  = tegangan permukaan sampel yang terbaca pada alat 

  C 

  o

3.3.6 Ekstraksi biosurfaktan dan penghitungan nilai CMC

  34 digunakan untuk proses ekstraksi adalah ± 50 mL dimasukkan ke dalam gelas

  Beaker 100 mL dan direndam dengan penangas es kemudian diputar dengan

  menggunakan magnetic stirrer. Menurut penelitian sebelumnya oleh Fitria (2011), penambahan ammonium sulfat untuk mencapai kadar 60% jenuh dalam proses ekstraksi adalah 7,8 gram ammonium sulfat dalam 20 mL supernatan.

  Amonium sulfat dimasukkan secara perlahan agar terlarut dengan sempurna, kemudian setelah semua ammonium sulfat larut, proses homogenisasi tetap dilakukan selama 15 menit. Setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 9000 rpm

  o pada suhu 4 C selama 15 menit untuk memisahkan produk dari supernatan.

  Selanjutnya pelet diliofilisasi dengan menggunakan freeze dryer hingga menjadi serbuk biosurfaktan yang digunakan untuk uji kelarutan oil sludge.

  Kemudian dilakukan penghitungan nilai CMC untuk produk kasar biosurfaktan yang telah dihasilkan. Pembuatan 10 mL larutan induk dengan 0,2 g produk biosurfaktan, kemudian diukur nilai tegangan permukaannya dengan tensiometer Du Nouy.

  Pengukuran dihentikan saat titik kritis tercapai, yaitu nilai tegangan permukaan larutan biosurfaktan tetap stabil. Titik kritis tersebut merupakan nilai CMC larutan biosurfaktan dan dinyatakan sebagai dyne/cm dengan satuan dari CMC dinyatakan dalam g/L.

3.3.7 Penentuan nilai aktivitas enzim lipase Bacillus sp. LII63B

  Penentuan aktivitas enzim lipase dilakukan dengan metode Pereira- Meirelles et al. (1997) dalam Sumarsih (2005) yang dimodifikasi. Aktivitas enzim ditentukan dengan metode spektrofotometrik dengan substrat p-nitrofenil palmitat

  35 (p-NPP). Kultur dengan umur 16 jam disentrifugasi pada 9.000 rpm dengan suhu 4º C selama 15 menit, sehingga terpisah antara supernatan dan suspensi sel.

  Supernatan yang diperoleh mengandung enzim lipase ekstraseluler.

  Disiapkan tabung Eppendorf yang diisi 700 µl larutan p-NPP 0,503 mM dalam buffer fosfat pH 7.0. Kemudian ditambahkan 300 µl supernatan yang mengandung enzim lipase ekstraseluler. Campuran diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37º C selama 30 menit. Tabung Eppendorf diangkat dari waterbath lalu ditambahkan 100 µl larutan Na

  2 CO 3 0,2 M. p-nitrofenol yang terbentuk ditandai

  dengan warna kuning, kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada λ = 410 nm. Absorbansi yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk menetapkan nilai aktivitas enzim lipase berdasarkan pada kurva standart p- nitofenol (U/mL).

3.3.8 Produksi crude enzim lipase

  Media produksi crude enzim lipase yang digunakan adalah media Nutrient

  Broth (13 g/L) yang ditambahkan dengan substrat minyak goreng sebanyak 2%

  (v/v). Sebanyak 100 mL media dimasukkan ke dalam masing-masing botol kultur

  o ukuran 500 mL dan disterilisasi pada suhu 121 C selama 15 menit.

  Sebanyak 5% (v/v) kultur Bacillus sp. LII63B dalam Nutrient Broth dengan nilai absorbansi 0,5 pada λ 650 nm diinokulasikan ke dalam masing-masing botol kultur berukuran 500 mL yang telah berisi media produksi dengan volume 100 mL. Inkubasi dilakukan dalam shaker incubator pada suhu ruang dengan agitasi 120 rpm selama 16 jam karena waktu optimal enzim lipase dari Bacillus sp. LII63B adalah pada jam ke-16 tersebut. Crude enzim diperoleh dengan cara kultur

  36 disentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm dalam suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan hasil sentrifugasi tersebut digunakan sebagai crude enzim (ekstrak kasar enzim). Crude enzim lipase tersebut dilakukan pengukuran nilai tegangan permukaannya (dyne/cm) dan aktivitas emulsifikasinya (%).

  3.3.9 Persiapan oil sludge Oil sludge yang cair dipipet 0.20 mL dan dimasukkan ke dalam tabung

  reaksi kemudian ditambahkan larutan uji hingga volume dalam tabung reaksi mencapai 8 mL. Jadi dalam satu tabung reaksi uji mengandung oil sludge sebanyak 2,5% (v/v). Volume oil sludge dalam tabung reaksi sebelum diberi larutan uji ditimbang dengan neraca analitik hingga diperoleh beratnya. Berat oil

  sludge perlakuan dicatat sebagai Wop.

  3.3.10 Uji kelarutan oil sludge

  Sembilan perlakuan untuk uji kelarutan divortex pada suhu ruang (27-

  o

  30 C) selama 15 menit. Oil sludge yang terlarut (dalam fase cair) diambil secara hati-hati menggunakan pipet tetes. Lalu, dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 9.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Kelarutan oil sludge diketahui dengan cara melakukan filtrasi atau penyaringan fase cair dari masing-masing perlakuan dengan menggunakan kertas saring Whatman.

  3.3.11 Filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan

  Kertas saring Whatman no. 1 diameter 110 mm disiapkan untuk filtrasi fase cair dari masing-masing perlakuan. Kertas saring yang digunakan untuk filtrasi dibungkus dengan aluminium foil yang sebelumnya telah ditimbang dengan neraca analitik dan dicatat beratnya sebagai Wo. Sebanyak 1 mL sampel

  37 dari masing-masing fase cair hasil sentrifugasi dan tidak disentrifugasi dimasukkan ke dalam kertas saring. Kelarutan oil sludge diukur dari minyak yang terpisah dan terperangkap di kertas saring tersebut.

  Kertas saring dikeringkan dengan cara dioven pada suhu 51-55°C selama 5 jam. Kertas saring yang telah kering kembali ditimbang dan dicatat beratnya sebagai Wt. Semua prosedur yang dilakukan ketika filtrasi fase cair dari kontrol dan perlakuan ini dilakukan secara bebas lemak.

  Setiap perlakuan yang dilakukan dalam uji kelarutan oil sludge, selalu disertai dengan blangko. Blangko merupakan berat larutan biosurfaktan ataupun

  crude enzim tanpa penambahan oil sludge yang diperlakukan sama seperti

  perlakuan lainnya. Berat blangko dari masing-masing perlakuan dicatat sebagai Wb.

3.3.12 Penghitungan nilai persentase kelarutan oil sludge

  Nilai persentase kelarutan oil sludge dari masing- masing perlakuan dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Dimana:

  Wot = berat oil sludge terlarut (g) Wb = berat blangko perlakuan (g) Wop = berat oil sludge perlakuan (g) Sedangkan berat oil sludge terlarut dihitung menggunakan rumus berikut:

  Dimana:

  38 Wot = berat oil sludge terlarut (g/volume total) Wt = berat kertas saring + oil sludge terlarut (g/mL) Wo = berat kertas saring + alumunium foil (g)

3.4 Rancangan Penelitian

  Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris yang menggunakan rancangan penelitian acak lengkap (RAL), dimana akan dilakukan tiga kali pengulangan untuk sembilan perlakuan yang akan dilakukan. Rincian perlakuan adalah sebagai berikut:

  1. Akuades (K) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 7,80 mL (97,5% (v/v)) akuades.

  2. Tween-20 (S) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 7,80 mL (97,5% (v/v)) surfaktan sintetis tween 20 dengan konsentrasi sama dengan CMC.

  3. Biosurfaktan (B) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 7,80 mL (97,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1).

  4. Enzim 1 mL (E1) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 1 mL (12,5% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 6,80 mL (85% (v/v)) akuades.

  5. Enzim 2 mL (E2) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 2 mL (25% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 5,80 mL(72,5% (v/v)) akuades.

  6. Enzim 3 mL (E3) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil sludge + 3 mL (37,5% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 4,80 mL (60% (v/v)) akuades.

  7. Kombinasi biosurfaktan dan enzim 1 mL (BE1) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil

  sludge + 1 mL (12,5% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 3 mL

  (37,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 3,80 mL (47,5% (v/v)) akuades.

  8. Kombinasi biosurfaktan dan enzim 2 mL (BE2) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil

  sludge + 2 mL (25% (v/v)) crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B + 3 mL

  (37,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 2,80 mL (35% (v/v)) akuades.

  9. Kombinasi biosurfaktan dan enzim 3 mL (BE3) yaitu 0,20 mL (2,5% (v/v)) oil

  sludge + 3 mL (37,5% (v/v)) crude enzim lipase dari Bacillus sp. LII63B + 3

  mL (37,5% (v/v)) biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) + 1,80 mL (22,5% (v/v)) akuades.

  3.5 Variabel Penelitian

  Variabel penelitian terdiri dari : Variabel bebas : perlakuan biosurfaktan (mL (% (v/v))) dan crude enzim lipase (mL (% (v/v))) terhadap oil sludge.

  Variabel terikat : persentase kadar oil sludge yang terlarut (%). Variabel kendali : lama waktu agitasi (menit), suhu (

  o

  C), pH (7), berat (g), volume oil sludge (mL (%(v/v))).

  3.6 Analisis Data Penelitian

  Data yang diperoleh dari penelitian ini adalah nilai tegangan permukaan, nilai emulsifikasi dan persentase kelarutan oil sludge. Data kelarutan dianalisis dengan program Statistical Package For Social Science 17.0 (SPSS 17). Data

  39

  40 kelarutan oil sludge (%) dianalisis terlebih dahulu dengan melihat data berdistribusi normal atau tidak dengan menggunakan uji One sample

  Kolmogorov-Smirnov. Kemudian homogenitas varians juga dianalisis dengan uji Levene test. Jika data berdistribusi normal dan varians homogen dilanjutkan

  dengan uji One-way Analysis of Varians (ANOVA) (derajat signifikasi (α) 5%) pada program SPSS. ANOVA digunakan untuk mengetahui ada-tidaknya pengaruh variasi perlakuan penambahan biosurfaktan Acinetobacter sp. P2(1) dan crude enzim lipase Bacillus sp. LII63B terhadap kelarutan oil sludge.

  Jika data tidak homogen, maka dilanjutkan dengan uji Brown-Forsythe, yang hampir sama dengan ANOVA fungsinya untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh variasi perlakuan. Selanjutnya jika terdapat pengaruh pada masing- masing perlakuan terhadap kelarutan oil sludge, kemudian untuk melihat beda signifikan pada masing-masing perlakuan dianalisis lanjutan dengan uji Independent Samples T-Test.

  41

3.7 Skema Penelitian

  Persiapan bahan dan peralatan Pembuatan stok bakteri uji pada media agar miring (NA) Pembuatan suspensi bakteri dalam media NB dan penentuan OD=0,5 dan λ=650 nm Produksi biosurfaktan pada media campuran AMS, 4% molase, serta 4% suspensi bakteri Acinetobacter _o sp. P2(1) (OD=0,5), inkubasi selama 3 hari dalam shaker inkubator pada suhu 28

  C, 120 rpm Uji produksi biosurfaktan Nilai tegangan permukaan Nilai aktivitas emulsifikasi

  Ekstraksi Biosurfaktan

  Enzim lipase dari Bacillus sp. LII63B. diproduksi pada media produksi crude enzim lipase 1 Uji kelarutan oil sludge

  Uji kelarutan oil sludge terhadap biosurfaktan crude enzim Acinetobacter sp. P2(1) terhadap biosurfaktan lipase 2

  Acinetobacter sp. P2(1) (konsentrasi = CMC) + crude enzim (konsentrasi = CMC) crude enzim lipase 3 persentase kelarutan oil sludge