Sampel DNA Aren Isolasi DNA Uji Kualitas Uji Kuantitas

  Lampiran 1. Alur penelitian Sampel DNA Aren Isolasi DNA

Uji Kualitas Uji Kuantitas

  Proses PCR-RAPD Elektroforesis Analisis Hasil Amplifikasi PCR-RAPD

   Lampiran 2. Koleksi 27 aksesi tanaman aren di Sulawesi Tenggara No. Kode LONG LAT TUTUPAN LAHAN KELURAHAN/DESA KECAMATAN KABUPATEN/KOTA PROVINSI

  

15 K13 122.483 -3.967 Permukiman WATULONDO PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

26 S7 122.379 -3.979 Semak/Belukar BAINI SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

25 S6 122.390 -3.981 Pertanian Lahan Kering BercampurdenganSemak POHARA SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

24 S5 122.414 -3.978 Semak/Belukar ANDAROA SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

23 S4 122.410 -3.979 Semak/Belukar BAO-BAO SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

22 S3 122.432 -3.977 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LASOSO SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

21 S2 122.445 -3.968 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LAKOMEA SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

20 S1 122.446 -3.962 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak ABELI SAWAH SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

  

19 K17 122.505 -3.982 Permukiman KADIA KADIA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

18 K16 122.497 -3.953 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LALODATI PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

17 K15 122.507 -3.961 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak TOBUUHA PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

16 K14 122.490 -3.966 Permukiman PUNGGOLAKA PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

14 K12 122.461 -3.969 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak PUUWATU PUUWATU KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

1 P2 122.400 -4.099 Semak/Belukar LABOJAYA KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA

  

13 K10 122.502 -3.935 Semak/Belukar WAWOMBALATA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

12 K9 122.510 -3.961 Permukiman MANDONGA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

11 K8 122.500 -3.932 Semak/Belukar LABIBIA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

10 K7 122.517 -3.959 Permukiman ANGGILOWU MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

9 K6 122.513 -3.950 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak ALOLAMA MANDONGA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

8 K5 122.500 -4.015 Pertanian Lahan Kering ANDUONOHU POASIA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

7 K4 122.400 -4.036 Semak/Belukar WATUBANGGA BARUGA KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

6 K2 122.590 -3.991 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak PETOAHA ABELI KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

5 K1 122.500 -3.981 Permukiman ABELI ABELI KENDARI SULAWESI TENGGARA

  

4 P5 122.400 -4.118 Hutan Lahan Kering Sekunder AMBOLOLI KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA

  

3 P4 122.450 -4.047 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak RANOMETTO KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA

  

2 P3 122.400 -4.056 Pertanian Lahan Kering Bercampur dengan Semak LAMOMEA KONDA KONAWE SELATAN SULAWESI TENGGARA

  

27 S8 122.400 -3.981 Semak/Belukar ANDADOWI SAMPARA KONAWE SULAWESI TENGGARA

Universitas Sumatera Utara

  Lampiran 3. Peta lokasi sampel tanaman aren di Sulawesi Tenggara

Universitas Sumatera Utara

  Lampiran 4. Pembuatan larutan stok dan bufer

• CTAB 5 % (100 ml): Timbang NaCl sebanyak 2.0 gram dan CTAB sebanyak 5.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate.
• Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml): Timbang Tris sebanyak 12.114 gram.

  Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan 4.2 ml HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

• Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m): Timbang Tris sebanyak 6.057 gram.

  Masukkan Tris ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 30 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan NaOH 2.5 M sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 7.4. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 50 ml.

• EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml): Timbang EDTA sebanyak 18.612 gram dan

  NaOH 2.0 gram. Masukkan bahan kimia ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Selanjutnya, ditambahkan HCl pekat sedikit demi sedikit sampai pH mencapai 8. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.

• NaCl 5 M (l00 ml): Timbang NaCl sebanyak 29.22 gram. Masukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 80 ml aquades. Aduk campuran larutan dengan menggunakan stirrer kemudian diletakkan diatas hote plate. Masukkan ke dalam gelas ukur, kemudian volume ditepatkan dengan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
• Semua bahan di atas disterilkan dengan menggunakan autoklaf kecuali CTAB 5%.
• Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml): Campurkan 40 ml CTAB 5%, 25.1 ml

  NaCl 5 M, 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0, 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0 dan 20.8 ml aquades.

• Buffer TAE 50 X (100 ml): Campurkan 24.2 ml Tris HCl 1 M pH 7.4, 5.7 ml Asam Asetat Glasial, 10 ml EDTA 0.5 M PH 8.0, dan aquades hingga volume larutan menjadi 100 ml.
• Buffer TAE 1X (500 ml): Campurkan 10 ml Buffer TAE 50 X dan 490 ml aquades.
• Buffer TE (50 ml): Campurkan 0.5 ml Tris HCl 1 M PH 8.0, 0.1 ml EDTA 0.5 M PH 8.0 dan 49.4 ml aquades.
• Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml): Campurkan 48 ml Kloroform dan 2 ml Isoamilalkohol.
• Etanol 70 % (100 ml): Campurkan 70 ml Etanol dan 30 ml aquades.

  Lampiran 5. Proses isolasi DNA

  Sampel daun aren ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil ditambahkan nitrogen cair dan PVPP Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 ml buffer ekstraksi dan 10 µl

  β-mercaptoetanol Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 65 C

  Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit

  Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu

  4 C selama semalaman Tabung disentrifus pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit dan dikeringanginkan

  Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl Campuran ditambahkan dengan etanol absolut dingin dan diinkubasi dalam freezer (-20

  C) selama 30 menit Campuran disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit

  Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringanginkan Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE

  Stok DNA disimpan dalam freezer (-20

  C)

  Lampiran 6. Proses uji kualitatif

  Agaros 0.28 gram ditambahkan dengan 35 ml bufer TAE 1x Campuran dipanaskan dengan hot plate

  Campuran ditambahkan 0.5 µl EtBr

  Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dlam chamber berisi bufer TAE 1x

  Sampel dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (5:1) Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt

  Proses running dimulai selama 45 menit

  Lampiran 7. Proses PCR-RAPD

  C 1 menit

  o

  C 10 menit Kondisi akhir PCR 4

  o

  72

  Post extension

  C 2 menit

  o

  72

  Extension

  o

  Komposisi Master Mix volume 25 µl :

  36

  Annealing

  C 1 menit

  o

  C 2 menit Denaturasi 94

  o

  Denaturasi awal 94

  Running PCR sebanyak 45 siklus :

  primer 1 µl DNA sampel 2 µl

  Go Taq PCR 12.5 µl nuclease free water 9.5 µl

  C Tak terbatas Proses running dimulai selama ± 4 jam

  Lampiran 8. Proses elektroforesis hasil PCR-RAPD

  Agaros 1.3 gram ditambahkan dengan 130 ml bufer TAE 1x Campuran dipanaskan dengan hot plate

  Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr

  Larutan gel dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dlam chamber berisi bufer TAE 1x

  Sampel hasil PCR, marker dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (8:5:2)

  Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 100 volt Proses running dimulai selama 65 menit

  Lampiran 9. Hasil uji kuantitatif 27 aksesi DNA tanaman aren No Kode Aksesi A A 260 A 280 260 /A Conc. (µg/ml) 280

  21 S2 1.003 0.560 1.886

  42.35

  16 K14 0.561 0.394 1.699

  20.30

  17 K15 0.856 0.640 1.598

  28.85

  18 K16 0.729 0.427 1.856

  32.75

  19 K17 1.098 0.591 1.927

  52.70

  20 S1 1.309 0.806 1.866

  54.20

  47.15

  32.25

  22 S3 1.199 0.673 1.889

  55.90

  23 S4 0.567 0.311 1.886

  27.25

  24 S5 0.781 0.421 1.889

  38.25

  25 S6 0.835 0.504 1.800

  37.25

  26 S7 1.066 0.698 1.770

  42.30

  27 S8 0.517 0.303 1.849

  15 K13 1.020 0.642 1.806

  14 K12 0.723 0.421 1.880

  1 P2 0.834 0.464 1.894

  7 K4 0.173 0.107 1.857

  39.20

  2 P3 1.336 1.011 1.627

  42.15

  3 P4 0.664 0.426 1.832

  26.20

  4 P5 0.626 0.342 1.890

  30.15

  5 K1 0.035 0.032 1.750

  0.35

  6 K2 0.449 0.268 1.862

  19.55

  7.15

  30.55

  8 K5 0.551 0.382 1.754

  19.65

  9 K6 0.751 0.400 1.931

  36.40

  10 K7 0.534 0.287 1.939

  25.50

  11 K8 0.041 0.042 0.500

  0.05

  12 K9 0.753 0.400 1.949

  36.25

  13 K10 0.644 0.351 1.921

  23.30

  Lampiran 10. Matriks jarak ketidaksamaan genetik pada 21 aksesi tanaman aren di Sulawesi Tenggara

Aksesi P2 P3 P4 P5 K1 K2 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K12 K13 K17 S2 S3 S4 S5

  P3 0.351 P4 0.353 0.371 P5 0.227 0.422 0.381 K1 0.231 0.500 0.297 0.234 K2 0.222 0.297 0.294 0.227 0.231 K4 0.268 0.286 0.333 0.184 0.318 0.268 K5 0.389 0.297 0.176 0.364 0.333 0.333 0.220 K6 0.317 0.381 0.231 0.265 0.182 0.220 0.261 0.268 K7 0.364 0.422 0.286 0.231 0.191 0.273 0.265 0.273 0.143 K8 0.200 0.268 0.316 0.208 0.256 0.250 0.156 0.300 0.333 0.333 K9 0.302 0.364 0.317 0.216 0.217 0.302 0.125 0.256 0.208 0.176 0.191 K10 0.351 0.474 0.314 0.289 0.250 0.243 0.238 0.297 0.286 0.156 0.268 0.182 K12 0.297 0.368 0.314 0.289 0.250 0.297 0.190 0.189 0.286 0.333 0.220 0.273 0.316 K13 0.286 0.395 0.300 0.240 0.200 0.238 0.191 0.238 0.191 0.240 0.217 0.184 0.256 0.163 K17 0.391 0.489 0.364 0.259 0.265 0.391 0.255 0.348 0.294 0.296 0.280 0.283 0.319 0.277 0.231 S2 0.297 0.474 0.314 0.333 0.250 0.351 0.286 0.351 0.286 0.333 0.317 0.273 0.263 0.368 0.256 0.277 S3 0.300 0.512 0.316 0.292 0.256 0.350 0.289 0.350 0.289 0.292 0.273 0.319 0.317 0.268 0.261 0.200 0.220 S4 0.333 0.435 0.395 0.208 0.250 0.333 0.160 0.333 0.240 0.245 0.224 0.154 0.261 0.261 0.137 0.200 0.261 0.224 S5 0.300 0.366 0.368 0.250 0.256 0.300 0.156 0.250 0.244 0.333 0.227 0.234 0.366 0.171 0.174 0.240 0.268 0.182 0.102 S6 0.455 0.353 0.290 0.463 0.444 0.455 0.316 0.333 0.421 0.463 0.297 0.300 0.412 0.471 0.436 0.442 0.294 0.459 0.381 0.351 Ket: P2 = Labojaya K5 =Anduonohu K13 = Watulondo

  = Jarak terjauh

  P3 = Lamomea K6 = Alolama K17 = Kadia

  = Jarak terdekat

  P4 = Ranometto K7 = Anggilowu S2 = Lakomea P5 = Amboli K8 = Labibia S3 = Lasoso K1 = Abeli K9 = Mandonga S4 = Bao-bao K2 = Petoaha K10 = Wawombalata S5 = Andaroa K4 = Watubangga K12 = Puuwatu S6 = Pohara

  Universitas Sumatera Utara